XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 2010 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH …. …. HỒ THỊ ÁNH TUYẾT XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis var. israelensis QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. BS. HỒ THỊ HỒNG NHUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 92010 ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hồ Thị Ánh Tuyết. Sinh ngày 05 tháng 12 năm 1963 tại tỉnh Thái Nguyên. Con Ông Hồ Văn Duyệt và Bà Nguyễn Thị Ninh. Tốt nghiệp tú tài tại trường Trung học phổ thông Trần Quốc Tuấn, thành phố Quảng Ngãi, tỉnh Quảng Ngãi, năm 1981. Tốt nghiệp đại học ngành Dâu tằm, hệ đại học chính quy tại Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, năm 1986. Hiện công tác tại phòng Công tác Học sinh Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2006 trúng tuyển và theo học cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng hôn nhân: Lập gia đình, năm kết hôn: 1987. Họ tên chồng: Đinh Thành Ngân. Các con: Đinh Nhật Huy sinh năm 1988. Đinh Bảo Huy, sinh năm 1991. Địa chỉ liên lạc: Phòng Công tác Học sinh Sinh viên trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh, số 01. Võ Văn Ngân, Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh. Điện thoại: (08) 38 999 866. Email: tuyethtahcmute.edu.vn iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hồ Thị Ánh Tuyết iv Lời cảm ơn Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, các Giáo sư, Giảng viên và CBVC phòng Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học. Đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khoá học, tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành tôi theo học và nghiên cứu, cũng như đã góp ý, chỉnh sửa đề tài, giúp đề tài được thực hiện tốt nhất. Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, Phòng Nghiên cứu thử nghiệm côn trùng y học, Khoa Dịch tễ học, các nhà nghiên cứu và các cộng sự đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cung cấp đầy đủ vật liệu ấu trùng muỗi thí nghiệm với chất luợng chuẩn thức suốt quá trình thực hiện đề tài. Ban Giám đốc Công ty TNHH Sinh học Mai Việt đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được sử dụng phòng thí nghiệm, trang thiết bị thực hiện đề tài. TS. BS. Hồ Thị Hồng Nhung hướng dẫn khoa học. Cùng toàn thể đồng nghiệp, anh chị em tại Trường, Viện, Công ty Sinh học Mai Việt đã giúp tôi hoàn thành công việc và nghiên cứu trong khoá học. Gia đình và nhiều bạn bè thân hữu đã cổ vũ động viên tôi. Xin chân thành cảm ơn. Hồ Thị Ánh Tuyết v TÓM TẮT Đề tài: “Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) quy mô phòng thí nghiệm” đã tiến hành tại phòng Kiểm nghiệm Công ty TNHH Sinh học Mai Việt từ tháng 62008 đến tháng 82010. Mục tiêu của đề tài là hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ A. aegypti từ qui trình chuẩn nuôi muỗi tại Viện Pasteur; xác định liều gây chết LD50, LD90, LD99 của Bti chuẩn và Bti thử; xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế trong 1 mg sinh phẩm (ITUmg) và suy ra liều dự đoán của Bti thử áp dụng diệt LQ muỗi ngoài thực địa. Kết quả cho thấy từ qui trình chuẩn nuôi muỗi của Viện Pasteur có thể cung cấp LQ cùng tuổi bằng cách lấy các băng giấy mà trứng muỗi đẻ cùng một ngày (24 giờ) nhúng chìm trong khay chứa nước cất hoặc nước không có clo ở 25 ± 20C. Thức ăn của LQ là các mảnh protein như thức ăn chế biến sẵn cho cá, thỏ, gà. Cần cho thức ăn vừa đủ để vi khuẩn không phát triển mạnh quá (giết chết lăng quăng). Cho ăn nhiều lần cách quãng trong 1 2 ngày và quan sát mỗi ngày. Quần thể LQ đồng nhất L3 hoặc L4 (5 ngày tuổi và dài 4 5 mm) được thu hoạch (tương ứng 6 7 ngày sau khi trứng nở). Ở các liều gây nhiễm từ 4x102 mgl đến 5x103 mgl Bti chuẩn sau 24 giờ phơi nhiễm có hoạt tính diệt LQ cao (trên 99%) ở tất cả các liều gây nhiễm. Đối với Bti thử, tỷ lệ LQ chết tương ứng giảm dần từ 98,99% xuống 6,12% nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90, LD99 của Bti thử. Ở liều gây nhiễm Bti chuẩn từ 4x103 mgl đến 5x104 mgl có tỷ lệ chết tương ứng giảm dần từ 94,91 % xuống 13,90 % nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90 . Trong khi đó Bti thử có tỷ lệ LQ chết dưới 5% nên kết quả không được sử dụng để tính các giá trị LD50, LD90 . Tương tự ở liều 4x104 mgl đến 5x105 mgl của Bti vi chuẩn lẫn Bti thử đều có tỉ lệ LQ chết dưới 5%. Như vậy đã xây dựng được quy trình kiểm định công hiệu Bti gồm 3 bước cơ bản: 1) Tiêu chuẩn chọn LQ dùng trong thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti. 2) Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ để xác định hàm lượng hoạt tính diệt LQ LD50, LD90, LD99 của Bti trong thí nghiệm. 3) Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc tế (ITUmg sản phẩm) và suy ra liều dự đoán của Bti áp dụng diệt LQ muỗi trên thử nghiệm thực địa. Quy trình này được áp dụng thành công vào kiểm định chế phẩm Bti do công ty TNHH sinh học Mai Việt sản xuất, đã tính được công hiệu diệt LQ của chế phẩm Bti có LD50 = 0,0148 mgl, LD90 = 0,0317 mgl; liều chết LD99 = 0,0589 mgl; liều dự đoán áp dụng ngoài thực địa là 0,1178 mgL; hàm lượng đơn vị độc tố quốc tế trong 1mg sinh phẩm Bti là 595,945 ITUmg. vii ABSTRACT The research project “Designing a process for testing the biological activity in killing mosquito larvae of biological products containing bacteria Bacillus thuringgiensis subsp. Israelensis (Bti), laboratory scale” was conducted in the Testing laboratory of Maivietbio Ltd., from June 2008 to August 2010. The objectives of the project were to complete the mosquito larvae breeding process based on the standard process of breeding the mosquito A. aegypti adopted at Pasteur Institute; determine the lethal doses LD50, LD90, LD99 of standard Bti and sampling Bti; determine the efficacy in killing mosquito larvae of sampling Bti biological products based on international toxic units (ITUmg); and find out the expected doses of sampling Bti to kill mosquito larvae in field tests. Results showed that Pasteur Institute’s standard mosquito breeding process could provide sameage mosquito larvae by immersing paper tapes containing mosquito eggs laid on the same day (24 hours) in a tray of distilled water or chlorineless water at 25 ± 20C. The food for mosquito larvae was protein fragments, such as processed food for fish, rabbits, and chickens. It was important to provide just enough food so that the bacteria would not develop too fast (and kill the mosquito larvae). The larvae were fed many times a day at regular intervals, for 12 days, and observed daily. Homogeneous populations of mosquito larvae L3 or L4 (5dayold and 45 mm long) were collected (67 days respectively after hatching). After 24 hours of exposure, all infected doses from 4x102 mgl to 5x103 mgl of standard Bti showed high activities in killing mosquito larvae (over 99%). As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae gradually declined from 98,99% to 6,12%. The results were subsequently processed to calculate the value of lethal doses LD50, LD90, LD99 of sampling Bti. With standard Bti infected doses from 4x104 mgl to 5x105 mgl, the death rates of mosquito viii larvae decreased from 94,91% to 13,90%, so the results were processed to calculate the value of LD50, LD90. As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae were under 5%, so the results were not used to calculate the value of LD50, LD90. Similarly, with doses of 4x104 mgl to 5x105 mgl of both standardized Bti and sampling Bti, the death rates of mosquito larvae were under 5%. The project as such established a process for testing Bti efficacy consisting of 3 basic steps: 1) selecting mosquito larvae used in experimental tests of Bti products, based on definite criteria 2) infecting mosquito larvae with Bti to determine its level of biological activity in killing mosquito larvae LD50, LD90, LD99 in experiments. 3) determining the mosquito larvae killing efficacy of Bti biological products in terms of international toxic units, and deriving predicted doses of Bti applied to kill mosquito larvae in field tests. This process was successfully applied to test Bti products of Maivietbio Ltd. The proven mosquito larvae killing efficacy of these Bti products is: LD50 = 0,0148 mgl, LD90 = 0,0317 mgl; lethal dose LD99 = 0,0589 mgl. The predicted dose for field tests is 0,1178mgl. The content of ITU in 1mg of Bti product is 595,945 ITUmg. ix MỤC LỤC Trang LÝ LỊCH CÁ NHÂN ..............................................................................................1 LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................. iii Lời cảm ơn .............................................................................................................iv TÓM TẮT...............................................................................................................v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ.............................................................xii DANH SÁCH CÁC BẢNG..................................................................................xiv Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG.........................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2. Mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể...................................................................3 1.2.1. Mục tiêu chung ..............................................................................................3 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ..............................................................................................4 Chương 2 TỔNG QUAN.......................................................................................5 2.1. Giới thiệu chung ...............................................................................................5 2.1.1. Chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng ..................................................................5 2.1.2. Muỗi..............................................................................................................5 2.1.3. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. israelensis H 14 ....................................8 2.2. WHOPES và chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis var. israelensis H 14 diệt LQ muỗi........................................................................................................12 2.2.1. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti trên thế giới ........................................13 2.2.2. Sử dụng Bti tại Việt Nam.............................................................................16 2.3. Tình hình nghiên cứu Bti tại Việt Nam ...........................................................16 2.4. Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti...............................................17 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................18 3.1. Thời gian và địa điểm .....................................................................................18 3.1.1. Thời gian .....................................................................................................18 x 3.1.2. Địa điểm ......................................................................................................18 3.2. Vật liệu và trang thiết bị .................................................................................18 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................18 3.2.2. Trang thiết bị ...............................................................................................20 3.3. Nội dung.........................................................................................................21 3.4. Mô tả thí nghiệm ............................................................................................22 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................29 4.1. Kết quả ...........................................................................................................29 4.1.1. Tiêu chuẩn chọn LQ (LQ) A. aegypti dùng trong thí nghiệm........................29 4.1.2 Tỉ lệ LQ hoá nhộng sau 24 giờ phơi nhiễm Bti chuẩn và Bti thử...................35 4.1.3. Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ và tính tỷ lệ LQ chết sau 24 giờ phơi nhiễm ứng với các liều của sản phẩm Bti chuẩn và Bti thử ....................................37 4.1.4 Xác định các liều chết LD50, LD90, LD99 của Bti trong thí nghiệm...............41 4.1.5 Cách tính công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế (ITUmg) và xác định liều dự đoán của Bti thử để áp dụng thử nghiệm diệt LQ muỗi trên thực địa .............................................................47 4.2. Một số nhận xét và bàn luận ...........................................................................48 Chương 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................51 5.1. Kết luận ..........................................................................................................51 5.2. Đề nghị...........................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................53 PHỤ LỤC..............................................................................................................56 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASEAN: Association of Southeast Asia Nations Bti: Bacillus thuringiensis var. israelensis PRMA: Canadas Pest Management Regulatory Agency Công ty TNHH: Công ty trách nhiệm hữu hạn EPA: Environmental Protection Agency ITU: International Toxic Units LC: Lethal Concentration LD: Lethal Dose LQ: Lăng quăng PTN: Phòng thí nghiệm WHO: World Heath Organization WHOPES: WHO Pesticide Evaluation Scheme xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Trang Hình 2.1 Một số loại LQ muỗi ................................................................................6 Hình 2.2 Vòng đời muỗi ........................................................................................7 Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis: .....................................10 Hình 2.4 Hình ảnh minh họa cơ chế diệt LQ của Bti .............................................11 Biểu đồ 2.1. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2004)..............13 Biểu đồ 2.2. Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2005)..............14 Hình 2.5. Trực thăng rải Bti ..................................................................................14 Hình 2.6. Các vùng ngập sau tuyết tan vào mùa xuân và vùng nước đọng vào mùa hè được chọn để dùng Bti ở Norfolk. .......................................................15 Hình 3.1. Chế phẩm Bti MOSQUITO BITS..........................................................19 Hình 3.2. Chế phẩm vi sinh Bti TN06 sản xuất tại Công ty TNHH SH Mai Việt...20 Hình 4.1 Nuôi muỗi tại Phòng Côn trùng y học viện Pasteur Tp HCM .................30 Hình 4.2 Nuôi LQ thí nghiệm Bti theo quy trình của Viện Pastuer........................31 Hình 4.3 Quần thể LQ không đồng đều về tuổi ....................................................31 Hình 4.4 Băng giấy có trứng muỗi chuẩn bị ngâm nước cho ấp nở thu LQ............32 Hình 4.5 Băng giấy có trứng muỗi ngâm nước cho ấp nở thu LQ..........................32 Hình 4.6 Chọn LQ làm thí nghiệm .......................................................................33 Hình 4.7 Quần thể LQ A. aegypti .........................................................................34 Hình 4.8 LQ A. aegypti phân theo theo tuổi (L1: LQ tuổi 1; L2: LQ tuổi 2; L3: LQ tuổi 3; L4: LQ tuổi 4).........................................................................35 Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 1).....................................................................42 Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 2).....................................................................43 Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x102 – 5x103 mgl (lần 3).....................................................................44 xiii Biểu đồ 4.4. Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 1)...................................................................45 Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 2) .....................................................................46 Biểu đồ 4.6 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ 4x103 – 5x 104 mgl (lần 3) .....................................................................47 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phân loại gen Cry theo giải trình tự ........................................................12 Bảng 3.1. Tóm tắt bố trí thí nghiệm.......................................................................26 Bảng 4.1. Tỷ lệ LQ hoá nhộng trong các thí nghiệm gây nhiễm Bti ......................36 Bảng 4.2 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x102 đến 5x103 mgl 38 Bảng 4.3 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x103 đến 5x104mgl39 Bảng 4.4 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x104 đến 5x105 mgl 40 Bảng 4.5 Tóm tắt kết quả xử lý LQ với các liều Bti từ 4x102 đến 5x105 mgl ......40 Bảng 4.6 Các giá trị LD của Bti chuẩn và Bti thử..................................................41
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
…. …
HỒ THỊ ÁNH TUYẾT
XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH
SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA
CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN
Bacillus thuringiensis var israelensis
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 / 2010
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
…. …
HỒ THỊ ÁNH TUYẾT
XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA HOẠT TÍNH
SINH HỌC DIỆT LĂNG QUĂNG CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC CHỨA VI KHUẨN
Bacillus thuringiensis var israelensis
QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Trang 3LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Hồ Thị Ánh Tuyết
Sinh ngày 05 tháng 12 năm 1963 tại tỉnh Thái Nguyên
Con Ông Hồ Văn Duyệt và Bà Nguyễn Thị Ninh
Tốt nghiệp tú tài tại trường Trung học phổ thông Trần Quốc Tuấn, thành phốQuảng Ngãi, tỉnh Quảng Ngãi, năm 1981
Tốt nghiệp đại học ngành Dâu tằm, hệ đại học chính quy tại Trường Đại họcNông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, năm 1986
Hiện công tác tại phòng Công tác Học sinh - Sinh viên trường Đại học Sưphạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 năm 2006 trúng tuyển và theo học cao học ngành Công nghệ Sinhhọc tại Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh
Tình trạng hôn nhân: Lập gia đình, năm kết hôn: 1987
Họ tên chồng: Đinh Thành Ngân
Các con: Đinh Nhật Huy sinh năm 1988 Đinh Bảo Huy, sinh năm 1991.Địa chỉ liên lạc: Phòng Công tác Học sinh - Sinh viên trường Đại học Sưphạm Kỹ thuật TP Hồ Chí Minh, số 01 Võ Văn Ngân, Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh
Điện thoại: (08) 38 999 866
Email:tuyethta@hcmute.edu.vn
Trang 4LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được aicông bố trong bất kỳ công trình nào khác
Hồ Thị Ánh Tuyết
Trang 5Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cám ơn
- Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp Hồ Chí Minh.
- Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, các Giáo sư, Giảng viên và CBVC phòng Sau Đại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học.
Đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khoá học, tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm chuyên sâu thuộc chuyên ngành tôi theo học và nghiên cứu, cũng như đã góp ý, chỉnh sửa đề tài, giúp đề tài được thực hiện tốt nhất.
- Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh, Phòng Nghiên cứu thử nghiệm côn trùng y học, Khoa Dịch tễ học, các nhà nghiên cứu và các cộng sự đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cung cấp đầy đủ vật liệu ấu trùng muỗi thí nghiệm với chất luợng chuẩn thức suốt quá trình thực hiện đề tài.
- Ban Giám đốc Công ty TNHH Sinh học Mai Việt đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được sử dụng phòng thí nghiệm, trang thiết bị thực hiện đề tài.
- TS BS Hồ Thị Hồng Nhung hướng dẫn khoa học.
- Cùng toàn thể đồng nghiệp, anh chị em tại Trường, Viện, Công ty Sinh học Mai Việt đã giúp tôi hoàn thành công việc và nghiên cứu trong khoá học.
- Gia đình và nhiều bạn bè thân hữu đã cổ vũ động viên tôi.
Xin chân thành cảm ơn.
Hồ Thị Ánh Tuyết
Trang 6TÓM TẮT
Đề tài: “Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế
phẩm sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) quy
mô phòng thí nghiệm” đã tiến hành tại phòng Kiểm nghiệm Công ty TNHH Sinh
học Mai Việt từ tháng 6/2008 đến tháng 8/2010
Mục tiêu của đề tài là hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ A aegypti từ qui trình
chuẩn nuôi muỗi tại Viện Pasteur; xác định liều gây chết LD50, LD90,LD99 của Btichuẩn và Bti thử; xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn
vị độc tố quốc tế trong 1 mg sinh phẩm (ITU/mg) và suy ra liều dự đoán của Bti thử
áp dụng diệt LQ muỗi ngoài thực địa
Kết quả cho thấy từ qui trình chuẩn nuôi muỗi của Viện Pasteur có thể cungcấp LQ cùng tuổi bằng cách lấy các băng giấy mà trứng muỗi đẻ cùng một ngày (24giờ) nhúng chìm trong khay chứa nước cất hoặc nước không có clo ở 25 ± 20C.Thức ăn của LQ là các mảnh protein như thức ăn chế biến sẵn cho cá, thỏ, gà Cầncho thức ăn vừa đủ để vi khuẩn không phát triển mạnh quá (giết chết lăng quăng).Cho ăn nhiều lần cách quãng trong 1 - 2 ngày và quan sát mỗi ngày Quần thể LQđồng nhất L3 hoặc L4 (5 ngày tuổi và dài 4 - 5 mm) được thu hoạch (tương ứng 6 -
7 ngày sau khi trứng nở)
Ở các liều gây nhiễm từ 4x10-2 mg/l đến 5x10-3 mg/l Bti chuẩn sau 24 giờphơi nhiễm có hoạt tính diệt LQ cao (trên 99%) ở tất cả các liều gây nhiễm Đốivới Bti thử, tỷ lệ LQ chết tương ứng giảm dần từ 98,99% xuống 6,12% nên kếtquả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90,LD99của Bti thử Ở liều gây nhiễmBti chuẩn từ 4x10-3 mg/l đến 5x10-4mg/l có tỷ lệ chết tương ứng giảm dần từ94,91 % xuống 13,90 % nên kết quả được xử lý để tính các giá trị LD50, LD90 Trong khi đó Bti thử có tỷ lệ LQ chết dưới 5% nên kết quả không được sử dụng đểtính các giá trị LD50, LD90 Tương tự ở liều 4x10-4 mg/l đến 5x10-5 mg/l của Bti
Trang 7chuẩn lẫn Bti thử đều có tỉ lệ LQ chết dưới 5%.
Như vậy đã xây dựng được quy trình kiểm định công hiệu Bti gồm 3 bước
cơ bản: 1) Tiêu chuẩn chọn LQ dùng trong thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti 2)Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ để xác định hàm lượng hoạt tính diệt LQ LD50,LD90,LD99của Bti trong thí nghiệm 3) Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm
vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc tế (ITU/mg sản phẩm) và suy ra liều dự đoáncủa Bti áp dụng diệt LQ muỗi trên thử nghiệm thực địa
Quy trình này được áp dụng thành công vào kiểm định chế phẩm Bti do công
ty TNHH sinh học Mai Việt sản xuất, đã tính được công hiệu diệt LQ của chế phẩmBti có LD50= 0,0148 mg/l, LD90 = 0,0317 mg/l; liều chết LD99 = 0,0589 mg/l; liều
dự đoán áp dụng ngoài thực địa là 0,1178 mg/L; hàm lượng đơn vị độc tố quốc tếtrong 1mg sinh phẩm Bti là 595,945 ITU/mg
Trang 8The research project “Designing a process for testing the biological activity
in killing mosquito larvae of biological products containing bacteria Bacillus thuringgiensis subsp Israelensis (Bti), laboratory scale” was conducted in the
Testing laboratory of Maivietbio Ltd., from June 2008 to August 2010
The objectives of the project were to complete the mosquito larvae breeding
process based on the standard process of breeding the mosquito A aegypti adopted
at Pasteur Institute; determine the lethal doses LD50, LD90, LD99of standard Bti andsampling Bti; determine the efficacy in killing mosquito larvae of sampling Btibiological products based on international toxic units (ITU/mg); and find out theexpected doses of sampling Bti to kill mosquito larvae in field tests
Results showed that Pasteur Institute’s standard mosquito breeding processcould provide same-age mosquito larvae by immersing paper tapes containingmosquito eggs laid on the same day (24 hours) in a tray of distilled water orchlorineless water at 25 ± 20C
The food for mosquito larvae was protein fragments, such as processed foodfor fish, rabbits, and chickens It was important to provide just enough food so thatthe bacteria would not develop too fast (and kill the mosquito larvae) The larvaewere fed many times a day at regular intervals, for 1-2 days, and observed daily.Homogeneous populations of mosquito larvae L3 or L4 (5-day-old and 4-5 mmlong) were collected (6-7 days respectively after hatching)
After 24 hours of exposure, all infected doses from 4x10-2 mg/l to 5x10-3mg/l of standard Bti showed high activities in killing mosquito larvae (over 99%)
As for sampling Bti, the corresponding death rates of mosquito larvae graduallydeclined from 98,99% to 6,12% The results were subsequently processed tocalculate the value of lethal doses LD50, LD90, LD99of sampling Bti With standardBti infected doses from 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l, the death rates of mosquito
Trang 9larvae decreased from 94,91% to 13,90%, so the results were processed to calculatethe value of LD50, LD90 As for sampling Bti, the corresponding death rates ofmosquito larvae were under 5%, so the results were not used to calculate the value
of LD50, LD90 Similarly, with doses of 4x10-4 mg/l to 5x10-5 mg/l of bothstandardized Bti and sampling Bti, the death rates of mosquito larvae were under5% The project as such established a process for testing Bti efficacy consisting of 3basic steps: 1) selecting mosquito larvae used in experimental tests of Bti products,based on definite criteria 2) infecting mosquito larvae with Bti to determine its level
of biological activity in killing mosquito larvae LD50, LD90, LD99in experiments 3)determining the mosquito larvae killing efficacy of Bti biological products in terms
of international toxic units, and deriving predicted doses of Bti applied to killmosquito larvae in field tests
