ĐỊNH LƯỢNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VIRUS PRRS TRÊN ĐÀN HEO GIỐNG TỈNH ĐỒNG NAI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH LƯỢNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VIRUS PRRS TRÊN ĐÀN HEO GIỐNG TỈNH ĐỒNG NAI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ….

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Đại học Nông Lâm Tp.HCM

Đại học Nông Lâm Tp HCM

3 Phản biện 1 : TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY

Đại học Mở Tp.HCM

Đại học Nông Lâm Tp HCM

Hội Thú Y Việt Nam

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

Tháng 02/2000 – 01/2003: Công tác tại Phòng Khoa học, Trung tâm NC và HLCN Bình Thắng -Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Tháng 01/2003 – 06/2006: Công tác tại Phòng Di truyền giống vật nuôi – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Tháng 07/2006 đến nay công tác tại Phòng Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

Tình trạng gia đình: họ và tên chồng là Lê Việt Khoa, nghề nghiệp chuyên viên Thẩm định giá, kết hôn năm 2005, con gái tên là Lê Thu Giang sinh năm 2006

Địa chỉ liên lạc: Viện KHKTNNMN, 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, phường Đakao, quận 1, Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại liên hệ: 08.37262218 (NR) - 0982870774

Email: habiotechias@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn,

Lê Thị Thu Hà

LỜI CÁM ƠN

Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành đến Ba mẹ

Xin thành kính ghi ơn PGS.TS Trần Thị Dân đã hết lòng tận tâm giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình công tác, học tập và thực hiện luận văn này

Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Đình Quát, PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải

đã giúp đỡ tôi trước và trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Thúy – Viện Công nghệ Sinh học (Viện KHCN Việt Nam) đã ủng hộ vật chất, tinh thần và những kinh nghiệm trong quá trình làm đề tài

Chân thành cám ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm, Ban chủ nhiệm và Thầy Cô giáo

Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Chăn nuôi – Thú Y, Phòng Đào tạo sau đại học

đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để chúng tôi hoàn thành khóa học

Ban Giám đốc Viện KHKTNNMN, lãnh đạo Phòng CNSH, TS Chung Anh Dũng đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khóa học và hoàn thành luận văn này

TS Phạm Hùng Vân và các bạn Ngọc, Trang, Yến… phòng RD - Cty Nam Khoa đã hỗ trợ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài

Các trại heo giống Hố Nai, Vĩnh Cữu, Gia Kiệm, Trảng Bom và Anh Lê Việt Trương đã tạo điều kiện cho tôi thu thập mẫu để phục vụ thí nghiệm Các bạn Thu Phương (Navetco), Khánh Hưng (ĐHNL), Thu Hương, Thu Hường (Chi cục thú y Tp.HCM), Khánh Tùng (Viện Thú Y), tập thể lớp Cao học K.2007 và các bạn đồng nghiệp Viện KHNNMN đã giúp đỡ và động viện tôi trong suốt quá trình học tập Xin gửi đến lời biết ơn và lòng yêu thương chân thành nhất đến chồng và con tôi vì đã luôn động viên, giúp đỡ cho tôi trong công tác và hoàn thành luận văn này Chân thành cám ơn

Lê Thị Thu Hà

102 bản sao/ml cho dòng EU

Trong số 50 mẫu xét nghiệm bằng real-time RT-PCR, kết quả có có 22 (44%) mẫu nhiễm PRRSV dòng NA, 19 (38%) mẫu nhiễm PRRS dòng EU và 7 (14%) mẫu nhiễm đồng thời hai dòng EU và NA Lượng virus trong mẫu thực địa nhiễm dòng NA cao nhất là 108 bản sao/ml và thấp nhất vào khoảng 102 bản sao/ml Trên dòng EU lượng virus cao nhất được phát hiện ở mẫu thực địa là 107 bản sao/ml

và thấp nhất là 102 bản sao/ml Đối với mẫu nhiễm cả hai dòng EU và NA lượng virus phát hiện ớ mức cao nhất là 104 bản sao/ml và thấp nhất là 102 bản sao/ml Phân tích đặc tính di truyền dựa vào trình tự vùng ORF5 của 5 chủng virus PRRS xác định được bằng phần mềm MEGA 4.1 Các mẫu nghiên cứu đều thuộc dòng Bắc Mỹ, nằm cùng nhóm với chủng 07QNVN và các chủng độc lực cao của Trung Quốc Tương đồng giữa dòng NA và EU thấp 60-65%) Ba chủng nghiên cứu tại Đồng Nai, Bình Dương và TP HCM có độ tương đồng cao (95,2-98,5%), tương đồng cao với chủng Trung quốc độc lực (99,5%) nhưng tương đồng thấp với chủng

cổ điển VR-2332 và các vaccine nhược độc Besta và IngelVac Tuy nhiên với virus vaccine JXA1, các chủng nghiên cứu có độ tương đồng rất cao (99,5%)

Như vậy sử dụng real-time RT-PCR cho kết quả nhanh, nhạy, chính xác và phát hiện sớm virus gây bệnh cho heo nhằm hạn chế thiệt hại kinh tế chăn nuôi

SUMMARY

The study “Quantification and phylogenetic analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in breeding pigs of Dong Nai province” was carried out at Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam, and Namkhoa Biotek Co., from 6/2009 to 9/2010 The aims were to apply qPCR qualifying ORF7 copies of PRRSV and to find the genetic diversity based on the ORF5 sequence of PRRSV isolates in Vietnam The results were as follows:

Primer and Taqman described by Lurchachaiwong et al (2008) and Kleiboeker et al (2005) were used in the protocol The detection limit of the assay was approximately 102/ml copies of EU-strain RNA (from Amervac-vaccine virus), and 103/ml copies of NA-strain RNA (from the cell culture liquid of LMY/2002 strain)

Of the 50 samples tested by real-time RT-PCR using Taqman, 22 samples were NA-strain positive, 19 samples EU-infected, and 7 samples positive to both

NA and EU The detected quantities of RNA copies in samples were highest at 108

copies/ml and lowest 102 copies/ml for NA strain With EU geneotype, quantities of RNA copies in samples were highest at 107/mll and lowest 102/ ml copies The range was 102 - 104 copies/ml as samples infected with both NA and EU geneotype

Only NA geneotype was used for phylogenetic analysis Sequence analysis revealed that these collections shared a close relationship with Chinese virulent PRRSV and 07QNVN isolated in Vietnam in 2007 as well as JXA-1 vaccine virus (95,2 -100%) All three samples collected from Dong Nai, Binh Duong and Ho Chi Minh City were identical 95,2 – 98,5 %, and only 85,2 – 88% to commercial vaccine

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời cám ơn iv

Tóm tắt v

Mục lục vii

Danh sách chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình xii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

2 TỔNG QUAN 4

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) 4

2.2 Virus PRRS 5

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus PRRS 5

2.2.2 Phân loại dòng virus 7

2.2.3 Chủng virus Trung Quốc 8

2.3 Các phương pháp chẩn đoán 9

2.3.1 Các phương pháp xét nghiệm kháng thể 9

2.3.2 Các phương pháp phát hiện kháng nguyên 10

2.3.3 Phương pháp khuếch đại 11

2.3.3.1 Phương pháp RT-PCR 11

2.3.3.2 Phương pháp nested RT-PCR 12

2.3.3.3 Phương pháp real-time RT- PCR 12

2.3.4 Phương pháp phân tích trình tự 19

2.4 Lượt khảo các nghiên cứu liên quan trên thế giới về PRRSV 19

2.4.1 Nghiên cứu sử dụng real-time RT-PCR 19

2.4.2 Phân biệt chủng virus PRRS dựa vào giải trình tự 21

2.5 Lượt khảo các công trình nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam 22

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.1 Thời gian 25

3.1.2 Địa điểm 25

3.2 Nội dung nghiên cứu 25

3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25

3.3.1 Vật liệu mẫu: 25

3.3.2 Hóa chất nghiên cứu 27

3.3.2.1 Hóa chất tách chiết RNA 27

3.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng RT-PCR và real-time RT-PCR 27

