Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Dương Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR

ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH

SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR

ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành : Hóa Phân Tích

Mã số : 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện luận luận văn này

Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Quỳnh Hoa đã hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn GS Peter C Hauser, TS Mai Thanh Đức và ThS Bùi Duy Anh đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Em xin chân thành cám ơn công ty 3SAnalysis đã cung cấp thiết bị CE-C4D cho nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian em học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, các anh, chị nghiên cứu sinh, các bạn học viên, các em sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015

Học viên

Dương Thị Nhàn

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11

1.1 Tổng quan về Salbutamol 11

1.1.1 Giới thiệu chung về Salbutamol 11

1.1.2 Vấn đề sử dụng Salbutamol trên thế giới 12

1.1.3 Vấn đề sử dụng Salbutamol ở Việt Nam 13

1.2 Các phương pháp xác định Salbutamol 14

1.2.1 Phương pháp điện hóa 5

1.2.2 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 6

1.2.3 Các phương pháp sắc ký 7

1.2.3.1 Các phương pháp sắc ký lỏng 7

1.2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 8

1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản 8

1.3 Phương pháp xác định Salbutamol bằng CE-C 4 D 18

1.3.1 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của hệ CE cơ bản 18

1.3.2 Giới thiệu về detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4D 20

1.3.3 Một số công trình xác định Salbutamol bằng CE 21

1.4 Các phương pháp làm giàu chất phân tích 23

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng 23

1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 24

1.4.2.1 Nguyên tắc của chiết pha rắn 25

1.4.2.2 Cơ chế của chiết pha rắn 26

1.4.2.3 Các loại cột SPE 28

1.4.2.4 Một số công trình làm giàu Salbutamol bằng chiết pha rắn 29

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 32

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 32

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 32

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Phương pháp phân tích 32

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu phân tích 33

2.2.3 Phương pháp xử lý mẫu 33

2.2.4 Quy trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn 34

2.2.5 Quy trình xử lý mẫu thịt bằng phương pháp chiết pha rắn 36

2.3 Trang thiết bị và hóa chất 37

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng 37

2.3.2 Hóa chất 39

2.3.2.1 Chất chuẩn 39

2.3.2.2 Hóa chất dung môi 39

2.3.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 39

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 40

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 40

2.4.2 Độ lặp lại của phương pháp 40

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Đánh giá phương pháp phân tích CE-C 4 D 42

3.1.1 Xây dựng đường chuẩn cho Salbutamol 42

3.1.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn phát hiện (LOQ) của thiết bị 43

3.1.3 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 44

3.2 Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện chiết pha rắn làm giàu Sabutamol trong mẫu nước tiểu 45

3.2.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết 45

3.2.2 Khảo sát đệm chiết 46

3.2.3 Khảo sát quá trình rửa tạp 47

3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải 48

3.2.5 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol trong mẫu nước tiểu bằng kĩ thuật CE-C4D kết hợp chiết pha rắn 50

3.2.5.1 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 50

3.2.5.2 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 51

3.2.5.3 Đánh giá độ đúng của phương pháp 51

3.2.6 Phân tích mẫu thực tế 52

3.3 Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện trong quá trình chiết pha rắn làm giàu Sabutamol trong mẫu thịt lợn 53

3.3.1 Chuẩn bị mẫu 53

3.3.2 Khảo sát lựa chọn cột chiết 53

3.3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp 54

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol trong mẫu thịt bằng kĩ thuật CE-C 4 D 56

3.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi 56

3.4.2 Đánh giá độ lặp của phương pháp phân tích Salbutamol bằng CE-C4D 57

3.4.3 Kết quả phân tích mẫu thịt lợn thực tế 57

3.5 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS 58

KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Salbutamol 14

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của Salbutamol 42

Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện của Salbutamol xác định bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D 43

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng Salbutamol 44

Bảng 3.4 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết 46

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn Salbutamol 51

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn Salbutamol 52

Bảng 3.7 Kết quả phân tích hàm lượng Salbutamol trong 08 mẫu nước tiểu được cung cấp 52

Bảng 3.8 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiết 54

Bảng 3.9 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng quy trình rửa tạp 56

Bảng 3.10 Khảo sát đánh giá độ thu hồi 56

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn Salbutamol 57

Bảng 3.12 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 19

Hình 2.1 Các bước chiết pha rắn 34

Hình 2.2 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam 38

Hình 3.1 Đường chuẩn của Salbutamol 43

Hình 3.2 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng (1) cột C18,(2) cột SCX 3ml và (3) cột SCX 6ml 45

Hình 3.3 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khảo sát đệm chiết (1) đệm photphat pH = 6, (2) đệm axetat pH=5,2 47

Hình 3.4 Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa tạp khác nhau (1; 2; 3; 4 tương ứng với quy trình 1; 2; 3; 4) 48

Hình 3.5 Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa giải (1; 2; 3 tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 49

Hình 3.6 Điện di đồ giới hạn phát hiện Salbutamol trong mẫu nước tiểu 50

Hình 3.7 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng(1) cột C18 , (2) cột SCX 3ml và (3) cột SCX 6ml 54

Hình 3.8 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp khác nhau (1; 2; 3 tương ứng với quy trình 1; 2; 3) 55

Hình 3.9 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp khác nhau (4; 5; 6 tương ứng với quy trình 4; 5; 6) 55

Hình 3.10 Điện di đồ kết quả phân tích mẫu thịt thực tế 58

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

C4D Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao – khối phổ…

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực

LC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ

Ppm Parts per million: phần triệu

UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

LỜI MỞ ĐẦU

Sử dụng chất tạo nạc mà phổ biến là Salbutamol trong chăn nuôi hiện nay đang là vấn đề nóng của nước ta Lợn ăn thức ăn có chứa Salbutamol sẽ tăng trọng nhanh, tỉ lệ nạc cao, thịt có màu đỏ tươi Tuy nhiên thịt lợn chứa dư lượng Salbutamol gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng như làm tăng huyết áp, tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa Mặc dù vậy, một số người chăn nuôi và các thương lái vì lợi nhuận đã bất chấp sức khỏe của người tiêu dùng, sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi gây hoang mang trong dư luận, Để đảm bảo sức khỏe cho người dân, lấy lại niềm tin của người tiêu dùng vào ngành chăn nuôi lợn cũng như đảm bảo tính công bằng cho những người chăn nuôi chân chính, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân tích, kiểm tra hàm lượng Salbutamol có trong thức ăn chăn nuôi và các đối tượng chăn nuôi, thực phẩm là cần thiết Việc xác định Salbutamol ở nước ta chủ yếu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm bằng phương pháp HPLC với quy trình phân tích phức tạp, giá thành phân tích cao Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) gần đây được biết đến là một phương pháp phân tích mới với nhiều ưu điểm, đã được nghiên cứu, ứng dụng để phân tích Salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi [9, 20] Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn khá phức tạp và thường có hàm lượng Salbutamol thấp mà giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp CE-C4D còn hạn chế nên việc phân tích Salbutamol bằng phương pháp CE-C4D trong các nền mẫu này gặp khó khăn [12, 14] Vì vậy, việc nghiên cứu kỹ thuật làm sạch mẫu và làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn sẽ làm tăng độ nhạy của phương pháp, giúp xác định được hàm lượng nhỏ của Salbutamol trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn bằng phương pháp CE-C4D, góp phần quản lý việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi Do đó chúng tôi đã lựa

chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc”

bị cấm sử dụng trong chăn nuôi ở VN và hầu hết các nước trên thế giới [1, 2]