This process was successfully applied to test Bti products of Maivietbio Ltd.The proven mosquito larvae killing efficacy of these Bti products is: LD50= 0,0148mg/l, LD90= 0,0317 mg/l; lethal dose LD99 = 0,0589 mg/l The predicted dose forfield tests is 0,1178mg/l The content of ITU in 1mg of Bti product is 595,945ITU/mg
Trang 10MỤC LỤC
Trang
LÝ LỊCH CÁ NHÂN 1
LỜI CAM ĐOAN iii
Lời cảm ơn iv
TÓM TẮT v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv
Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể 3
1.2.1 Mục tiêu chung 3
1.2.2 Mục tiêu cụ thể 4
Chương 2 TỔNG QUAN 5
2.1 Giới thiệu chung 5
2.1.1 Chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng 5
2.1.2 Muỗi 5
2.1.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis H 14 8
2.2 WHOPES và chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis var israelensis H 14 diệt LQ muỗi 12
2.2.1 Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti trên thế giới 13
2.2.2 Sử dụng Bti tại Việt Nam 16
2.3 Tình hình nghiên cứu Bti tại Việt Nam 16
2.4 Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti 17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1 Thời gian và địa điểm 18
3.1.1 Thời gian 18
Trang 113.1.2 Địa điểm 18
3.2 Vật liệu và trang thiết bị 18
3.2.1 Vật liệu 18
3.2.2 Trang thiết bị 20
3.3 Nội dung 21
3.4 Mô tả thí nghiệm 22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1 Kết quả 29
4.1.1 Tiêu chuẩn chọn LQ (LQ) A aegypti dùng trong thí nghiệm 29
4.1.2 Tỉ lệ LQ hoá nhộng sau 24 giờ phơi nhiễm Bti chuẩn và Bti thử 35
4.1.3 Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ và tính tỷ lệ LQ chết sau 24 giờ phơi nhiễm ứng với các liều của sản phẩm Bti chuẩn và Bti thử 37
4.1.4 Xác định các liều chết LD50, LD90,LD99của Bti trong thí nghiệm 41
4.1.5 Cách tính công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố quốc tế (ITU/mg) và xác định liều dự đoán của Bti thử để áp dụng thử nghiệm diệt LQ muỗi trên thực địa 47
4.2 Một số nhận xét và bàn luận 48
Chương 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
5.1 Kết luận 51
5.2 Đề nghị 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 56
Trang 12DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASEAN: Association of Southeast Asia Nations
Bti: Bacillus thuringiensis var israelensis
PRMA: Canada's Pest Management Regulatory Agency
Công ty TNHH: Công ty trách nhiệm hữu hạn
EPA: Environmental Protection Agency
ITU: International Toxic Units
LC: Lethal Concentration
LD: Lethal Dose
LQ: Lăng quăng
PTN: Phòng thí nghiệm
WHO: World Heath Organization
WHOPES: WHO Pesticide Evaluation Scheme
Trang 13DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Trang
Hình 2.1 Một số loại LQ muỗi 6
Hình 2.2 Vòng đời muỗi 7
Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis: 10
Hình 2.4 Hình ảnh minh họa cơ chế diệt LQ của Bti 11
Biểu đồ 2.1 Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2004) 13
Biểu đồ 2.2 Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2005) 14
Hình 2.5 Trực thăng rải Bti 14
Hình 2.6 Các vùng ngập sau tuyết tan vào mùa xuân và vùng nước đọng vào mùa hè được chọn để dùng Bti ở Norfolk .15
Hình 3.1 Chế phẩm Bti MOSQUITO BITS 19
Hình 3.2 Chế phẩm vi sinh Bti TN06 sản xuất tại Công ty TNHH SH Mai Việt 20
Hình 4.1 Nuôi muỗi tại Phòng Côn trùng y học viện Pasteur Tp HCM 30
Hình 4.2 Nuôi LQ thí nghiệm Bti theo quy trình của Viện Pastuer 31
Hình 4.3 Quần thể LQ không đồng đều về tuổi 31
Hình 4.4 Băng giấy có trứng muỗi chuẩn bị ngâm nước cho ấp nở thu LQ 32
Hình 4.5 Băng giấy có trứng muỗi ngâm nước cho ấp nở thu LQ 32
Hình 4.6 Chọn LQ làm thí nghiệm 33
Hình 4.7 Quần thể LQ A aegypti 34
Hình 4.8 LQ A aegypti phân theo theo tuổi (L1: LQ tuổi 1; L2: LQ tuổi 2; L3: LQ tuổi 3; L4: LQ tuổi 4) 35
Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x10-2– 5x10-3mg/l (lần 1) 42
Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x10-2– 5x10-3mg/l (lần 2) 43
Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti thử ở các liều gây nhiễm từ 4x10-2– 5x10-3mg/l (lần 3) 44
Trang 14Biểu đồ 4.4 Đường biểu diễn kết quả thí nghiệm Bti chuẩn ở các liều gây nhiễm từ
Trang 15DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Phân loại gen Cry theo giải trình tự 12 Bảng 3.1 Tóm tắt bố trí thí nghiệm 26 Bảng 4.1 Tỷ lệ LQ hoá nhộng trong các thí nghiệm gây nhiễm Bti 36 Bảng 4.2 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x10-2đến 5x10-3mg/l 38
Bảng 4.3 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x10-3đến 5x10-4mg/l39
Bảng 4.4 Tỷ lệ chết của LQ sau 24g phơi nhiễm với Bti từ 4x10-4đến 5x10-5mg/l 40
Bảng 4.5 Tóm tắt kết quả xử lý LQ với các liều Bti từ 4x10-2đến 5x10-5mg/l 40
Bảng 4.6 Các giá trị LD của Bti chuẩn và Bti thử 41
Trang 16Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG
1.1 Đặt vấn đề
Muỗi vằn cái (Aedes aegypti) nhiễm vi rút (Dengue virus) truyền sang người qua vết cắn gây bệnh sốt xuất huyết (sốt Dengue) Muỗi cái bị nhiễm vi rút cũng có
thể truyền vi rút cho thế hệ sau bằng cách truyền qua trứng
Các vụ dịch sốt xuất huyết do vi rút Dengue đầu tiên được ghi nhận xảy ravào những năm từ 1778 – 1780 ở châu Á, châu Phi và Bắc Mỹ Sự xuất hiện gầnnhư đồng thời của các vụ dịch trên ba lục địa khác nhau chứng tỏ rằng vi rút gâybệnh cũng như vector truyền bệnh phân bố rộng rãi trên toàn thế giới đã từ hơn 200năm trước Trong thời gian này sốt Dengue chỉ được xem là bệnh nhẹ Một vụ đạidịch sốt Dengue xuất hiện ở Đông Nam Á sau Chiến tranh thế giới thứ II và từ đólan rộng trên toàn cầu Cũng ở khu vực Đông Nam Á, sốt Dengue lần đầu tiên đượcphát hiện ở Philippines vào năm 1950, đến năm 1970 bệnh đã trở thành nguyênnhân nhập viện và tử vong thường gặp ở trẻ em trong vùng này
Tỷ lệ mắc bệnh trên toàn thế giới đã gia tăng mạnh trong những năm gầnđây Bệnh này hiện đã trở thành dịch tại trên 100 quốc gia ở châu Phi, châu Mỹ, khuvực phía Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương Đông Nam
Á và Tây Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất Trước năm
1970, chỉ có 9 quốc gia có dịch lưu hành; con số này tăng lên gấp hơn 4 lần vàonăm 1995; không chỉ số trường hợp mắc bệnh gia tăng mà khả năng nhiễm nhiềuloại vi rút khác nhau cũng ngày càng đáng báo động Trong vụ dịch, tỷ lệ mắc bệnh
ở những đối tượng nhạy cảm thường là 40 – 50% nhưng cũng có thể ở mức 80 –90%
Trang 17em khiến trẻ nhập viện và tử vong cao ở các vùng Đông Nam Á và Tây Thái BìnhDương trong những thập kỷ qua Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm,