3.3.2.3 Hóa chất và kít điện di Chip 28

3.3.2.4 Hóa chất tinh sạch sản phẩm RT-PCR 28

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 29

3.4 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.1 Thu thập mẫu 29

3.4.2 Tách chiết RNA 29

3.4.3 Khuếch đại vùng gene ORF7 bằng kỹ thuật RT-PCR 29

3.4.4 Thực hiện real-time RT-PCR định tính với RNA chuẩn dựa vào ORF7 30

3.4.5 Định lượng virus PRRS trong mẫu thực địa bằng real-time RT-PCR 31

3.4.6 Giải trình tự chuỗi ORF5 và xây dựng cây sinh dòng 32

3.4.6.1 Khuếch đại gene ORF5 32

3.4.6.2 Giải trình tự gene ORF5 trên hai dòng NA, EU 33

3.4.6.3 Phân tích trình tự chuỗi và xây dựng cây sinh dòng 33

3.5 Phân tích dữ liệu 35

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Thăm dò quy trình real-time RT-PCR trên ORF7 37

4.1.1 Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR 37

4.1.2 Kết quả thực hiện real-time RT-PCR định tính trên mẫu chuẩn 38

4.1.2.1 Kết quả thực hiện real-time RT-PCR định tính đối với dòng EU 38

4.1.2.2 Kết quả thực hiện realtime RT-PCR định tính đối với dòng NA 38

4.1.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy, đường chuẩn tuyến tính và chứng nội tại 39

4.2 Thực hiện real-time PCR định lượng virus trong các mẫu thực địa 43

4.3 Giải trình tự chuỗi ORF5 của virus PRRS 47

4.3.1 Khuếch đại gene ORF5 của virus PRRS 47

4.3.1.1 Khuếch đại ORF5 của Bắc Mỹ 47

4.3.1.2 Khuếch đại ORF5 của dòng Châu Âu 48

4.3.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào trình tự vùng ORF5 của virus 48

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

IFA Indirect flourescent antibody

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay

LDV Lactase dehydrogenease elevating virus

Open reading frame ORF

PEARS Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

nRT-PCR Nested reverse transcriptase

RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction SHFV Simian hemorrhagic fever virus

SIRS Swine infertility and respiratory syndrome

DANH SÁCH BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Các cặp chất phát quang và chất hấp phụ thường sử dụng 16

Bảng 2.2 Kết quả phát hiện virus PRRS bằng các phương pháp khác nhau 21

Bảng 3.1: Nguồn mẫu trong nghiên cứu 25

Bảng 3.2: Danh sách mồi (primer) và mẫu dò (Taqman probe) 28

Bảng 3.3: Danh sách các mẫu được định trình tự chuỗi trong nghiên cứu 34

Bảng 3.4: Các chủng virus PRRS tham khảo trên ngân hàng Gene 34

Bảng 4.1: Phân bô mẫu có kết quả real-time PCR định lượng virus PRRS 43

Bảng 4.2: Phần trăm tương đồng trình tự nucleotidee dựa vào vùng gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS 56

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc bộ gene virus PRRS 7

Hình 2.2: Biểu đồ khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang 13

Hình 2.3: Biểu đồ đánh giá mức độ tối ưu của phản ứng 14

Hình 2.4: Đường chuẩn đánh để đánh giá mức độ tối ưu của phản ứng 14

Hình 4.1: Sản phẩm khuếch đại vùng ORF7 37

Hình 4.2: Biểu đồ khuếch đại real-time RT-PCR định tính dòng EU 38

Hình 4.3: Biểu đồ khuếch đại real-time RT-PCR định tính dòng NA 39

Hình 4.4: Biểu đồ khuếch đại mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng 39

Hình 4.5: Đường chuẩn tuyến tính các độ pha loãng dòng EU 40

Hình 4.6:Biểu đồ khuếch đại của các độ pha loãng từ 10-3 đến10-8 40

Hình 4.7: Đường chuẩn tuyến tính dựa vào 3 độ pha loãng chuẩn dòng NA 41

Hình 4.8: Kết quả real-time RT-PCR kênh HEX dòng NA giữa chuẩn và mẫu 42

Hình 4.9: Kết quả real-time RT-PCR dòng EU kênh FAM giữa chuẩn EU và mẫu 42 Hình 4.10: Tương quan giữa mật độ hùynh quang và Ct dòng NA 44

Hình 4.11: Tương quan giữa mật độ huỳnh quang và Ct dòng EU 45

Hình 4.12: Tương quan giữa mật độ huỳnh quang và Ct 2 dòng EU và NA 46

Hình 4.13: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại dòng NA 47

Hình 4.14: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại dòng EU 48

Hình 4.15: Cây sinh dòng của virus PRRS dựa vào vùng ORF5 54

Để phát hiện virus PRRS, các phương pháp huyết thanh học, nuôi cấy tế bào được sử dụng phổ biến Gần đây kỹ thuật RT-PCR đã được áp dụng rộng rãi do những tính ưu việt của nó, tuy nhiên, RT-PCR cũng cho kết quả dương tính giả Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, kỹ thuật real-time RT-PCR đã được

áp dụng để khắc phục những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học, phân lập virus và giảm đi những bất lợi của RT-PCR thông thường Đối với virus PRRS ORF7 là vùng gene được chú trọng khi áp dụng real-time RT-PCR để phân biệt hai chủng EU và NA

Real-time RT-PCR cho phép định lượng số bản sao khởi đầu của khuôn mẫu với độ nhạy cao, đồng thời độ đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện các tác nhân gây bệnh không thua kém so với phương pháp nuôi cấy tế bào (Egli và cs, 2001; Phạm Hùng Vân, 2009) Kỹ thuật này có thể định lượng và phát hiện sớm lượng virus ở mức thấp, đồng thời làm giảm nguy cơ nhiễm bẩn và các thao tác sau khuếch đại PCR, tiết kiệm được thời gian xét nghiệm Hơn nữa, nhờ vào kết quả định lượng cho phép nhà chuyên môn có hướng điều trị, loại thải, công bố dịch hay tiêu hủy heo bị nhiễm virus này Do đó có thể nói việc định lượng virus trong việc chẩn đoán

là vùng biến đổi nhiều nhất và có đặc tính di truyền cao giữa các chủng trong khi ORF6 là vùng bảo tồn nhất Để hiểu rõ hơn về sự hiện diện, phân bố chủng và biến đổi di truyền của chủng virus thực địa, đề tài này sẽ giải trình tự ORF5 của virus PRRS và so sánh với một số chủng tại Việt nam và trên thế giới

Đồng Nai là tỉnh có số lượng heo đứng thứ 2 của cả nước, với tổng đàn heo

khoảng 1.225,7 triệu con (cả nước 27.627,7 triệu con) (Niên gián thống kê, 2009)

Theo số liệu của Cục thú Y, tháng 8/2010 dịch PRRS bùng phát trở lại tại tỉnh này sau một năm công bố dịch, điều này chứng tỏ Đồng Nai với nguy cơ tái phát dịch có

thể xảy ra bất kỳ lúc nào.Vì vậy việc tiến hành đề tài “Định lượng và giải trình tự

virus PRRS trên đàn heo giống Tỉnh Đồng Nai” là cần thiết thực nhằm phát hiện

sớm lượng nhiễm virus, và đặc điểm của virus thực địa thông qua kết quả định trình

tự chuỗi sẽ giúp hiếu biết thêm về đặc điểm dịch tễ, đánh giá được khuynh hướng biến đổi di truyền của chủng virus thực địa và góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng vaccine, giảm thiệt hại kinh tế

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Ứng dụng real-time RT-PCR trong việc phát hiện mẫu nhiễm và định lượng virus PRRS trên heo

- Xác định đặc tính di truyền dựa trên vùng ORF5 của virus gây bệnh trên đàn heo giống tỉnh Đồng Nai

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Thăm dò quy trình real-time RT-PCR với RNA chuẩn của virus PRRS