1.1.1 Giới thiệu chung về Salbutamol

Công thức phân tử: C13H21O3N

pKa = 9,3; 10,7

Công thức cấu tạo:

Khối lượng phân tử: 239,152 đvC

Độ tan: Salbutamol tan được trong các dung môi phân cực, tan tốt tron metanol

Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol Salbutamol được sử dụng chủ yếu ở ba dạng uống, hít, tiêm, dùng trong thăm

dò chức năng hô hấp, điều trị cơn hen, ngăn cơn co thắt phế quản do gắng sức, điều trị tắc nghẽn đường dẫn khí hồi phục được, viêm phế quản mạn tính, giãn phế nang… Ngoài ra, Salbutamol cũng được sử dụng trong sản khoa, Salbutamol dạng

dịch truyền có thể được sử dụng như là thuốc đỡ đẻ, làm giãn cơ mềm tử cung có tác dụng làm chậm sự đẻ non

Tác dụng phụ thường thấy khi sử dụng Salbutamol là gây khó chịu, nhức đầu, hoa mắt, chóng mặt, buồn nôn, bồn chồn, run các đầu chi, tim đập nhanh, loạn nhịp tim, biến đổi huyết áp, co giật, có thể hạ kali huyết nhất là run, lo lắng, đau đầu, khô họng, hồi hộp… Các triệu chứng phụ khác có thể bao gồm phù, nổi mày đay, hạ huyết áp, trụy mạch, thiếu máu cục bộ cơ tim, rối loạn giấc ngủ và hành vi… Salbutamol dùng với lượng lớn gây hiện tượng tim đập nhanh, hệ thống thần kinh hưng phấn quá mức

Bên cạnh tác dụng dùng trong y học, Salbutamol còn là một chất chuyển đổi tương đối hiệu quả, làm giảm tỉ lệ mỡ, tăng tỉ lệ nạc ở gia súc, gia cầm Do đó, một

số người chăn nuôi đã lợi dụng đặc tính này để kích thích cho lợn nở vai, bung đùi, tạo nạc trong một thời gian ngắn tăng hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, trong vật nuôi vẫn tồn đọng Salbutamol ở thịt, gan, thận, nội tạng mà không bị phân hủy khi chế biến, gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người

1.1.2 Vấn đề sử dụng Salbutamol trên thế giới

Vào tháng 4 năm 2002, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã ban hành một danh mục các loại thuốc thú y và một số hợp chất tổng hợp bị cấm sử dụng trong chăn nuôi [24] Danh mục này áp dụng cho cả các loại thuốc sản xuất trong nước và nhập khẩu Đứng đầu danh sách này là Clenbuterol, Salbutamol, Cimaterlo và các muối của chúng đã bị cấm sử dụng trong mọi loại thức ăn chăn nuôi

Tại Hồng Công, Trung Tâm Y tế công cộng đã đưa ra quy định về các chất cấm trong thú y bao gồm Clenbuterol, Salbutamol và các hóa chất nông nghiệp khác đồng thời nghiêm cấm mua bán các loại thịt và nội tạng động vật bị nhiễm độc [26] Các văn bản pháp luật liên quan đến vấn đề này có hiệu lực từ ngày 31 tháng 12 năm 2001 Việc thử nghiệm trước khi giết mổ lợn được thực hiện ngay tại các lò mổ nhằm bảo đảm an toàn đối với thực phẩm trước khi đưa ra thị trường Trung bình, mỗi năm có hơn 60000 mẫu nước tiểu lợn được kiểm tra, tất cả các lô hàng có kết quả dương tính đều bị tiêu hủy

Tại Malaysia, trong những năm qua đã có sự gia tăng đột biến về việc sử dụng Salbutamol trong thức ăn gia súc nhằm tăng độ nạc và giảm tỉ lệ mỡ trong các loại vật nuôi [27] Trung tâm kiểm soát chất kích thích của trường đại học Sains Malaysia đã đưa ra báo cáo vào tháng 1 năm 2007 về việc xác định tồn dư Salbutamol trong mẫu thịt bò, lợn, cừu và thịt vịt Kết quả cho thấy, Salbutamol có mặt trong 2 trên tổng số hơn 100 mẫu được phân tích Năm 1996, Malaysia đã cấm

sử dụng toàn bộ các chất thuộc nhóm β-agonist

1.1.3 Vấn đề sử dụng Salbutamol ở Việt Nam

Theo thông tư 57 ngày 7.11.2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn quy định việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist trong chăn nuôi

Theo quyết định về một số loại kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi ban hành ngày 20/06/2002 của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, Salbutamol là một trong những chất bị cấm sử dụng hoàn toàn [1, 2] Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi đang là một vấn đề nóng ở Việt Nam, đặc biệt là tại khu vực phía Nam Vật nuôi ăn thức ăn chứa Salbutamol được bài tiết dần qua nước tiểu, nhưng vẫn tích tụ trong gan, thận, thịt Đây cũng là nguyên nhân khiến người tiêu dùng bị ngộ độc khi sử dụng thực phẩm nhiễm Salbutamol Gần đây, việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi đang có chiều hướng gia tăng đáng báo động ở các địa phương Điều này không chỉ có tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng mà còn làm phương hại đến sản xuất ngành chăn nuôi trong nước, nhất là trong lúc sức ép của các loại thực phẩm ngoại nhập đang ngày một gia tăng

