Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học“phân lập và định danh vi khuẩn lactic lên men nem chuatỉnh đồng tháp và thành phố cần thơ”

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là thực phẩm lên men truyền thống được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời này sang đời khác của người Việt Nam. Tuy nem chua không phải là một món ăn đòi hỏi cần phải chế biến công phu, cầu kỳ và trang trí đẹp mắt, nhưng nó lại luôn là một món ăn được người dân yêu thích từ trước đến nay. Hay cũng có thể nói chính sự đơn giản trong khâu chế biến cùng với hương thơm và vị chua dễ chịu của nem chua đã mang lại lợi thế cho sản phẩm này. Quá trình chín của nem chua không qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn các chất dinh dưỡng quí trong thịt như các acid amin hòa tan không bị mất đi. Hương thơm và vị chua đặc trưng của nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễ chịu khi ăn cũng như quá trình tiêu hóa được dễ dàng hơn. Từ trước đến nay, nem chua được chế biến theo phương pháp truyền thống nên không thể tránh khỏi những nhược điểm của phương pháp này. Đó là phụ thuộc vào hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và có trong thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết mổ, chất lượng thịt, môi trường bên ngoài, đặc biệt là nhiệt độ…Tất cả những yếu tố đó không thể khống chế được, gây ra sự mất ổn định chất lượng của sản phẩm, tăng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường hay khó kiểm soát được sự phát triển của các tạp khuẩn có trong thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻ người tiêu dùng. Trong chiến lược công nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thống trên thị trường, việc tạo ra được một sản phẩm có chất lượng ổn định và mùi vị phù hợp với thị hiếu tiêu dùng của người Việt Nam là cần thiết. Đề tài: “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ” nhằm mục đích là chủ động được giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua, từ đó làm cơ sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thời gian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, giúp sản phẩm được sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng hơn. 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua Khảo sát khả năng sinh acid lactic từ đường glucose Định danh một số vi khuẩn lactic bằng phương pháp PCR (polymerase chain reaction) và giải trình tự gen

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nem chua là thực phẩm lên men truyền thống được sản xuất thủ công, mangsắc thái kinh nghiệm lưu truyền từ đời này sang đời khác của người Việt Nam Tuynem chua không phải là một món ăn đòi hỏi cần phải chế biến công phu, cầu kỳ vàtrang trí đẹp mắt, nhưng nó lại luôn là một món ăn được người dân yêu thích từtrước đến nay Hay cũng có thể nói chính sự đơn giản trong khâu chế biến cùng vớihương thơm và vị chua dễ chịu của nem chua đã mang lại lợi thế cho sản phẩm này.Quá trình chín của nem chua không qua phương pháp xử lí nhiệt, nên phần lớn cácchất dinh dưỡng quí trong thịt như các acid amin hòa tan không bị mất đi Hươngthơm và vị chua đặc trưng của nem chua giúp cho người sử dụng có cảm giác dễchịu khi ăn cũng như quá trình tiêu hóa được dễ dàng hơn

Từ trước đến nay, nem chua được chế biến theo phương pháp truyền thốngnên không thể tránh khỏi những nhược điểm của phương pháp này Đó là phụ thuộcvào hệ vi sinh vật có trong tự nhiên và có trong thịt, phụ thuộc vào điều kiện giết

mổ, chất lượng thịt, môi trường bên ngoài, đặc biệt là nhiệt độ…Tất cả những yếu

tố đó không thể khống chế được, gây ra sự mất ổn định chất lượng của sản phẩm,tăng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường hay khó kiểmsoát được sự phát triển của các tạp khuẩn có trong thịt gây nguy hiểm cho sức khoẻngười tiêu dùng

Trong chiến lược công nghiệp hóa qui trình sản xuất sản phẩm truyền thốngtrên thị trường, việc tạo ra được một sản phẩm có chất lượng ổn định và mùi vị phù

hợp với thị hiếu tiêu dùng của người Việt Nam là cần thiết Đề tài: “Phân lập và

định danh vi khuẩn lactic lên men nem chua tỉnh Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ” nhằm mục đích là chủ động được giống vi khuẩn cho sản xuất nem chua,

từ đó làm cơ sở để tăng hương vị thơm ngon, tăng giá trị dinh dưỡng, rút ngắn thờigian sản xuất, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, giúp sản phẩmđược sản xuất với qui mô lớn, mang sản phẩm đến thị trường tiêu thụ rộng hơn

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua

- Khảo sát khả năng sinh acid lactic từ đường glucose

- Định danh một số vi khuẩn lactic bằng phương pháp PCR (polymerase chainreaction) và giải trình tự gen

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nem chua

Nem chua là một sản phẩm lên men thịt tươi được sản xuất và tiêu thụ nhiều ởĐồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Đây là một sản phẩm được sản xuất hoàntoàn thủ công, tùy theo kinh nghiệm của từng vùng mà chất lượng và khả năng bảoquản nem chua rất khác nhau Bản chất lên men là một quá trình chuyển hóa đường

(cho thêm vào khi chế biến) thành acid lactic nhờ hoạt động vi khuẩn Lactobacillus,

Pediococcus và Micrococcus Trong đó nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng là

Lactobacillus (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Việt Nam có nhiều vùng sản xuất nem nổi tiếng mang nét đặc trưng của từngvùng như: nem Vẽ (Từ Liêm, Hà Nội), nem Phủ Từ (Bắc Ninh), nem chua Đông Ba(Huế), nem chua Chợ Huyện (Bình Định), nem chua Ninh Hòa (Khánh Hòa), nemThủ Đức (Thành phố Hồ Chí Minh), Lai Vung (Đồng Tháp), Tân Hưng (TiềnGiang), (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1)

Bảng 1 Thành phần dinh dưỡng của nem chua

41068,021,74,33,724,078,0

(Nguồn http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1)

2.1.2 Hệ vi sinh vật của thịt

Thịt của gia súc khỏe thường ít vi sinh vật, tuy nhiên thịt có thể bị nhiễm bẩnkhi giết mổ, vận chuyển và bảo quản Hai nguồn chính gây nhiễm vi sinh vật trênthịt là các cơ quan nội tạng có bệnh hoặc viêm nhễm, đặc biệt là các vi sinh vật ởđường tiêu hóa và các vi sinh vật từ bên ngoài

Vi sinh vật thường nhiễm nhiều ở trên bề mặt thịt và phát triển làm cho sốlượng tăng nhanh dần lên, đặc biệt là những miếng thịt giữ trong điều kiện nóng làmcho số lượng vi sinh vật tăng nhanh, gây cho thịt chóng bị hư hỏng Ở đây có thể

tìm thấy các bào tử của nấm mốc thuộc các giống như Mucor, Penicilium,… các giống vi khuẩn như Bacillus, Salmonella,… trong đó các vi sinh vật phát triển trên thịt ở nhiệt độ lạnh có Achromobacter, Pseudomonas…Ngoài ra nấm men cũng

được thấy phát triển trên thịt (Lương Đức Phẩm, 2002)