- Định lượng virus PRRS dựa trên ORF7 bằng quy trình real-time RT-PCR

đã thiết lập

3

- Giải trình tự chuỗi ORF5 của virus PRRS trên mẫu ở Đồng Nai và hai địa

phương lân cận, từ đó so sánh với các chủng trên thế giới từ Ngân hàng gene

4

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS)

Hội chứng PRRS xảy ra trên heo mọi lứa tuổi, triệu chứng biểu hiện trên heo nái với đặc điểm sẩy thai ở giai đoạn mang thai cuối, làm chết thai, heo con sinh ra yếu, tỉ lệ chết cao ở heo sơ sinh, nái phối nhiều lần không đậu Biểu hiện rối loạn

hô hấp, chậm lớn trên heo sơ sinh và heo choai (Goyal, 1993; Meulenberg, 1993, 1998); đối với heo đực giống có biểu hiện giảm tính hăng, hoạt lực tinh trùng giảm, hiệu quả phối giống không cao (Wang, 1994) Hội chứng PRRS gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế của ngành chăn nuôi heo công nghiệp trên toàn cầu (Albina, 1997; Blaha, 2000; Gao và cs, 2004; Yoon và cs, 2008; Zimmerman và cs, 2008; Balka và cs, 2009)

PRRS được phát hiện lần đầu tiên ở Hoa kỳ và Canada năm 1987 (Keffaber, 1989; Wensvoort và cs, 1991; Colin, 1992; Abina, 1997), vài năm sau đó ở các nước châu Âu (Paton và cs, 1991; Wensvoort và cs, 1991; Benfield, 1994) và xuất hiện ở châu Á vào năm 1991 (Mukarami và cs, 1994; Shimizu và cs, 1994), năm

1997 PRRS được phát hiện ở Việt Nam trên đàn heo nhập từ Mỹ Kể từ khi xuất hiện, hội chứng này đã được gọi nhiều tên khác nhau như: bệnh bí ẩn trên heo (Mystery Swine Disease - MSD), bệnh tai xanh (Blue Ear Disease - BED), hội chứng vô sinh và hô hấp trên heo (Swine infertility and respiratory syndrome SIRS) hội chứng sẩy thai dịch vùng và hô hấp trên heo (Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome – PEARS) Cho đến năm 1992, tại hội nghị quốc tế về bệnh này ở St Paul, Minnessota, Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí sử dụng tên chung của bệnh này là “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS)

5

Năm 2006, PRRS đã xảy ra đại dịch ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc bệnh Trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của virus thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây chết rất nhanh trên heo Và cho đến nay, hội chứng PRRS đã xảy ra hầu hết ở các nước có ngành chăn nuôi heo công nghiệp trên toàn thế giới Gần đây các ổ dịch xảy ra tại Thụy Điển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc

và Việt Nam với chủng độc lực cao, diễn biến ngày càng phức tạp (FAO, 2007) Năm 2007, dịch PRRS chính thức được công bố tại tỉnh Hải Dương của nước

ta và từ đó đến nay dịch vẫn liên tục xảy ra ở một số đại phương trong cả nước

Tính đến ngày 25/9/2010 cả nước có 32 tỉnh là là Nghệ An, Cao Bằng, Sóc Trăng,

Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước,

Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, Đăk Lăk, Hậu Giang, Lâm Đồng, Tây Ninh, Bà

Rịa Vũng Tàu, An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Kiên Giang, Cà Mau,

Kon Tum, Đăk Nông, Gia Lai, Trà Vinh, Bình Thuận, Ninh Thuận và Phú Yên có

dịch PRRS chưa qua 21 ngày (Cục Thú Y tháng 9/2010)

2.2 Virus PRRS

Virus PRRS thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades cùng

với virus gây viêm động mạch trên ngựa (Equine arteritis virus- EAV), virus gây sốt xuất huyết trên khỉ (Simian hemorrhagic fever virus -SHFV) và virus gây tăng men lactate dehydrogenease chuột (Lactase dehydrogenease elevating virus - LDV) (Thiel và cs, 1993; Cavanagh, 1997; Dea và cs, 2000)

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus PRRS

Virus PRRS là virus sợi đơn, thẳng, có vỏ bọc với đường kính 50 – 60 nm, bề

mặt khá nhẵn và có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm (Cavanagh, 1997; Cho và Dee, 2006; Zimmerman và cs, 2006)

Các ORF của bộ gene mã hóa cho sáu protein cấu trúc của virus lần lượt là GP2, GP3, GP4, GP5, M, N Trong đó GP5, M và N là 3 protein cấu trúc chính; GP2, 3 và 4 là những protein cấu trúc thứ cấp Trình tự ORF5 của hai dòng virus Châu Âu và Bắc Mỹ có sự khác biệt lớn nhất, do đó protein GP5 (25kDa) là protein cấu trúc khác biệt nhiều nhất và chỉ có khoảng 51 -55% acid amin (aa) tương đồng

6

Trong khi đó protein M (do ORF6 mã hóa), có khối lượng 18 kDa, không liên kết với phân tử đường, là protein ổn định nhất, có 78- 81% aa tương đồng Protein M có rất nhiều trong lưới nội chất, hình thành các phân tử dị hợp liên kết với GP5 bằng cầu nối disulfide Các phân tử dị hợp này không liên kết chặt chẽ trong hạt virus và được cho là protein cần thiết cho sự gây nhiễm của virus ORF7 và protein M quan trọng cho phát hiện virus bằng PCR (Inoue và cs, 2006), và là mục tiêu quan trọng cho phát hiện huyết thanh bằng ELISA và các phương pháp khác (Seuberlich và cs, 2000; dẫn liệu của Yoon và cs, 2008) Protein N (15kDa) là protein cơ bản nhất của virus, được phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm và chiếm khoảng 20-40% lượng protein có trong hạt virus (Meulenberg, 2000)

Virus PRRS được phân lập và định danh vào năm 1991, chuỗi hệ gene đầy

đủ được xác lập vào năm 1993 Bộ gene của virus PRRS dài khoảng 15 kb (Stadejek và cs, 2002) bao gồm 9 ORF (open reading frame), trong đó 2 ORF mã hóa protein polymerase (ORF1a và ORF1b), 7 ORF mã hóa những protein cấu trúc (ORF 2a, 2b, 3, 4, 5, 6, 7) (Meulenberg và cs, 1993; Dea và cs, 2000; trích dẫn bởi Yoon và cs, 2008) Theo dữ liệu giải trình tự của bộ gene virus PRRS, ORF1a và 1b chiếm gần 75% bộ gene, mã hóa các enzyme cho nhân bản virus (protein không cấu trúc - nsp) Những protein từ hai vùng này sẽ tham gia vào quá trình chuyển hóa để tạo thành 12 protein nhỏ hơn nhờ protease do virus tạo ra Chức năng chính xác của các protein này vẫn chưa được hiểu hết, chỉ biết rằng chúng liên quan đến việc mã hóa RNA và dịch mã Protein nucleocapsid (N) được mã hóa ở vùng ORF7 và protein màng (M) được mã hóa ở vùng ORF6 là các protein không được glycosyl hóa Ngược lại, GP2a (mã hóa bởi ORF 2a), GP3 (ORF 3), GP4 (ORF 4), và GP5 (ORF5) là những protein được glycosyl hóa Gần đây, phát hiện thêm một protein mới được mã hóa bởi một vùng nằm trong đoạn ORF2 (được gọi là vùng ORF2b) Vùng ORF2b này mã hóa cho một protein nhỏ không glycosyl hóa, được gọi là protein 2b ở PRRSV và protein E ở EAV (Snijder và cs, 1999; Meulenberg, 2000;

Wu và cs, 2001) Protein gây đáp ứng kháng thể sớm nhất trong virion là protein nhân (nucleocapsid) được quy định bởi ORF7 (Plana-Duran và cs, 1997) và hầu hết