có trên 50 triệu người nhiễm vi rút Dengue trên toàn thế giới trong đó có hơn500.000 bệnh nhân cần phải nhập viện Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệbệnh nhân sốt xuất huyết cao trong khu vực, phần lớn trong số đó là trẻ em Tỷ lệ tửvong chung vào khoảng 2,5% Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh sốt xuất huyếtgia tăng hàng năm, trong 5 năm gần đây dịch sốt Dengue chưa bao giờ giảm trênhầu hết các tỉnh phía Nam, và đang tăng cao trở lại tại Hà Nội Mới đây, Sở Y tếtỉnh Khánh Hoà cho biết sốt xuất huyết trên địa bàn tỉnh ngày càng gia tăng Ngày16/7/2010, Khánh Hoà đã công bố dịch sốt xuất huyết trên toàn tỉnh Sau 2 tuầncông bố dịch, toàn Khánh Hoà đã có gần 3.000 trường hợp mắc bệnh Trung bìnhmỗi tuần có thêm 265 trường hợp sốt xuất huyết, cao gấp đôi năm 2009 (Báo Công
an online ngày 03/8/2010) Đồng thời, tại thời điểm này các tỉnh Phú Yên, BìnhĐịnh, Gia Lai cũng đều đã công bố có dịch sốt xuất huyết
Tính từ đầu tháng 6 đến nay, Bệnh viện trung ương Huế đã tiếp nhận, điều trịhơn 2.870 ca mắc sốt xuất huyết từ các nơi chuyển đến (báo Tiền Phong onlinengày 7/8/2010) Nếu không được điều trị, tỷ lệ tử vong của sốt xuất huyết Dengue
có thể vượt quá 20% số người mắc bệnh Với phương thức điều trị tích cực hiện đại,
tỷ lệ tử vong có thể thấp hơn 1%
Hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị để điều trị sốt xuất huyết Dengue và cũngchưa có vắc xin phòng bệnh sốt xuất huyết Hầu hết ở các nước đang phát triển cácphương pháp kiểm soát hoặc bệnh sốt xuất huyết chủ yếu vẫn là phun diệt muỗi
Aedes aegypti, tuyên truyền nằm mùng, không để nước đọng tạo môi trường sinh
lăng quăng, …
Trên thế giới Bti đã và đang được sản xuất, sử dụng rộng rãi ở các nước pháttriển Một số quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ sản xuất với số lượng rất lớn và cóchính sách sử dụng Bti như một biện pháp hữu hiệu nhằm khống chế dịch sốtDengue đang hoành hành
Trang 18Ở Việt Nam, biện pháp chủ yếu diệt muỗi và LQ là sử dụng các hoá chất diệtcôn trùng Bên cạnh những tác dụng tích cực thì nhóm hoá chất này cũng bộc lộnhiều hạn chế như ảnh hưởng đến môi trường sống, con người, chúng cũng diệt cáccôn trùng có ích, mặt khác tạo tình trạng quen thuốc, kháng thuốc của lăng quăng,muỗi Hơn nữa, việc sử dụng liên tục các hoá chất diệt côn trùng trong những khu
đô thị đông dân cư sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng Vì vậy, sản xuất haynhập khẩu những chế phẩm sinh học diệt LQ là cần thiết để phối hợp tăng hiệu quảdiệt muỗi, giảm bớt việc sử dụng hoá chất diệt côn trùng
Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có phòng thí nghiệm nào kiểm định công hiệuchế phẩm sinh học diệt lăng quăng Việc nghiên cứu sản xuất vì thế gặp khó khăntrong khâu đánh giá công hiệu giúp cải tiến, nâng cao chất lượng để ra được sảnphẩm tương đương nhập ngoại
“Xây dựng quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học diệt LQ của chế phẩm
sinh học chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis quy mô phòng thí
nghiệm” chính là đề tài chúng tôi mong muốn thực hiện, nhằm có được một quy
trình kiểm định Bti tại cơ sở đáp ứng nhu cầu thực tế trên, và có thể nhanh chóngbiết được công hiệu sản phẩm qua các loạt sản xuất, từ đó cải tiến nâng cao chấtlượng sản xuất độc tố của Bti trong sản phẩm
Đề tài được thực hiện với sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh họctrường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS BS HồThị Hồng Nhung, Trưởng Phòng thí nghiệm Gốc giống và sinh phẩm chẩn đoán,Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh
1.2 Mục tiêu chung và mục tiêu cụ thể
1.2.1 Mục tiêu chung
Nghiên cứu xây dựng quy trình kiểm định công hiệu của chế phẩm sinh học
Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) áp dụng kiểm tra hoạt tính sinh học diệt
Trang 19LQ ở phòng thí nghiệm cơ sở tại Việt Nam.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
1 Hoàn chỉnh qui trình nuôi LQ từ qui trình chuẩn nuôi muỗi A aegypti tại
Viện Pasteur nhằm phục vụ cho thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti
2 Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ A aegypti để xác định liều chết LD50, LD90,
LD90của Bti
3 Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc
tế trong 1 mg sinh phẩm (ITU/mg) và suy ra liều dự đoán của Bti áp dụngdiệt LQ muỗi trong thử nghiệm thực địa
Trang 20Chương 2 TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu chung
2.1.1 Chế phẩm vi sinh diệt lăng quăng
Chế phẩm vi sinh diệt LQ là sản phẩm có chứa vi khuẩn giết lăng quăng,thuộc nhóm chế phẩm sinh học diệt côn trùng, thường được sử dụng diệt LQ muỗitại các khu vực bên ngoài nhà ở như kênh rạch, nước lũ lụt, nước tù đọng, hồ nướctrong khu chăn thả gia súc, vùng ngập nước do triều cường, … mà không sử dụngtrực tiếp vào nước ăn uống, sinh hoạt Trên thị trường thế giới hiện nay có hai loại
vi khuẩn dùng sản xuất chế phẩm diệt LQ là Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) và Bacillus sphaericus (Bs).
2.1.2 Muỗi
Người ta đã phát hiện khoảng hơn 2.500 loài muỗi trên thế giới
Muỗi truyền rất nhiều loại bệnh nguy hiểm cho người, động vật có vú nhưtruyền bệnh sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản, sốt rét, hay loại bệnh mới như viêmnão Nipah (Malaysia), viêm não Chikungunya, ở Âu Mỹ là các bệnh như Sốt vàng,Sốt Tây sông Nile Ở Việt Nam muỗi truyền bệnh vào bất kỳ thời điểm nào trongnăm
Muỗi là một loại côn trùng thuộc bộ 2 cánh Diptera, họ Culicidea, có kiểu biến thái hoàn toàn, vòng đời gồm 4 giai đoạn: Trứng - Ấu trùng (lăng quăng) - Nhộng - Muỗi (hình 2.1).
- Trứng muỗi được đẻ và nở ở nơi có nước, mỗi con muỗi cái đẻ khoảng 200
Trang 21đến 300 trứng cùng một thời gian Mỗi loại muỗi khác nhau có các tập tính đẻ trứng
khác nhau trong môi trường sống Muỗi vằn Culex và Culiseta, trứng đẻ ra kết thành từng khối hàng trăm trứng trong khi Anopheles và Aedes trứng được đẻ riêng
rẽ Culex, Culiseta và Anopheles đẻ trứng trên mặt nước trong khi Aedes đẻ trứng
trên đất ẩm ướt sẽ ngập nước Hầu hết trứng nở thành ấu trùng trong vòng 48 giờ.Giai đoạn trứng là 2 – 3 ngày
Hình 2.1 Một số loại LQ muỗi
- Ấu trùng (lăng quăng) có 4 tuổi tính từ lúc trứng nở đến lúc hoá nhộng gọi là
L1, L2, L3 và L4 (L: larvar), LQ sống trong nước từ khoảng 5 – 10 ngày tùy thuộcnhiệt độ, môi trường Giai đoạn ấu trùng tăng trưởng rất nhanh sau mỗi lần lột xác;
Trang 22sau lần lột xác thứ 4, chúng trở thành nhộng và không ăn Hầu hết các ấu trùng đều
có 1 ống thở (siphon) được treo trên mặt nước để lấy oxy trong không khí, riêngAnopheles ấu trùng không có ống thở và vì thế chúng nằm song song với mặt nước
Hình 2.2 Vòng đời muỗi
Thức ăn của LQ là vi khuẩn hoặc các hạt hữu cơ trong nước Nhờ đặc điểm sinh họcnày người ta dùng Bti như là một loại thức ăn để diệt LQ
- Nhộng là giai đoạn cuối tiếp theo của LQ ở dưới nước, nhộng sống trong
nước khoảng 2 – 3 ngày, chúng không ăn nữa và chuẩn bị lột xác thành muỗi Khinhộng hoàn chỉnh, vỏ nhộng tách ra và LQ đã chuyển sang thành một cá thể muỗi
1 : Trứng muỗi 2 : LQ tuổi 1 (L1)
3 : LQ tuổi 2 (L2) 4 : LQ tuổi 3 (L3)
5 : LQ tuổi 4 (L4) 6 : Nhộng
7 : Muỗi trưởng thành
Trang 23trưởng thành.
