Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các tế bào có khả năng phân bào và phát [r]
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”
LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội - 2020
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-
NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO
DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( CATHARANTHUS ROSEUS L.)
CỦA VIỆT NAM”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 6020114
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn 1 : TS Trần Mỹ Linh Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Tường Vân
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Tác giả
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST), TS Nguyễn Tường Vân – Viện Công nghệ sinh học, VAST và ThS Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn Xin cảm ơn Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số QTBY01.05/18-19 do TS Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa học và Công nghệ, VAST đã hết lòng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt hai năm học vừa qua
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Học viên
Nguyễn Thị Thanh Huyền
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN 1
LỜI CẢM ƠN 2
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5
DANH MỤC CÁC BẢNG 6
DANH MỤC CÁC HÌNH 7
MỞ ĐẦU 8
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1 Giới thiệu chung về dừa cạn 10
1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố 10
1.1.2 Giá trị y học 11
1.2 Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro 12
1.2.1 Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro 13
1.2.2 Các yếu tố chính ảnh hưởng nuôi cấy mô và tế bào cây thuốc in vitro 16
1.2.3 Nuôi nhân chồi in vitro 19
1.2.4 Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù 20
1.3 Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cường sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23 1.4 Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro 26
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1 Vật liệu 27
2.1.1 Các giống thực vật nghiên cứu 27
2.1.2 Các môi trường dùng cho nghiên cứu 27
2.2 Phương pháp nghiên cứu 28
2.2.1 Khử trùng và nảy mầm hạt 28
2.2.2 Tạo nguồn vật liệu bằng phương pháp nhân nhanh chồi in vitro 28
2.2.3 Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn 28
2.2.3.1 Tối ưu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo 28
2.2.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của ví trí và kích thước đoạn thân đến hình thành mô sẹo 29
Trang 62.2.3.3 Tối ưu hóa kích thước đoạn thân 29
2.2.3.4 So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam30 2.2.4 Tối ưu hóa môi trường nhân nhanh mô sẹo dừa cạn 30
2.2.5 Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn 30
2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào huyền phù dừa cạn 31
2.2.7 Tách chiết và định lượng alkaloid tổng số 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1 Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn 33
3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro 33
3.1.2 Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn 33
3.1.3 Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro 35
3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của đoạn lóng thân đến khả năng hình thành mô sẹo 39 3.1.5 Tối ưu hóa kích thước đoạn thân dùng trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo39 3.1.5 Đánh giá khả năng hình thành mô sẹo ở hai giống dừa cạn QN02 và H01 từ đoạn thân thứ 3, kích thước 0,3cm 41
3.2 Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn 43
3.2.1 Phát triển môi trường nhân nhanh mô sẹo, bảo toàn khả năng sinh tổng hợp alkaloid 43
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ tế bào ban đầu đến sự phát triển của tế bào dừa cạn nuôi lỏng 47
3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng lên tốc độ phát triển của tế bào 49
3.2.4 So sánh khả năng nhân nhanh của tế bào huyền phù của hai giống dừa cạn QN02 và H01 51
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
4.1 Kết luận 54
4.2 Kiến nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
Trang 7DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit
2,4-D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic
B5 Môi trường nuôi cấy của Gamborg (1968)
DDW Nước cất hai lần (double distilled water)
DW Trọng lượng khô – dry weight
IAA Indole Acetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
LS Môi trường nuôi cấy của Linsmaier và Skoog (1965)
MS Môi trường nuôi cấy của Murashige và Skoog (1962) N6 Môi trường nuôi cấy của Chu và cs (1975)
NAA α-Naphthaleneacetic acid
Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Thông tin ký hiệu mẫu dừa cạn 27 Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy mô 27 Bảng 3.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo của các đoạn lóng thân lên môi trường CT2 36 Bảng 3.2 A Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn giống QN02 thử nghiệm trên
các công thức của môi trường nhân nhanh tế bào 45
Bảng 3.2 B Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn giống H01 thử nghiệm trên các
công thức của môi trường nhân nhanh tế bào 45
Bảng 3.3 Sự tăng trưởng của tế bào dừa cạn QN02 sau 27 ngày nuôi cấy 48 Bảng 3.4 Trọng lượng tươi tế bào dừa cạn thử nghiệm trong môi trường lỏng
CT4 nhân nhanh tế bào huyền phù trong thí nghiệm cấy chuyển tế bào từ môi trường đặc CT3 sang môi trường lỏng CT4 51
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây dừa cạn 10 Hình 2.1 Lựa chọn đoạn thân trong thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo ở dừa
cạn 29
Hình 3.1 Hạt dừa cạn nảy mầm sau 1 tuần gieo hạt 33 Hình 3.2 Hình ảnh thí nghiệm nhân chồi dừa cạn tạo nguyên liệu cho TN tạo
mô sẹo 34
Hình 3.3 Mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát triển trên
môi trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L IAA 35
Hình 3.4 Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 (A) và H01 (B) sau 4 tuần phát
triển trên môi trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 1,5 mg/L NAA 37
Hình 3.5 Mô sẹo dừa cạn H01 sau 4 tuần phát triển trên môi trường CT2 có
các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau 38
Hình 3.6 Hình ảnh mô sẹo dừa cạn QN02 sau 4 tuần phát triển trên môi
trường CT2 có các nồng độ thử nghiệm 2,4-D khác nhau 38
Hình 3.7 Một số hình ảnh thí nghiệm tối ưu vị trí đoạn lóng thân trong thí
nghiệm tạo mô sẹo sau 4 tuần đặt trên môi trường tạo mô sẹo A: đoạn 1; B: đoạn 2; C: đoạn 3 39
