Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng S. paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ
NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ Sphingomonas paucimobilis
ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội - 2018
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm
TS Trần Thị Mai
Phản biện 1: PGS TS Trần Đình Mấn
Phản biện 2: PGS TS Nguyễn La Anh
Phản biện 3: PGS TS Dương Văn Hợp
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi … giờ, ngày … tháng … năm ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1.Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2.Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án
Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu khí
Sphingomonas sp Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và
các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel
So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải khát Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel mềm, mọng nước và tăng được nhiệt
độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản phẩm Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả
Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội do gel có độ trong suốt cao, tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch
Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi trong chế biến
và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng Các công bố về quá trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng cho chế phẩm
Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được sử dụng để
bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, nhưng giá nhập khẩu vẫn còn cao (khoảng 20-50 usd/kg, tùy loại) Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của đề tài chúng tôi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao (18-20 g/lít dịch nuôi) và bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng, cần phải có các nghiên
cứu cải tiến hơn nữa nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận
gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã
được lựa chọn trong khuôn khổ của luận án này
Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan
của chủng S paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo
quản, chế biến thực phẩm
Nội dung nghiên cứu
1 Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL4; So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng
S paucimobilis GL4 và S paucimobilis GL12
2 Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis lựa chọn: Tối ưu hóa điều kiện sinh
tổng hợp gellan trên bình tam giác; Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít; Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột; Nghiên
Trang 4cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm; Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng
S paucimobilis lựa chọn
3 Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S paucimobilis: Xác định
điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl; Xác định điều kiện tách chiết
và sấy kết tủa gellan khử acyl; Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl; Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl
4 Đánh giá chất lượng các chế phẩm: Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S paucimobilis; Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl
5 Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl: Ứng dụng chế phẩm gellan
trong tạo màng bao bảo quản chuối; Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1 Về khoa học: Luận án là một nghiên cứu có hệ thống từ lựa chọn chủng giống, đến sinh
tổng hợp, thu hồi và khai thác khả năng ứng dụng gellan, cũng như chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thu nhận và ứng dụng gellan hoặc các polisaccharit ngoại bào khác đi từ nguồn
vi sinh vật
2 Về thực tiễn: Xây dựng được qui trình công nghệ thu nhận gellan và gellan khử acyl góp
phần chủ động tạo nguồn phụ gia thực phẩm sở hữu các đặc tính phù hợp cho ứng dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm
Kết quả mới
- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis GL12 phân lập
tại Việt Nam đạt 32,8 g/lít Giải pháp sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan thay thế nguồn trypton, kết hợp cải thiện phương thức cấp ôxi bằng việc bổ sung H2O2 theo bậc nhằm khắc phục độ nhớt của dịch lên men đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp gellan
- Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86% đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao
- Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ S paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến, bảo quản thực phẩm
- Đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với 9 ngày ở mẫu đối chứng) Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định trong môi trường pH thấp (pH<4) nên thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm có độ axit cao như thạch dứa
Bố cục luận án: Luận án được trình bày trong 114 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan
tài liệu (25 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang), kết quả và thảo luận (52
Trang 5trang với 29 bảng, 28 hình), kết luận (1 trang), kiến nghị (1 trang), danh mục các công trình
đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (10 trang với 8 tài liệu tiếng Việt và 93 tài liệu tiếng Anh)
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thông tin chung về gellan và gellan khử acyl bao gồm 04 tiểu mục: 1.1.1 Cấu tạo;
1.1.2 Tính chất; 1.1.3 Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel và mục
1.1.4 Sphingomonas paucimobilis: giới thiệu chung về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa,
cơ chế sinh tổng hợp gellan và động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan
1.2 Tình hình nghiên cứu thu nhận gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan, phần này đề cập đến các vấn đề về giống, tuổi giống, tỷ lệ giống, thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí cho quá trình lên men; 1.2.2 Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men; 1.2.3 Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl
1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục:
1.3.1 Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây; 1.3.2 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm; 1.3.3 Ứng dụng trong các lĩnh vực khác
1.4 Vấn đề cần nghiên cứu của luận án mục này điểm qua những kết quả nghiên cứu đã
có trước để đưa ra những định hướng và nội dung nghiên cứu cụ thể cho luận án
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu
- Hai chủng S paucimobilis GL4 và GL12 nhận được từ bộ sưu tập giống của Bộ môn
Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch-Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH Chủng
S paucimobilis GL12 đã được kiểm nghiệm về độ an toàn chung và khả năng gây tan huyết
đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho ứng dụng trong chế biến thực phẩm
- Chuối tiêu được trồng tại Đông tảo, Khoái Châu, Hưng Yên vụ 2017
2007), độ ẩm (AOAC 920.05), độ tro (AOAC 930.30), hàm lượng chì (AOAC 999.11), hàm lượng asen (AOAC 986.15), E Coli (TCVN 7924-2:2008), Salmonella (TCVN 4829:2005), Coliform (TCVN 6848:2007), tổng số vi khuẩn hiếu khí (TCVN 4884:2005),
Trang 62.3 Phương pháp nghiên cứu
- Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: chủng S paucimobilis GL12 và
GL4 được thử nghiệm với 150 ml dịch với glucose 3,2%; trypton 0,6 %; tỷ lệ tiếp giống 8 %; nhiệt độ lên men 30oC, pH 7, tốc độ lắc 200 vòng/phút Sau 72h dịch lên men được nâng nhiệt lên 95oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi và đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan (Nguyễn Thị Hồng Hà, 2015)
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng STH gellan từ S paucimobilis GL12: tiến
hành tương tự như trên, khảo sát với các nồng độ bột đậu tương, axit amin khác nhau và 6 chế độ cấp H2O2 theo bậc vào quá trình lên men (Guilan Z., 2014)
- Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL12 trên bình tam giác