- Muỗi: Lúc mới thoát khỏi vỏ nhộng muỗi nằm yên trên mặt nước để cơ thể
khô và cứng lại trước khi bay ra khỏi mặt nước Ăn (chích hút máu) của muỗi cáitrưởng thành là một đặc điểm sinh học vì chúng phải cần đến dinh dưỡng (máu) đểhoàn thành chu kỳ sống, đẻ trứng Đặc điểm này là mắt xích làm cho muỗi thànhvector truyền vi rút từ cơ thể người bệnh đến người khác, từ động vật đến người
Đời sống của muỗi trưởng thành kéo dài khoảng 2 tuần Chỉ muỗi cái A aegypti
mới chích hút máu và là trung gian truyền vi rút gây bệnh sốt xuất huyết
Có 4 loài muỗi quan trọng gây bệnh phổ biến là muỗi Aedes, Anopheles, Culex, và Culiseta trong đó ở Việt Nam muỗi A aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue và Anopheles truyền bệnh sốt rét
2.1.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis H 14
2.1.3.1 Lịch sử phát hiện ra Bti
Trong 2 năm 1975 - 1976, đã có một dự án do WHO tài trợ nghiên cứu cáctác nhân ký sinh trùng và gây bệnh trên loài muỗi ở Israel Suốt quá trình giám sát
này, một chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) mới được phát hiện có tính độc
cao với LQ muỗi (Goldberg và Margalit 1977, được trích dẫn bởi Glare và
O’Callaghan, 1998), sau đó được định danh là B.thuringiensis var israelensis, tuýp
huyết thanh (serotype) H14 (Bti) (de Barjac 1978 được trích dẫn bởi Glare vàO’Callaghan, 1998) Tại thời điểm được biết đến, chủng Bti này cho thấy có độctính cao với LQ hơn các chủng vi khuẩn đã biết khác Bti được phân lập tại vùng samạc Negev của Israel Các nghiên cứu về độc tính của Bti nhanh chóng đượcnghiên cứu và phát triển, người ta đã biết về tính độc giới hạn trong phạm vi cácloài muỗi và ruồi đen (blackfly) Từ đó Bti được xem xét về tiềm năng để phát triểnthành thương phẩm diệt LQ muỗi dùng trên toàn thế giới Nhanh chóng ngay sau
đó, rất nhiều các sản phẩm Bti đã có mặt trong thập niên 1980 Các giám sát hoáchất diệt muỗi đã cho thấy một số hoá chất phun diệt tỏ ra bị đề kháng, cùng với
Trang 24việc phải luôn tìm ra hoá chất mới, sự cần thiết của Bti càng cấp bách và đượcWHO khuyến khích dùng mạnh mẽ
Phân loại B.thuringiensis var israelensis:
Loài Bacillus thuringiensis
Biến chủng kursaki, israelensis , tenebrionis
2.1.3 2 Đặc tính sinh vật và hoá học Bti
Bti là trực khuẩn gram dương, hình thành nha bào, có khả năng diệt côntrùng đặc hiệu (chỉ diệt muỗi, ruồi đen) Trong quá trình hình thành nha bào một sốchủng Bti sản xuất một hoặc nhiều loại protein bên trong vi khuẩn thường gọi là cácprotein tinh thể diệt côn trùng hay là các delta endotoxin Đặc tính sinh delta-endotoxins (Cry) hầu hết nằm trên các plasmid Các protein giống như ở dạng kếttinh này có tính độc đặc hiệu với các nhóm côn trùng bộ 2 cánh (Diptera)
Phương pháp định danh Bti dựa trên tuýp huyết thanh học, hình dạng cáctinh thể độc tố Cry và các thử nghiệm sinh hoá Dựa trên kháng huyết thanh lông(flagellar kháng nguyên H) khác nhau người ta phân biệt được có hơn 60 tuýp huyếtthanh Bti (Glare và O'Callaghan, 1998) Quan trọng nhất là serovar H14, đặc tínhcủa từng serovar H nằm trên nhiễm sắc thể, nhưng khả năng sinh độc tố là nằm trênplasmid
Trang 25Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var israelensis:Nha bào tế bào vàđộc tố Cry (Glare và O'Callaghan, 1998)
2.1.3 3 Cơ chế diệt LQ muỗi của Bti
Vi khuẩn Bti sản xuất ra 4 nhóm tinh thể nội độc tố (protein Cry) chính diệt
LQ (27, 65 128 và 135 kDa) Các Cry của Bti quan trọng là: Cry4B, Cry4A,Cry11Aa và Cyt1Aa, theo xếp loại mới nhất Cry4 và Cyt đặc hiệu với côn trùng 2cánh Các protein tinh thể được hình thành ở điểm cuối nha bào (cận nha bào) Tất
cả các protein đều độc với muỗi, tuy nhiên nếu có đầy đủ và tương tác của cácprotein Cyt Aa và Cry4, Cry11 sẽ tạo ra độc tính mạnh hơn (Glare and O'Callaghan,1998)
Bào tử và các tinh thể nội độc tố được sinh ra ra trong quá trình sinh trưởng,phát triển của Bti Chúng xâm nhập vào ống tiêu hoá của LQ qua đường thức ăn,sau khi vào ống tiêu hoá, các tinh thể nội độc tố bị hoà tan trong môi trường kiềmcủa ruột giữa LQ (là các tế bào biểu mô trụ giữa), sau đó được các proteolytic hoạthoá, các tinh thể độc tố này gắn vào thụ thể trên vách tế bào ống ruột giữa LQ, kếtquả là tạo ra các lỗ thủng trên tế bào ruột giữa, dịch ruột giữa của LQ sẽ tràn vàoxoang cơ thể LQ làm mất cân bằng ion trong máu LQ và LQ chết (hình 2.4)
Thông thường sau khi nhiễm Bti trong vòng 1 giờ LQ sẽ ngừng ăn, sau 2 giờ
LQ giảm hoạt động, hầu hết mất hoạt động trong vòng 4 giờ và bị liệt trong vòng 6
Trang 26giờ (Glare and O'Callaghan, 1998).
Hình 2.4 Hình ảnh minh họa cơ chế diệt LQ của Bti lên tế bào ống ruột LQ
(Crytal: tinh thể độc tố; spore: bào tử Bti, enlarged section of midgut: đoạn ruột giữa được phóng lớn, larval gut: ruột ấu trùng, body cavity: lỗ tự nhiên của cơ thể
ấu trùng, perforation of gut wall through toxin action: lỗ bị tạo ra bởi hoạt động độc tố)
Các chủng B thuringiensis tạo ra hai loại độc tố chính là tinh thể độc tố (Cry) được
mã hóa bởi gen Cry khác nhau, và đây là cơ sở để phân loại Bt, loại thứ hai lànhững độc tố Cyt (cytolytic), Cyt có thể làm tăng thêm tính độc của tinh thể độc tốCry Hơn 50 gen mã hóa các độc tố Cry hiện đã được giải mã trình tự và là cơ sở đểphân loại gen Cry vào hơn 15 nhóm có các trình tự gen tương tự, tính đặc hiệu của
Bt phụ thuộc vào vào các nhóm gen Cry như trong bảng 2.1
Trang 27Bảng 2.1 Phân loại gen Cry theo giải trình tự
protein (kDa)
Hoạt tính đặc hiệu trên
côn trùng
cry I [several subgroups:
A(a), A(b), A(c), B, C, D, E, F, G] 130-138 ấu trùng bộ cánh Vảy
cry II [subgroups A, B, C] 69-71 ấu trùng bộ cánh Vảy và
bộ 2 cánhcry III [subgroups A, B, C] 73-74 ấu trùng bộ cánh Cứng
cry IV [subgroups A, B, C, D] 73-134 ấu trùng bộ 2 cánh
(Nguồn http://gophisb.biochem.vt.edu/news/specials/news95.dec.html)
2.1.3 4 Tính an toàn của Bti với con người, môi trường và các loài động vật
Tính từ năm 1978 là năm thương phẩm Bti lần đầu tiên được đăng ký lưuhành đến nay (2010) là 32 năm, các báo cáo an toàn về Bti được đánh giá liên tụctrên thực địa và phòng thí nghiệm Các tài liệu của WHOPES, EPA Hoa kỳ, PRMACanada đều đánh giá Bti là sản phẩm an toàn với con người và môi trường (Glareand O'Callaghan, 1998)
2.2 WHOPES và chế phẩm vi sinh Bacillus thuringiensis var israelensis H 14 diệt LQ muỗi
Tổ chức Đánh giá chất diệt côn trùng của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) gọitắt là WHOPES là cơ quan giám sát, tài trợ các nghiên cứu hiệu quả, an toàn cũngnhư hướng dẫn kiểm tra công hiệu của các chế phẩm diệt côn trùng trong đó có
Bacillus thuringiensis var israelensis là loại vi khuẩn sống tự nhiên trong đất, vùng
ngập nước, chế phẩm vi sinh được đăng ký là chất diệt côn trùng lần đầu vào năm
1983 tại Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ Tính đến tháng 12 năm 2007 có 38 sản
Trang 28phẩm Bti kiểm soát muỗi được đăng ký ở Mỹ với tên thương mại của riêng từnghãng.