Sau khi vi sinh vật phát triển trên thịt sẽ dần ngấm sâu vào bên trong làm hưhỏng thịt Quá trình ngấm này phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật và vào nhữngđiều kiện bên ngoài như ẩm độ, nhiệt độ, kỹ thuật bảo quản, phương pháp

chế biến… Vi khuẩn Salmonella trong điều kiện nhiệt độ bình thường sau 24-48 giờ

có thể ngấm sâu vào trong thịt được 14 cm; ở cùng điều kiện, các vi khuẩn hoại sinhchỉ ngấm được từ 4-5 cm Ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn chỉ ngấm được 1 cm trong mộttháng (Lương Đức Phẩm, 2002)

(http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1 )

2.1.5 Các loại gia vị

2.1.5.1 Đường

Đường được sử dụng trong sản xuất nem chua ngoài tác dụng tạo hương vị,

nó còn là cơ chất cho quá trình lên men tạo acid Do có tính chất háo nước nênđường giúp trạng thái liên kết gel của thịt thêm chặt chẽ Trong quá trình sản xuấtnhiều loại đường khác nhau được sử dụng là đường lactose, galactose, maltose,saccarose

Quá trình sản xuất nem chua ở phía Nam sử dụng rất nhiều đường, từ 35% so với trọng lượng của nguyên liệu chính, ngược lại lượng đường sử dụng ởcác tỉnh phía Bắc thường từ 10%-15% (http://www.scribd.com/doc/3175604/-an-cong-ngh1-vi-khn-lactic1)

30%-2.1.5.2 Muối

Muối có tác dụng làm tăng vị của sản phẩm, diệt khuẩn, hạn chế sự hoạtđộng của vi sinh vật gây thối, tăng cường sự hoạt động của vi khuẩn lactic nên tạođiều kiện lên men lactic và sản phẩm có hương vị thơm ngon, muối ở nồng độ cao

sẽ ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật, kể cả vi khuẩn lactic Do đó có thểđiều chỉnh lượng acid lactic theo ý muốn bằng cách khống chế nồng độ muối ở mức

thích hợp (Nguyễn Văn Tiếp et al., 2003).

2.1.5.3 Tỏi

Tỏi được trồng khắp nơi trên thế giới, tỏi là loại gia vị dùng để ướp, khử mùihay tạo mùi cho nguyên liệu Tỏi có vị cay, tính ôn, ngoài làm gia vị, các thànhphần khác trong tỏi còn có tác dụng kháng sinh mạnh Ngoài một ít iode và tinh dầu(100 kg tỏi chứa 60-200 g tinh dầu), thành phần chủ yếu trong tỏi là chất kháng sinhalicin (C6H10OS2) là một hợp chất sulfur có tác dụng diệt khuẩn rất mạnh đối với vi

sinh vật như Staphylococcus, Salmonella, Shigella…

2.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC

2.2.1 Định nghĩa quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí chứa các hợp chấtđường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác (Nguyễn Thành Đạt,2001)

2.2.2 Acid lactic

Acid lactic là sản phẩm của quá trình lên men lactic bởi vi khuẩn

Lactobacillus, sản phẩm cuối cùng của quá trình đường phân kị khí glucose Acid

lactic là chất lỏng không màu, không mùi; khối lượng riêng 1,24 g/cm3; tnc = 18oC; ts

= 119oC/12 mmHg, tan trong nước, etanol Acid lactic tồn tại ở hai dạng đồngphân quang học là D-acid lactic và L-acid lactic

là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic Năm

1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococcus lactis (Nguyễn Thành Đạt, 2001).

2.2.3.1 Đặc điểm chung

Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu (hoặc hình ovan) và hình que, kíchthước 0,5-1,1 µm, đôi khi đến 1,6 µm, tạo khuẩn lạc nhỏ 2 mm-5 mm, khuẩn lạc cóđặc điểm bìa liền, lồi, nhẵn, sáng (Kandler và Weiss, 1986)

Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, Gramdương, kị khí không bắt buộc Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành acidlactic rất khác nhau trong môi trường và như vậy sức chịu acid (hay độ bền với

acid) cũng khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn(khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển

ở pH trong khoảng 3,8-4 Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pHtrong khoảng 5,5-6 (Lương Đức Phẩm, 2002)

Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 35oC, các loài

ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích là 40oC-45oC, ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đốithấp (5oC hoặc thấp hơn) Khi gia nhiệt tới 60oC-80oC hầu hết chúng bị chết sau 10-

30 phút Trong tự nhiên vi khuẩn lactic thường gặp trong đất, không khí, trong nướcnhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa,thịt ) (Lương Đức Phẩm, 2002)

2.2.3.2 Một số giống vi khuẩn lactic

* Lactobacillus

Vi khuẩn Lactobacillus đều là Gram dương, kích thước 0,5-1,1µm đôi khi

lên tới 1,6 µm, dạng trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi Nhiệt độ tối thích

để Lactobacillus sinh trưởng là 30°C-40°C và pH từ 5,5-6,2 Lactobacillus phát

triển dưới điều kiện kị khí hoặc thiếu oxy Khuẩn lạc có dạng bìa liền, lồi, nhẵn,sáng (Kandler và Weiss, 1986)

Tùy vào điều kiện môi trường sống, hình dạng của vi khuẩn Lactobacillus

thay đổi từ que ngắn đến que dài, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ

Lactobacillus chiếm phần lớn nhóm vi khuẩn sinh acid lactic, chúng rất phổ biến và

thông thường là có lợi (Hồ Nhân, 2008)

* Streptococcus

Giống Streptococcus có dạng hình cầu hoặc hình ovan, đường kính tế bào

0,5-1 µm Sau khi phân chia chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn

Streptococcus thuộc dạng lên men lactic đồng hình, Gram dương, catalase âm tính,

không sinh bào tử, không di động và kỵ khí tùy ý (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

* Leuconostoc

Giống Leuconostoc có đường kính từ 0,5-0,8 µm và chiều dài khoảng 1,6

µm, trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1,3 µm

Sau khi phân chia Leuconostoc thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám

tập trung(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Leuconostoc thường là vi khuẩn kị khí không bắt buộc và có nhu cầu cao về

dinh dưỡng Leuconostoc phát triển từ 20°C-30°C và không phát triển ở 45°C Đó là

những giống lây nhiễm thường xuyên trong thực phẩm và gây ra những rủi ro trongquá trình sản xuất nhất là trong các sản phẩm đường, sản phẩm acid hay trong các

sản phẩm thực vật khác Leuconostoc có vai trò chính trong quá trình lên men

malolactic của rượu vang và chúng cần thiết cho sự lên men của một vài loại

phômai Ngoài ra, Leuconostoc cũng tham gia trong việc chế biến các sản phẩm

thức ăn gia súc lên men và trong các sản phẩm rau quả lên men (Roissart và Luquet,

Pediococcus có dạng tứ cầu hoặc song cầu Pediococcus cần nhu cầu dinh

dưỡng cao và hoạt tính thủy phân protein yếu Khuẩn lạc có màu vàng xanh, kíchthước khuẩn lạc 1-3 mm, hình dạng khuẩn lạc trơn láng (Nguyễn Thành Đạt, 2001)