Tại cuộc họp báo vào ngày 31/8/2015, Bộ NN-PTNT đã công bố kết quả kiểm tra việc sử dụng chất cấm trong chăn nuôi, đoàn đã phát hiện nhiều cơ sở chăn nuôi sử dụng chất tạo nạc Salbutamol Tại thành phố Hồ Chí Minh, cơ quan chức năng kiểm tra đột xuất 227 mẫu lợn giết mổ, phát hiện 31 mẫu dương tính với Salbutamol Phần lớn tỷ lệ mẫu lợn tồn dư Salbutamol có xuất xứ từ trang trại chăn nuôi ở Đồng Nai, Long An, Tiền Giang, Tây Ninh, Bến Tre…Cũng tại thành phố

Hồ Chí Minh, theo Chi cục Thú y, đoàn thanh tra đã kiểm tra đột xuất trên 61 lô lợn tại 10 lò giết mổ trên địa bàn thành phố Kết quả cho thấy có 12 lô dương tính với Salbutamol, trong đó lợn xuất xứ từ Đồng Nai dẫn đầu với năm lô dương tính với Salbutamol

Qua kiểm tra, đoàn thanh tra liên ngành ở Đồng Nai đã phát hiện ba cơ sở chăn nuôi ở thành phố Biên Hòa sử dụng Salbutamol Các cơ sở này đều bị xử phạt hành chính và cấm xuất bán lợn ra thị trường nếu chưa được sự cho phép của cơ quan thú y tỉnh

Để chấn chỉnh tình trạng này, cần kiểm tra thức ăn chăn nuôi và nhất là nước tiểu vật nuôi ở giai đoạn vỗ béo, trước khi xuất bán tại các trang trại chăn nuôi nhằm phát hiện, ngăn chặn vật nuôi có sử dụng chất cấm đưa ra thị trường Còn tại các lò mổ, chợ cần kiểm tra các mẫu thịt, gan, thận trước khi đến tay người tiêu dung, đảm bảo sức khỏe của người dân

1.2 Các phương pháp xác định Salbutamol

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định Salbutamol trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau (nước tiểu, thịt lợn, huyết thanh, dược phẩm ) như: điện hóa, ELISA [16], sắc ký, điện di mao quản Khoảng tuyến tính, các giá trị LOD, LOQ, hiệu suất thu hồi, sai số tương đối của mỗi phương pháp cho kết quả tương đối tốt

1.2.1 Phương pháp điện hóa

Xiaoyun Lin và các cộng sự đã nghiên cứu một loại điện cực mới phân tích các β-agonist Sự có mặt của Ractopamin và Salbutamol trong các mẫu thịt lợn và mẫu nước tiểu người được Muniyandi Rajkumar và các cộng sự nghiên cứu và phát triển bằng việc sử dụng quy trình chế tạo điện cực màng cacbon thuỷ tinh biến tính với poly taurine/hạt nano Zirconi (ZrO2) [18] Trong phương pháp vôn-ampe quét thế tuyến tính, poly taurine/hạt nano Zirconi (ZrO2) được trực tiếp sử dụng để xác định Ractopamin và salbutamol Thế oxi hoá hấp phụ của Ractopamin là 0,65V và của salbutamol là 0,71V trên bề mặt điện cực Điện cực biến tính xác định được tín hiệu oxi hoá của Ractopamin trong khoảng tuyến tính từ 1 đến 28 μM và salbutamol

trong khoảng tuyến tính từ 5 đến 220 μM Điện cực này cũng có thể dùng để xác định tín hiệu của Ractopamin (1 - 26μM) trong các mẫu thịt lợn và salbutamol (1 -114μM) trong các mẫu nước tiểu của người

1.2.2 Phương pháp ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Nguyên lý của phương pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol là dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng thể- kháng nguyên Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu sẽ biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) Tuy nhiên các thiết bị này đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và chỉ có ở các phòng thí nghiệm hiện đại

J Pleadin, A Vulic, N Persi cùng với các cộng sự đã nghiên cứu là đánh giá

sự của enzyme liên kết xét nghiệm miễn dịch (ELISA) trong việc xác định sự có mặt của các b-agonist clenbuterol và salbutamol trong huyết tương và huyết thanh động vật Phương pháp có độ thu hồi và độ lặp cao (trên 70%) [16], Cho thấy ELISA có thể áp dụng cho việc xác định định lượng của cả hai chất phân tích trong

cả huyết tương và huyết thanh, tốt nhất trong huyết tương Ông đã xác định và kiểm soát nồng độ của clenbuterol và salbutamol trong huyết thanh và huyết tương

mà không cần chuẩn bị mẫu Trong quá trình xác nhận, cho cả hai phân tích, các LOD và LOQ tính được là 0,3 và 0,6 mg / L trong huyết tương và 0,5 và 1,0 mg /

L trong huyết thanh tương ứng Độ thu hồi của hai chất trong các mẫu huyết thanh

là 77,9 và 74,2% và độ lặp lại của 75,6 và 71,8%, đối với các mẫu huyết tương là 83,1 và 75,4%, và độ lặp lại tỷ lệ 80,0 và 74,9%, tương ứng

Các kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng một phương pháp ELISA là phương pháp nhanh chóng, dễ thực hiện và phù hợp cho việc xác đinh bán định lượng b-agonist trong huyết thanh động vật và mẫu huyết tương

1.2.3 Các phương pháp sắc ký

Phương pháp phổ khối được sử dụng rộng rãi để xác định lượng vết dư lượng các chất hữu cơ và các chất gây ô nhiễm cụ thể là phương pháp sắc kí khí và sắc kí lỏng kết hợp với phương pháp khối phổ được sử dụng để xác định β–agonist trong các nền mẫu

1.2.3.1 Các phương pháp sắc ký lỏng

Việc kết hợp hệ tách HPLC và một detector như MS đã tạo thành hệ xác đinh β-agonist hiệu quả và đang ngày càng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện đại Nhiều công trình nghiên cứu theo hướng này đã đạt được những thành tựu nhất định trong việc định lượng các β-agonist cũng như sự có mặt của chúng trong các mẫu dược phẩm, thực phẩm