Hình 3.8 Hình ảnh thí nghiệm tối ưu kích thước đoạn thân trong TN tạo mô
sẹo 40
Hình 3.9 Mô sẹo dừa cạn trên môi trường CT2 chứa 1,5 mg/L 2,4-D 41 Hình 3.10 Tốc độ nhân sinh khối của tế bào dừa cạn QN02 và H01 47 Hình 3.11 Hình ảnh tế bào dừa cạn QN02 phát triển trên môi trường CT3-547 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tế bào dừa cạn 50 Hình 3.13 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự phát triển của tế bào huyền phù
dừa cạn A tế bào nuôi trong tối; B tế bào nuôi ngoài ánh sáng 50
Hình 3.14 Hình ảnh tế bào huyền phù dừa cạn QN02 nuôi lỏng tại thời điểm
A: 1 ngày; B: 3 ngày; C: 5 ngày; D: 7 ngày; E: 10 ngày; F: 14 ngày 52
Trang 10MỞ ĐẦU
Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lượng khổng lồ các hợp chất hóa học có hoạt tính và được dùng làm thuốc Các hợp chất hoạt tính sinh học được chiết xuất từ thực vật có thể được sử dụng như thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hương vị và mỹ phẩm Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thư trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại không có sản phẩm tổng hợp hoặc bán tổng hợp thay thế Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và những nghiên cứu nhằm tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính dược học là đòi hỏi cấp bách
Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có những bước phát triển vượt bậc, là một phương pháp thay thế thích hợp trong việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mô khác nhau không phụ thuộc vào mùa
vụ Ngoài ra, việc nuôi cấy mô tế bào còn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc hại Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị Nuôi cấy tế bào huyền phù còn là một trong những giải pháp để cải thiện khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã được phát triển thành công như chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thông đỏ,
có tác dụng chữa ung thư)
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) G Don) là cây dược liệu, chứa
nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) như vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung
Trang 11(lymphosarcoma), ung thư biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung thư tế bào lưới Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhưng quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lượng rất thấp, khoảng 0,0002-0,0005% tổng hàm lượng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các
cơ quan khác nhau của cây Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro
để phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp
có giá trị đã được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập
trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa
cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam” nhằm chọn tạo được các
dòng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đươc khả năng tổng hợp các chất thứ cấp Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ
cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro
Để đạt được mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ được tiến hành như sau:
1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu, môi trường, chất kích thích sinh trưởng khác nhau đến khả năng hình thành mô sẹo của 02 giống dừa cạn của Việt Nam
2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo dừa cạn đã được chọn lọc
Trang 12CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về dừa cạn
1.1.1 Đặc điểm sinh học và phân bố
Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G Don, tên
thường gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trường xuân hoa là một loài thực vật
thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae) Chi
Catharanthus gồm 8 loài, trong đó 7 loài có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar
(C coriaceus, C lanceus, C longifolius, C ovalis, C roseus, C scitulus, C trichophyllus) và 1 loài C pusillus từ Ấn Độ Loài Catharanthus roseus (L)
G Don (dừa cạn) được du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài
từ Bắc vào Nam [1] Loài cây này chủ yếu được trồng ở các nước nhiệt đới, ở những vùng lạnh cây được trồng vào mùa hè vì không chịu được lạnh
Hình 1.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.php?q=node/195)
Dừa cạn là dạng cây thường xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm đến 1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2]
Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm, không có lông, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá
ngắn khoảng 1-1,8 cm và được sắp xếp theo cặp đối diện Hai giống C roseus phổ biến nhất được đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa
màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba Hoa có nhiều màu từ màu
Trang 13của ống vành, tâm bì rời ở noãn sào với năm cánh giống thùy hoa Quả là
một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm Dừa cạn C roseus là một
loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tương thích Tuy nhiên, quá trình tự thụ phấn trong hoa thường không xảy ra ở cây dừa cạn
vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tượng được gọi là herkogamy ngược, khi nhụy bị thấp xuống dưới mức bao phấn [3]
Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên Ngoài ra dừa cạn còn xuất hiện ở các đảo như Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1] Ở những vùng phân bố
tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển
1.1.2 Giá trị y học
Catharanthus roseus được coi là một nhà máy sản xuất đến 130
terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, trong đó có nhiều chất có hoạt tính dược học quan trọng được dùng trong điều trị ung thư, tiểu đường, cao huyết áp, dị ứng, táo bón và nhiều bệnh đường ruột Trong đó, vinblastine là hợp chất đã được FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ phê duyệt vào năm 1965 và trở thành một thành phần chính của phương pháp hóa trị liệu trong điều trị nhiều loại ung thư như bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các
u bạch huyết, ung thư vú, ung thư phổi tế bào nhỏ…, được bán trên thị trường hơn 40 năm nay Ngoài ra, vincristine và vinblastine còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [4] Một hợp chất khác của nhóm TIA là ajmalicin được sử dụng làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường [5] Khi nghiên cứu để phát hiện các chất có hoạt tính hạ đường huyết từ cây dừa cạn của Việt Nam, Nguyen và cs [6] đã