XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER1 CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT βLACTAMASE PHỔ RỘNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER1 CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT βLACTAMASE PHỔ RỘNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 112010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

CHÂU THỤY VY

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER-1 CỦA VI KHUẨN

ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT

β-LACTAMASE PHỔ RỘNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

CHÂU THỤY VY

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER-1 CỦA VI KHUẨN

ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT

XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN GENE blaPER-1 CỦA VI KHUẨN

ACINETOBACTER BAUMANNII TIẾT

β-LACTAMASE PHỔ RỘNG CHÂU THỤY VY

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

2 Thư k ý: TS LÊ HỒNG PHƯỚC

Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II

3 Phản biện 1: TS VÕ THỊ TRÀ AN

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

5 Ủy viên: TS BS PHẠM HÙNG VÂN

Trường Đại học Y Dược TP HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Châu Thụy Vy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị đồng môn, gia đình và bạn bè đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến:

Quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học cùng quý thầy cô phòng Sau Đại học, Trường Đại học Nông Lâm đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Quý công ty Nam Khoa cùng anh Phạm Thái Bình, anh Đặng Mai Anh Tuấn và chị Lê Thị Phi Yến đã quan tâm, động viên và góp ý kiến chân tình giúp tôi hoàn thiện luận văn

Tôi xin gửi lời tri ân đến:

Tiến sĩ bác sĩ y khoa Phạm Hùng Vân, người thầy đáng kính đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi có cơ hội được tiếp cận khoa học ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tiễn

Ba mẹ và những người thân yêu cùng bạn bè thân hữu đã luôn bên cạnh tôi, khuyến khích, động viên và hỗ trợ tôi vượt qua chính mình

TÓM TẮT

Sự gia tăng khả năng kháng thuốc của Acinetobacter baumannii trong

thập niên qua, một trong những cơ chế đề kháng đa kháng sinh là khả năng tiết β-lactamase thuỷ phân các kháng sinh thuộc họ belactam được gọi là Expanded Spectrum Betalactamase (ESBL) Trong đó, PER-1 là một ESBL có khả năng

đề kháng kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và aztreonam Do đó, dựa vào

kiểu hình để phát hiện sự hiện diện của ESBL trên Acinetobacter baumannii là

mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi Nghiên cứu này đã được thực hiện với đề

tài “Phát hiện gen blaPER-1 nhằm xác định kiểu hình β-lactamase phổ rộng của

vi khuẩn Acinetobacter baumannii” tại phòng thí nghiệm công ty Nam Khoa,

thời gian từ tháng 10 năm 2009 đến tháng 08 năm 2010

Dựa vào kết quả kiểu hình kháng sinh đồ của khoảng 350 chủng

Acinetobacter spp được phân lập từ 3.000 mẫu bệnh phẩm ở bệnh viện

Nguyễn Tri Phương, Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2009 đến 06

năm 2010, chúng tôi nhận thấy trong đó chỉ có 3 chủng Acinetobacter spp có kiểu hình ESBL dương tính và đồng thời chọn 3 chủng Acinetobacter spp có

kiểu hình ESBL âm tính ngẫu nhiên làm đối chứng Tất cả 6 chủng

Acinetobacter spp này được định danh lại với hệ thống định danh IDS 14 GRN

và trình tự 16S rDNA xác định loài Acinetobacter baumannii Phát hiện sự hiện

diện của ESBL được xác định dựa vào kiểu hình và kiểu gen: (i) Phương pháp xác định kiểu hình dựa vào sự mở rộng vòng vô khuẩn ở vùng giao tiếp giữa cephalosporin và clavulanate gồm phương pháp đĩa đôi và đĩa kết hợp; (ii) Phương pháp dựa vào kiểu gen gồm phương pháp PCR và giải trình tự khuếch

đại vùng gen blaPER-1 với cặp mồi đặc hiệu đã được công bố trên thế giới Kết quả giải trình tự nucleotide được so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI Kết quả nghiên cứu đã xác định được sự hiện diện của ESBL dựa vào

tiết ESBL blaPER-1 trên Acinetobacter baumannii ở vị trí integron lớp 1 Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phát hiện kiểu hình ESBL và kiểu gen blaPER-

1 trên Acinetobacter baumannii góp phần vào tình hình nghiên cứu chung của các nước trên thế giới về blaPER-1 Acinetobacter baumannii

SUMMARY

Over the last decade, increasing therapeutic difficulties owing to the

emergence of highly multidrug-resistant Acinetobacter baumannii have been

described with increasing frequency One of the mechanisms of resistance to

β-lactam antibiotics in Acinetobacter baumannii that is producing

extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) such as PER-1 is an ESBL to have the ability to inactivate the oxyimino – cephalosporins and aztreonam Therefore, based on the

phenotype to detect ESBL screen-positive of Acinetobacter baumannii is the aim

of our research conducted at Nam Khoa laboratory from October 2009 to August

2010 with the study “Detection of the blaPER-1 gene extended-spectrum

β-lactamse-producing in Acinetobacter baumannii”

Based on the results of the phenotypic tests of 350 Acinetobacter spp

isolates isolated from 3,000 specimens at Nguyen Tri Phuong hospital in Ho Chi Minh city, Vietnam (from January 2009 to June 2010), we found that there are

only 3 Acinetobacter spp isolates confirmed ESBL positive phenotype and chose

3 Acinetobacter spp isolates confirmed non-ESBL phenotype randomized

controlled trials as well All 6 isolates were re-identified to determine

Acinetobacter baumannii based on the suitable bio-chemical reactions by using the

IDS 14 GNR system and 16S rDNA ESBL expressing status of the strains was determined by the phenotypic and genotypic tests: (i) The phenotypic test, which

is based on seeking synergy between cephalosporins and clavulanate, includes the double disc and combination disc methods; (ii) The genotypic test includes the

direct PCR method with the PCR-amplified the blaPER-1 gene by using previously reported primers and the gene sequencing techniques Nucleotide sequence analysis was performed at the National Center of Biotechnology Information Website

A detailed analysis of the results not only determined ESBL expressing

status based on the phenotypic test and direct PCR, but also identified the blaPER-1

gene of Acinetobacter baumannii located on the class I integron To the best of our knowledge, this is the first study to detect the ESBL phenotype and blaPER-1 gene

of Acinetobacter baumannii in Vietnam, further supporting the global spread of

such strains

MỤC LỤC

Trang tựa

Trang Chuẩn Y i

L ý Lịch Cá Nhân ii

Lời Cam Đoan iii

Lời Cảm Ơn iv

Tóm tắt v

Summary vii

Mục lục ix

Danh sách các chữ viết tắt ….xii

Danh sách các bảng xiii

Danh sách các hình xiv

1 MỞ ĐẦU 1

2.TỔNG QUAN 3

2.1 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii 3

2.1.1 Lịch sử 3

2.1.2 Đặc điểm phân loại, hình thái và sự phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm gây bệnh và sự truyền nhiễm 4