2.2.2 Phân loại dòng virus

Hiện nay, virus PRRS đã được xác định với hai kiểu gene chính, đó là kiểu gene có nguồn gốc từ châu Âu (EU- type 1) và kiểu gene có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA- type 2) (Meulenberg và cs, 1993; Nelsen và cs, 1993; Murtaugh và cs, 1995; Nelsen và cs, 1999) Nhiều báo cáo về so sánh chuỗi gene đã cho thấy sự khác biệt

di truyền quan trọng giữa hai nhóm này Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gene NA, mặc

dù một số báo cáo cho thấy đã phân lập được kiểu gene EU (Ropp và cs, 2004) Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gene trên đã được xác định Tuy nhiên, bên trong mỗi kiểu gene lại có sự khác nhau giữa các chủng Sự khác nhau này phụ thuộc vào

sự khác nhau trong chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng virus

ORF1a, ORF1b: Protein không cấu trúc

ORF2a, ORF3, ORF4 (GP2, GP3, GP4): Protein màng

ORF5 (E): Protein vỏ ngoài

ORF6 (M): Protein gian màng

ORF7 (N): Protein Capsid

Gene mã hóa RNA polymerase Các gene cấu trúc

8

Theo Mardassi (1994) và Meng (1995), sự tương đồng về trình tự nucleotidee giữa virus thuộc kiểu gene Châu Âu và kiểu gene Bắc Mỹ chỉ khoảng 67 % Những nghiên cứu về trình tự virus hai kiểu gene này cho thấy chúng ít tương đồng về trình

tự nucleotidee và aa (Allende và cs, 1999; Nelsen và cs, 1999; Suarez và cs, 1996)

So sánh chi tiết trình tự nucleotidee trên vùng ORF1 của virus Lelystad (LV)

ở châu Âu và 2 chủng virus thuộc kiểu gene Bắc Mỹ (Allende và cs, 1999) đã cho thấy nhiều khác biệt trong vùng gene này, đặc biệt là các khác biệt nằm trên nsp2 (protein không cấu trúc 2) Protein nsp2 của kiểu gene Bắc Mỹ dài hơn nsp2 của Châu Âu (Lelystad virus) khoảng 102 aa, hơn nữa, trình tự aa tương đồng giữa 2

kiểu gene này chỉ đạt khoảng 32 %

2.2.3 Chủng virus Trung Quốc

Hội chứng PRRS đã xuất hiện ở Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to lớn cho ngành công nghiệp chăn nuôi heo của quốc gia này (Chen và cs, 2006) Gần đây, dòng virus PRRS (PRRSV) của Trung Quốc độc lực cao đã được nhắc đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết với

tỉ lệ cao Nhiều công trình nghiên cứu đã cung cấp những thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV này với các chủng virus khác trên thế giới, đồng thời thiết lập những giả thiết ban đầu cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các chủng virus độc lực cao như hiện nay (Gao và cs, 2004; Chen và cs, 2006; An và cs, 2007; Tian

và cs, 2007; Feng và cs, 2009) Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn bùng nổ ở Trung Quốc gây tỷ lệ chết lớn và chủ yếu ảnh hưởng đến heo nái và heo trưởng thành Theo Tian và cs (2007) virus gây bệnh vẫn là PRRSV nhưng với độc lực cao hơn nhiều với đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở aa 482 và đột biến thứ hai là mất đoạn liên tục 29 aa từ aa 534 – 562 Từ các kết quả này, Tian và cs (2007) đã xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc kiểu gene Bắc Mỹ với vùng tiến hóa tiềm năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1 Điều này có thể do nguyên nhân tiến hóa của các chủng virus Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hưởng về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ và ẩm độ cao vào mùa hè hay sự nhiễm các vi khuẩn thứ

9

phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng virus độc lực Đây cũng chính là chủng virus PRRS gây ra trận dịch từ 2007 tại Việt Nam có độ tương đồng khoảng 99% chủng virus Trung Quốc (Feng và cs, 2009)

2.3 Các phương pháp chẩn đoán

Để có kết luận chính xác về hội chứng PRRS, cần phải kết hợp việc tìm hiểu thông tin về quá trình phát triển bệnh, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và điều không thể thiếu là các thông tin về tình hình bệnh trong trại chăn nuôi và vùng chăn nuôi lân cận Việc phối hợp giữa chẩn đoán phân biệt các bệnh dựa trên triệu chứng lâm sàng và thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm PRRS là hết sức cần thiết để nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện bệnh, giảm thiệt hại kinh tế cho trại chăn nuôi

Cần thực hiện chẩn đoán phân biệt PRRS với các bệnh như: cúm heo, dịch

tả, viêm não Nhật Bản, giả dại, bệnh do Circovirus type 2, Enterovirus, Parvovirus,

Leptospira Trong chẩn đoán virus, có thể sử dụng các phương pháp huyết thanh

học như: kháng thể huỳnh quang, hóa mô miễn dịch, ELISA Phương pháp nuôi cấy phân lập virus cho độ chính xác cao nhưng tốn nhiều thời gian Gần đây, các phương pháp sinh học phân tử như: RT- PCR, nested RT- PCR, real-time RT- PCR, phân tích trình tự đã được sử dụng phổ biến giúp chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh đạt hiệu cao hơn

2.3.1 Các phương pháp xét nghiệm kháng thể

Các phương pháp như phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp – IFA,

trung hòa huyết thanh – SN, miễn dịch với peroxidase một lớp – IPMA, và ELISA được dùng để phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS Xét nghiệm kháng thể

huỳnh quang gián tiếp IFA (indirect flourescent antibody) có độ đặc hiệu cao đến

99,5% nhưng độ nhạy khác nhau giữa các cá thể Độ nhạy phụ thuộc vào thao tác xét nghiệm, sự khác biệt giữa kháng nguyên và kháng thể trên heo IFA cho phép phát hiện kháng thể virus PRRS đối với heo đã nhiễm từ 2- 3 tháng, nhưng không thể phát hiện kháng thể virus PRRS ở heo bị nhiễm sau 5 tháng (Yoon và cs, 1992; Yoon và cs, 1995; Christopher-Hennings và cs, 2002)

Xét nghiệm ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) có độ nhạy và độ

đặc hiệu cao, và có thể sử dụng ELISA trực tiếp hay gián tiếp một cách đơn giản hơn so với hai phương pháp IPMA và IFA (Albina và cs, 1992; Yoon và cs, 1995) Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của ELISA là có thể cho kết quả dương tính giả và không thể phát hiện kháng thể sau khi heo nhiễm 4 -10 tháng Hiện nay, kít dùng phát hiện kháng thể thường dùng là kít ELISA HerdCheck® 2XR (IDEXX-Mỹ), đây có thể được coi là tiêu chuẩn vàng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS, có

độ nhạy cao, đặc hiệu, chuẩn và nhanh chóng Phương pháp này có thể phát hiện được kháng thể PRRS trên heo 9 ngày sau khi nhiễm, và đạt ngưỡng cao nhất ở 30-

50 ngày sau nhiễm (Zimmerman và cs, 2006)

Các phương pháp IFA, SN và ELISA được sử dụng nhiều trong hầu hết các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ, trong khi đó miễn dịch một lớp IPMA (immunoperoxidase monolayer assay) được sử nhiều ở châu Âu IPMA thường dùng để phát hiện trên heo nhiễm sớm, có thể phát hiện heo nhiễm sau 7 – 15 ngày

và có thể phát hiện kháng thể đối với heo sau ba tháng sau nhiễm, nhưng không thể phát hiện kháng thể ở heo sau nhiễm 11- 12 tháng (Yoon và cs, 2003)

2.3.2 Các phương pháp phát hiện kháng nguyên

Phương pháp kháng thể huỳnh quang FA (fluorescent antibody) và hóa mô miễn dịch IHC (immunohistochemistry staining) có thể phát hiện virus PRRS trên mẫu mô Tuy nhiên độ đặc hiệu và độ nhạy không cao so với một số phương pháp khác Bên cạnh đó việc thu nhận mẫu có tác động lớn đối với kết quả của FA (Halbur và cs, 1995; Rossow và cs, 1999)

Môi trường thích hợp cho việc nuôi cấy phân lập là đại thực bào phế nang heo - PAM (prorcine alveolar marcrophage) và các tế bào thận khỉ (CL-2621 và