Mukesh Maithani và Ranjit Singh đã nghiên cứu và phát triển một phương pháp xác định đồng thời Salbutamol Sulphate và Theophyllinebằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC (PerkinElmer loại 200) [17] Dụng cụ được trang bị một loạt mô hình 200 máy bơm, máy hút khử khí, detector UV-Visible và C-18 cột được sử dụng Điều kiện sắc ký : Pha động bao gồm acetonitrile và đệm photphat 65:35 (v / v) (pH 4,2 ± 0,02, điều chỉnh với trietylamine) Pha động được âm trong 30 phút và lọc qua một giấy lọc màng 0,45 μ Tốc độ dòng chảy của pha động là 1,2 mL/phút

và bước sóng sử dụng là 235 nm

Để xác định độ tuyến tính của phương pháp tác giả đã nghiên cứu ở bảy nồng

độ khác nhau (2, 4, 8, 16, 32, 48 và 64 mg/ml) Của hai loại thuốc đùng trong nghiên cứu Kết quả của HPLC được đưa ra như sau Khoảng nồng độ tuyến tính là 2-64 mg/ml cho cả hai loại thuốc Các phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng cho Salbutamol Sulphate và Theophyllinelàtìm thấy là y = 6191.4x + 3064,7 và y = 6370.7x - 1993,7.Các giá trị hệ số hồi quy R2 là 0,9999 và 0,9996 Độ thu hồi của Salbutamol Sulphate và Theophylline là 99,41 và 101,11 Kết quả cho thấy rằng

không có sự ảnh hưởng của các tá dược Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là 0,40mg/ml và 0,75mg/ml cho Salbutamol Sulphate và 0,55 và 0,80 mg/ml cho Theophylline

1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường (E) nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các β-agonist trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau Weiyu Wang và các cộng sựđã tách và xác định thành công đồng thời 5 β-agonist

có trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu và gan của lợn (clenbuterol, metoprolol, Ractopamin, isoxsuprine and salbutamol) sử dụng phương pháp điện di mao quản với sự phát hiện của detector điện hóa [23] Điều kiện điện di được thực hiện với đệm H3BO3–Na2B4O7 100mM (pH =9), điện thế tách là 14kV và thời gian cho

quá trình điện di là 15 phút Giá trị LOD, LOQ của salbutamol là 0,17 μg/ml và 0,59 μg/ml

Trong một bài báo khác, Tianshu Zhou và các cộng sự [21] đã ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo dòng (CE-AD) để xác định các β–agonist: adrenaline, salbutamol và salmeterol trong huyết thanh Trong công trình nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng đệm phosphat 0,06 mol/l ở pH = 5,5 với thế

áp vào hai đầu mao quản là 12kV và thời gian bơm mẫu là 8s Phương pháp có độ chính xác khá tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 92,2 † 99,5%, RSD < 4,71%

Fabiana S Felix và các cộng sự [15] sử dụng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để tách và định lượng salbutamol có trong các sản phẩm thuốc dạng xi-rô với thành phần dung dịch đệm

là 10mM CH3COOH/CH3COONa (pH = 4,9), dung dịch tetraethylammonium (TEA) được dùng làm chất nội chuẩn, thế áp vào hai đầu mao quản là 28kV, thời gian bơm mẫu là 25s và ở độ cao 10cm Kết quả thu được với khoảng tuyến tính từ 7,0.10-5 † 3,0.10-4 mol/l, giới hạn phát hiện của salbutamol là 1,0x10-5 mol/l, giới hạn định lượng là 3,3.10-5 mol/l Phương pháp có độ lặp lại khá tốt (RSD = 4,7% với n =10 tại mức nồng độ 7,0.10-5mol/l)

Gần đây, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt như hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít… Phương pháp đã được ứng dụng để tách

và xác định các β-agonist trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau [9, 15]

1.3 Phương pháp xác định Salbutamol bằng CE-C 4

D

1.3.1 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của hệ CE cơ bản

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH và trong tác dụng của điện trường (E) nhất định do thế (V) đặt vào hai đầu mao quản sinh ra [4, 6]

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản

Một hệ thiết bị CE cơ bản bao gồm các bộ phận:

- Mao quản tách: thường làm bằng vật liệu silic gọi là mao quản silica, là loại mao quản phổ biến nhất, với đường kính ngoài (OD) 365 μm, đường kính trong (ID)

từ 10 đến 150 μm (thường là 50 μm) Tổng chiều dài mao quản có thể từ 10 đến 100

cm (thường là 60 cm) Chiều dài hiệu dụng (là chiều dài tính từ đầu bơm mẫu của mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ 25 – 50 cm đối với mao quản dài 60 cm Trong quá trình điện di, mao quản được nạp đầy dung dịch đệm điện di

- Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di

- Nguồn điện thế cao: thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra

- Detector (cảm biến): bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình phân tách điện di mao quản, do đó thường được đặt ở phần cuối (gần cuối hoặc cuối) của mao quản tuỳ theo loại cảm biến Các loại cảm biến thông dụng trong phương pháp CE bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo thế và đo độ dẫn

- Bộ phận điều khiển: thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích Hiện nay, bộ phận này còn có

thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản

1.3.2 Giới thiệu về detector đo độ dẫn không tiếp xúc C 4 D

Trong phương pháp điện di mao quản, detector đo độ dẫn là một trong những loại detector rất được chú ý, tuy có độ nhạy thấp hơn so với hai kĩ thuật điện hóa khác nhưng lại có ưu điểm là detector đa năng có thể dùng cho rất nhiều loại chất phân tích khác nhau Detector này có thể thu nhỏ, thuận lợi khi kết hợp với các mao quản có đường kính hẹp, thậm chí với các microchip mà không ảnh hưởng đến độ nhạy và các tính chất khác của detector

Detector đo độ dẫn không tiếp xúc (C4

D) với thiết kế hai điện cực đồng trục xuất hiện lần đầu trên thế giới vào năm 1998 Dựa trên thiết kế này, năm 2002 nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ) đã phát triển thành công dòng sản phẩm C4D với nguồn điện thế kích thích xoay chiều cao (HV-C4D, 200V) Hãng điện tử eDAQ của Úc sau đó đã phối hợp cùng nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser để phát triển dòng sản phẩm C4D thương phẩm

C4D có nhiều tính năng nổi trội như:

- Điện cực không cần tiếp xúc với dung dịch đo nên tránh được hiện tượng

ăn mòn làm hỏng điện cực

- Thể tích mẫu đo rất nhỏ, chỉ vài nl

- Là detector vạn năng có khả đáp ứng với tất cả các hợp phần mang điện tích trong môi trường nước

- Khác với detector UV, vốn chỉ có thể cố định tại một điểm nơi có cửa sổ quang trên cột tách, C4D có thể đặt ở bất kì vị trí nào bằng cách di chuyển tùy ý dọc theo cột phân tích

- Có thể dùng cho tất cả các cột tách với vật liệu chế tạo khác nhau, đây cũng

là lợi thế của C4

D so với detector UV, vốn chỉ phù hợp với những cột trong suốt Ngoài ra, C4D không yêu cầu tạo cửa sổ quang trên cột tách silica nóng chảy nên giảm thiểu nguy cơ gẫy cột như thường xảy ra với detector đo quang