2.1.4 Đặc điểm đề kháng kháng sinh 5

2.1.4.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh 5

2.1.4.2 Tình hình đề kháng kháng sinh 8

2.2 ESBL 8

2.2.1 Cơ sở phân lớp phân tử β-lactamase 8

2.2.2 Sự tiến hoá của ESBL .9

2.2.3 Các lớp β-lactamase 9

2.2.5 Các yếu tố nguy cơ, điều trị và cách phòng ngừa nhiễm khuẩn

do vi khuẩn tiết ESBL 13

2.2.6 Các ESBL và gen ESBL của A baumannii 15

2.2.6.1 Các ESBL của A baumannii 15

2.2.6.2 Gen ESBL của A baumannii 16

2.3 Một số phương pháp phát hiện ESBL 18

2.3.1 Phương pháp dựa vào kiểu hình 18

2.3.1.1 Phương pháp đĩa đôi 19

2.3.1.2 Phương pháp đĩa kết hợp 19

2.3.1.3 Phương pháp Etest 19

2.3.2 Phương pháp dựa vào kiểu gen 20

2.3.2.1 Phương pháp oligotyping 20

2.3.2.2 Phương pháp PCR-RFLP 21

2.3.2.3 Phương pháp PCR-SSCP 21

2.3.2.4 Phương pháp LCR 22

2.3.2.5 Phương pháp PCR và giải trình tự gen 22

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Đối tượng nghiên cứu 24

3.2 Vật liệu nghiên cứu 24

3.2.1 Thiết bị dụng cụ 24

3.2.2 Hoá chất 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Phương pháp định danh sinh hoá 25

3.3.2 Phương pháp kháng sinh đồ xác định kiểu hình ESBL 26

3.3.3 Phương pháp ly trích vi khuẩn 26

3.3.4 Phương pháp PCR 27

3.3.4.1 Trình tự primer 27

3.3.4.2 Phương pháp loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại PCR 29

3.3.4.4 Phương pháp PCR khuếch đại gen blaPER-1 30

3.3.5 Phương pháp điện di DNA 32

3.3.5.1 Phương pháp điện di gel agarose 32

3.3.5.2 Phương pháp điện di chip 32

3.3.6 Phương pháp giải trình tự gen 32

3.3.6.1 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột 32

3.3.6.2 Phương pháp PCR sequencing 33

3.3.6.3 Phương pháp tủa sản phẩm giải trình tự 34

3.3.6.4 Phương pháp điện di mao quản DNA 34

3.3.6.5 Phương pháp xử lý kết quả giải trình tự 35

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả định danh A baumannii 36

4.1.1 Kết quả định danh sinh hoá 36

4.1.2 Kết quả PCR và giải trình tự 16s rDNA 36

4.1.2.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16s rDNA 36

4.1.2.2 Kết quả giải trình tự 16s rDNA 38

4.2 Kết quả kháng sinh đồ xác định kiểu hình ESBL 40

4.3 Kết quả PCR xác định kiểu hình ESBL 41

4.4 Kết quả giải trình tự xác định gen blaPER-1 43

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 49

BẢNG VIẾT TẮT

K ý hiệu Nội dung

A baumanii Acinetobacter baumannii

β-lactama betalactama

β-lactamase betalactamase: men betalactama

cs cộng sự

CS Conserved Squence: trình tự gene bảo tồn

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

ddNTP dideoxyribonucleotide triphosphate

dNTP deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

ESBL Expanded Spectrum Betalactamase

GuSCN Guanidine thiocyanate

IS Insertion Sequences

LCR Ligase Chain Reaction

MgCl2 Magnesium chloride

MC Mac Conkey Agar

MHA Mueller Hinton Agar

MIC Minimum Inhibitory Concentration

NALC N-Acetyl-L-Cysteine

NCBI National Center for Biotechnology Information

ORF Open Reading Frame

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SSCP Single-Strand Conformation Polymorphism

Tris Tris-(hydroxymethyl) aminomethane

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG

TRANG Bảng 2.1 Sự phân lớp β-lactamase 12

Bảng 3.1 Bộ định danh IDS 14 GNR 26

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 16s rDNA 30

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR blaPER-1 31

Bảng 4.1 Kết quả định danh IDS 14 GNR 37

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH

TRANG Hình 2.1 Hình dạng A baumannii 4

Hình 2.2 Các cơ chế đề kháng kháng sinh của A baumannii 6

Hình 2.3 Vị trí tác động của β-lactamase lên các kháng sinh chứa

vòng β-lactam 7

Hình 2.4 Cơ chế tác động của β-lactamase lên vòng β-lactam 7

Hình 2.5 A Sơ đồ xác định vị trí blaPER-1 A baumannii trên Tn1213 17

Hình 2.5 B Sơ đồ xác định blaPER-1 A baumannii không xuất hiện

trên Tn 1213 17

Hình 2.6 Cấu trúc integron lớp 1 18

Hình 4.1 Kết quả định danh sinh hoá IDS 14 mẫu 999 37

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR 16s rDNA 38

Hình 4.3 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide 16s rDNA mẫu 999 39

Hình 4.4 Kết quả giải trình tự 16s rDNA xác định A baumannii mẫu 999 40

Hình 4.5 Kết quả kiểu hình ESBL (-) 40

Hình 4.6 Kết quả kiểu hình ESBL (+) 41

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR PER-1 ở nhiệt bắt cặp 55oC và 60oC 42

Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR PER-1 42

Hình 4.9 Kết quả điện di chip sản phẩm PCR blaPER-1 mẫu 1900 và 2040 43

Hình 4.10 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide blaPER-1 mẫu 1900 44

Hình 4.11 Kết quả giải trình tự xác định blaPER-1 mẫu 1900 45

Hình 4.12 Hình dữ liệu thô trình tự nucleotide blaPER-1 mẫu 2040 45

Hình 4.13 Kết quả giải trình tự xác định blaPER-1 mẫu 2040 46

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

Bệnh nhiễm trùng vẫn còn đang đứng hàng đầu trong mô hình bệnh tật ở nước ta và các nước phát triển, đặc biệt là nhiễm khuẩn bệnh viện do các tác nhân vi khuẩn gram âm Nếu trước đây các nhiễm khuẩn bệnh viện có thể được điều trị dễ dàng bằng các cephalosporin thế hệ 3 hay thế hệ 4 thì hiện nay tình hình không còn

dễ dàng như vậy nữa vì các vi khuẩn này đã sở hữu được một thứ vũ khí rất đáng sợ,

đó là khả năng tiết men betalactama (β-lactamase) thuỷ phân các kháng sinh thuộc

họ β-lactam được gọi là Expanded Spectrum Betalactamase (ESBL) giúp vi khuẩn kháng được tất cả các kháng sinh cephalosporin các thế hệ từ 1 đến 4 và hầu hết các loại kháng sinh betalactama (β-lactam) khác Do đó, thất bại lâm sàng thường do các

vi khuẩn tiết ESBL mà ra, mặc dù với kết quả kháng sinh đồ là nhạy với một loại oxyimino – cephalosporin nào đó

Phát hiện sự hiện diện ESBL được thực hiện trên diện rộng chủ yếu đối với

các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae và Enterobacter dựa vào kết quả kiểu hình kháng sinh đồ có sự cộng

hưởng dương tính với cephalosporin Tuy nhiên, đối với các vi khuẩn không lên

men như Acinetobacter cũng xuất hiện một số kết quả “hình ảnh” kiểu hình tiết ESBL tương tự như vậy thì có thể nhận định rằng Acinetobacter có thực sự tiết

ESBL hay không Với l ý do này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xác định sự

hiện diện gene blaPER-1 của vi khuẩn Acinetobacter baumannii tiết β-lactamase phổ

rộng”

Mục tiêu chung của đề tài: xác định kiểu hình và kiểu gene blaPER-1 tiết ESBL

trên vi khuẩn Acinetobacter baumannii

Mục tiêu cụ thể:

- Sàng lọc chủng Acinetobacter spp có kiểu hình tiết ESBL từ kết quả xét

nghiệm bệnh phẩm tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Tp Hồ Chí Minh thời gian từ

01/2009 đến 06/2010

- Định danh xác định loài Acinetobacter baumannii bằng phương pháp sinh

hoá và 16s rDNA, đồng thời xác định lại kiểu hình tiết ESBL của những chủng đã chọn lọc bằng phương pháp kháng sinh đồ

- Xác định kiểu hình ESBL PER-1 bằng phương pháp PCR trên

Acinetobacter baumannii

- Xác định kiểu gene blaPER-1 trên Acinetobacter baumannii bằng phương

pháp giải và so sánh trình tự gene

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn Acinetobacter baumannii

2.1.1 Lịch sử

Acinetobacter được miêu tả lần đầu tiên bởi Morax vào 1896 (Ann Inst

Pasteur, 1896) Những năm sau đó, với hình thái học được miêu tả bởi Axenfeld được xem như là “Morax-axenfeld bacilli”, vi khuẩn tiếp tục sự thay đổi với các tên

gọi khác nhau như Bacterium anitratum, Herella (hoặc Herellea) vaginicola, Mima

polymorpha, Achromobacter, Micrococcus calcoaceticus, Diplococcus, B5W và Cytophaga Cho đến năm 1954, tên Acinetobacter baumannii xuất xứ từ Hy Lạp là akinetos (ακίvєτοσ) với nghĩa “không chuyển động” do Prévôt và Brisou đề xướng

và đã được công nhận bởi Juni và Janik (1969) Cho đến 1980, sự phân loài

Acinetobacter được xác định dựa vào kiểu gene (Dijkshoorn và cs, 1998) và sự lai

DNA và trình tự 16s rDNA (Bouvet và Grimont, 1986) Giống Acinetobacter bao

gồm 31 loài (17 loài có tên được công nhận), nhưng chỉ có một vài loài được xác

định là có khả năng gây bệnh, trong đó Acinetobacter baumannii được biết đến liên

quan đến nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt tại các khoa chăm sóc tích cực (trích dẫn bởi Bergogne-Bérézin, 2007)

2.1.2 Đặc điểm phân loại, hình thái và sự phân bố

Theo phân loại NCBI, Acinetobacter baumannii (A baumannii ) thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria

Ngành (Division) : Proteobacteria

Lớp (Class) : Gammaproteobacteria

Bộ (Order) : Pseudomonadales

Họ (Genus) : Moraxellaceae

Giống (Familiar) : Acinetobacter

Loài (Species) : baumannii

A baumannii là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, hình que ngắn (cầu trực), trơn

láng, xám trắng, thường ở dạng cụm, glucose (+/-), catalase (+), oxidase (-), manitol (-), maltose (-), không di động, hầu hết sống ở 20-37oC, có thể tồn tại ở 44oC, phát triển dễ dàng trong điều kiện phòng thí nghiệm (Bergogne-Bérézin, 2007; Estapé, 2008)

Hình 2.1: Hình dạng vi khuẩn A baumannii

(Nguồn: http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/9330/9330_lores.jpg)

A baumannii sống trên cơ thể người ở da, họng, hệ thống hô hấp, tiêu hoá và

hầu hết các nơi ẩm ướt trên cơ thể người (Bergogne-Bérézin, 1987; Joly-Guillou và

Burn-Buisson, 1996) A baumannii liên quan đến nguồn lây nhiễm bệnh viện xuất

hiện thỉnh thoảng rải rác hoặc bùng phát (Bergogne-Bérézin và cộng sự, 1987; Fiérobe và cs, 2001) (trích dẫn bởi Bergogne-Bérézin, 2007)

2.1.3 Đặc điểm gây bệnh và sự truyền nhiễm

Vào những năm 1980, A baumannii được tìm thấy ở các khoa chăm sóc tích

cực tại một số nước như Tây Ban Nha với tỷ lệ lây nhiễm từ 4 – 8,2 % vào năm

1990-1997 (Vaque và cs, 1999) và ở toàn Châu Âu là 9 % vào năm 1995 (Vincent

và cs, 1995) Acinetobacter là nguyên nhân gây ra các bệnh nhiễm trùng như nhiễm

trùng máu, một trong những nguồn lây nhiễm cao nhất ở các bệnh viện, theo nghiên cứu ở Anh với tỷ lệ 5 % trên toàn bệnh viện, trong đó ở các khoa chăm sóc tích cực

chiếm 54 %, sự hiện diện của A baumanni chiếm 10 – 15 % (Wisplinghoff và cs, 2000) Ngoài ra, A baumannii còn được biết đến do có khả năng gây viêm phổi

được xác định chính xác đầu tiên vào năm 1997 làm cho 85 % động vật chết trong 3

ngày (Joly-Guillou và cs, 1997) và đặc biệt ở các khoa chăm sóc tích cực A

baumannii là nguyên nhân gây viêm phổi quan trọng nhất, theo thống kê nghiên cứu

tại Mỹ, chiếm 5 – 10 % và có khả năng ngày càng gia tăng (Gaynes và Edward,

2005) Thêm vào đó, sự lây lan của A baumannii gây viêm phổi đã xuất hiện ra

ngoài cộng đồng chủ yếu là ở các vùng nhiệt đới như Úc và các nước Châu Á Bên

cạnh đó, A baumannii gây nhiễm trùng dẫn đến hoại tử vết thương và có khả năng

gây bùng phát do xuất hiện hiện tượng kháng đa kháng sinh, được thể hiện gần đây

nhất trong cuộc chiến ở Irac và Apganixtan, A baumannii chiếm 32,5 % từ kết quả phân lập các nạn nhân bị thương Thêm vào đó, A baumannii còn có khả năng gây

ra các nhiễm khuẩn không thường gặp như nhiễm khuẩn tuyến giáp (Yu và cs, 1998), gây hoại tử và nhiễm khuẩn ruột non (Mishra và cs, 1998), viêm phúc mạc (Caputo

và cs, 1997), viêm màng não gây tử vong ở trẻ (Kelkar và cs, 1989), viêm màng

trong và ngoài tim (Lam và Huang, 1997) Trong những năm gần đây, A baumannii trở

thành một đối tượng gây nhiễm trùng quan trọng trên thế giới do có khả năng gây bùng phát và khó kiểm soát chiếm từ 2 - 10 % trong tất cả các vi khuẩn gram âm ở các khoa chăm sóc tích cực (trích dẫn bởi Joly-Guillou, 2007; Estapé, 2008; Peleg, 2008)

2.1.4 Đặc điểm đề kháng kháng sinh

2.1.4.1 Cơ chế đề kháng kháng sinh

A baumannii có khả năng đề kháng đối với β-lactam phổ rộng, cephalosporin

thế hệ 2 và 3 (Héritier và cs, 2006), carboxypenicillin (Joly-Gouillou và cs, 1995),

carbapenem (Mussi và cs, 2005) và fluoroquinolone (Joly-Gouillou và cs, 1995; Vila và cs, 1993) (trích dẫn bởi Bergogne-Bérézin, 2007)

Cơ chế đề kháng của A baumannii đối với nhóm kháng sinh này:

- Khả năng tiết men β-lactamase là enzyme thuỷ phân làm phá vỡ cầu amide của vòng β-lactam gây ra sự bất hoạt của kháng sinh