MARC-145) (Benfield và cs, 1992; Kim và cs, 1993) Nuôi cấy trên môi trường PAM có độ nhạy hơn MARC-145 (Yoon và cs, 2003), các dòng Châu Âu thích hợp hơn khi nuôi cấy trên môi trường PAM Các mẫu thu nhận từ phổi, huyết thanh, hạch bạch huyết, hạch amidan, hầu họng đều thích hợp cho việc nuôi cấy phân lập RNA virus phân lập từ dịch chiết tế bào cho tỉ lệ thành công trong RT-PCR cao hơn RNA thu nhận từ mẫu trực tiếp Mặc dù nuôi cấy phân lập là phương pháp truyền thống trong việc xác định virus PRRS nhưng tốn nhiều thời gian và khó thực hiện

2.3.3 Phương pháp khuếch đại

2.3.3.1 Phương pháp RT-PCR

Trong những năm gần đây, phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reation) được sử dụng rất nhiều để phát hiện virus PRRS trong huyết thanh và các mẫu xét nghiệm khác (Christopher-Hennings và cs, 1995; Legeay và cs, 1997; Spagnuolo-Weaver và cs, 2000; Christopher-Hennings và cs, 2001) và phân biệt hai dòng Châu Âu và Bắc Mỹ (Mardassi và cs, 1994; Egli và cs, 2001) Christopher-Hennings và cs (2001) cho rằng virus PRRS không những được phát hiện trong tinh dịch vào 11 ngày sau khi lây nhiễm cho heo mà còn có thể tìm thấy trong huyết thanh, bạch cầu đơn nhân và mô của heo đực Yorkshire, Hampshire và Landrace bằng phản ứng PCR Phương pháp RT-PCR phát hiện virus thường khuếch đại vùng gene ORF6, ORF7, đó là vùng có trình tự nucleotidee bảo tồn nhất mà có thể phân biệt giữa hai dòng virus PRRS Trong khi đó vùng ORF5 cho thấy có sự biến đổi của virus nhiều nhất (Wasilk và cs, 2004) Kết quả nghiên cứu ở Thái Lan trên 2/3 chủng được tìm thấy đều thuộc dòng châu Âu, có lẽ vì Thái Lan là nước liên tục nhập heo từ cả Châu Âu và Bắc Mỹ (Larochelle và cs, 2003)

So với các phương pháp phân lập virus, hóa mô miễn dịch và kháng thể hùynh quang, phương pháp RT-PCR có các ưu điểm hơn ở độ nhạy và tính đặc hiệu, ít tốn thời gian hơn, phát hiện được virus trên heo nhiễm cấp và mãn tính và trong một số trường hợp như thai tự tiêu, mẫu tinh dịch, phân Phương pháp này hỗ trợ rất nhiều và là bước cần thiết để có được sản phẩm PCR cho việc giải trình tự Tuy nhiên, phương pháp này khó phát hiện virus PRRS dòng Châu Âu và không đủ

nhạy để phát hiện virus PRRS ở mức nhiễm thấp (Đặng Ngọc Thùy Dương, 2009; Huỳnh Thị Thu Hương, 2009) Vì thế, để phát hiện sớm mức nhiễm virus PRRS, nhất là trong công tác nhập và xuất heo giống cần có những kỹ thuật với độ nhạy cao hơn như nested RT-PCR hay real-time RT- PCR

2.3.3.2 Phương pháp nested RT-PCR

Phương pháp nested RT-PCR (nRT-PCR) cải thiện độ nhạy của PCR Trong nghiên cứu của Christopher-Hennings và cs (1995), dùng phương pháp nested RT-PCR với các mồi từ khung đọc mở ORF 1b đến ORF7 cho phép phát hiện virus PRRS ở nồng độ 10 virion/ml tinh dịch, nghiên cứu cũng cho thấy các RNA của vius PRRS được phát hiện trong các phân đoạn tế bào của tinh dịch Ưu điểm của nRT-PCR là làm tăng độ nhạy của PCR khi mà mồi cho trình tự đặc hiệu muốn tìm

có độ nhạy thấp Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của nRT-PCR là nguy cơ ngoại nhiễm cao do phải mở ống PCR vòng trong để cho sản phẩm PCR vòng ngoài vào Nhằm giúp công tác phát hiện và kiểm soát dịch bệnh ngày càng phức tạp như hiện nay, cần tìm ra một kỹ thuật cho kết quả xét nghiệm nhanh, chính xác, nhạy và đặc hiệu cao như Real-time RT-PCR là thiết thực với nhu cầu thực tế

2.3.3.3 Phương pháp real-time RT- PCR

Real-time PCR định lượng (qPCR) là một công cụ tốt trong chẩn đoán vì tính nhạy cao, đồng thời độ đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện các tác nhân gây bệnh không thua kém so với phương pháp nuôi cấy tế bào (Egli và cs, 2001; Kleiboeker

và cs, 2005; Phạm Hùng Vân, 2009) Khi Real-time RT-PCR cho kết quả dương tính, nghĩa là mẫu thử bị nhiễm tác nhân gây bệnh nhưng xác định chính vật nuôi này có bệnh hay không lại là vấn đề khác Ngược lại khi kết quả định lượng là âm tính cho dù lấy mẫu và xét nghiệm chính xác, cũng không thể nói rằng vật nuôi này không bệnh, do bởi trong vật nuôi này vẫn còn mang virus trong máu nhưng trong giai đoạn miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể còn lấn át được virus nên PRRS chỉ

có trong huyết thanh và tạo ra các kháng nguyên bề mặt nhưng không có RNA Đây chính là trường hợp heo lành bệnh nhưng vẫn nhiễm virus PRRS và vẫn có nguy cơ

Phản ứng bắt đầu bằng một đường cong khuếch đại mẫu (hình 2.2) Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại trong ống, được trình bày ở trục y Đường cong khuếch đại có 2 pha, một pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn định Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh quang là không thể phát hiện được cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép phát hiện được tín hiệu huỳnh quang Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi

đủ cho một tín hiệu huỳnh quang trên mức nền Vì vậy, phản ứng sẽ có Ct thấp hơn hoặc sớm Ngược lại, nếu lượng mẫu lúc đầu phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng trên mức nền, Ct cao hoặc muộn hơn Các dạng tương quan này là cơ sở cho định lượng của real-time RT-PCR

(2) Đường chuẩn của real-time RT-PCR

Đường biểu diễn chuẩn (standard curve) là một đường tuyến tính đi qua các tọa độ xác định bởi số lượng bản RNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn và chu kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản RNA đích Yếu tố ảnh hưởng đến kết quả real-time là thao tác hút dung dịch của người làm thí nghiệm và được đánh giá qua hai thông số là hệ số quyết định của đường tuyến tính được ký hiệu R2 và hiệu quả PCR – E% Thông thường dùng hệ số quyết định của đường tuyến tính (R2) để

Hình 2.4: Đường chuẩn để đánh giá mức độ tối ưu của phản ứng

Hình 2.3: Biểu đồ đánh giá mức độ tối ưu của phản ứng

đánh giá mức độ chính xác của thao tác hút dung dịch, và hệ số này phải đạt trên hay bằng 0,99 nghĩa là đường biểu diễn chuẩn đạt tuyến tính cao Một tiêu chuẩn rất quan trọng nữa là hiệu quả PCR (E%), E% được tính bởi công thức E% = (10-1/slope-1) x 100%) và E % chấp nhận được trong khoảng 90 -105% Dùng E% để có thể đánh giá thao tác hút dung dịch trong thao tác pha loãng mẫu, việc pha loãng mẫu

để xây dựng đường chuẩn nếu thiếu hoặc dư mẫu đều ảnh hưởng đến hiệu quả của PCR Tuy nhiên, khi thao tác pipet pha loãng mẫu chính xác mà hiệu quả PCR còn thấp thì có thể do thiết kế mồi chưa đạt độ nhạy, sự bắt cặp của mồi và mẫu dò chưa đặc hiệu hay việc tách chiết RNA còn các chất ức chế ngăn cản phản ứng khuếch đại Do vậy, E% còn được xem là thông số để tối ưu kỹ thuật real-time PCR