- Độ nhạy của C4D không phụ thuộc vào đường kính cột tách nên có thể sử dụng được với mao quản nhỏ hơn 25m để tăng hiệu quả tách chất trong khi detector UV, cột mao quản phải có đường kính trong tối thiểu là 50 m mới tạo dủ

độ dài đường truyền quang

- Đặc biệt là C4D có khả năng thu nhỏ, vận hành được bằng ắc quy và có thể

tự chế tạo được với cơ sở hạ tầng của các xưởng điện tại Việt Nam

Chính vì những tính năng trên mà C4D đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong CE

1.3.3 Một số công trình xác định Salbutamol bằng CE

Gần đây, có nhiều công trình khoa học, bài báo trong nước và quốc tế đã được công bố về các kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp CE để xác định các β-agonist nói chung và Salbutamol nói riêng trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

Trong một nghiên cứu gần đây, nhóm nghiên cứu của khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã sử dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) xác định đồng thời Metoprolol, Ractopamine, Sabutamol có trong mẫu dược phẩm và mẫu thức ăn chăn nuôi [20] Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã xác định được các điều kiện tối ưu để xác định Metoprolol, Ractopamine, Sabutamol là: mao quản silica (đường kính trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60 cm), dung dịch đệm điện di: Arginine (10mM)/Axit axetic pH = 4,9 bơm mẫu thủy động lực học kiểu xiphông ở

độ cao 10 cm, thời gian bơm mẫu 20 s, thế tách 18 kV Với điều kiện tối ưu trên nhóm tác giả đã xác định được giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,5 ppm và 1,7 ppm, hiệu suất thu hồi trong khoảng 98,8% - 103,7% Từ

đó tiến hành áp dụng vào mẫu thực tế là các mẫu thuốc và thức ăn chăn nuôi Mẫu thuốc dạng xiro chứa Salbutamol sulfate (Solmux Broncho của dược phẩm quốc tế, Bình Dương, Việt Nam) được pha loãng với nước deion Mẫu thuốc dạng viên nén

5 mg (Dorpharma, Hà Nội và Plendil Plus, AstraZeneca AB, Sodertalje, Thụy Điển) được nghiền thành bột và sau đó hòa tan với 5 ml nước deion (cho viên có chứa Salbutamol) hoặc 5 ml MeOH (cho viên có chứa metoprolol) Các dung dịch thu

được cho rung siêu âm 10 phút và lọc qua màng 0,45 µm Đối với mẫu chứa metoprolol phải thêm một bước ly tâm ở 8000 rpm trong 10 phút để kết tủa tá dược trước Mẫu thức ăn chăn nuôi lợn (lấy 2 g) được nghiền thành bột pha loãng 10 ml hỗn hợp MeOH/H2O (v/v 4/1) sau đó xoáy trộn đều Hỗn hợp thu được rung siêu

âm trong 2 h sau đó lọc qua màng 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống CE

Trên thế giới, Weiyu Wang và các cộng sự đã tách và xác định thành công đồng thời 5 β-agonist có trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu và gan của lợn (Clenbuterol, Metoprolol, Ractopamin, Isoxsuprine and Salbutamol) sử dụng phương pháp điện di mao quản với sự phát hiện của detector điện hóa [23] Điều kiện điện di được thực hiện với đệm H3BO3–Na2B4O7 100 mM (pH =9), điện thế tách là 14 kV và thời gian cho quá trình điện di là 15 phút Giá trị LOD, LOQ của Salbutamol là 0,17 μg/ml và 0,59 μg/ml

Peter Mikus, Iva Valášková, Emil Havránek đã phát triển, sử dụng phương pháp điện di mao quản (CE) để tách, xác định Salbutamol trong dược phẩm (xirô, dung dịch uống, viên nén) và trong chất lỏng sinh học (nước tiểu, huyết thanh) [15] Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nghiên cứu bao gồm chất tạp, nồng độ của các ion mang, ion đối và độ pH của hệ đệm Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của Salbutamol tương ứng là 1,30 ppm và 4,33 ppm; RSD

là 1,31%

Trong một bài báo khác, Tianshu Zhou và các cộng sự đã ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo dòng (CE-AD) để xác định Adrenalin, Salbutamol và Salmeterol trong huyết thanh [21] Trong công trình nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng đệm photphat 0,06 mol/l ở pH = 5,5 với thế áp vào hai đầu mao quản là 12 kV và thời gian bơm mẫu là 8 s Phương pháp có độ chính xác khá tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 92,2 † 99,5%, RSD < 4,71%

Fabiana S Felix và các cộng sự [15] sử dụng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) để tách và định lượng Salbutamol có trong các sản phẩm thuốc dạng xirô với thành phần dung dịch đệm là

10 mM CH3COOH/CH3COONa (pH = 4,9), dung dịch tetraethylammonium (TEA)

được dùng làm chất nội chuẩn, thế áp vào hai đầu mao quản là 28 kV, bơm mẫu ở

độ cao 10 cm trong thời gian là 25 s Kết quả thu được với khoảng tuyến tính từ 16,74† 71,7 ppm, giới hạn phát hiện của Salbutamol là 2,39 ppm, giới hạn định lượng là 7,89 ppm Phương pháp có độ lặp lại khá tốt (RSD = 4,7% với n =10 tại mức nồng độ 16,74 ppm)

Các công trình nghiên cứu trên đều đưa ra phương pháp nghiên cứu với những điều kiện khác nhau để phân tích các hợp chất β-agonist nói chung và Salbutamol nói riêng trong mẫu dược phẩm, thực phẩm, huyết thanh, thịt lợn, nước tiểu… Mỗi phương pháp trên đều có những, ưu nhược điểm riêng và tùy từng trường hợp cụ thể mà các nhà phân tích sẽ lựa chọn phương pháp thích hợp Trong

đề tài này, nhằm mục tiêu hướng đến xây dựng một phương pháp phân tích nhanh, đơn giản, hiệu quả, chúng tôi tập trung nghiên cứu phương pháp làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn nhằm ứng dụng xác định lượng nhỏ Salbutamol trong các mẫu vật nuôi và dư lượng Salbutamol trong các mẫu thực phẩm thành phẩm bằng phương pháp CE-C4D

1.4 Các phương pháp làm giàu chất phân tích

Trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu trước [20] đã đưa ra giới hạn phát hiện Salbutamol bằng phương pháp điện di mao quản là 0,5 ppm còn giới hạn định lượng là 1,7 ppm Tuy nhiên, thực tế phân tích cho thấy hàm lượng Sabutamol trong nước tiểu lợn và thịt lợn đều thấp hơn giới hạn phát hiện này nhiều nên để đạt được mục tiêu xác định hàm lượng của Salbutamol trong mẫu thực là khó khăn Việc làm giàu Salbutamol trước khi phân tích bằng phương pháp CE vì thế là rất cần thiết Có nhiều phương pháp làm giàu chất phân tích khác nhau nhưng phương pháp thông dụng, đơn giản nhất là phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn SPE