- Thay đổi điểm tác động của vòng β-lactam liên quan đến các cầu nối penicillin protein (PBPs- Penicillin binding proteins)

- Hoạt động của các bơm đẩy β-lactam (beta-lactam efflux bumps) đẩy kháng sinh ra ngoài tế bào (Livermore, 1995; Poole, 2004; Perez và cs, 2007; Vila và Pachón, 2007)

Hình 2.2: Các cơ chế đề kháng kháng sinh của A baumannii

t i

Hoạt động của bơm đẩy β-lactam đẩy kháng sinh

ra ngoài tế bào

Hình 2.3: Vị trí tác động của β-lactamase lên các kháng sinh chứa vòng β-lactam

(Nguồn: http://www.showcasehospitals.com/ /David_Wareham.ppt)

Hình 2.4: Cơ chế tác động của β-lactamase lên vòng β-lactam

(Nguồn: Livermore, 1995)

2.1.4.2 Tình hình đề kháng kháng sinh

Sự gia tăng khả năng kháng đa kháng kháng sinh của A baumannii là

nguyên nhân gây ra bùng phát tại các bệnh viện ở các nước trên thế giới như ở Châu

Âu (Anh, Pháp, Đức, Ý, Tây Ban Nha, Hà Lan và Bungari), Bắc Mỹ (New York),

Mỹ La Tinh (Achentina, Braxin, Chilê và Côlombia), Châu Úc (Brisbane, Sydney

và Melbourne), Châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Hong Kong, Nhật và Hàn Quốc) và vùng Trung Đông (Perez và cs, 2007; Peleg, 2008; Savov và cs, 2008) Tại Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu đa trung tâm khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của các trực khuẩn gram âm dễ mọc gây nhiễm khuẩn bệnh viện từ 1/2007 đến

5/2008, trong đó Acinetobacter đề kháng rất cao với hầu hết các loại kháng sinh trên

40 % và theo thống kê chính thức của Bộ y tế công bố vào năm 2004, tình hình đề kháng kháng sinh của các trực khuẩn gram âm gây bệnh đang ở mức báo động,

trong đó Acinetobacter kháng ceftazidime 64 %, ceftriaxone 60 % và ciprofloxacine

55 % (Phạm Hùng Vân và cs, 2009)

2.2 ESBL (Expanded Spectrum Betalactamase)

2.2.1 Cơ sở phân lớp β-lactamase

Sự phân lớp β-lactamase dựa trên phổ thuỷ phân (hydrolytic spectrum) và sự nhạy cảm với các chất ức chế (inhibitor-resistant β-lactamase) Lớp đầu tiên được phân loại vào năm 1970 do Jack và Richmond và đến năm 1973 các lớp được mở rộng bởi Richmond và Sykes Sự phân lớp β-lactamase này tiếp tục được sắp xếp lại

do Bush thực hiện vào năm 1989 và được bổ sung vào năm 1995 Tuy nhiên, sự phân lớp này khi có sự thay đổi chất nền và chất ức chế làm thay đổi nhóm enzyme tác động Vì vậy, β-lactamase được phân lớp dựa vào trình tự gene của nhiễm sắc thể hay plasmid đã được mã hoá như transposon và integron (đơn vị DNA nhỏ được tìm thấy ở nhiễm sắc thể, plasmid và transponson, có thể bắt và di chuyển gene bằng cách tái tổ hợp các vị trí đặc biệt, chịu trách nhiệm cho việc đề kháng kháng sinh) gồm 4 lớp từ A-D, với lớp đầu tiên do Ambler phân loại vào năm 1980 Hàng trăm

lactamase đã biết và được đặt tên rất phức tạp Dựa vào trình tự amino acid lactamase được chia thành 3 lớp A, C và D là những lớp β-lactamase phổ biến có khả năng đề kháng penicillin, cephalosporin và monobactam Lớp còn lại ít phổ biến hơn là metallo β-lactamase hay β-lactamse lớp B kháng penicillin, cephalosporin, carbapenem nhưng không kháng monobactam (Livermore, 1995; Samaha-Kfoury và Araj, 2003; Poole, 2004)

β-2.2.2 Sự tiến hoá của ESBL

Một trong các cơ chế đề kháng mới là sự đột biến gene trên plasmid được tìm

thấy đầu tiên vào 1983 tại Đức với 2 loài Klebsiella pneumoniae và E coli tạo ra các

β-lactamase có khả năng thuỷ phân các cephalosporin hoạt phổ rộng được gọi là extended-spectrum β-lactamase (ESBL) Các ESBL có nguồn gốc từ sự đột biến của các β-lactamase nguyên thuỷ như: TEM-1, SHV-1, CTX-M (Poole, 2004; Jacoby

và Munoz-Price, 2005; Livermore và Paterson, 2005; Phạm Hùng Vân, 2006)

Nhiều nhà nghiên cứu không nghĩ rằng AmpC β-lactamase (β-lactamase trên nhiễm sắc thể lớp C có khả năng thuỷ giải cephalosporin) là một ESBL Dĩ nhiên thuật ngữ ESBL dành cho enzyme có khả năng chuyển đổi thuộc lớp A và thuỷ giải được cephalosporin cũng như bị ức chế bởi acid clavulanic ESBL không thể thuỷ giải carbapenem (không như ApmC) cũng như cephamycin (cefoxitin và cefotetan)

và không giống như AmpC, ESBL kháng được với cephalosporin thế hệ 4 như cefepime và cefpirome Định nghĩa ESBL được mở rộng cho cả những đột biến β-lactamase OXA thuộc lớp D có khả năng ức chế cephalosporin vì chúng đại diện cho sự tiến hoá song song với một số loại enzyme nhóm A, mặc dù khác nhau về khả năng đề kháng các chất ức chế β-lactamase (Livermore và Paterson, 2005)

2.2.3 Các lớp β-lactamase

TEM-ESBL (Lớp A): là các đột biến TEM penicillinase, việc thay thế amino acid tại nhiều vị trí ở TEM-1 β-lactamase có thể làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt

hóa của men, cho phép thâm nhập vào oxyimino-β-lactam Việc mở vị trí hoạt hóa của men với β-lactam làm gia tăng tính nhạy cảm với chất ức chế (acid clavulanic) Trên 130 men TEM đã được tìm thấy và sự đa dạng của chúng có lợi cho việc theo dõi sự lan tràn của các gene đề kháng

SHV-ESBL (lớp A): là các đột biến SHV penicillinase ở Kleb pneumoniae thì

xuất phát từ nhiễm sắc thể, SHV-1 có khoảng 68 % các amino acid tương đồng với TEM-1 và có cấu trúc tương tự Cũng như TEM, SHV có một hoặc nhiều sự thay thế các amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa với hơn 50 dạng khác nhau của SHV

đã được biết

CTX-M-ESBL (lớp A): ở Kluyvera hầu hết các phân lớp đều xuất phát từ

nhiễm sắc thể, rồi được chuyển động nhờ các trình tự chèn Hiện nay, có hơn 40 CTX-M đã được biết trong 5 phân lớp được nhấn mạnh về hoạt tính của nó chống lại cefotaxime lớn hơn ceftazidime Một vài CTX-M thủy phân ceftazidime nhanh hơn cả thủy phân cefotaxime