Do đó, có thể nói biểu đồ chuẩn có công dụng quan trọng đầu tiên là đánh giá mức độ chính xác thao tác kỹ thuật viên sử dụng pipet để hút dung dịch, vì như thế kết quả định lượng mới chính xác được Công dụng thứ hai của biểu đồ chuẩn là xác định số lượng tác nhân đích ban đầu có trong mẫu thử Giá trị này được tính toán nhờ vào hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y= Ct) với log10

của số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng Hàm số Y = hệ số góc (X) + hằng số Trong đó X = log10Sq, Sq = 10[hằng số/hệ số góc] Từ Sq này cho phép tính được số lượng tác nhân đích ban đầu có sẵn trong mẫu thử dựa vào hiệu quả tách chiết và các pha loãng khi thực hiện phản ứng real-time PCR

(3) Real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman

Mẫu dò TaqMan là những oligonucleotidee có trình tự bổ sung với một trình

tự đặc hiệu trên DNA đích, dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5’gắn chất phát huỳnh quang (reporter) còn đầu 3’có gắn chất hấp thụ tương ứng (quencher) để hấp phụ lại ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter.Việc chọn reporter phù hợp với quencher rất quan trọng, và cần chính xác và hiệu quả Ưu điểm của mẫu dò TaqMan là rất đặc hiệu, tỉ lệ huỳnh quang phát cao, và có khả năng thực hiện các phản ứng đa mồi

Mức độ huỳnh quang tương ứng với số DNA đặc hiệu mong muốn Đây là điểm khác biệt của Taqman so với SYBR Green I, hiện tượng dimer của các đoạn

Bảng 2.1: Các cặp chất phát quang và chất hấp phụ thường sử dụng

Tên reporter Bước sóng

kích thích

Bước song huỳnh quang

Thiết kế mồi và mẫu dò Taqman

Thiết kế mồi cho real-time RT-PCR dùng Taqman cũng theo quy luật thiết

kế mồi chung cho PCR Nên thiết kế mồi có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55o – 60oC

và thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của Taqman khoảng 5o – 10oC Mẫu dò không dài quá 30 base, tỉ lệ GC trong probe khoảng 30-80% với C nhiều hơn G, vị trí bắp cặp của đầu 5’ trong mẫu dò chỉ 2-5 base cách vị trí 3’của mồi bắt cặp trên cùng sợi đích, và quan trọng nhất là đầu 5’ gắn reporter không gắn G, vì G có thể là quencher

sẽ cho rất nhiều reporter Thiết kế mồi làm sao để chiều dài sản phẩm khuếch đại trong real-time PCR từ 75-150bp để hiệu quả PCR đạt tối ưu Tuy nhiên, trên thực

tế còn phụ thuộc vào DNA đích có cho phép chúng ta chọn được mồi tối ưu để đạt sản phẩm khuếch đại đạt như vậy hay không, vậy nên để đạt được sự tối ưu đó cần lưu ý là làm sao giá trị E% luôn đạt từ 90-105%

Chu trình nhiệt cho real-time RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman

Trong chu trình nhiệt cho real-time nhiệt độ cho giai đoạn biến tính là 94 -

95oC trong 15- 30 giây, giai đoạn vừa bắt cặp và kéo dài là 60oC trong 30- 60 giây, thiết bị real-time sẽ hoạt động ở giai đoạn này Ở giai đoạn nhiệt độ 60oC Taqman

sẽ bắt cặp vào sợi đích trước vì đây là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của Taqman rồi sau đó

mồi mới bắt cặp vào Chính nhờ vậy khi Taq polymerase tổng hợp sợi bổ sung,

enzyme này mới có cơ hội thủy giải được Taqman cản đầu nó Ngược lại, khi mồi bắt cặp trước vào sợi đích thì Taqman sẽ không thủy giải được và đây chính là lý do

để giải thích rằng nhiệt độ của mồi khoảng 55- 60oC và thấp hơn nhiệt độ của Taqman 5o- 10oC

Xây dựng đường chuẩn để làm cơ sở tính toán số copy ban đầu của mẫu thử Hơn nữa có thể kiểm soát được thao tác dùng pipet của người làm thí nghiệm có tốt không, qua giá trị R và E Chính vì vậy mà khi làm thí nghiệm bắt buộc phải cho các mẫu chuẩn vào chạy real-time PCR Mẫu chuẩn bao gồm: chứng dương, chứng

âm và chứng nội tại

Chứng dương [+]: là DNA/RNA được đưa vào PCR mix để cho sản phẩm khuếch đại có kích thước và trình tự đúng giống hệt sản phẩm khuếch đại của DNA/RNA đích tách chiết được từ mẫu bệnh Thông thường chứng [+] cho PCR mix là dung dịch pha loãng ở nồng độ biết trước của plasmid có chèn đoạn DNA đích Việc cho chứng [+] vào PCR mix vào mỗi lần chạy nhằm kiểm tra độ nhạy của PCR mix có đạt chuẩn hay không, có kết quả của chứng [+] đúng kích thước mong đợi, nhờ vào đó mới có thể kết luận cho mẫu dương tính hay âm tính Tuy nhiên, chứng [+] cho PCR mix không kiểm tra được quy trình tách chiết nucleic acid từ mẫu có đạt hay không Muốn kiểm tra được vấn đề này cần chuẩn bị mẫu dương được biết trước để thực hiện song song với các mẫu ly trích

Chứng âm [-]: là mẫu nước tinh sạch hay TE 1X được cho vào PCR mix cho mỗi lần làm xét nghiệm real-time PCR chẩn đoán Chứng âm nên được cho vào một PCR mix cho mỗi lần chạy PCR, và cho vào cuối cùng sau khi đã cho mẫu và chứng dương vào các PCR mix tương ứng vì các mục đích như sản phẩm không bị

nhiễm chéo hay không bị nhiễm sản phẩm khuếch đại.Tuy nhiên chứng [-] cho PCR mix không kiểm tra được toàn bộ quy trình thực hiện thử nghiệm PCR có bị ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại hay nhiễm chéo không Muốn kiểm tra toàn bộ quy trình thí nghiệm PCR thì người thực hiện cần phải có chứng nội tại

Chứng nội tại (IC - Internal control): là DNA/RNA được khuếch đại song song với DNA/RNA đích nhưng cho sản phẩm khuếch đại có kích thước khác sản phẩm khuếch đại của DNA đích nhờ vậy có thể phân biệt được khi điện di; và hoặc trình tự khác hoàn toàn hay khác một phần (trong PCR-ELISA hay trong real-time PCR), nhờ vậy có thể phân biệt được khi sử dụng mẫu dò đặc hiệu Tùy nguồn gốc

và thiết kế mà có thể phân ra 4 loại chứng nội tại bao gồm: DNA bộ gene vật chủ, DNA tổng hợp có nguồn gốc là DNA đích, DNA tổng hợp có nguồn gốc khác DNA đích, và DNA khác biệt với DNA đích Tùy được cho vào các giai đoạn nào mà chứng nội tại có thể đựợc dùng cho các vai trò như sự kiểm soát sự tách chiết, sự ức chế để xác định được kết quả âm tính thật hay âm tính giả, kiểm soát hệ thống tách chiết và hệ thống khuếch đại

Một kết quả Real-time RT-PCR được cho là chuẩn mực cần phải đáp ứng các yếu tố như có độ nhạy cao, việc xác định độ nhạy thông qua chứng dương được cung cấp với số bản sao đã biết trước Chứng nội tại được cung cấp với lượng tối thiểu để người thực hiện thí nghiệm chứng minh được hiệu quả ly trích RNA từ mẫu thử bằng cách cho chung vào với mẫu thử để được trích biệt cùng với mẫu thử Ngoài ra chứng nội tại có thể cho biết được mẫu âm tính thật sự mà không phải âm tính giả vì PCR bị ức chế Bên cạnh đó, cần có chứng âm là mẫu âm tính thật sự để

có thể kiểm tra có ngoại nhiễm hay không trong suốt quá trình thao tác xét nghiệm Làm được như vậy thì chúng ta mới vừa đảm bảo được chất lượng xét nghiệm real-time PCR được chuẩn mực trong chẩn đoán Bên cạnh đó, để khẳng định lại kết quả một cách chính xác về sự khác biệt, cũng như sự biến đổi chủng virus cần phải tiến hành giải trình tự mẫu thí nghiệm