Vi khuẩn lactic cũng được phân loại tùy theo hình thức lên men của chúng,chúng được chia làm hai loại gồm nhóm vi khuẩn lactic đồng hình và nhóm vikhuẩn lactic dị hình

* Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình

Lactobacillus plantarum thường hiện diện trong nước bọt và đường tiêu hóa

của người Tên khác của Lactobacillus plantarum là Lactobacillus pentosus,

Lactobacillus arabinosus (Robert, 1957) Lactobacillus plantarum là vi khuẩn kị

khí, ngẫu nhiên, trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi hoặc chuỗi Nhiệt độ tối thích cho

vi khuẩn này sinh trưởng là 30oC (Lương Đức Phẩm, 2002) Lactobacillus

plantarum thường được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm (ví dụ một số

loại thực phẩm có chứa Lactobacillus plantarum như yaourt, phômai, kim chi, xúc xích, muối chua rau dưa ) (Lương Đức Phẩm, 2002) Lactobacillus plantarum có

thể làm tăng hoạt động trao đổi chất trong tế bào đường ruột, kích thích phản ứng

miễn dịch (Nissen et al., 2009) Lactobacillus plantarum được chứng minh có khả năng giảm cholesterol khi chủng riêng rẽ hoặc kết hợp với Lactobacillus paracasei trong khẩu phần ăn của chuột (Hanaa et al., 2009) Ngoài ra, Lactobacillus

plantarum còn có thể tạo ra bacteriocin ức chế sự tăng trưởng của Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Lactobacillus delbreckii subsp, Lactobacillus bulgaricus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus cloacae và Pseudomonas aeruginosa (Todorov và Dicks, 2005).

Lactobacillus acitophilus là trực khuẩn, Gram dương, có khả năng lên men

các loại đường như glucose, fructose, galactose, manose, mantose Chúng hoàn toànkhông có khả năng lên men xylose, arabinose, glycerol manitol, sorbitol Trong quátrình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid lactic Nhiệt

độ tối ưu để Lactobacillus acitophilus phát triển là 45oC-50oC (Nguyễn Thành Đạt,2001)

Lactobacillus farciminis thường được tìm thấy trong các thực phẩm như sản

phẩm thịt, xúc xích Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng Lactobacillus làm

giảm các cơn co thắt cơ bụng trong tình trạng viêm ruột kết ở chuột, có thể đượcdùng trong điều trị hoặc phòng ngừa bệnh lý viêm mãn tính hay cấp tính ở ruột(www.international.inra.fr/ /mechanisms_of_action_of_the_probiotic_lacto)

- Nhóm vi khuẩn lactic dị hình

Lactobacillus brevis được tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải,

dưa chuột nên còn được gọi là trực khuẩn bắp cải Trong lên men, ngoài acid lactic(1,2%) nó còn tạo thành acid acetic, etanol (tới 2,4%), và CO2, nó còn tạo hươnglàm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu (Lương Đức Phẩm, 2002)

Weissella paremesenteroides đã được tìm thấy trên dưa chuột về khả năng

sinh bacteriocin DFR-8 có thể ngăn chặn một số lượng lớn mầm bệnh như Listeria

monocytogenes (Pal và Ramana, 2010).

2.2.3.3 Ý nghĩa thực tế của lên men lactic

Vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt làtrong công nghiệp chế biến sữa Các vi khuẩn này có một ý nghĩa rất lớn trong sảnxuất sữa, phômai, trong việc muối chua rau quả ủ chua thức ăn chăn nuôi Nhữngnăm gần đây vi khuẩn lactic đã được đưa vào trong việc chế biến một số dạng giòchả, xúc xích

Trong công nghiệp đã xây dựng các dây chuyền công nghệ lên men để sảnxuất acid lactic Acid lactic được dùng nhiều cho công nghệ đồ hộp và bánh kẹo,sản xuất thức ăn kiêng, thức ăn chống suy dinh dưỡng ở người già và trẻ em nguyên liệu dùng trong sản xuất acid lactic là mật bột, tinh bột và những vật liệuchứa tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2002)

Trong quá trình lên men thịt, chức năng chính của vi khuẩn lactic là làm pHcủa bột thịt giảm nhanh (tăng tính ổn định của sản phẩm và khả năng sống của vikhuẩn lactic bằng cách ức chế những vi sinh vật gây hư hỏng không mong muốn)

Vi khuẩn lactic còn góp phần tạo ra những thay đổi sinh hóa để có được những đặc

điểm cảm quan mới cho độ chín của sản phẩm (Ho et al., 2009).

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh

vực probiotic (Champ et al., 1983) Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong

việc tạo khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ hoặc làm giảm sự lan truyền bệnh(Muralihara, 1977)

Lactobacillus có vai trò sinh thái trong ống tiêu hóa của một số loài cá như

sản xuất chất kháng khuẩn, tăng cường các phản ứng miễn dịch, tăng cường khảnăng hấp thu các chất dinh dưỡng và tăng sử dụng một số carbohydrate khó tiêu

Ngoài ra Lactobacillus cũng hiện diện trong ống tiêu hóa của một số loài động vật không xương sống (Fuller, 1989; Havenaar et al., 1992)

2.2.6 Lên men lactic

Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm làacid lactic

C6H12O6 2C3H6O3 + 94 kcal

(Glucose) (Acid lactic)

Lên men lactic dị hình là loại lên men, ngoài acid lactic còn có các sản phẩmkhác như acid acetic, ethanol, CO2

C6H12O6 C3H6O3 + C2H4(COOH)2 + CH3COOH + C2H5OH + CO2 + H2(Glucose) (Acid lactic) (acid succinic) (acid acetic) (etanol)

(Lương Đức Phẩm, 2002)

2.2.7 Điều kiện của quá trình lên men lactic

2.2.7.1 Các cấu tử môi trường

Glucid là một trong những thành phần chủ yếu của môi trường cần thiết choquá trình lên men Khi nuôi cấy các vi sinh vật khác nhau, người ta dùng nồng độđường khác nhau Trong suốt quá trình sinh hóa, các vi khuẩn lactic chuyển glucosethành acid lactic, thành phần chính làm giảm pH Việc sản sinh acid lactic giúp bảoquản sản phẩm do vi khuẩn lactic ngăn chặn tác nhân gây bệnh, vi khuẩn gây hưhỏng Mặt khác vi khuẩn lactic góp phần tạo tính chất cảm quan đặc biệt của sảnphẩm thịt lên men Vì vậy, có thể điều chỉnh tiến trình lên men thông qua việc điều

chỉnh lượng đường (Consuelo et al., 2006).

Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu về chất dinh dưỡng phức tạp, khôngmột đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoángthuần khiết chứa glucose và NH4, đa số chúng cần hàng loạt các vitamin nhưlactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid folic, biotin…và các acid amin (Nguyễn

số vi khuẩn lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10oC-40oC Ảnh hưởng

của nhiệt độ có lẽ nhiều nhất là đến các phản ứng enzym Trong một khoảng nhiệt

độ nào đó thì tốc độ phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt

độ thì sẽ xảy ra sự biến tính protein (Đồng Thị Thanh Thu, 1995)

* pH của môi trường

Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzym của chúng, chịu tácđộng mạnh của pH Mỗi enzym đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực củaenzym cao nhất Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,6-6,2

(Lactobacillus); 5,5-6,5 (Pediococcus) (Trần Minh Tâm, 1998) Trong quá trình lên

men lactic, acid lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác Sau

đó khi lượng acid tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Tốc độphát triển cũng như lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi lượng acid lactic quánhiều Acid lactic sinh ra làm giảm pH của sản phẩm và là một phương thức bảoquản sản phẩm hữu hiệu pH < 4 vi khuẩn lactic ngừng hoạt động (Trần Minh Tâm,1998)

* Oxy

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn yếm khí không bắt buộc Do đó, oxy không ảnhhưởng đến quá lên men của vi khuẩn tuy nhiên càng thiếu oxy sẽ có lợi cho quátrình lên men lactic (Trần Minh Tâm, 1998)

2.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NEM CHUA

Quá trình lên men lactic trong sản xuất nem chua xảy ra đồng thời hai quátrình sinh hóa là quá trình lên men lactic và quá trình thủy phân protein Trong quátrình lên men lactic, các vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa lượng đường có trong nemthành acid lactic và các sản phẩm phụ tạo cho nem có vị chua và các mùi vị khácđặc trưng Trong quá trình lên men lactic, vi khuẩn lactic tạo ra một lượng nhỏprotease góp phần vào quá trình thủy phân protein Song song với quá trình lên menlactic là quá trình thủy phân protein được thực hiện bởi enzyme protease có sẵntrong nguyên liệu và do vi sinh vật tạo ra trong quá trình trao đổi chất của nó, tạothành các polypeptid, peptid, acid amin làm tăng chất lượng sản phẩm

Mặt khác, acid lactic tạo thành từ quá trình lên men làm giảm pH của thịtxuống thấp (khoảng 4,5) làm protein của thịt bị đông tụ Bên cạnh đó môi trườngacid còn giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây thối rữa, giúp miếng nemkhông bị hư hỏng trong quá trình bảo quản Tuy nhiên, ở pH này không ức chếđược nấm mốc phát triển, nên cần có biện pháp pháp chống nấm mốc để bảo quản

nem chua được lâu (Nguyễn Lân Dũng et al., 1997).

2.4 MỘT SỐ HIỆN TƯỢNG XẢY RA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

2.4.1 Sự acid hoá

Phản ứng đặc trưng nhất trong các quá trình lên men các sản phẩm thịt là sựacid hoá Đây là kết quả của quá trình dị hoá đường bởi các vi sinh vật Quá trìnhacid hoá cần thiết để đạt được một cấu trúc và độ rắn chắc thích hợp của sản phẩmcuối cùng Các protein của cơ hoà tan bởi muối sẽ được keo hoá trở lại nhờ quátrình acid hoá Quá trình này đem lại hương vị cho sản phẩm, chủ yếu là hương vịacid, cho phép đảm bảo tính không độc hại, sự ổn định của sản phẩm (Susanna,2001)

2.4.2 Biến đổi màu sắc

Màu sắc đặc trưng của sản phẩm thịt được xác định bởi các sắc tố có trongthịt Myoglobin chính là sắc tố quyết định màu sắc của thịt, chất này chiếm khoảng80% sắc tố của cơ Sắc tố này có 3 dạng gồm Oxymyoglobin (màu đỏ tươi),myoglobin dạng khử (màu đỏ tía), metmyoglobin hay myoglobin dạng oxy hoá(màu đỏ sẫm đến nâu) Màu sắc được gây nên bởi các yếu tố như tỉ lệ các sắc tố,phụ thuộc vào chủng giống con vật, cấu trúc cơ thịt, cấu tạo của phân tử sắc tố ở

dạng oxy hoá hay dạng khử (Lê Ngọc Tú et al., 2003).

Cấu tạo hoá học của sắc tố còn phụ thuộc vào giá trị pH pH cao thìmyoglobin ở dạng khử, khi pH giảm nhanh thì sắc tố ở dạng metmyoglobin (Lê

Ngọc Tú et al., 2003).

2.4.3 Biến đổi hương thơm

Các sản phẩm thịt lên men có hương thơm đặc trưng là nhờ muối gia vị, cácacid cùng tất cả các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các carbohydrate,protein và chất béo

Trong lên men tự nhiên, các vi sinh vật hiện diện chủ yếu là loài

Micrococcus và Lactobacillus Vai trò chính của Lactobacillus là sinh ra các acid

quan trọng trong việc hình thành các chất tham gia vào quá trình tạo hương Cácloài lên men dị hình đưa lại cho sản phẩm hương thơm nhờ việc sinh ra các acid dễbay hơi, rượu và CO2(Susanna, 2001)

2.5 PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT PCR

2.5.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR do Mullis phát minh vào năm 1985 được sử dụng rộng rãinhất Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền

nhờ enzym polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự ADN đặc hiệu in

vitro, không cần sự hiện diện của tế bào; chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi

(primers pair) chuyên biệt, enzym ADN polymerase, các nucleotide tự do, dungdịch đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Đây là

sự khuếch đại theo cấp số nhân Đoạn trình tự ADN đặc trưng sẽ được khuếch đạivới số lượng là 2n-1 với n là số chu kỳ phản ứng Theo tính toán sau 30 chu kỳ, sựkhuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu Mỗi chu kỳ phản ứng gồm babước

Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồmcác thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độcao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94oC- 95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút

Giai đoạn lai (hybridization): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của cácmồi) cho phép các mồi bắt cặp vào khuôn; trong thực nghiệm nhiệt độ này dao độngtrong khoảng 40oC-70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây-1phút

Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elonggation): nhiệt độ được tăng lên đến

72oC giúp cho ADN polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt độngtổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại,thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Những phản ứng này được thực hiện nhờ Taq polymerase, và sự thay đổi chu

kỳ nhiệt độ một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ để tách dây đôi thành dây đơn vànhiệt độ cho đoạn mồi gắn vào vùng mục tiêu trên dây nền (annealing)

Sự phát hiện và phân lập một ADN polymerase (Taq polymerase) có tính ổn định cao đối với nhiệt độ, từ vi khuẩn chịu nhiệt (thermophilic) Thermus aquaticus (Taq), cho phép chúng ta có thể tổng hợp dây ADN có tính chất lặp lại nhiều lần (Saiki et al, 1998), số lượng khuếch đại tăng theo hàm số mũ, làm cho công nghệ

sinh học có thêm một phương tiện rất có giá trị để ứng dụng cho nhiều lĩnh vựcnghiên cứu khác nhau (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2004)

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Mồi và nhiệt độ lai:

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc trưng và cóhiệu quả cao Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sunggiữa mồi xuôi (sense) và mồi ngược (antisense) và cũng không có những cấu trúc

“kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi Tm của mồixuôi và mồi ngược không quá cách biệt nhau Thành phần nucleotide của các mồiphải cân bằng tránh lặp lại nhiều lần các cặp GC Các mồi được chọn phải đặc trưngcho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lai trên gene.Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưutrên những trình tự nhỏ hơn 1 kb

thuat-PCR-can-ban-30k)

(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-ADN mẫu

Phản ứng PCR tối ưu khi ADN thật tinh sạch Tuy nhiên nhiều kĩ thuật chẩnđoán bằng PCR vẫn đạt kết quả đối với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào

hoặc ngay cả mẫu ADN không được bảo quản tốt Ngoài ra, phản ứng PCR tối ưucũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu Lượng ADN mẫu sử dụng cũng có khuynhhướng giảm (1 µg xuống còn 100 ng) khi sử dụng các ADN polymerase cho hiệuquả cao Việc giảm lượng mẫu còn hạn chế được sự khuếch đại “kí sinh” tạo nhữngsản phẩm phụ không mong muốn.

thuat-PCR-can-ban-30k)

(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-Enzym

Enzym được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I Đây

là enzym không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp Hiện nay, một sốenzym mới có hiệu quả hơn ADN polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ một vi

khuẩn hiện diện trong suối nước nóng, Thermus aquaticus Enzym này được viết tắt Taq polymerase Polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt

động như một enzym phiên mã ngược khi có mặt RNA khuôn và ion Mg2+; ngượclại, khi khuôn là ADN và có ion Mg2+, enzym này lại xúc tác phản ứng khuếch đạiADN (http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-thuat-PCR-can-ban-30k)

dNTP

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 µM/mỗinucleotide Nồng độ cao hơn dẫn đến sự khuếch đại “kí sinh” Sự mất cân bằngtrong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

thuat-PCR-can-ban-30k)

(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-Nồng độ ion Mg 2+

Mg2+ là cofactor cho hầu hết các ADN polymerase, đặc biệt là các ADNpolymerase chịu nhiệt thường dùng Khi nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) làmgiảm phản ứng kéo dài mạch ADN do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế.Ngược lại, nồng độ Mg2+ quá thừa làm ổn định sự bắt cặp sai của mồi với khuôn,dẫn đến nhiều sản phẩm không đặc hiệu Do đó, nồng độ tối ưu của Mg2+ phải đượcxác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm

(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-Số chu kì của phản ứng PCR

Trong thực tế, số lượng chu kì của phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kì

do hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần củaphản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đượctổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

thuat-PCR-can-ban-30k)

(http//:www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Sach:Cam-nang-SHPT/Chuong-18-Kỹ-2.6 Điện di gel agarose

Sau phản ứng PCR, các ADN của vi khuẩn được nhuộm bởi Ethidiumbromide và điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV

2.6.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của cácnucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khichịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điệntrường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.6.2 Gel agarose

Đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng

để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5-20 kb Gel được đổ trênmột giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang (HồHuỳnh Thùy Dương, 2002)

Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện dưới tia tử ngoại (UV) nhờ mộthóa chất có tên là ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa cácbase của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Trongthao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ Sau điện di, gel đượcchiếu sáng bằng tia tử ngoại, nucleic acid sẽ hiện dưới dạng những vạch màu đỏcam (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.7 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ADN

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phươngpháp dideoxy Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện vàgiải các nhầm lẫn do kỹ thuật Có hai loại mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng chomỗi mạch đơn ADN Tiến hành biến tính ADN trong môi trường có urea và nhiệt

độ cao (khoảng 55ºC), hai mạch đơn ADN tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau.Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotide, từ đó tổng hợpđược trình tự sắp xếp các gen

Các máy giải trình tự gen thông dụng của hãng ALF II (Pharmacia), Simadu(Nhật) có kèm theo phần mềm xử lý số liệu, kit hóa chất tiêu chuẩn bán Giải trình

tự gen cần tùy theo từng loại máy giải trình tự để tạo dung môi và các điều kiệnthích hợp, đảm bảo độ chính xác kết quả (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.8 PHẦN MỀM PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ (BLAST)

BLAST là chương trình so sánh cấu trúc của chuỗi ADN, chuỗi amino acidcần phân tích với các chuỗi tương ứng lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu, nhằm tìmkiếm chuỗi (hay một số chuỗi) tương đồng nhất với chuỗi cần kiểm tra Sau đó,người phân tích sẽ khai thác các thông tin về đặc điểm hay đặc tính đã biết của cácchuỗi trong ngân hàng để dự đoán xác định cấu trúc và đặc tính của chuỗi kiểm tra.Trọng tâm của kỹ thuật phân tích là tìm kiếm xác định các vùng tương đồng nhau

về cấu trúc trên các chuỗi để xác định mức độ phân ly tương đối của chuỗi cần phântích với chuỗi khác trong ngân hàng dữ liệu Về phương diện kỹ thuật chương trìnhBLAST cho phép phát hiện sự tương đồng ở hai mức độ là mang tính cục bộ ở mộtvùng hay mang tính tổng thể giữa hai chuỗi với nhau (Nguyễn Văn Cách, 2005)

Có 5 chương trình BLAST là BLAST N, BLAST P, BLAST X, TBLAST N,TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide- Nucleotide BLAST) cho phép sosánh cấu trúc chuỗi nucleotide cần phân tích với cấu trúc chuỗi nucleotide trongngân hàng dữ liệu (Madden, 2003)

Sử dụng phần mềm phân tích trình tự BLAST tại địa chỉ

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ và kết nối trực tiếp trên mạng để xác định

tên và trình tự cặp mồi sử dụng Đồng thời hỗ trợ thêm của phần mềm ADN club đểchuyển trình tự của mạch đơn thành trình tự bổ sung

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

3.1.1 Thời gian thực hiện

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học Khoa Khoa Học

Tự nhiên và phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triểnCông nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ

Hình 1: Tên một số loại nem được dùng trong phân lập

3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị

- Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm: đĩa Petri, ống nghiệm,que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, kính mang vật, kính đậy vật

- Cân phân tích (Mettler Toler, Switzerland)

- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

- Máy lắc (Heidolph MR3001, Đức)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt (HVE.50)

- Máy li tâm (Eppendorf, Đức)

Chú thích: A: Máy PCR Perkin Elmer 9700

B: Khuôn đổ gel

C: Máy đọc và chụp Gel Bio-Rad UV 2000

D: Máy ly tâm Eppendorf

3.2.2 Hóa chất

Các hóa chất pha môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe )

Hóa chất dùng để nhuộm Gram

Dung dịch crystal violet

Dung dịch Lugol iodine

Dung dịch safranin

Hóa chất dùng để trích ADN vi khuẩn lactic

Môi trường LB (Luria Bertani)

TE để hòa tan ADN (gồm 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA).

Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% hòa tan ADN và giúp proteinase K hoạtđộng tách protein khỏi ADN hiệu quả hơn

Isopropanol nhằm tủa ADN và etanol 70% dùng rửa ADN

Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10% NaCl 0,75 M

Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharid khỏi ADN.Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăngiữa ADN và protein

Lysozyme và RNase A ; nước cất hai lần vô trùng

Hóa chất dùng để chạy PCR nhận diện vi khuẩn lactic

PCR buffer, Taq-polymerase

ADN vi khuẩn

Deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs) gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTPNước cất vô trùng, primer

Hóa chất dùng để chạy điện di sản phẩm PCR

Agarose 1%-1,2%, TAE buffer (hỗn hợp của Tris base, Acetic acid vàEDTA), loading buffer, Ethidium bromide (EtBr), ADN chuẩn để ước lượng kíchthước các trình tự nucleic acid trong gel agarose

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phân lập vi khuẩn lactic

2 g mẫu nem được cho vào bình tam giác 100 ml nước cất đã khử trùng, lắctrên máy lắc khoảng 30 phút 50 µl dung dịch sau khi lắc được cho vào dĩa petri cóchứa môi trường đặc MRS đã chuẩn bị trước Mẫu được trải đều và ủ ở 30oC trong

3 ngày Các dạng khuẩn lạc khác nhau tạo vòng tan CaCO3 trên môi trường MRS

được chọn và cấy chuyển sang các dĩa môi trường khác cho đến khi các khuẩn lạcđược rời rạc qua các đường cấy Cuối cùng chuyển một khuẩn lạc rời vào ốngnghiệm chứa môi trường MRS đặc Các dòng vi khuẩn được kiểm tra ròng trênkính hiển vi với độ phóng đại 400 lần Sau đó các dòng vi khuẩn này được cấy riatrên môi trường đặc MRS, ủ ở nhiệt độ 30oC Sau 3 ngày quan sát hình dạng củakhuẩn lạc.

Quá trình phân lập trên được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây

3.3.2 Xác định vi khuẩn lactic bằng thử nghiệm sinh hóa

3.3.2.1 Nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi

Nhuộm Gram được thực hiện theo quy trình như sau:

Dùng que cấy đã khử trùng trải mỏng một ít vi sinh vật trên kính mang vật đãchuẩn bị 10 µl nước cất vô trùng Sau khi trải mỏng, mẫu vật được cố định bằng

Cho 50 µl vào dĩa petri chứa môi trường MRS đặc

cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó, vi khuẩn được nhuộm với một đến hai giọtcrystal violet trên kính mang vật trong 2 phút

Sau khi rửa tiêu bản bằng nước cất vô trùng và để khô, tiếp tục cho một đếnhai giọt dung dịch iod lên kính mang vật trong 1 phút Tiêu bản được rửa bằng nướccất vô trùng hai lần và rửa bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy hết màu tím của crystalviolet Sau đó tiêu bản được rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây và để khô

Vi khuẩn được tiếp tục nhuộm bằng một đến hai giọt fushin, rồi trải đều bằngque cấy trong 1 phút Cuối cùng tiêu bản được rửa bằng nước cất vô trùng, để khô

và quan sát dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của

vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương sẽ có màu tím xanh, vi khuẩn Gram âm có màuhồng đỏ

3.3.2.2 Phản ứng catalse

Enzym catalase được tìm thấy trong đa số vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn hiếukhí, có khả năng biến đổi H2O2 thành O2 và H2O Catalase có thể được phát hiệnbởi một thí nghiệm đơn giản bằng cách cho một giọt H2O2 vào môi trường đặc cókhuẩn lạc vi khuẩn, nếu như có hiện diện của bọt khí chứng tỏ vi khuẩn có phảnứng catalase và thí nghiệm dương tính, ngược lại không có bọt khí là trắc nghiệm

âm tính (Lê Duy Linh et al., 2001) Vi khuẩn lactic có phản ứng catalase âm tính

Hàm lượng acid sinh ra được xác định bằng cách cho 45 ml nước cất chứa 1

ml dung dịch chỉ thị phenophtalein cho vào bình tam giác 250 ml pH của dung dịch

được chuẩn bằng dung dịch NaOH 0,1 N sao cho pH 8,2 Sau đó, cho chính xác 5

ml môi trường chứa dịch vi khuẩn lactic cần xác định acid sinh ra vào bình tam giác

và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi pH 8,2 Như vậy số ml cần để trung hòa là n ml

Hàm lượng acid tổng do vi khuẩn tạo ra tính theo mg đương lượng trên 1 lítmôi trường hoặc g/l Ở đây hàm lượng tổng được tính theo acid lactic

Ax = (n x 0,009 x 1000)/ V

Trong đó:

Ax: lượng acid có trong 1 lít sản phẩm (g/l)

n: số ml NaOH 0,1N tiêu hao khi định phân mẫu

V: lượng mẫu mang đi phân tích (5 ml)

0,009: số gam acid lactic tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N

1000: Hệ số qui đổi từ lít sang ml

3.3.4 Nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Các dòng vi khuẩn đã được làm ròng Sau đó được nhận diện bằng phương pháp sinh học phân tử như sau

Quy trình nhận diện vi khuẩn

3.3.4.1 Ly trích ADN

Cho 1 ml vi khuẩn sau khi được nuôi trong môi trường LB lỏng ở nhiệt độphòng trong 24 giờ vào ống eppendofl 2 ml Sau khi ly tâm ống eppendofl chứa vikhuẩn với tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút Phần dịch lỏng bên trên được loại

Vi khuẩn đã kiểm tra ròng

Ly trích ADNKiểm tra khả năng sinh acid

Thực hiện phản ứng PCR

Giải trình tự nucleotide

bỏ Kết tủa được hòa tan trong 250 µl dung dịch đệm TE Sau đó, thêm 50 µl dungdịch SDS 10% và 5 µl protein K (10 mg/ml) để phân hủy protein liên kết với ADN.Ống eppendofl chứa các thành phần trên được ủ ở 65°C trong 20 phút, cứ 5 phútđảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch.

Sau khi ủ ở 65°C, hỗn hợp được thêm 400 µl dung dịch CTAB 10%NaCl 0,7% trộn đều và tiếp tục ủ ở 65°C trong 20 phút Tiếp theo, 600 µl dung dịchchloroform : isoamyl alcol (24:1) được thêm vào phản ứng và lắc mạnh Hỗn hợptrên được ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút Phần trong phía trênđược thu nhận và cho vào ống eppendofl ADN được kết tủa bằng 1 ml isopropanol

ở -20°C trong 30 phút Kết tủa thu được bằng cách ly tâm 13000 vòng trong 10phút và được rửa với 1 ml ethanol 70% ADN được ly tâm chân không trong 15-20phút ở 45°C để loại bỏ hết ethanol Cuối cùng ADN được hòa tan trong 300 µl nướccất vô trùng và bảo quản ở -20°C

3.3.4.2 Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR

Sau khi trích ADN từ các dòng vi khuẩn đã phân lập, phản ứng PCR được

thực hiện với cặp primer giống Lactobacillus với trình tự primer như sau để nhận

diện các dòng vi khuẩn lactic:

LbF1 (5’ -CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC- 3’)

LbR1 (5’ -CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA-3’)

(Dubernet, 2002)