Những ESBL lớp A khác: những ESBL lớp A khác không thường gặp được

tìm thấy chủ yếu ở Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa và A baumannii

như PER-1 được phân lập ở Thổ Nhĩ Kỳ, Hàn Quốc, Pháp, Ý và Bỉ; PER-2 có sự

tương đồng amino acid 86 % với PER-1 được xác định ở Salmonella enterica,

Enterobacter spp., Kleb pneumoniae và Vibrio cholerae chủ yếu ở Nam Mỹ VEB-1

và VEB-2 được biết từ lâu là penicillinase và có dưới 3 biến thể Bên cạnh đó, một

số các men rất ít gặp được tìm thấy ở Enterobacteriaceae như BES-1, họ GES/IBC,

SFO-1 và TLA-1

OXA-ESBL (lớp D): gồm 12 ESBL bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1 hay

OXA-2 bằng cách thay thế các amino acid được tìm thấy chủ yếu ở Pseudomonas

aeruginosa OXA-15 được biết từ lâu là penicillinase dưới 3 biến thể và OXA-11,

14, 16, 17 trên 5 biến thể

Plasmid-mediated AmpC (lớp C): AmpC sinh ra do β-lactam, được mã hóa ở các gene trên nhiễm sắc thể ở nhiều trực khuẩn gram âm Hơn 20 AmpC β-lactamase được tìm thấy truyền qua trung gian plasmid, các đột biến làm gia tăng

tình trạng đề kháng cephalosporin phổ rộng ở Enterobacter cloacae AmpC

β-lactamase có tính đặc trưng làm cho đề kháng với cephamycin cũng như với oxyimino-β-lactam và đề kháng với chất ức chế (acid clavulanic)

Carbapenemase (Lớp A, B và D): tuy rất ít gặp nhưng rất được quan tâm vì chúng có hoạt tính không những chỉ chống lại oxyimino-cephalosporin và cephamycin mà còn với carbapenem Hiện nay, plasmid-mediated IMP-type

carbapenemase đã biết được 17 loại ở cả gram âm đường ruột, Pseudomonas và

Acinetobacter, họ IMP được tìm thấy ở Châu Âu năm 1997 và họ thứ 2 của

carbapenemase đang phát triển là họ VIM Một vài men lớp A, đặc biệt là men plasmid-mediated KPC, cũng có tác dụng như carbapenemase Ngoài ra, một vài OXA-type β-lactamase có hoạt tính carbapenemase bằng cơ chế đề kháng khác thêm vào như thay đổi tính thấm hay bơm đẩy kháng sinh ra ngoài (Poole, 2004; Jacoby

và Munoz-Price, 2005; Livermore và Paterson, 2005; Phạm Hùng Vân, 2006)

Bảng 2.1: Sự phân lớp β-lactamase (Nguồn: Jacoby và Munoz-Price, 2005)

Ức chế bằng acid clavulanic

Lớp phân

tử

TEM-1, TEM-2, SHV-1 Benzylpenicillin (penicillin G),

amino-penicillin (amoxicillin and ampicillin), carboxypenicillin (carbenicillin và ticarcillin), ureidopenicillin (piperacillin), cephalosporin phổ hẹp (cefazolin, cephalothin, cefamandole,

broad-spectrum trên cộng thêm cloxacillin, methicillin và oxacillin

+ D

spectrum trên cộng với cephalosporin (cefotaxime, cefpodoxime, ceftazidime và ceftriaxone) và monobactam (aztreonam)

oxyimino-++++ A

Khác (BES-1, GES/IBC, PER-1, PER-2, SFO-1, TLA-1, VEB-1 và VEB-2)

CTX-M Hoạt chất nhóm

Expanded-spectrum

AmpC ACC-1, ACT-1, CFE-1,

CMY, DHA-1, DHA-2, FOX,LAT, MIR-1, MOX-

1 và MOX-2

Hoạt chất nhóm spectrum cộng thêm cephamycin (cefotetan, cefoxitin và thuốc khác)

expanded-0 C

IMP, VIM, GIM-1 và SPM-1

Hoạt chất nhóm spectrum cộng với cephamycin và carbapenem (ertapenem,

Giống như IMP, VIM, GIM-1 và

2.2.4 Bản chất cuả ESBL

ESBL rất đa dạng và có nhiều gốc khác nhau Hầu hết các loại enzyme này đều có hoạt tính thuỷ giải, phân giải được tất cả cephalosprin (ngoại trừ cephamycin), các loại penicillin (ngoại trừ temociline) và aztreonam Tuy nhiên, một số ESBL vẫn còn nhạy với carbapenem (imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem) và các chất ức chế như acid clavulanic, tazobactam Tuỳ thuộc vào từng loại enzyme, số lượng và tính thấm mà các loài vi khuẩn sản xuất ESBL dường như vẫn còn nhạy với một hoặc vài loại oxyimino – cephalosporin nào đó Bên cạnh đó, plasmid mang gene ESBL tương đối lớn khoảng 80 kb hoặc hơn, đặc biệt trên plasmid đó thường có một số các gene kháng kháng sinh khác, tạo nên hiện tượng đồng kháng rất nguy hiểm như hiện tượng đồng kháng kháng aminoglycoside, fluoroquinolone, tetracycline, chloramphenicol và sulfamethoxazol-trimethoprim (Poole, 2004; Jacoby và Munoz-Price, 2005; Livermore và Paterson, 2005; Fournier

hệ 3 trước đó với nhiễm khuẩn ESBL sau đó và những bệnh viện sử dụng cephalosporin thế hệ 3 nhiều nhất thường có tỉ lệ nhiễm tác nhân ESBL cao nhất Do

đó, việc giảm sử dụng cephalosporin thế hệ 3 cũng liên quan đến việc giảm tỉ lệ nhiễm ESBL (Livermore và Paterson, 2005)

Những hiểu biết về yếu tố nguy cơ của nhiễm khuẩn ESBL giúp cho việc chọn lựa kháng sinh điều trị cho từng bệnh nhân với từng bệnh l ý nhiễm khuẩn cụ thể Cho đến nay, chưa có thử nghiệm nào được thực hiện chứng minh rằng một kháng sinh nào đó thì tốt hơn những kháng sinh khác trong điều trị ESBL Vì vậy, quyết định sử dụng kháng sinh để điều trị ESBL phụ thuộc vào các dữ liệu kháng sinh đồ, các kết quả từ những nghiên cứu trên động vật, các dữ liệu từ những nghiên cứu quan sát sử dụng kháng sinh và những phân tích trên thử nghiệm đối chứng

ngẫu nhiên Đối với vi khuẩn tiết ESBL nói chung và Acinetobacter nói riêng, do tỷ

lệ đề kháng carbapenem và polymixin B còn rất thấp nên vẫn còn hiệu quả trong điều trị Tuy nhiên, polymixin B là kháng sinh có độc tính cao và đã bị rút ra khỏi sử dụng trên người nên được thay thế kháng sinh tương tự và cùng họ là colistin kháng hoàn toàn các kháng sinh nhưng vẫn chưa có một sự đồng thuận về hiệu quả Do vậy carbapenem (imipenem, meropenem) là kháng sinh được các nhà điều trị ưu tiên lựa chọn cao nhất nhưng cần phải lưu ý về hiện tượng đồng kháng của ESBL và tính không thấm của vi khuẩn Tuy nhiên, trong quá trình điều trị cũng không nên lạm dụng carbapenem vì có thể gây nguy hiểm cho khả năng nhạy cảm với kháng sinh trong tương lai Với quan điểm này, dạng thuốc kết hợp giữa β-lactam và chất ức

chế β-lactamase tỏ ra hiệu quả hơn (nhất là đối với Acinetobacter nhạy với chất ức

chế β-lactamase) như sự kết hợp của ampicillin/sulbactam, amoxicillin/clavulanate

và cefoperazon/sulbactam được sử dụng như là kháng sinh thay thế cephalosporin thế hệ 3 trong điều trị các nhiễm khuẩn (Livermore và Paterson, 2005; Al-Jasser, 2006; Bassetti và cs, 2008; Phạm Hùng Vân và cs, 2009)