bằng quy hoạch thực nghiệm bậc hai theo Box–Behnken
- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít: các thí nghiệm được tiến hành lên men trên bình lên men sục khí 10 lít với các thông số về thành phần môi trường lên men theo điều kiện tối ưu tìm được khi lên men trên bình tam giác Thiết bị lên men được cài đặt chế độ nhiệt độ 30oC, tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph, khảo sát với các tốc độ khuấy dao động từ 200 đến 300 vòng/phút
- Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men với các khảo sát về điều kiện tiền xử lý dịch
lên men, lựa chọn dung môi kết tủa, tỷ lệ dịch lên men và dung môi theo Fialho A M., (1999)
của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày lớp vật liệu sấy Các thí nghiệm đều được thực hiện với tốc độ thổi khí 1 m/s, khi bề mặt khối sấy khô se, dùng que sắt nhọn kẻ thành các ô vuông có cạnh 1,5 cm,tiến hành đảo để khối ô vuông gellan rời ra, rồi dàn đều, sau đó cứ 2 giờ lặp lại
01 lần Khi mẫu khô đem đi nghiền thành bột và bảo quản trong bao bì kín
- Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl: xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan
khử acyl theo Nampoothiri M K., (2003); xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl; xác định điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm gellan khử acyl
Mức độ deacyl hóa của mẫu được tính theo công thức sau:
ĐĐA = 100 - x a
Trong đó: h1720 và h3400 là chiều cao các đỉnh phổ tại bước sóng 1720 và 3400 cm-1 đặc trưng cho các nhóm carbonyl và nhóm - OH trong phân tử gellan và a là hệ số thực nghiệm
Trang 7- Nghiên cứu ứng dụng gellan tạo màng bao trong bảo quản chuối: xác định công thức
dung dịch tạo màng gellan theo Rojas G M A., (2007); xác định một số đặc tính của dung dịch tạo màng gellan như xác định hàm lượng chất khô, thời gian khô của màng, thời hạn sử dụng dung dịch tạo màng, độ bám dính của màng, tính thẩm thấu hơi nước của màng, mức độ ngăn cản trao đổi khí được tiến hành theo Nguyễn Duy Lâm (2011)
- Nghiên cứu ứng dụng gellan khử acyl trong chế biến thạch dứa: xác định hàm lượng
gellan khử acyl thích hợp cho công thức thạch; đánh giá cảm quan và độ ổn định của sản phẩm)
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao
Từ kết quả ở bảng 3.1 rút ra, trong điều kiện khảo sát chủng S paucimobilis GL12 có khả năng sinh tổng hợp gellan cao hơn chủng S paucimobilis GL4 Hơn thế chủng S.paucimobilis GL12 đã được đánh giá là chủng an toàn, bước đầu đảm bảo cho các sản
phẩm của chúng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm (Nguyễn Thị Hồng Hà., 2015)
Do vậy, chủng S paucimobilis GL12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo của luận án
Bảng 3.1 So sánh khả năng STH gellan của hai chủng S paucimobilis GL4 và S paucimobilis GL12
3.2 Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis GL12
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan
3.2.1.1 Ảnh hưởng của nitơ
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ là trypton, hàm lượng gellan đạt cao nhất là 22,7g/l Tuy nhiên, với nguồn nitơ là bột đậu tương cũng cho sản lượng sinh tổng hợp gellan khá cao đạt 21,9g/l Điều này có thể do bột đậu tương có hàm lượng protein cao (khoảng 40%) và chứa nhiều tryptophan là một axit amin cũng được chứng minh như một tiền tố làm tăng khả năng sinh tổng hợp gellan (Hyuck J., 2003) Bajaj B I., (2006) khi bổ sung tryptophan ở nồng độ 0,05% vào môi trường lên men đã tăng được sản lượng gellan lên tới 39,5 g/l
Trang 8Bảng 3.2 Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis GL12
Nguồn nitơ (%) Hàm lượng gellan (g/l)
Trypton (0,6) 22,7a± 0,40
Bột đậu tương * (1,5) 21,9 ab ± 0,95
* Hàm lượng bột đậu tư ng được tính lấy để tư ng tư ng với 0,6% protein trong dịch lên men
Kết quả ở hình 3.1 cho thấy khi bổ sung tăng dần bột đậu tương vào môi trường lên men, sản lượng gellan cũng tăng theo và tăng chậm lại khi bổ sung bột đậu tương 2% Kết quả này cũng phù hợp với Hyuck J., (2003), tác giả cũng đã tìm ra dịch chiết đậu tương 2%