2.2.1 Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti trên thế giới
2.2.1.1 Sử dụng Bti tại các nước phát triển
Trong các thập niên 1980-1990; Hoa Kỳ, Canada, Đức, Nam Phi là nhữngquốc gia sử dụng chế phẩm có nguồn gốc Bti nhiều nhất Hiện nay, Bti hầu như sửdụng trên toàn thế giới Hoa Kỳ là nước áp dụng nhiều biện pháp kiểm soát sinh họcnhất, việc sử dụng Bti cũng được quản lý có hệ thống tại đây
Tại châu Bắc Âu, dự án kiểm soát muỗi tại Norfolk cho các dữ liệu thể hiệnrất rõ hiệu quả chỉ số LQ trước và sau giám sát LQ bằng Bti, trong 2 năm 2004 và
2005 trên các địa phương có dùng Bti so với vùng đối chứng không dùng Bti Dự ánthành công, và chính phủ đã lập kế hoạch xử lý LQ trên hàng ngàn mẫu với mức xử
lý 5 pounds trên 1 mẫu Anh trong suốt mùa xuân và 7,5 pounds trên 1 mẫu Anhtrong suốt mùa hè
Kết quả thể hiện trong biểu đồ 2.1 và biểu đồ 2.2
2004 S pring Aerial Larvicide D ip D ata
Trang 29Trong biểu đồ 2.1 so sánh chỉ số LQ các vùng có xử lý và không xử lý Bti, ởnhững vùng không xử lý Bti, chi số LQ tăng cao tới 86%, ở vùng có xử lý Bti chỉ số
LQ giảm tới 88% Tương tự với các vùng được xử lý Bti vào mùa xuân
Biểu đồ 2.2 Hiệu quả về chỉ số LQ trước và sau giám sát bởi Bti (2005)
Hình 2.5 Trực thăng rải Bti (trên 13000 mẫu mùa xuân, 7000 mẫu vào mùa
hè Thời gian rải giữa 6h30 sáng và 7h30 chiều, tính đến tốc độ gió không quá12m/giờ)
Trước xử lý Sau xử lý
Trang 30Hình 2.6 Các vùng ngập sau tuyết tan vào mùa xuân và vùng nước đọng vào mùa
hè được chọn để dùng Bti ở Norfolk
2.2.1.2 Sử dụng tại các nước đang phát triển
Châu Phi là nơi dùng và sản xuất chế phẩm Bti trong việc cố gắng ngăn ngừamuỗi Anophel truyền bệnh sốt rét
Tại Trung Quốc, chỉ riêng nhà máy Longxiang Chemistry Co., Ltd đã cócông suất sản xuất 50.000kg/tháng Mới đây theo Báo Điện tử ngày 16/7/2007(http://vietnamnet.vn/khoahoc/tdsk/2007/07/718969/) Trung Quốc hợp tác với Cuba
để sản xuất sinh phẩm này với số lượng cực lớn xuất khẩu sang Nam Mỹ
Ấn Độ là nước trong hội đồng WHOPES đã nghiên cứu và sản xuất Bti Ấn
Độ cũng có hợp tác với Viện khoa học Việt Nam nghiên cứu gen đơn dòng sinh độc
tố từ chủng Bti của Việt Nam Năm 2007, Bộ Y tế Ấn Độ, dự án kiểm soát muỗiphòng chống sốt xuất huyết quốc gia đã đưa Bti vào sử dụng và phun trên một phạm
vi rộng vùng trọng điểm sốt xuất huyết
2.2.1.3 Sử dụng tại khu vực Đông Nam Á
Malaysia và Thái Lan là 2 nước trong khối ASEAN tham gia chương trìnhWHOPES Các nước như Singapore, Philipines, Indonesia đều sử dụng Bti
Trang 312.2.2 Sử dụng Bti tại Việt Nam
Ở Việt Nam, đã thử dùng một tác nhân sinh học trong dự án diệt LQ là
Mesocyclop, một loại phiêu sinh vật ngành Arthropoda, họ chân kiếm, không có
độc tính, chúng giết LQ bằng cách ăn trực tiếp LQ có trong môi trường nước, làm
giảm mật độ LQ trong nước, Mesocyclop chỉ có thể ăn LQ tuổi 1, 2 Tuy nhiên kết
quả của nghiên cứu này mới áp dụng thực tế trong phạm vi nhỏ
2.3 Tình hình nghiên cứu Bti tại Việt Nam
Nghiên cứu Bti bắt đầu ở Việt Nam khoảng một thập niên trước Đã cóchương trình và dự án nghiên cứu Bt và Bti Nhóm nghiên cứu do TS Võ Thị Thứcủa Viện Khoa học Việt Nam tại Hà Nội nghiên cứu về các chủng Bt và Bti tại ViệtNam Năm 1998, đã có báo cáo khoa học đầu tiên (Võ Thị Thứ và cộng sự, 1998).Các nghiên cứu đã phân lập được một số chủng mang gen sản xuất độc tố diệt muỗitrong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu với Ấn Độ
Một nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng (2005) báo cáo thử nghiệm trongphòng thí nghiệm về chủng Bti 49.5 phân lập tại Việt Nam: chủng Bti 49.5 đượccông bố là diệt 100% LQ sau 72 giờ Mô hình đánh giá công hiệu diệt LQ trongphòng thí nghiệm là do tác giả tự thiết kế
Năm 2006, nghiên cứu hợp tác giữa trường Đại học Nông nghiệp Kyushu,
Nhật Bản và Việt Nam đã phân lập được 63 chủng Bacillus thuringiensis từ đất khu
vực ngoại thành Hà Nội Trong đó có 34 chủng được xác định là thuộc nhóm huyếtthanh H12, không có chủng nào cho thấy có hoạt tính diệt lăng quăng Có 3 chủngphân lập được thuộc hai nhóm huyết thanh là Colmeri và Konkukian cho thấy có
độc tính cao với LQ muỗi Aedes aegypti (Yasutake và cộng sự, 2006)
Nghiên cứu sản xuất tại công ty TNHH Sinh học Mai Việt TP HCM
Sau 2 năm nghiên cứu từ năm 2008 đến năm 2010, công ty TNHH Sinh họcMai Việt đã hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm Bti quy mô nhỏ Sản phẩm Btigồm 2 dạng bột khô và dạng nước Công ty cũng đồng thời tiến hành nghiên cứu
Trang 32xây dựng quy trình kiểm định công hiệu Bti tại cơ sở theo hướng dẫn của các tàiliệu quốc tế để giám sát nâng cao hiệu quả tạo độc tố cao của sản phẩm trongnghiên cứu sản xuất Bti.