Hiện nay, tại các cơ sở điều trị, ESBL đang là tác nhân nội dịch với tần số dao động bất thường, do vi khuẩn tiết ESBL có thể tạm trú mà không triệu chứng nên những kết quả phân lập từ bệnh nhân không triệu chứng và có triệu chứng cần được đưa vào phân tích dịch tễ học phân tử, bên cạnh việc tìm kiếm ở môi trường tự nhiên xung quanh khi phát hiện ra các loài vi khuẩn có liên quan di truyền Về cách

thực hiện, đối với cá nhân bệnh nhân thì cần tránh dùng cephalosporin thế hệ 3 và aztreonam hay cefuroxime, tránh đặt các thiết bị xâm nhập như ống thông tiểu hay đường truyền tĩnh mạch, các nhân viên y tế đảm bảo bàn tay sạch trước và sau khi khám trên bệnh nhân Ở mức độ bệnh viện thì cần giới hạn dùng cephalosporin thế

hệ 3, cách ly và lưu ý các bệnh nhân mang hay bị nhiễm khuẩn ESBL và cần khảo sát sự nhiễm khuẩn môi trường nếu xảy ra sự gia tăng vi khuẩn ESBL (Livermore và Paterson, 2005)

2.2.6 Các ESBL và gene ESBL của A baumannii

2.2.6.1 Các ESBL của A baumannii

A baumannii đã được biết rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên việc nghiên cứu

khả năng sản sinh β-lactamase của vi khuẩn này chỉ mới được nghiên cứu gần đây

(Pino và cs, 2007; Sinha và cs, 2007; Poirel và Nordmann, 2007)

PER-1 (Pseudomonas extended resistant) là ESBL đầu tiên được xác định ở

Pseudomonas aeruginosa vào 1993 với các đặc tính kháng penicillin, cephalosporin

(cefotaxime, ceftibuten, ceftazidime, cefepime), aztreonam nhưng không kháng carbapenem, cephamycin và vẫn còn nhạy với acid clavulanic (Poole, 2004; Poirel

và cs, 2005; Jeong và cs, 2005; Perez và cs, 2007) Sau đó, PER-1 được phát hiện ở

A baumannii trên diện rộng ở Thổ Nhĩ Kỳ có khả năng kháng ceftazidime từ 11 %

vào năm 1996 lên đến 31 % vào năm 2003 (Vahaboglu và cs, 1997; Vahaboglu và

cs, 2001; Poirel và cs, 2005; Kolayli và cs, 2005; Erac và Gulay, 2007) và tiếp tục được tìm thấy ở Hàn Quốc (Yong và cs, 2003; Jeong và cs, 2005; Lim và cs 2007), Pháp (Poirel và cs, 1999), Mỹ (Hujer và cs, 2006), Bỉ (Naas và cs, 2006), Rumani (Naas và cs, 2007a), Nga (Naas và cs, 2007b), Hunggari (Szabó và cs, 2008), Bungari (Strateva và cs, 2008) và Ấn độ (Joshi và cs, 2009) Bên cạnh đó, khả năng kháng carbapenem được tìm thấy ở Trung Quốc có liên quan đến PER (PER-like) (Wang và cs, 2007)

VER-1 được xem như là ESBL quan trọng thứ hai sau PER-1, đầu tiên được tìm thấy ở Pháp tại hầu hết các khoa chăm sóc tích cực (Poirel và cs, 2003) và sau

đó được tìm thấy ở Bỉ (Naas và cs, 2006)

CTX-M được tìm thấy đầu tiên cách đây 15 năm và rất hiếm gặp ở A

baumannii kháng cefotaxime và cetriaxone với CTX-M-2 tại Nhật (Nagano và cs,

2004) và Bolivia (Celenza và cs, 2006)

TEM rất hiếm gặp ở A baumannii, trong đó TEM-92 được phát hiện tại Ý

(Endimiani và cs, 2007) và TEM-116 được tìm thấy ở Amsterdam, Hà Lan (Naiemi

và cs, 2005)

SHV tương tự với TEM, SHV cũng rất hiếm thấy ở A baumannii chỉ với một

vài báo cáo xác định SHV-12 ở Hà Lan (Naiemi và cs, 2005) và SHV-5 từ các bệnh nhân bị thương trong cuộc chiến Apganixtan và Irac được điều trị tại Mỹ (Hujer và

cs, 2006) và ở Pháp từ một bệnh nhân có xuất xứ Mỹ (Naas và cs, 2007c)

OXA thì chỉ với OXA-37 có khả năng kháng cefotaxime và ceftazidime nên được xem như là ESBL (Navia và cs, 2002)

Bên cạnh đó, A baumannii với những ESBL khác tuy được xác định ở một

số nước trên thế giới như Chilê và Ấn Độ nhưng nội dung về ESBL chưa thể hiện được một cách chi tiết (Pino và cs, 2007; Sinha và cs, 2007)

2.2.6.2 Gene ESBL của A baumannii

Do nguồn gốc ESBL xuất phát từ β-lactamase nên gene ESBL được xác định

với tên gọi là bla (β-lactamase) và chỉ mới được nghiên cứu gần đây đối với A

baumannii Gene blaSHV (SHV-5 ở nhiễm sắc thể), blaTEM (TEM-92ở tranposon Tn3

và TEM-116 ở plasmid) và blaVER-1 ở integron lớp 1 là những gene ESBL rất hiếm gặp và đã được công bố chỉ ở một vài báo cáo (Poirel và cs, 2003, Naiemi và cs, 2005; Jacoby, 2006; Naas và cs, 2007c, Endimiani và cs, 2007)

Trong tất cả các gene ESBL của A baumannii, blaPER-1 được xác định đầu tiên và cho đến nay vẫn được tiếp tục nghiên cứu ở các nước trên thế giới Thổ Nhĩ

Kỳ là quốc gia đầu tiên xác định blaPER-1 (Vahaboglu và cs, 1997) và sau đó là Pháp (Poirel và cs, 1999), Hàn Quốc vào năm 2002 (Yong và cs, 2003) Tiếp theo là các nước Châu Âu như Bỉ (Naas và cs, 2006), Rumani (Naas và cs, 2007a), Nga (Naas

và cs, 2007b), Hunggari (Szabo và cs, 2008), Bungari (Strateva và cs, 2008) và Mỹ

từ các kết quả điều trị bệnh nhân trong cuộc chiến Apganixtan và Irac (Hujer và cs, 2006)

Các gene kháng được xác định ở vị trí của nhiễm sắc thể hoặc các “đơn vị” gene có thể di chuyển được như integron, transposon hoặc plasmid (Jacoby và Sutton, 1991; Levesque và cs, 1995, Vahaboglu và cs, 1997; Jacoby và Munoz-Price,

2005), blaPER-1 cũng như các gene kháng được xác địnhở transposon, cụ thể là

Tn1213 (do sự kết hợp giữa ISPa12 và ISPa13) (Poirel và cs, 2005; Naas và cs,

2006; Naas và cs, 2007a; Naas và cs, 2007b) Tuy nhiên, Poirel và cs đã chứng minh