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự phân bố chất tan khi giữa hai pha không trộn lẫn, thường là các dung môi hữu cơ và nước [7]

Sự lựa chọn các dung môi hữu cơ phải đáp ứng các yêu cầu sau:

- Dung môi phải không trộn lẫn với nước

- Các chất cần tách phải hòa tan trong dung môi này và khả năng hòa tan trong dung môi phải lớn hơn trong nước

- Tỷ trọng của dung môi này phải lớn hơn nước khi chiết rút được tách ra trong phễu chiết hoặc một dụng cụ tách chiết liên tục chất lỏng – chất lỏng, ngược lại dung môi phải có tỷ trọng nhỏ hơn nước khi sự tách chiết vi phân trong bình thủy tinh nhỏ

Phụ thuộc vào sự trộn lẫn của mẫu chất lỏng với dung môi, các chất cần tách

sẽ hòa tan vào trong dung môi chiết.Hệ số phân bố sẽ tương ứng tỷ lệ của các chất hòa tan trong dung môi theo các công thức:

P = Cdung môi/Cnước

Vì P không phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích và là hằng số ở nhiệt độ nhất định nên khi tăng thể tích dung môi chiết thì lượng chất hòa tan vào chúng sẽ tăng Trong trường hợp thể tích dung môi chiết không thay đổi, chia nhỏ và chiết nhiều lần cũng

sẽ tăng hiệu quả của quá trình tách chiết

Yung Yang và các cộng sự [25] đã dùng phương pháp sắc ký lỏng hai lần để tách và xác định Salbutamol, Salmeterol và Atenololby sau khi chiết lỏng lỏng Độ thu hồi chất phân tích từ 82-90% trong các mẫu nước tiểu Tác giả lấy 2 hoặc 3 ml nước tiểu điều chỉnh về pH 6,0 bằng ammonium acetat 200 mM, sau đó lắc xoáy đều, đun nóng đến 550C trong 2 giờ rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng Cuối cùng, dịch chiết được bơm vào cột HILIC (cột sắc kí lỏng ưa nước) để định lượng Phương pháp đã đạt được giới hạn phát hiện và định lượng lần lượt nằm trong khoảng 0,12 † 0,27 ppm và 0,24 † 0,90 ppm Tuy nhiên, việc chiết lặp hai lần tốn nhiều thời gian, dung môi hơn và phương pháp chủ yếu chỉ áp dụng cho những chất

có độ phân cực thấp

1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE)

Chiết pha rắn (SPE: Solid - Phase Extraction) được ra đời vào giữa những năm 1970, nhưng mãi đến năm 1998 thuật ngữ „„chiết pha rắn“ mới được công nhận trên toàn thế giới

Chiết pha rắn đang được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích do những

ưu điểm sau:

+ Hiệu suất thu hồi cao

+ Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch

+ Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất

+ Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành loạt

+ Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn

Từ đó đến nay chiết pha rắn được phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực phân tích, đặc biệt là phân tích lượng vết trong các mẫu môi trường, thực phẩm

1.4.2.1 Nguyên tắc của chiết pha rắn

Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp phụ pha rắn với các cơ chế khác nhau Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau, trong đó mẫu phân tích ở dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), còn chất chiết ở dạng rắn, hạt nhỏ, xốp, đường kính 25 – 70 μm Chất chiết được gọi là pha tĩnh (pha rắn), và được nhồi vào một cột chiết nhỏ hoặc đĩa Chất chiết là các hạt Silica trung tính, các hạt ôxit nhôm, hay các Silicagen trung tính đã bị alkyl hoá nhóm –OH bằng nhóm mạch cacbon thẳng –C2, -C4, -C8, -C18, hay nhân phenyl Nó được chế tạo trong điều kiện giống như pha tĩnh của sắc ký HPLC, và các hạt này có độ xốp lớn, với diện tích bề mặt xốp thường từ 50 – 300

m2/gam

Khi xử lý mẫu, dung dịch phân tích được dội lên cột chiết, pha tĩnh sẽ tương tác với các chất trong dung dịch phân tích và giữ một nhóm chất phân tích lại trên cột (trên pha tĩnh), còn các nhóm chất khác sẽ đi ra khỏi cột cùng với dung môi hoà tan mẫu và khi đó nhóm chất cần phân tích sẽ được thu lại trên pha tĩnh (chất chiết rắn) Sau đó dùng một dung môi thích hợp hoà tan tốt các chất phân tích để rửa giải chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết) sẽ thu được dung dịch có chất phân tích để xác định theo một phương pháp phân tích công cụ đã chọn

Theo đặc điểm và bản chất của sự chiết, các chất chiết pha rắn được chế tạo

và phân chia theo các loại chất:

• Loại hấp phụ pha thường: các silica trung tính và oxit nhôm

• Hấp phụ pha ngược: các silica thường được alkyl hoá nhóm-OH

• Loại chất trao đổi ion để tách cation và anion

• Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước của phân tử chất

• Loại chất hấp phụ khí (purge and trap extraction), để hấp thụ chất khí

1.4.2.2 Cơ chế của chiết pha rắn

Chính vì có nhiều loại chất chiết pha rắn nên kỹ thuật chiết pha rắn cũng có nhiều cơ chế và quá trình động học khác nhau, theo bản chất của mỗi loại chất chiết (pha chiết) Nói chung, các chất chiết pha rắn cũng tương tự như các pha tĩnh trong sắc

lý lỏng hiệu năng cao (HPLC) Do đó, chiết pha rắn cũng có 3 loại cơ chế chính là:

Cơ chế 1: Hấp phụ pha thường (loại NP)

Trong kiểu chiết này, pha rắn là các silica trung tính, có bề mặt phân cực, tác dụng tốt với các chất mẫu không phân cực và ít phân cực, đó là sự tương tác hấp phụ của pha tĩnh: chất chiết rắn trong cột Tùy theo bản chất, cấu trúc phân tử mỗi nhóm chất phân tích, bản chất hấp phụ của silica trung tính và các điều kiện thực hiện sự tách mà các nhóm chất phân tích bị pha tĩnh hấp phụ và bị giữ lại trên cột Cơ chế của

sự tương tác này hoàn toàn tương tự như cơ chế tương tác trong HPLC pha thường và xảy ra chủ yếu với các chất hữu cơ và các hợp chất phức theo cân bằng