bổ sung vào môi trường lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S paucimobilis NK2000 đã
cho khả năng sinh tổng hợp gellan tăng 44%
Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis GL12
3.2.1.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin
Các thí nghiệm được thử nghiệm với 4 loại axit amin với tỷ lệ bổ sung 0,05 % Kết quả thử nghiệm đã xác định được L-threonine là axit amin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp gellan (đạt 24,3 g/l với liều bổ sung 0,05%) Việc bổ sung L-threonine được cho là làm tăng sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp gellan do vậy dẫn đến làm tăng sản lượng gellan (Nampoothiri M K., 2003)
Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan thu được ở hình 3.2 đã khẳng định lại khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi môi trường được bổ sung L-threonine 0,05%
0 5 10 15 20 25 30
Trang 9Axit amin Hàm lƣợng gellan
3.2.1.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung H 2 O 2
Động học phát triển của chủng S paucimobilis GL12 cho thấy chủng sinh trưởng mạnh
nhất từ giờ thứ 6 đến 24 giờ Theo thời gian lên men, với việc tăng sinh khối, đồng thời lượng gellan được tích lũy quanh tế bào cũng tăng lên, kéo theo giảm hiệu quả cấp oxy cho
tế bào Để khắc phục hiệu ứng này, tiến hành các thử nghiệm bổ sung thêm H2O2 vào dịch lên men dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2 Tuy nhiên, nồng độ H2O2 quá mức lại là một trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến việc ức chế sự phát triển của
tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan Do vậy, trong phần này tiến hành các thử nghiệm bổ sung dần H2O2 vào các mốc thời gian tương ứng 6, 12, 18, 24, 28 giờ với các liều lượng khác nhau theo từng chế độ thử nghiệm Sau 72 giờ lên men, các mẫu được lấy đi đánh giá lượng sinh khối và gellan tạo thành
Kết quả phân tích ở bảng 3.4 cho thấy, việc bổ sung H2O2 theo CĐ1 và CĐ2 hầu như không làm tăng được lượng sinh khối cũng như không cải thiện được khả năng sinh tổng hợp gellan cho chủng nghiên cứu Điều này có thể lý giải do ở những giờ nuôi đầu (6, 12 giờ) lớp gellan bảo vệ bên ngoài vi khuẩn chưa nhiều nên việc sử dụng hàm lượng H2O2 ở những nồng độ 4 và 3 mM là không phù hợp sẽ gây sốc tế bào, ức chế quá trình tăng sinh Đổi lại, với CĐ3 lượng H2O2 bổ sung ban đầu được duy trì ở mức thấp hơn (2 mM) sau mới tăng dần lên tới 3 và 4 mM ở những giờ cuối đã kích thích tăng sinh khối tế bào và kéo theo tăng hàm lượng gellan Kết quả nhận được ở các CĐ4, CĐ5 và CĐ6 cho hàm lượng gellan thấp hơn hoặc tương tự với CĐ3 Thử nghiệm cũng cho thấy, kéo dài việc cung cấp H2O2 ở giờ thứ 28 (CĐ6) là không cần thiết bởi lẽ lúc đó vi khuẩn bắt đầu vào pha cân bằng, nhu cầu oxy đã giảm, khi đó chế độ sục khí hay lắc của hệ thống lên men cũng đủ để đảm bảo duy trì sự sống cho vi khuẩn Guilan Z., (2014) cũng đã công bố sự sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi bổ sung H2O2 trong những giờ đầu lên men Như vậy, bổ sung H2O2 theo CĐ3 sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
0 5 10 15 20 25 30
Trang 10Bảng 3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung H 2 O 2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan
3.2.1.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan
Để xác định được thời gian lên men thích hợp cho hàm lượng gellan cao nhất, trong phần này các thí nghiệm được thiết kế theo các điều kiện lựa chọn ở trên (Bột đậu tương
2,0%, L-threonine 0,05 %, bổ sung H2O2 theo CĐ3, các điều kiện khác giữ nguyên)
Kết quả trình bày ở hình 3.3 cho thấy, quá trình sinh tổng hợp gellan diễn ra sau 6 giờ nuôi cấy Pha logarit của chủng kéo dài từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 30 Cùng với sự tăng sinh khối trong pha này, lượng gellan tích lũy trong dịch lên men cũng tăng theo từ 0,44 đến 10,20 g/l nhưng đạt giá trị cực đại (31,40 g/l) ở giờ thứ 66 Như vậy, hàm lượng gellan của