* Qui trình phản ứng PCR

Gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn tách mạch ở nhiệt độ 94oC trong 3 phút

+ Giai đoạn nhân bản: 35 chu kỳ

Hình 3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi Lactobacillus

Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong Bảng 3.3

hình gel bằng máy Bio-Rad ADN để nhận diện giống Lactobacillus có kích thước

200 bp được quan sát và so sánh với ADN chuẩn

Sau đó, các dòng vi khuẩn khác nhau có khả năng sinh acid tổng cao đượcchọn ngẫu nhiên để giải trình tự nucleotide và định danh Các dòng vi khuẩn lacticđược giải trình tự nucleotide bằng máy giải trình tự tự động, sau đó so sánh với cáctrình tự trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng phần mềm BLAST để xác định mức

độ đồng hình của các dòng vi khuẩn đó (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

3.3.5 Phương pháp xử lí số liệu

Các kết quả được thiết lập, phân tích thống kê bằng chương trình Microsoft excel và Statgraphics Plus 5.0

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN

42 dòng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nem thuộc huyện Lai Vung, tỉnhĐồng Tháp và Thành phố Cần Thơ Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 4.1 bêndưới

Bảng 6 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn

Giáo Thơ, Lai Vung, Đồng Tháp

Sáu Xệ, Lai Vung, Đồng Tháp

Thanh Sơn, Lai Vung, Đồng Tháp

Tư Kiên, Lai Vung, Đồng Tháp

Cô Hiệp, Lai Vung, Đồng Tháp

Thanh Vân, Cần Thơ

Cô Phúc, Cái Răng, Cần Thơ

GT SXTSTKCHTVCP

06040603030504

Qua quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng vi khuẩn

có dạng hình que hoặc hình cầu, không chuyển động Sau khi cấy chuyền trên môitrường MRS và ủ 3 ngày Kết quả phân lập vi khuẩn lactic được chọn là nhữngdòng phân huỷ CaCO3 làm cho môi trường xung quanh khuẩn lạc có vòng trong Đa

số các dòng vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc màu trắng sữa, trắng đục, hoặcvàng kem, độ nổi mô, bìa nguyên, kích thước khuẩn lạc từ 0,5 mm- 1,5 mm Đây

cũng là những đặc điểm nổi bật về kiểu hình của vi khuẩn lactic mà Kandler và

Weiss (1986) đã mô tả (Bảng 4.2)

* Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc:

42 dòng vi khuẩn đã phân lập được quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc vớikết quả được trình bày trong Bảng 4.3 như sau:

Dạng 1: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, mô, vàng kem, kích thước thay đổi từ0,5-1 mm gồm UT11

Dạng 2: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, lài, vàng kem, kích thước thay đổi từ1-1,5 mm gồm GT5, GT6.

Dạng 3: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên lài, trắng đục, kích thước thay đổi từ

0,5-1 mm gồm UT9, GT0,5-1, GT2, GT3, GT4

Dạng 4: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, mô, trắng sữa, kích thước thay đổi từ0,5-1 mm gồm UT3, UT4, UT5, UT6, UT7,UT8, UT10, UT12, UT13, TS3, TS4,TS5, TS7, TS8, CH1, CH3, CH4, TK3, SX1

Dạng 5: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, lài, trắng sữa, kích thước thay đổi từ1-1,5 mm gồm TS2, TV2, TK1, TK2, CP10

Dạng 6: Khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, mô, trắng sữa, kích thước thay đồi từ1-1,5 mm gồm SX2, SX3, SX4, CP1, CP2, CP4

Dạng 7: Khuẩn lạc hình bầu dục, bìa nguyên, mô, trắng sữa, kích thước thayđổi từ 1-1,5 mm gồm TV4, TV6, TV8

Dạng 8: Khuẩn lạc hình bầu dục, bìa nguyên, lài, trắng sữa, kích thước thayđổi từ 0,5-1 mm gồm TV5

* Đặc điểm của vi khuẩn:

42 dòng vi khuẩn đã phân lập được quan sát đặc điểm hình dạng với kết quảđược trình bày trong Bảng 4.4 như sau:

Dạng hình que ngắn gồm: TK1, TK2, TK3, CP1, CP2, CP4, CP10, UT13,UT10, UT11, SX1, SX4, TS8

Dạng hình cầu gồm: UT12, CH3, GT1, TV2, UT4, UT5, UT6, UT7, UT8,TS2, TS3, TS5, TV6, SX2, SX3, UT3, UT9, TV4, TV5, CH1, CH4, GT3, GT4,GT5, GT6, TS4, TS7, GT2, TV8

Bảng 7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn

STT Dòng vi khuẩn

Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm vi khuẩn

Màu sắc Độ nổi Bìa Hình dạng thước Kích

(mm)

Hình dạng

20 GT6 Vàng kem Lài Nguyên Tròn 1,5 Cầu

Bảng 8 Đặc điểm khuẩn lạc của 42 dòng vi khuẩn phân lập

Đặc điểm khuẩn lạc Các loại Số lượng Tỉ lệ (%)

Bầu dục

384

90,489,52

Trắng đụcVàng kem

3453

80,9511,97,15

Lài

2913

69,0530,95

Bảng 9 Đặc điểm hình dạng vi khuẩn của 42 dòng phân lập

Đặc điểm vi khuẩn Các loại Số lượng Tỉ lệ (%)

Cầu

1329

3169Như vậy, về đặc điểm khuẩn lạc thì trong 42 dòng vi khuẩn phân lập đượctrên môi trường MRS khác nhau dựa trên màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nổicủa khuẩn lạc

Về hình dạng: khuẩn lạc có dạng tròn (38/42) chiếm tỉ lệ 90,48%, khuẩn lạc

có dạng hình bầu dục (4/42) chiếm tỉ lệ 9,52%

Về màu sắc khuẩn lạc: khuẩn lạc có màu vàng kem (3/42) chiếm tỉ lệ 7,15%,khuẩn lạc có màu trắng đục (5/42) chiếm tỉ lệ 11,9%, khuẩn lạc có màu trắng sữa(34/42) chiếm tỉ lệ 80,95%

Về độ nổi: khuẩn lạc có dạng mô (29/42) chiếm tỉ lệ 60,05%, khuẩn lạc códạng lài (13/42) chiếm tỉ lệ 30,95%

Về hình dạng vi khuẩn: vi khuẩn hình que (13/42) chiếm tỉ lệ 31%, vi khuẩnhình cầu (29/42) chiếm tỉ lệ 69% (Bảng 4.4)

Môi trường MRS

bổ sung CaCO3

Hình 4 Hình dạng khuẩn lạc của dòng CP2 4.2 ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP

4.2.1 Nhuộm Gram

Kết quả nhuộm Gram các dòng vi khuẩn cho thấy tất cả các dòng vi khuẩnphân lập được đều có màu tím xanh của Crystal violet, chứng tỏ các dòng vi khuẩnnày thuộc vi khuẩn Gram dương, đây cũng chính là đặc điểm chung của vi khuẩnlactic (Lương Đức Phẩm, 2002)

Hình 5 Dòng vi khuẩn hình que và hình cầu sau khi nhuộm Gram.