được blaPER-1 không phải luôn luôn ở vị trí transposon Tn 1213 (Poirel và cs, 2005)

A)

B)

Hình 2.5: A) Sơ đồ xác định vị trí blaPER-1 A baumannii trên Tn1213

B) Sơ đồ xác định blaPER-1 A baumannii không xuất hiện trên Tn 1213

(gst): glutathione-S-transferase gene

(abct): ABC-type multidrug transporter gene

(Nguồn: Poirel và cs, 2005)

Bên cạnh đó, việc xác định vị trí blaPER-1 trên A baumannii trong những

nghiên cứu gần đây đã tìm thấy ở integron lớp 1 Integron lớp 1 bao gồm 2 vùng bảo

tồn với đầu 5’ chứa gene intI1 có thể mã hoá 337 amino acid biểu hiện cho sự tương đồng với các gene β-lactamase khác và đầu 3’ chứa gene qacEΔ1, sulI kháng

ethidium bromide, hợp chất amonium, sulfonamide, orf5 và xen giữa 2 vùng bảo tồn

là vùng biến đổi là vùng chứa gene có khả năng đề kháng hoặc có thể là vùng gene chưa biết chức năng gọi là “cassette” Vùng gene kháng ở vị trí integron đã được ghi nhận là vùng gene có khả năng đề kháng cao với hơn 5 loại kháng sinh Ngoài ra,

khi so sánh cấu trúc gene kháng của A baumannii ở vị trí integron có khả năng đề

kháng cao hơn đối với những vùng gene kháng không thuộc lớp integron (Koeleman, 2001; Ribera và cs, 2004; Erac và Gulay, 2007; Estapé, 2008; Poirel và cs 2008)

Hình 2.6: Cấu trúc integron lớp 1

(Nguồn: Estapé, 2008)

2.3 Một số phương pháp phát hiện ESBL

2.3.1 Phương pháp dựa vào kiểu hình (phenotypic test)

Hiện nay có nhiều phương pháp phát hiện ESBL, bên cạnh những phương pháp cổ điển thử nghiệm trên thạch hoặc đĩa kháng sinh truyền thống, xuất hiện các

hệ thống phát hiện ESBL tự động như Phoenix, Vitek…Tuy nhiên, về nguyên tắc xét nghiệm ESBL thì không có gì khác biệt đều gồm 2 bước:

Bước 1: khảo sát sự đề kháng hay giảm nhạy cảm trong những xét nghiệm sàng lọc với chất kháng sinh cephalosporin chỉ điểm, nhờ đó phát hiện các loài có thể tiết ESBL

Bước 2: thử nghiệm cộng hưởng giữa cephalosporin và clavulanate giúp phân biệt các loài ESBL (cộng hưởng dương tính) khỏi các loài kháng kháng sinh vì nhiều lý do khác (cộng hưởng âm)

Các phương pháp dựa vào kiểu hình gồm phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp Etest là những phương pháp cổ điển có khả năng phát hiện ESBL thông dụng nhất được sử dụng cho đến ngày nay (Livermore và Paterson, 2005)

2.3.1.1 Phương pháp đĩa đôi (double disk diffusion test)

Trong phương pháp đĩa đôi, đặt đĩa cephalosporin với đĩa kháng sinh chứa

clavulanate (amoxillin – clavulanate) cách nhau 15 – 20 mm trên thạch Kết quả

ESBL (+) khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate Mặt thuận lợi của phương pháp này là dễ thực hiện tại bất

cứ các phòng thí nghiệm nhưng có điểm bất lợi là khó có thể tìm được khoảng cách tối ưu giữa hai đĩa vì tuỳ vào nồng độ và vi khuẩn thử nghiệm do đó có thể bỏ sót một số vi khuẩn có khả năng tiết ESBL (Bradford, 2001; Livermore và Paterson, 2005; Al-Jasser, 2006; Wiegand và cs, 2007; Harada và cs, 2008)

2.3.1.2 Phương pháp đĩa kết hợp (cephalosporin/clavulanate combination)

Đĩa kết hợp gồm có 2 đĩa, một chứa cephalosporin và đĩa còn lại chứa đồng thời cephalosporin và clavulanate Khi đĩa chứa clavulanate tạo ra vòng vô khuẩn ≥

50 % hoặc ≥ 5mm so với đĩa tương ứng không có clavulanate thì có thể suy ra rằng

vi khuẩn có tiết ESBL Phương pháp này là lựa chọn tốt về độ nhạy và giá cả nhưng vẫn cần thiết thực hiện với đối chứng (Bradford, 2001; Livermore và Paterson, 2005; Al-Jasser, 2006; Wiegand và cs, 2007; Harada và cs, 2008)

2.3.1.3 Phương pháp Etest

Dùng que Etest với một đầu có chứa cephalosporin và đầu kia chứa cephalosporin và clavulanate Khi đầu chứa clavulanate cho MIC giảm ≥ 8 lần so với đầu chứa cephalosporin thì suy ra rằng vi khuẩn tiết ESBL và được thực hiện cùng với đối chứng Phương pháp này có độ chính xác cao, tuy nhiên không nhạy bằng phương pháp đĩa đôi và đắt tiền hơn

Ngoài ra, có thể xác định vi khuẩn tiết ESBL bằng các thử nghiệm tìm cộng hưởng trên kỹ thuật pha loãng kháng sinh trong môi trường lỏng hay agar, cũng với cách đọc kết quả xác định ESBL (+) khi cephalosporin đơn thuần có MIC lớn hơn hay bằng 8 lần MIC của cephalosporin kết hợp clavulanate (MIC được xác định dựa vào tiêu chuẩn của CLSI) (Bradford, 2001; Livermore và Paterson, 2005; Al-Jasser, 2006; Wiegand và cs, 2007; Harada và cs, 2008)

2.3.2 Phương pháp dựa vào kiểu gene (genotypic test)

Sự đề kháng cephalosporin trên các trực khuẩn không lên men còn có những

cơ chế đề kháng khác nên sự phát hiện ESBL trên các vi khuẩn này vẫn còn là thử thách Thực tế cho thấy rằng dựa vào kiểu hình chưa đủ phát hiện ESBL vì có thể bỏ sót một số trường hợp hoặc có thể nhầm lẫn với các cơ chế đề kháng khác, do đó dựa vào kiểu gene có khả năng khắc phục được các trường hợp này Tuy nhiên, phương pháp dựa vào kiểu gene chỉ có thể “bộc lộ” được sự biểu hiện của các gene kháng mà không thể hiện được sự “phản hồi” của kháng sinh Do đó, có thể kết hợp

cả 2 phương pháp dựa vào kiểu hình và kiểu gene được xem là giải pháp tối ưu nhất phát hiện ESBL (Bradford, 2001; Al-Jasser, 2006; Wiegand và cs, 2007)

2.3.2.1 Phương pháp oligotyping (PCR with oligonucleotide primers)

Đây là phương pháp phổ biến nhất và được thực hiện dễ dàng trong tất cả các phương pháp sinh học phân tử Phương pháp PCR với các đoạn mồi oligonucleotide

có khả năng khuếch đại các vùng gene đột biến mã hoá tiết ESBL (bla genes), các

đoạn mồi oligonucleotide có thể được chọn lựa trên các cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index) Tuy nhiên, phương pháp PCR này không phân biệt được sự khác nhau giữa các lớp ESBL và không phát hiện được điểm đột biến gene cụ thể, thậm chí cũng có thể không phân biệt được các vùng gene đột biến và vùng gene không đột biến nếu các đoạn mồi oligonucleotide không chuyên biệt và phản ứng PCR không được kiểm soát một cách nghiêm nhặt (Bradford, 2001; Al-Jasser, 2006)