chủng S paucimobilis GL12 được sinh tổng hợp trong suốt pha logarit và cả ở pha cân bằng Tác giả Nampoothiri M K., (2003) cũng cho thấy chủng S paucimobilis ATCC 31461 đạt hàm lượng gellan cao nhất tại 48 giờ Trong khi đó, với chủng S paucimobilis E2, Lobas D.,
(1992) lại tìm thấy từ 60-68 giờ là khoảng thời gian thích hợp cho thu nhận gellan Như vậy, thời gian lên men tạo gellan phụ thuộc nhiều vào chủng sản xuất và điều kiện tiến hành Dựa vào các kết quả thí nghiệm thu được, lựa chọn thời gian 66 giờ là thời điểm kết thúc quá
trình lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S paucimobilis GL12
Hình 3.3 Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S paucimobilis GL12
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
0 5 10 15 20 25 30 35
Trang 113.2.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác
Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp
gellan từ S paucimobilis GL12, đã xác định được mức độ tác động đơn lẻ của các yếu tố tới
sự sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL12 Tuy nhiên, trong môi trường lên men các vi
sinh vật sẽ phải chịu tác động đồng thời của các yếu tố đó, đặc biệt ba yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn là glucose, bột đậu tương và L-threonine Nhằm xác định được giá trị tối
ưu của các yếu tố này, phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken đã được sử dụng
và đưa ra được phương trình hồi qui biểu diễn ảnh hưởng của ba yếu tố trên tới khả năng sinh
tổng hợp gellan của S paucimobilis GL12 như sau:
Hàm lượng gellan (Y) = + 32,2 + 2,02X1 + 0,71X2 + 1,18X3 + 1,5X1X2 – 0,89X1X3 + 1,39X2X3 – 3,05X12 – 3,05 X22 – 1,12X32
với X1, X2 và X3 là các yếu tố glucose, bột đậu tương và L-threonine tương ứng
Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng
S paucimobilis GL12 Kết quả tìm được giá trị hàm lượng gellan cao nhất theo lý thuyết đạt
từ 31,0 đến 32,96 g/l khi tổ hợp 3 yếu tố là nồng độ glucose: 3,6 %; bột đậu tương: 2,1 %; threonine 0,06 %
L-Tiến hành lên men thực nghiệm với các điều kiện vừa tìm được ở trên, kết quả hàm lượng gellan thu được đạt (32,80 ± 0.85 g/l) nằm trong khoảng tin cậy trung bình 95% của khoảng giá trị dự đoán theo lý thuyết Những kết quả này xác nhận, kết quả lý thuyết và thực nghiệm chênh trong giới hạn cho phép
Dưới điều kiện tối ưu, chủng S paucimobilis ATCC 31.461 sinh tổng hợp gellan với
hàm lượng 32,7 g/l sau 48 giờ lên men (Nampoothiri M K., 2003) Cũng với chủng trên, Bajaj B I., (2007) lại thu được 35,9 g/l, trong khi đó, Jun Zhang (2015) báo cáo chỉ tổng hợp
được gellan từ S paucimobilis QHZJUJW CGMCC2428 với hàm lượng 19.90 ± 0.68 g/l trên
môi trường có 4% sucrose, 3% peptone, ở pH 7.0, 30oC sau 72 giờ lên men
3.2.3 Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít
* Xác định tốc độ khuấy: Trong phần này 5 tốc độ khuấy 200; 225, 250, 275 và 300 vòng/phút được thử nghiệm Kết quả hình 3.10 cho thấy, ở tốc độ khuấy 200 vòng/phút, khả năng tạo gellan thu được khá thấp chỉ đạt 28,3 g/l sau 66 giờ lên men Sản lượng gellan đạt tối đa là 32,5 g/l ở tốc độ khuấy 275 vòng/phút Tuy nhiên, khi tăng tốc độ khuấy lên 300 vòng/phút sản lượng gellan giảm nhẹ Kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, tốc độ khuấy trộn
ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL12 Trong
nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô lớn thì độ nhớt của môi trường cao và nhu cầu oxy lớn do vậy nếu tốc độ khuấy thấp sẽ không thích hợp Nhưng tốc độ khuấy quá lớn sẽ tạo ra lực cắt làm ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như sự phát triển của tế bào, điều đó đồng nghĩa với việc các sản phẩm thứ cấp tạo thành cũng bị ảnh hưởng (Banik R M., 2006) Do vậy, tốc độ khấy
275 vòng/phút được chọn cho nghiên cứu tiếp theo
Trang 12Hình 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Hình 3.5 Động học quá trình sinh tổng hợp gellan trên
bình lên men 10 lít (khấy 275 v/ph)
* Xác định thời gian thu hồi gellan: Đồ thị biểu thị sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp gellan của chủng vi khuẩn S paucimobilis GL12 trong quá trình sinh tổng hợp gellan trên