Xi + SPEx ↔ Xi.SPEx Dung môi rửa giải chất phân tích trong loại này thường là các dung môi hữu

cơ không hay ít phân cực và kỵ nước hoặc hỗn hợp của chúng theo tỷ lệ thích hợp như: n-hexane, n-heptane, CCl4, CHCl3, CH2Cl2, benzen Các dung môi này được gọi là pha động và phải hòa tan tốt chất phân tích.Với các chất tan Xi ở dạng phân

tử trung hòa điện tích, không phân cực và ít phân cực

Cơ chế 2: Hấp phụ pha đảo (NP)

Trong kiểu chiết này, pha tĩnh là silica được ankyl hóa nên có bề mặt không phân cực, pha tĩnh tương hợp tốt với các chất không phân cực hay phân cực kém Tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh và pha động phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích (độ phân cực, kích thước, cấu trúc), pha tĩnh (độ phân cực, diện tích

bề mặt riêng ) và pha động (độ phân cực, thành phần, tốc độ chảy ) Tương tác này tương tự với tương tác của pha tĩnh-pha động-chất tan gặp trong HPLC pha đảo Dung môi rửa giải sử dụng trong kiểu chiết pha rắn pha đảo này là các dung môi có tính phân cực như nước, acetonitril, methanol, ethylacetate

Cơ chế 3: Trao đổi ion và cặp ion đối với các chất dạng ion (loại Iex)

Kiểu chiết này dựa trên cơ sở của quá trình tương tác của chất phân tích với ion đối (của chất trao đổi ion-pha tĩnh) Chất phân tích sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh và

sẽ được rửa giải bằng một pha động thích hợp

Chất trao đổi ion của kiểu chiết này có thể có hai loại sau:

+ Trao đổi cation acid mạnh (gốc R-SO3Na) và acid yếu (R-COONa)

+ Trao đổi anion bazơ mạnh (gốc R-NR‟3OH) và bazơ yếu (R-NHOH)

Cơ chế trao đổi loại cation :

Support-SO3Na + Men+ support-(SO3)nMe + n Na+

Cơ chế trao đổi loại anion:

Support-NR3OH + Xn- support-(NR3)nX + nOHTrong quá trình trao đổi, tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích và pha tĩnh

-mà quá trình có thể được thực hiện tốt trong một khoảng pH nhất định nào đó

Bên cạnh cơ chế trao đổi anion và cation; trong chiết pha rắn còn có cơ chế chiết theo kiểu cặp ion (ion-pair), hoàn toàn tương tự như sắc ký cặp ion của hệ pha đảo (RP-HPLC) Pha tĩnh ở đây là chất trao đổi pha ngược

Cơ chế 4: Rây phân tử theo độ lớn của chất phân tích (Gel)

Chất chiết ở đây là các hạt silica (pha thuận hay pha đảo) có lỗ xốp lớn Sự tách chiết theo kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của chất phân tích khi mẫu được cho qua pha tĩnh trong cột chiết Các phân tử kích thước nhỏ sẽ bị dồn ép vào phía sâu trong cùng của lỗ xốp, các phân tử kích thước lớn sẽ

ở phía ngoài Các phân tử có kích thước to hơn lỗ xốp sẽ nằm bên ngoài hạt pha tĩnh Như vậy khi rửa giải, các phân tử có kích thước lớn sẽ được rửa giải ra trước và tuần tự theo đó sẽ là các phân tử có kích thước nhỏ dần Đây chính là cơ sở của sự tách chiết bằng kỹ thuật rây phân tử Kĩ thuật chiết này chủ yếu chỉ dùng cho các

chất cao phân tử, có M > 1000 đvC, như protein, DNA, lipit,…

Các điều kiện chiết pha rắn: Quá trình chiết ở đây thực chất vẫn là quá trình phân bố của một chất trên hai pha tĩnh (pha rắn) và động (pha lỏng hay khí) trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ, pH, tốc độ chảy dung môi qua cột chiết Như vậy hệ số phân bố KD của một chất trên hai pha cũng là yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết nên chiết pha rắn phải có các điều kiện sau:

• Pha rắn hay chất chiết (dạng cột chiết hay đĩa chiết) phải có tính chất hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với một chất, hay một nhóm chất phân tích nhất định, tức

là tính chọn lọc của pha tĩnh chiết

• Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao theo yêu cầu của cấp hàm lượng phân tích

• Hệ số phân bố nhiệt động KD của cân bằng chiết phải lớn, để có được hiệu suất chiết cao

• Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích

• Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch, để còn có thể rửa giải được tốt chất phân tích ra khỏi pha chiết bằng một pha động phù hợp

• Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết bởi bất kỳ

- Loại chứa các chất như silica, florisil, amino alumina,… có gắn các nhóm như –OH, -NH2, -CN chủ yếu dùng để tách các chất tương đối phân cực Phần lớn

được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột gắn –CN có thể sử dụng trong pha đảo)

- Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation) theo cơ chếtrao đổi ion và cặp ion đối với các chất dạng ion (loại Iex) Kiểu chiết này dựa trên cơ sở của quá trình tương tác của chất phân tích với ion đối (của chất trao đổi ion-pha tĩnh) Chất phân tích sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh và sẽ được rửa giải bằng một pha động thích hợp Có hai loại là trao đổi cation acid mạnh và trao đổi anion bazơ mạnh Trong quá trình trao đổi, tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích và pha tĩnh mà quá trình có thể được thực hiện tốt trong một khoảng pH nhất định nào đó

-Loại cột chứa các silicagel được ankyl hóa hoặc sulfonat hóa để tách các hợp chất ion (cột MAX tách anion, cột MCX tách cation)

-Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C2, cyclophenyl… là silic ghép các nhánh không phân cực dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cựctheo

cơ chế hấp phụ pha thường (loại NP), trong kiểu chiết này, pha rắn là các silica trung tính, có bề mặt phân cực, tác dụng tốt với các chất mẫu không phân cực và ít phân cực, đó là sự tương tác hấp phụ của pha tĩnh