2.3.2.2 Phương pháp PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)

Phương pháp PCR-RFLP dựa vào sự đa dạng về chiều dài của các đoạn phân

tử (Fragment Length Polymorphism) Từ sản phẩm PCR khuếch đại vùng gene đột biến tiết ESBL được phân cắt bởi enzyme cắt chuyên biệt (restriction endonuclease)

có khả năng xác định chính xác vị trí đột biến, tạo thành những đoạn phân tử có kích thước khác nhau (restriction fragment) và được phân tích trên gel agarose hay polyacrylamide Phương pháp này có thể phát hiện được vị trí điểm đột biến nhưng cần phải dựa vào nguồn thông tin về vùng gene kháng cần nghiên cứu (Bradford, 2001; Al-Jasser, 2006; Phạm Hùng Vân, 2009)

2.3.2.3 Phương pháp PCR-SSCP (PCR-Single Strand Conformation Polymorphism)

Sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA được giả định rằng là do sự thay đổi

ngoại hình của dây đơn (single-strand conformation), do đó phương pháp này được

dùng để phát hiện vùng gene đột biến trên sợi dây đơn tạo nên tính đa hình ở các dây đơn (Single Strand Conformation Polymorphism) Trong phân tích SSCP, dựa vào các đoạn mồi oligonucleotide chuyên biệt thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gene đột biến, sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa, lúc này hiện tượng “snap-back” sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp (các mẫu này phải được xử lý trong điều kiện lạnh để tránh hiện tượng đứt gãy cấu trúc), các cấu trúc thứ cấp này được đánh dấu bằng chất phóng xạ P32 hay nhuộm bạc và được điện di trên gel polyacrylamide, dựa vào kết quả diện di có thể phát hiện được vùng gene đột biến Ngoài ra, phương pháp PCR-SSCP kết hợp với phương pháp PCR-RFLP có thể phát hiện được vị trí đột biến dựa vào enzyme cắt chuyên biệt Tuy nhiên phương pháp này cần phải được thực hiện so sánh với DNA đối chứng (DNA có dạng “wilde type”) (Bradford, 2001; Al-Jasser, 2006)

2.3.2.4 Phương pháp LCR (Ligase Chain Reaction)

Phương pháp LCR có thể phát hiện các đột biến khác nhau của các ESBL trong cùng một phân lớp do có thể phân biệt được các trình tự DNA khác nhau chỉ ở một cặp base Về nguyên tắc, phương pháp LCR tương tự như phương pháp PCR Tuy nhiên, phương pháp LCR có thêm sự hiện diện của enzyme ligase có chức năng chỉ nối các mạch đơn DNA (one strand) khi đã được bổ sung hoàn chỉnh (full-match) bởi các đoạn mồi oligonucleotide chuyên biệt (được thiết kế dựa vào điểm đột biến cụ thể) và cứ thế tiếp tục được khuếch đại ở các chu kỳ nhiệt tiếp theo, còn đối với các các mạch đơn DNA không được các đoạn mồi oligonucleotide bổ sung hoàn chỉnh (mismatch) sẽ không được khuếch đại, nhờ đó có thể phát hiện được chính xác sự khác biệt ở một cặp base Sản phẩm của phản ứng LCR được phân tích trên thiết bị đo màu (nhưDNA array) (Kim và Lee, 2000; Bradford, 2001; Al-Jasser, 2006)

2.3.2.5 Phương pháp PCR và giải trình tự gene (sequence analysis)

Phương pháp PCR và giải trình tự được xem là “tiêu chuẩn vàng” trong tất cả các phương pháp dựa vào kiểu gene phát hiện ESBL vì không những có khả năng phát hiện các kiểu gene đột biến, vị trí đột biến một cách chính xác mà còn có thể tìm ra được các đột biến mới (Bradford, 2001; Wiegand và cs, 2007; Poirel và cs 2008)

Phương pháp này dựa vào phương pháp enzyme giải trình tự của Sanger (1977) do sự xuất hiện của các ddNTP có cấu trúc hoá học bị mất đi gốc –OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, là nơi để dNTP kế tiếp gắn vào và được thay bằng –H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau Trong quá trình tổng hợp DNA bổ sung (mẫu gene cần giải trình tự ở dạng DNA sợi đơn) sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP kéo vào tạo ra những đoạn DNA có độ dài khác nhau Những đoạn DNA này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các ddNTP được phát hiện bởi đầu đọc laser Trình tự gene của mẫu chính là trình tự bổ sung

các ddNTP được phát hiện bởi đầu đọc laser Quá trình giải trình tự gene được thực hiện theo thứ tự các bước: tinh sạch sản phẩm PCR, thực hiện phản ứng PCR sequencing tạo đoạn DNA gắn các ddNTP, tinh sạch sản phẩm đã gắn các ddNTP, điện di mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser (Phạm Hùng Vân, 2009)

Hiện nay, tình hình vi khuẩn đề kháng đa kháng sinh đang ở mức báo động, đặc biệt là nhóm trực khuẩn gram âm dễ mọc với cơ chế đề kháng tiết ESBL chiếm

tỷ lệ rất cao (Phạm Hùng Vân và cs, 2009) Trong đó, Acinetobacter thuộc nhóm vi

khuẩn đề kháng với hầu hết các loại kháng sinh và đồng thời cũng “xuất hiện” kiểu

hình tiết ESBL tương tự như nhóm Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và

Enterobacter Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định kiểu hình ESBL trên

A baumannii bằng phương pháp kháng sinh đồ và phương pháp PCR, đồng thời xác

định cụ thể gene blaPER-1 bằng phương pháp giải và so sánh trình tự gene

CHƯƠNG 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Dựa vào kết quả kháng sinh đồ với kiểu hình cộng hưởng theo chuẩn CLSI

2009 của 350 chủng Acinetobacter spp từ khoảng 3.000 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm

ở bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Tp Hồ Chí Minh từ tháng 01 năm 2009 đến tháng

06 năm 2010, chúng tôi đã chọn lọc được chỉ có 3 chủng Acinetobacter spp có kiểu

hình ESBL dương tính (mã code vi khuẩn là 1900, 2040 và 3040) và chọn 3 chủng

Acinetobacter spp có kiểu hình ESBL âm tính ngẫu nhiên làm đối chứng (gồm 999,

1122 và 1757)

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Thiết bị dụng cụ

- Máy ly tâm thường (Hitachi, Nhật)

- Tủ cấy vi sinh (Sanyo, Nhật)

- Máy vortex

- Máy PCR (MyCycler, Bio-Rad, Mỹ)

- Máy điện di ngang (Wide Mini Sub Cell GT/ PowerPac Bais, Bio-Rad)

- Máy đọc gel (GelDoc XR, Bio-Rad, Mỹ)

- Máy sấy khô (Nam Khoa, Việt Nam)

- Tủ hút ẩm

- Máy giải trình tự DNA tự động (ABI 3130XL genetic Analyzer, Mỹ)

- Tủ lạnh âm 20oC (Sanyo, Nhật)