bình lên men sục khí 10 lít với tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và tốc độ khuấy 275 vòng/phút được thể hiện ở hình 3.5 Kết quả phân tích cho thấy, đường cong sinh trường của chủng nghiên cứu ở qui mô này cũng tương tự như ở qui mô bình tam giác, lượng sinh khối đạt cực đại sau khoảng 30 giờ lên men Gellan cũng được tích lũy ngay từ pha logarit, tăng dần theo thời gian và đạt cực đại ở pha cân bằng (33,1 g/l ở 58 giờ) Mặc dù hàm lượng gellan thu nhận ở quy mô bình sục khí không khác nhiều so với quy mô phòng thí nghiệm (32,8 g/l ở
66 giờ), nhưng thời gian thu nhận gellan đã rút ngắn được tới 8 giờ Điều này có thể là do ở
hệ thống bình lên men việc kiểm soát tốc độ cấp khí tốt hơn cho quá trình tăng trưởng và duy trì của vi khuẩn Hơn nữa, lượng H2O2 bổ sung theo bậc vào môi trường lúc này có thế lại đóng vai trò như một tác nhân gây sốc nhẹ để cảm ứng cho vi khuẩn tăng tiết nhanh gellan ra bên ngoài bề mặt để bảo vệ chúng
3.2.4 Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men
3.2.4.1 Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối
Do đặc tính của chủng S paucimobilis khi sinh trưởng phát triển sẽ tiết ra gellan bám
xung quanh tế bào để bảo vệ chúng khỏi các tác động bên ngoài Do vậy, để tách gellan khỏi sinh khối, dịch lên men cần được xử lý trước khi ly tâm
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn
Nhiệt độ dịch lên men
Chú thích: - : Không tách pha, không thu hồi được gellan;
: Có dấu hiệu tách pha, khi ly tâm không phân tách được sinh khối tế bào và gellan;
0 5 10 15 20 25 30 35
Trang 13Kết quả của bảng 3.5 cho thấy, khi xử lý dịch lên men ở nhiệt độ dưới 85oC không thể tách hết gellan ra khỏi sinh khối Tuy nhiên ở các mốc nhiệt xử lý 90, 95, 100o
C trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút cho hiệu quả tách vi khuẩn khỏi dịch lên men là như nhau Hiện tượng này có thể do khi nâng nhiệt tế bào vi khuẩn ở nhiệt
độ cao sẽ biến tính co cụm lại và nhả khối dịch gellan bám xung quanh tế bào Bên cạnh đó
ở khoảng nhiệt độ này cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan ở dạng sợi đơn, độ nhớt giảm kéo theo giảm độ kết dính với bề mặt vi khuẩn Do vậy, khi tiến hành ly tâm sẽ dễ dàng tách được gellan khỏi tế bào vi khuẩn
3.2.4.2 Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ
* Lựa chọn dung môi thích hợp: Dịch lên men thu được qua bước tiền xử lý ở trên được cho
thử nghiệm kết tủa gellan với các dung môi ethanol, acetone và isopropyl alcohol theo tỉ lệ dịch:dung môi là 1:3 (v/v) Kết quả ở hình 3.6A cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan từ các dung môi thử nghiệm là khá cao (trên 91%) và khác nhau không đáng kể, có lẽ vì gellan là một polyme anion nên chúng kết tủa tốt với các dung môi phân cực Tuy nhiên xét về hiệu quả kinh tế và tính an toàn, ethanol sẽ là dung môi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp của luận án West T P., (2003) cũng đã chọn ethanol là dung môi để thu hồi gellan và nhận thấy khi sử dụng ethanol hiệu suất thu hồi gellan đạt cao hơn so với khi sử dụng dung môi isopropyl alcohol và methanol
Hình 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất thu hồi gellan
* Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan: Để hiệu suất thu hồi
gellan cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men gellan/ethanol đến khả năng thu hồi gellan được tiến hành khảo sát với 4 tỷ lệ khác nhau: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3 Kết quả nghiên cứu ở hình 3.6B cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan cao nhất ở
tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/3 cho hiệu suất thu hồi đạt 94,2% Ở tỷ lệ 1/2, hiệu suất thu hồi gellan có thấp hơn nhưng không nhiều so với tỉ lệ 1/3 (hiệu suất đạt 93,6%) Khi giảm lượng cồn xuống (ở các tỷ lệ 1/1 và 2/2) hiệu suất thu hồi gellan cũng bị giảm xuống nhiều
(tương đương 76,2% và 62,5%)
0 5 10 15 20 25 30
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100