1.4.2.4 Một số công trình làm giàu Salbutamol bằng chiết pha rắn

Chen Huijing và các cộng sự [13] đã nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời 25 beta-agonist Các chất phân tích được làm sạch bằng chiết lỏng-lỏng

và chiết pha rắn SPE, sau đó định lượng bằng sắc kí lỏng ghép ion hóa khối phổ UPLC-ESI-MS/MS Cân 2 g thịt heo trên cân phân tích (± 0,01 g) cho vào ống 15

ml, thêm 8 ml dung dịch natriacetat 0,2 M (pH 5.2) và 100 ml β-glucuronidat sau

đó lắc vortex trong 2 phút Tiếp theo thủy phân ở 37°C trong 16 giờ, loại cặn lấy dung dịch lắc 15 phút, ly tâm 4000 rpm trong 10 phút Lấy dịch trong điều chỉnh pH xuống 1 ± 0,3 bằng acid percloric, sau đó đem ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút Thu dịch trong điều chỉnh pH đến 11 bằng NaOH Sau đó thêm 10ml isopropanol-ethyl acetat (60:40), lắc 5 phút và ly tâm với tốc độ 4000 rpm trong 5 phút, thu phần hữu cơ, làm khô ở 40°C bằng dòng khí nitơ, hòa tan cặn bằng 5 ml

dung dịch natri acetat 0,2 M (pH 5,2) rồi cho chảy qua cột SPE Cột SCX được hoạt hóa bằng 3 ml methanol và 3 ml nước Sau đó nạp 5 ml mẫu thu được ở trên với tốc

độ (khoảng 1 ml/phút), rửa cột bằng 2 ml nước, 2 ml axit formic 2% trong nước, cuối cùng rửa giải bằng 5 ml dung dịch methanol (95/5 v/v) với tốc độ chảy 1 ml/phút Sau đó dung dịch thu được sấy khô bằng nitơ ở 40°C Cuối cùng hòa tan cặn bằng 1 ml axit formic 0,1% trong dung dịch nước/trile (90/10 v/v) Mẫu thu được phân tích bằng sắc ký phân tích UPLS-ESI MS/MS Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện (LOD) của Salbutamol nằm trong khoảng 0,02†0,05 ppb, hiệu suất thu hồi trong khoảng 78-101%, giá trị RSD là 1,8-7,2%

Tomasz Sniegocki và các cộng sự [22] đã đưa ra phương pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong mẫu nước tiểu động vật bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ GC-MS Mẫu nước tiểu trước khi được bơm vào GC-MS được làm sạch cặn và làm giàu chất phân tích bằng kĩ thuật chiết pha rắn (SPE) Lấy 10 ml nước tiểu, thêm 10 ml dung dịch đệm (pH= 7), rồi đem ly tâm ở 4000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Cột SPE được hoạt hóa bằng 2 ml methanol, 2 ml nước, 2 ml đệm photphat sau đó nạp mẫu nước tiểu ở trên, tiếp theo rửa cột bằng 1ml dung dịch acid acetic, 6 ml methanol Hút khô cột trong 5 phút, rửa giải bằng 5 ml axetyl axetat với amoniac (4%), thu dịch rửa giải đem sấy khô bằng dòng khí nitơ ở 45°C cuối cùng hòa tan cặn bằng 300 ml methanol Sau đó thêm 20 µl BSTFA có chứa 1% TMCS, đun nóng ở 65°C trong 1,5 giờ, dịch thu được đem phân tích bằng GC-

MS Kết quả thu được cho giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

là 0,022 ppb và 0,037 ppb với Clenbuterol còn Salbutamol là 0,024 ppb và 0,041 ppb Hiệu suất thu hồi tương ứng là 68,8% và 69,6%

Một phương pháp khác để xác định đồng thời dư lượng của 11 β2-agonist bao gồm Clenbuterol, Salbutamol, Ractopamine, Terbutaline, Salmeterol, Propranolol, Tulobuterol, Cimaterol, Mabuterol, Mapenterol và Zilpaterol trong thịt lợn đã được Andy Zhai phát triển và xác nhận [10] Các chất phân tích được chiết xuất bằng cách chiết lỏng-lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) và định lượng bằng sắc

ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ (LC-ESI-MS/MS) Cân 5 g thịt lợn (± 0,01 g)

vào ống 50 ml, thêm 20 ml dung dịch natriacetat 0,2 M (pH 5,2) và 250 µl β glucuronidase (1000 U/ml), lắc vortex trong 2 phút, thủy phân ở 37°C trong 16 giờ sau đó ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút hút dịch trong phía trên cho vào một ống ly tâm, thêm 5 m axit percloric 0,1 M điều chỉnh pH đến 1 ± 0,3 rồi đem ly tâm ở 4000 rpm trong 10 phút sau đó được chuyển đến ống ly tâm khác và điều chỉnh pH lên 11 bằng natrihidroxit 10M, thêm tiếp 10ml isopropanol-ethyl acetat (60:40) lắc trong 5 phút, ly tâm ở 4000 rpm trong 5 phút lấy dịch trong đem cô khô bằng dòng khí nitơ

ở 40°C cuối cùng hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch natriacetat 0,2 M (pH 5,2) Các mẫu sau đó đã sẵn sàng cho SPE đề làm sạch Cột SPE PCX được hoạt hóa với 3 ml methanol, 3 ml nước sau đó nạp 5 ml dung dịch mẫu ở trên (khoảng 1 ml/phút), rửa tạp bằng 2 ml nước, 2 ml axit formic 2% trong nước Hút chân không 3 phút để khô hoàn toàn tiếp theo rửa giải bằng 5ml hỗn hợp dung dịch methanol/(95/5 v/v) (tốc

độ khoảng 1 ml/phút) thu dịch rửa giải, sấy khô bằng dòng khí nitơ ở 40°C cuối cùng hòa tan cặn bằng 1ml hỗn hợp gồm axit formic 0,1% trong nước/ace-tonitrile (90/10 v/v), lắc và rung siêu âm để đảm bảo cặn hòa tan hoàn toàn, lọc qua màng lọc 0,45µm và được chuyển vào ống 1,5ml sau đó được phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS Phương pháp đã xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của 11 β2-agonist trong thịt lợn nằm trong khoảng từ 0,01-0,08 ng/g, hiệu suất thu hồi các beta-agonist nằm trong khoảng từ 82% đến 105% với giá trị RSD nằm trong khoảng 1,6% và 8,4%

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử

lý, làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn, sau đó định lượng bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối

tụ điện (CE-C4D)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm:

- Tổng quan tài liệu về các phương pháp xử lý, làm giàu chất trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn, đặc biệt là phương pháp chiết pha rắn

- Khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp phân tích, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp CE – C4D Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích Đánh giá

độ đúng của thiết bị và của phương pháp phân tích

- Nghiên cứu, tối ưu quy trình chiết pha rắn để xử lý, làm sạch, làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn

- Áp dụng phân tích định lượng Salbutamol trong một số mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn thực tế

2.2 Phương pháp nghiên cứu