4.2.2 Thử nghiệm catalase

Để xác định sự hiện diện của enzym catalase trong các dòng vi khuẩn phânlập được xác định bằng thử nghiệm catalse bằng H2O2 3 %

Kết quả các dòng vi khuẩn đã phân lập có catalase âm tính nghĩa là không có

sự hiện diện của bọt khí Kết quả này hoàn toàn phù hợp với đặc điểm của vi khuẩnlactic (Vũ Thị Minh Đức, 2001)

4.3 KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG SINH ACID TỔNG CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP VỚI ĐƯỜNG GLUCOSE

Thí nghiệm xác định khả năng sinh acid tổng của các dòng vi khuẩn hình que

và hình cầu được thực hiện qua các ngày 1, 2, 3, 4, 7 Kết quả cho thấy sinh khối(OD) vi khuẩn tăng dần từ ngày thứ nhất đến ngày thứ ba Riêng một số dòng sinhkhối tiếp tục tăng đến ngày thứ tư (CP1, TK1, TK3, UT13, CH1, CH3, CH4, GT1,GT2, GT3, TV2, TV8, TS2, TS5, TS7) Chỉ một số dòng có sinh khối giảm nhẹ(CP10, SX4, TK1, CH3, GT5, GT6, TV2, TS5, TS7, UT12) Hầu hết các dòng vikhuẩn đều đạt sinh khối cao nhất vào ngày thứ ba (CP2, CP4, CP10, SX1, SX4,TK2, TS8, UT10, UT11, SX2, SX3, GT5, GT6, TV4, TV5, TV6, TS3, TS4, UT5,UT6, UT9), riêng một số dòng đạt sinh khối cao nhất vào ngày thứ hai (GT1, GT4,UT3, UT7, UT8) hoặc ngày thứ tư (CP1, TK1, TK3, UT13, CH1, CH3, CH4, GT2,GT3, TV2, TV8, TS2, TS5, TS7) hoặc ngày thứ 7 (UT4, UT12) (Bảng 4.7 và Bảng4.9)

Trong khi đó, giá trị acid tổng trung bình tăng dần từ ngày thứ nhất đến ngàythứ tư Một số dòng giá trị acid tổng trung bình chỉ tăng từ ngày thứ nhất đến ngàythứ hai (TV8, UT4, UT8, UT12), hoặc ngày thứ ba (CP2, SX1, SX4, TK2, TS8,SX2, SX3, GT5, GT6, TV4, TS4, UT7) Sau đó, lượng acid tổng trung bình giảmnhẹ hoặc khác biệt không có ý nghĩa thống kê Riêng một số dòng có lượng acidtổng trung bình giảm (CP1, SX4, TK1, CH3, TS5, TS7, UT3) Lượng acid tổngtrung bình đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ tư (CP1, CP4, CP10, TK1, TK3, UT10,CH1, CH3, CH4, GT1, GT2, GT3, TV2, TV5, TV6, TS2, TS5, TS7, UT3, UT5,UT9) Một số dòng lượng acid tổng trung bình đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ 1(UT11, TS3, GT4, UT6), ngày thứ hai (TV8, UT4, UT8, UT12), ngày thứ ba (CP2,SX1, SX4, TK2, TS8, SX2, SX3, GT5, GT6, TV4, TS4, UT7) hoặc ngày thứ 7

(UT13) (Bảng 4.6 và Bảng 4.8) Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của

Mai Đàm Linh et al (2008).

Kết quả đo sinh khối và hàm lượng acid tổng có thể giải thích là khi số lượng

vi khuẩn tăng cao (OD cao), acid tích tụ nhiều, pH dịch lên men giảm nhanh, acidlactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác Sau đó khi lượng acidtích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Tốc độ phát triển cũng nhưlượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi lượng acid lactic quá nhiều Và đối vớidạng trực khuẩn điều kiện pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5- 6,0 còn cầu khuẩn là5,5-6,5 (Trần Minh Tâm, 1998) Do đó khi sinh khối đạt giá trị cao nhất vào ngàythứ ba, lượng acid vẫn tiếp tục tăng cho đến ngày thứ tư hoặc thứ 7, rồi sau đó giảmdần và ổn định

Mặt khác khi lượng acid tổng đạt giá trị cao nhất, nếu tiếp tục nuôi thì lượngacid sinh ra sẽ giảm, một số dòng giảm mạnh, một số dòng giảm không đáng kể.Điều này có thể giải thích rằng những dòng có lượng acid giảm nhẹ là những dòngsinh ra acid lactic là chủ yếu hay đây là những dòng lên men đồng hình, còn nhữngdòng có lượng acid giảm mạnh là những dòng lên men dị hình (những dòng nàyngoài acid lactic còn tạo ra các chất dễ bay hơi khác như acid acetic, etanol) (LươngĐức Phẩm, 2004)

Ngày thứ tư là ngày hầu hết các dòng vi khuẩn đều đạt lượng acid tổng trungbình cao nhất Trong đó, có 09 dòng vi khuẩn hình que (UT13, TS8, TK1, TK2,TK3, CP1, CP2, CP4, CP10) và 07 dòng vi khuẩn hình cầu (UT12, TV8, SX3,CH3, CH4, TS2, TS4) đều có khả năng sinh acid tổng trung bình cao Đồng thờinhững dòng vi khuẩn có khả năng sinh acid tổng trung bình cao đều là những dòng

có giá trị OD cao nghĩa là những dòng này có khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh(Hình 4.4 và Hình 4.5)

Tóm lại từ các kết quả trên cho thấy có chín dòng vi khuẩn hình que (CP1,CP2, CP4, CP10, TK1, TK2, TK3, TS8, UT13) có khả năng sinh acid tổng cao vàchọn đại diện một dòng vi khuẩn hình cầu cũng có khả năng sinh acid tổng cao(TV8) Chín dòng vi khuẩn hình que trên được chọn ra để thực hiện phản ứng PCR

với cặp mồi giống Lactobacillus và một dòng vi khuẩn hình cầu TV8 được chọn để

Bảng 11 Khả năng sinh acid tổng trung bình của 13 dòng vi khuẩn hình que trên đường glucose.

3,66e16,86a10,62b10,92b7,50cd8,04c8,34c10,86b6,12d3,34e8,34c10,32b8,40c

7,32f16,74a12,12cd14,04bc7,80f11,04de9,60ef16,08ab11,16de14,94ab9,06ef10,32def9,48ef

9,96efgh17,16a11,34def14,52bc8,64hi11,64de10,56efg16,38ab12,90cd18,06a9,72fghi8,04i8.94ghi

15,66bc16,62ab15,36bc16,44ab8,46e11,40d17,04ab15,78bc13,80c16,20ab10,20de8,10e18,36a

13,14cde17,04ab14,94bcd15,24abcd8,16f8,40f9,78ef15,78abc12,30de15,96abc9,90ef7,68f18,48a

Chú thích: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột Các giá trị trung bình cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa ở độ tin cậy 99% Giá trị acid tổng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.