2.3.4 Phương pháp phân tích trình tự

Bên cạnh real-time RT-PCR, giải trình tự được xem như là “tiêu chuẩn vàng”

trong việc xác định chủng virus Kết quả đọc trình tự những mẫu dương tính với PRRS sẽ được so sánh với các virus PRRS đã được giải trình tự trong nước và từ Ngân hàng Gene để khẳng định lại các kết quả chạy PCR từ các cặp mồi đã sử dụng Ngoài ra, giải trình tự giúp cung cấp cho các nhà nghiên cứu thông tin chính xác về trình tự nucleotide của virus PRRS Các thông tin này có thể chỉ ra được các đột biến trên gene ở mức độ nucleotide (thêm, mất nucleotide) mà các phân tích PCR hay real-time PCR không thể chỉ ra được Phương pháp phân tích trình tự gene

cũng tránh được các sai số do đột biến trong ống nghiệm thường thấy khi sử dụng

Hiệu quả của giải trình tự trong phân biệt các chủng PRRSV lần đầu tiên được chứng minh qua công trình của Kapur và cs (1996) Khi phân tích trình tự các vùng từ ORF2 đến ORF7, nghiên cứu trên đã cho thấy ORF5 là vùng biến đổi nhiều nhất trong khi ORF6, ORF7 là vùng bảo tồn nhất Kết quả này đặt nền tảng cho việc lựa chọn các gene ở

2 vùng trên (ORF5 và ORF6, ORF7) trong nhiều các nghiên cứu phân tích trình tự PRRSV

về sau Việc xác định đặc điểm di truyền của virus PRRS dựa vào giải trình tự nhằm giúp hiểu rõ hơn về tính đa dạng di truyền, về dịch tễ học, hỗ trợ nhiều cho việc phát triển vaccine và các xét nghiệm chẩn đoán mới trong đó có real-time RT-PCR Định trình tự chuỗi một phần, một gene riêng biệt hay toàn bộ gene, đặc biệt là vùng gene chức năng và cấu trúc GP-2-3-4-5-M-N để phân biệt một số đặc điểm phân tử cần thiết nhằm góp phần cung cấp thông tin về sự tiến hóa và nguồn gốc của virus lưu hành tại thực địa với thế giới (Ansari và cs, 2006; Feng và cs, 2008; Lê Thanh Hòa và cs, 2009; Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2010)

2.4 Lượt khảo các nghiên cứu liên quan trên thế giới về PRRSV

2.4.1 Nghiên cứu sử dụng real-time RT-PCR

Phương pháp real-time RT-PCR sử dụng SYBR Green hoặc Taqman khá phổ biến để phát hiện hai dòng Châu Âu (EU) và Bắc Mỹ (NA) (Egli và cs, 2001; Wasilk và cs, 2004; Chung và cs, 2005; Kleiboeker và cs, 2005; Cheng và cs, 2008; Lurchachaiwong và cs, 2008; Martínez và cs, 2008; Xiao và cs, 2008; Yoon và cs,

2008; Balka và cs, 2009; Chen và cs, 2009) Tuy nhiên, sử dụng Taqman đòi hỏi sự bắt cặp chính xác giữa mẫu dò và vùng mục tiêu, nếu không thì độ nhạy có thể giảm

đi (Bustin, 2000; trích dẫn của Balka và cs, 2009)

Khi thực hiện real-time PCR định lượng với mẫu dò Taqman để phát hiện và phân biệt hai chủng NA và EU cùng với phương pháp PCR truyền thống và nuôi cấy tế bào, độ nhạy và đặc hiệu của real-time PCR Taqman bằng hoặc vượt trội và tiết kiệm thời gian hơn phương pháp PCR truyền thống và nuôi cấy phân lập tế bào (Egli và cs, 2001)

Wasilk và cs (2004) đã phát triển phương pháp real-time RT-PCR để phát hiện virus và đo lường nồng độ virus PRRS trong huyết thanh hoặc tinh dịch bằng cách so sánh với nested RT-PCR về độ nhạy và tính đặc hiệu Ngoài ra, việc định lượng của real-time RT-PCR giúp ích cho việc nghiên cứu sinh bệnh học, điều trị và nghiên cứu hiệu quả vaccine Kết quả nghiên cứu cho biết độ nhạy của phương pháp real-time RT- PCR trong phát hiện Lelystad và European-like PRRSV cũng phù hợp với xét nghiệm nPCR Tuy nhiên, với real-time RT-PCR lượng virus được phát hiện ở giới hạn thấp hơn, độ nhạy được quan sát vào khoảng 33 bản sao/ml lúc bắt đầu phản ứng

Kleiboeker và cs (2005) thử nghiệm realtime RT-PCR để phát hiện dòng NA

và EU của virus PRRS trên 83 chủng (74 NA, 9 EU) của mẫu nuôi cấy phân lập Độ nhạy của hai phương pháp phân tích được nhận thấy đều dưới một TCID50 (tương ứng với 5-10 phân tử RNA) Độ nhạy và đặc hiệu trong phương pháp realtime RT-PCR là tương đương với cả 2 phương pháp nRT-PCR và nuôi cấy phân lập virus Martínez và cs (2008) áp dụng real-time RT-PCR với SYBR Green phát hiện đồng thời hai dòng NA và EU Kết quả cho thấy độ nhạy của phương pháp này đạt 100% cao hơn RT-PCR (97,5%) khi xét nghiệm trên cùng mẫu Xiao và cs (2008) phát hiện virus PRRS độc lực cao gây ra những trận dịch tại Trung Quốc năm 2006 bằng kỹ thuật real-time RT-PCR với Taqman Kết quả cho biết virus PRRS được phát hiện với độ nhạy là 105 bản sao Có thể nói đây là cơ sở dữ liệu cho thấy phương pháp này rất đặc hiệu trong việc phát hiện mức độ nhiễm virus rất thấp

Lurchachaiwong và cs (2008) sử dụng real-time RT-PCR để phát hiện nhanh

và xác định dòng (NA và EU) của virus PRRS với SYBR Green I, Taqman và giải trình tự Kết quả phát hiện virus với độ nhạy là 104 bản sao đối với SYBR Green I,

và với mẫu dò Taqman là 103 bản sao Kết quả nghiên cứu cũng cho biết khi xét nghiệm 112 mẫu ở phương pháp RT-PCR cho 18 trường hợp dương tính trong khi real-time RT-PCR dùng Taqman và giải trình tự cho 20 mẫu dương tính, và có 16 mẫu dương khi dùng real-time RT – PCR với SYBR Green I (Bảng 2.2)

Bảng 2.2 Kết quả phát hiện virus PRRS bằng các phương pháp khác nhau

Nội dung

Phương pháp

RT - PCR

Real-time PCR

RT-Taqman probe

Real-time PCR

EU: chủng châu Âu; NA: chủng Bắc Mỹ; ND: Không phát hiện

Balka và cs (2009) sử dụng real-time RT-PCR dựa vào chuyển hóa năng lượng của mẫu dò để phát hiện đồng thời hai dòng NA, EU của virus PRRS Độ đặc hiệu được kiểm tra với 37 chủng PRRS khác nhau và 8 virus gây bệnh khác trên heo, giới hạn phát hiện vào khoảng 10 bản sao RNA Nhóm tác giả đã đưa ra kết luận là có thể sử dụng và phát triển phương pháp này để phát hiện và định lượng

chủng virus PRRS

2.4.2 Phân biệt chủng virus PRRS dựa vào giải trình tự

Vùng ORF5 của virus PRRS là vùng có sự biến đổi di truyền rất cao (Andreyes và cs, 1997; Kapur và cs, 1996) Do đó phân tích trình tự gene của vùng này giữa các chủng PRRSV phân lập với vaccine PRRS nhược độc và các chủng

virus PRRS độc lực trong các đợt dịch trước có thể giúp tìm ra được sự tiến hóa ditruyền cũng như là nguồn gốc của các chủng virus PRRS Hiệu quả của phương pháp giải trình tự càng được chứng minh bởi nhiều nghiên cứu trước đây (Yoon và

cs, 2001; Gao và cs, 2004; Cha và cs, 2006; Feng và cs, 2009; và Amonsin và cs,

Cha và cs (2006) đưa ra kết quả giải trình tự vùng ORF5 của 28 mẫu phân lập tại Hàn Quốc từ năm 2002 – 2003 đều thuộc dòng Bắc Mỹ Tuy nhiên chủng phân lập mới LMY nằm ở nhánh riêng và có đặc điểm gần giống với các chủng phân lập từ Trung Quốc gây độc lực cao

Khi phân tích so sánh trình tự chuỗi các mẫu phân lập tại Thái Lan với dòng Bắc Mỹ và Châu Âu, nhóm tác giả Amonsin và cs (2009) cho biết mẫu phân lập 01CB1 thuộc dòng EU có thể có nguồn gốc từ vacine, còn mẫu 01NP1 thuộc dòng

NA có lẽ có nguồn gốc hay dẫn suất của vaccine bởi vaccine NA-MLV không có sẵn trên thị trường Thái Lan năm 2001 Điều này có thể lý giải rằng virus vaccine

đã du nhập vào Thái Lan bằng con đường nhập heo hoặc tinh heo giống

Feng và cs (2009) đã tiến hành xác định đặc tính các chủng virus PRRS phân lập được từ các ổ dịch PRRS tại Việt Nam và Trung Quốc năm 2007 Kết quả cho thấy các chủng virus này có bộ gene tương đồng gần 99 % Phân tích di truyền đã

chỉ ra rằng các chủng virus đều bị mất một đoạn aa ở nsp2 và điều đó chứng tỏ rằng

các biến chủng virus xuất hiện tại Việt Nam và Trung Quốc là đồng nhất

2.5 Lượt khảo các công trình nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam

Năm 2000, Nguyễn Lương Hiền và cs đã khảo sát virus PRRS trong 17 trại chăn nuôi heo giống thuộc 05 tỉnh: Đồng Nai, Bình Dương, Tp Hồ Chí Minh, Tiền Giang và Vĩnh Long với tổng số mẫu 2308, có 596 mẫu dương tính Tỷ lệ nhiễm

Kim Văn Phúc và cs (2007) sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR trên 23 mẫu khảo sát cho kết quả các mẫu nhiễm virus dòng Bắc Mỹ, không tìm thấy mẫu nhiễm dòng Châu Âu.

Huỳnh Trọng Tiến (2007) sử dụng RT-PCR để xác định virus PRRS chủng EU

và NA, tác giả phát hiện được virus trong huyết thanh, hạch phổi, hạch amidan tế bào nuôi cấy, nhưng không phát hiện virus PRRS trong tinh dịch đực giống

Nhóm các nhà khoa học Việt Nam và Trung Quốc đã xác định đặc tính của chủng virus phân lập từ các ổ dịch trên heo xảy ra tại Việt Nam năm 2007, có sự tương đồng bộ gene khoảng 99%, các chủng này đều bị mất một đoạn aa trên

protein không cấu trúc số 2 (nsp-2) (Feng và cs, 2009)

Lê Thanh Hòa và cs (2008) phân tích trình tự ORF6 trên mẫu heo bệnh thu nhận ở Quảng Nam (TXMT1), kết quả cho thấy TXMT1 này thuộc dòng NA, có tỷ

lệ đồng nhất về thành phần nucleotidee và tỷ lệ tương đồng về aa rất cao (99-100%) với các chủng của Trung Quốc; thấp hơn (94% nucleotidee; 96% aa) so với chủng VR2332 và rất thấp (69% nucleotidee; 79% aa) so với chủng Lelystad TXMT1 chỉ

có 2 - 3 vị trí sai khác nucleotidee với các chủng Trung Quốc, trong khi đó có đến

28 aa so với chủng VR2332 cổ điển và khác rất nhiều so với các chủng Châu Âu Điều này cho thấy chủng TXMT1 của Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh với các chủng PRRSV của Trung Quốc cường độc cao

Huỳnh Thị Thu Hương (2009) sử dụng kỹ thuật RT-PCR phát hiện virus PRRS trên các mẫu cho ELISA dương tính và trên máu, kết quả mẫu cho thấy chỉ nhiễm dòng NA với tỉ lệ 19,89%, khả năng phát hiện virus trong máu cao hơn virus trong huyết thanh

Sử dụng kỹ thuật RT-PCR-RFLP với 4 loại enzyme MluI, HincII, SacII và

HaeIII đồng thời phân tích RFLP bằng phần mềm Chromas Pro với sự kết hợp các

enzyme HaeII, HincII, PstI hay HaeII, HincII, ClaI, Đặng Ngọc Thùy Dương

(2009) có thể phân biệt virus PRRS vaccine với virus PRRS thực địa dòng NA và

EU Kết quả nghiên cứu 12 mẫu virus PRRS xác định được đều thuộc dòng NA, không có mẫu thuộc dòng EU Các chủng này nằm cùng nhóm với các chủng độc lực cao của Trung Quốc và chủng 07QN đã được phân lập tại Việt Nam 2007 với

độ tương đồng di truyền ở mức 98 - 98,7 % và có khác biệt với chủng virus PRRS vaccine nhược độc Besta hiện đang được sử dụng tại Việt Nam với độ tương đồng

di truyền ở mức 85,9 - 86,7 %

Theo Nguyễn Ngọc Hải và cs (2010), phân tích ORF5 của virus PRRS tại Đồng Nai và Tp.HCM cho thấy virus thuộc nhóm Bắc Mỹ cùng nhóm với chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc So sánh trình tự aa của protein GP5 giữa các chủng PRRSV Tp.HCM và Đồng Nai với chủng vaccine BSL-PS100 cho thấy không sự đột biến mất hay thêm vào, có khác biệt lớn tại vùng peptide tín hiệu (aa 1-31), vùng chức năng trung hòa sơ cấp, vùng chức năng không trung hoà và mang tính trội miễn dịch

Như vậy, cho đến nay việc nghiên cứu bệnh PRRS ở Việt Nam chủ yếu dựa vào các kỹ thuật ELISA, RT-PCR và nuôi cấy tế bào, chưa sử dụng real-time RT-PCR để định lượng virus gây bệnh Ngoài ra cũng đã có nghiên cứu thực hiện việc giải trình tự ORF5, ORF7 của virus PRRS nhưng số mẫu giải trình tự cần tăng thêm

và tiến hành ở các thời gian sau này để nhận định chính xác sự biến đổi di truyền của virus PRRS thực địa

Chương 3

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian: đề tài được thực hiện từ 6/2009 đến 9/2010

3.1.2 Địa điểm: Real-time RT-PCR được thực hiện tại Viện Khoa học Kỹ thuật

Nông nghiệp miền Nam và Công ty TNHH Nam Khoa Sản phẩm PCR được đọc

trình tự tại Cty Macrogene (Hàn Quốc)

3.2 Nội dung nghiên cứu

1 Thăm dò quy trình real-time RT-PCR với RNA chuẩn của virus PRRS

2 Định lượng virus PRRS dựa trên ORF7 bằng quy trình real-time RT-PCR

đã thiết lập

3 Giải trình tự chuỗi ORF5 của virus PRRS trên mẫu ở Đồng Nai và hai địa

phương lân cận, từ đó so sánh với các chủng trên thế giới từ Ngân hàng gene

3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

3.3.1 Vật liệu mẫu: Nghiên cứu trên 50 mẫu bao gồm 17 mẫu huyết thanh, 24 mẫu

máu, 6 mẫu tinh dịch của heo giống, 1 mẫu dịch nuôi cấy tế bào chủng LMY (Hàn Quốc – là mẫu chuẩn) và 2 loại vaccine PRRS nhược độc lưu hành tại Việt Nam là BCL.PS 100 của Besta (NA) và Amervac của Hipra (EU)

Bảng 3.1: Nguồn mẫu trong nghiên cứu

STT Mẫu Địa điểm Năm phân lập Đặc điểm mẫu

26