2.4 Các phòng thí nghiệm kiểm định chế phẩm Bti
Thế giới: Các nhà sản xuất có quy trình kiểm định Bti của riêng mình gọi làkiểm định cơ sở Các quy trình này có khác nhau ít nhiều nhưng đều tuân thủ cáchướng dẫn của WHOPES Tùy theo quốc gia sẽ có các phòng thí nghiệm kiểm địnhBti thuộc các trung tâm kiểm định chất diệt côn trùng là các cơ quan kiểm định cóthẩm quyền quốc gia
Tại Việt Nam: Một số các viện nghiên cứu y học Việt Nam có các trung tâmnghiên cứu thử nghiệm côn trùng truyền bệnh trong đó có các phòng thí nghiệmkiểm định hoá chất diệt côn trùng Các phòng này có các phòng thí nghiệm nuôi cácdòng muỗi chuẩn quốc tế hoặc chủng địa phương phục vụ cho công tác thí nghiệm
và kiểm nghiệm như Viện Sốt rét, Viện Vệ sinh Dịch tễ học Trung ương, ViệnPasteur Tp Hồ Chí Minh Tùy theo chức năng khoa học và nhiệm vụ phòng dịch,các phòng nuôi muỗi thí nghiệm sẽ nuôi các chủng đặc thù Các Viện Sốt rét nuôi
muỗi Anopheles, Viện Dịch tễ, Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh nuôi các dòng muỗi Aedes aegypti, Culex Các phòng thí nghiệm nuôi muỗi đều có các nhân viên thực
hành được đào tạo Cho đến nay các dòng muỗi vẫn được dùng trong một số nghiêncứu và kiểm định hoá chất diệt muỗi mà chưa có phòng thí nghiệm nào dùng LQ
muỗi Aedes Aegypti kiểm định Bti hay đã có quy trình kiểm định Bti áp dụng như
thường qui kiểm tra công hiệu Đây là một khó khăn cho việc kiểm tra hàm lượngđộc tố Bti trong việc theo dõi chất lượng cho các nhà nghiên cứu sản xuất Bti, cũngnhư kiểm định Bti nhập khẩu nếu có
Trang 33Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
ở hàm lượng đơn vị cao, ít giảm hiệu lực khi lưu giữ dùng lâu dài
- Thương phẩm Bti có hàm lượng, xuất xứ, nguồn gốc, được phép lưu hànhđang trong hạn sử dụng
Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh không có chủng Bti chuẩn nên chúng tôi sửdụng chế phẩm Bti Mosquito bits của công ty Summit
Vi khuẩn Bti trong sản phẩm của công ty Summit đã được Cục bảo vệ Môitrường Mỹ (EPA) công bố các thông số kỹ thuật cũng như tác động môi trường.Theo hướng dẫn ghi trên bao bì đóng gói của nhà sản xuất, sản phẩm chứa độc tốBti diệt LQ là 7000 ITU/mg (Đơn vị độc tố quốc tế trong 1 mg sản phẩm), đang
Trang 34trong hạn sử dụng Công hiệu của chế phẩm Bti không căn cứ trên số đếm tế bào vikhuẩn (CFU) có trong 1 gam sinh phẩm mà tính liều diệt LQ theo đơn vị ITU/mgchế phẩm.
Hình 3.1 Chế phẩm Bti MOSQUITO BITS dùng trong nghiên cứu
Sinh phẩm Bti dùng làm mẫu thử kiểm tra độc tính để tiến hành các thínghiệm áp dụng xây dựng quy trình là sản phẩm Bti loạt TN6 sản xuất tại CtyTNHH Sinh học Mai Việt, Tp Hồ Chí Minh Việt Nam, dạng bột khô màu trắngngà, sinh phẩm này chưa biết liều gây chết và hàm lượng độc tố trong sản phẩm
Trang 35Hình 3.2 Chế phẩm vi sinh Bti TN06 sản xuất tại Công ty TNHH Sinh học Mai
Việt dùng làm mẫu Bti thử trong các thí nghiệm kiểm tra công hiệu Bti
LQ Aedes aegypti: LQ dùng trong các thí nghiệm theo hướng dẫn của WHOPES, có thể dùng các dòng muỗi A aegypti chuẩn quốc tế (Bora bora) hoặc dòng muỗi A aegypti của địa phương thế hệ F1 hoặc F2.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, muỗi vằn A aegypti địa phương được nuôi
trong phòng nuôi muỗi thí nghiệm của khoa côn trùng, Viện Pasteur TP HCM,dòng muỗi này thu thập từ xã Mỹ Hoà, huyện Cầu Ngang, tỉnh Trà Vinh Trước khinuôi nhân giống, muỗi được kiểm tra phải không bị nhiễm vi rút Dengue mới đưavào nuôi sản xuất LQ dùng cho các thí nghiệm kiểm định công hiệu Bti Tiêu chuẩn
LQ A aegypti dùng trong thí nghiệm (hay LQ A aegypti chuẩn) là LQ của cùng
một loạt muỗi đồng nhất, nở cùng ngày tuổi Thế hệ F1 hoặc/và F2 Đây là điều cốtyếu và quan trọng trong thí nghiệm nghiên cứu xác định công hiệu sinh học của chếphẩm vi sinh Bti
3.2.2 Trang thiết bị
- Phòng thí nghiệm có kiểm soát vi khí hậu như nhiệt độ khoảng 280C, ánh
Trang 36sáng, độ ẩm, hoá chất… để tiến hành thử Bti trên LQ suốt quá trình thử nghiệm.Các dụng cụ chuyên dụng chọn, đếm LQ.
Nước tinh khiết hoặc nước cất
1 Xây dựng tiêu chuẩn LQ A aegypti dùng trong thí nghiệm kiểm định công
hiệu Bti
2 Quy trình gây nhiễm Bti trên LQ A aegypti để xác định mức độ đáp ứng của
LQ (tỷ lệ chết của LQ), xác định các liều chết LD50, LD90,LD99của Bti trongthí nghiệm
3 Xác định công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti theo đơn vị độc tố quốc
tế có trong 1 mg sản phẩm (ITU/mg) và suy ra liều dự đoán của Bti áp dụngdiệt LQ trên thử nghiệm thực địa
Tiến hành các thí nghiệm kiểm tra công hiệu của Bti trong sản phẩm đượcthực hiện theo các bước như sau:
- Bước 1: Tham khảo, nghiên cứu quy trình nuôi muỗi của PTN Côn trùng, Viện
Pasteur, tiến hành nuôi LQ A aegypti dùng cho thí nghiệm kiểm định Bti tại
Công ty TNHH Sinh học Mai Việt
Trang 37- Bước 2: Xây dựng tiêu chuẩn chọn LQ A aegypti dùng trong kiểm định công
hiệu Bti
- Bước 3: Các thí nghiệm gây nhiễm Bti trên LQ A aegypti với các hàm lượng và
liều Bti khác nhau Mỗi liều gây nhiễm lặp lại 3 lần thí nghiệm trong cùng điềukiện
- Bước 4: Xác định các liều chết LD50, LD90, LD99 của Bti Đếm số LQ hoánhộng, số LQ chết, tính tỷ lệ LQ hoá nhộng, tỷ lệ LQ chết theo công thức Abbott
và áp dụng phần mềm xử lý thống kê, phân tích để tính các giá trị liều gây chết
LQ ở tỷ lệ 50% (LD50), 90% (LD90), và 99% (LD99) của chế phẩm Bti dùng làmchuẩn và Bti thử trong mỗi thí nghiệm, tiếp theo tính giá trị liều trung bình gâychết LD50, LD90, LD99của 3 lần thí nghiệm nhắc lại của cả Bti chuẩn và Bti thử
- Bước 5: Tính công hiệu diệt LQ của chế phẩm vi sinh Bti thử theo đơn vị độc tố
quốc tế (ITU/mg) và tính liều dự đoán của Bti áp dụng diệt LQ muỗi trên thửnghiệm thực địa (mg/l)
3.4 Mô tả thí nghiệm
Phương pháp nuôi LQ A aegypti dùng trong thí nghiệm kiểm tra công
hiệu Bti: Phương pháp nuôi muỗi đã có ở các phòng côn trùng thí nghiệm
muỗi Chúng tôi đã tham khảo và áp dụng phương pháp nuôi muỗi từ phòng
TN Côn trùng Viện Pasteur, bổ sung một số hướng dẫn của WHOPES dành
riêng cho nuôi LQ muỗi A aegypti phục vụ thí nghiệm đánh giá công hiệu
Bti
Xây dựng tiêu chuẩn LQ A aegypti dùng cho thí nghiệm Bti: Thực hiện
Chọn LQ theo hướng dẫn của WHOPES, quan sát, theo dõi LQ trong các thínghiệm, và ghi lại các tiêu chuẩn của LQ
Cách chọn LQ A aegypti để thí nghiệm: Loại bỏ LQ sắp hoá nhộng (cơ thể đã
thu ngắn lại, có màu đen, hoạt động chậm), lựa những LQ tuổi L3 hoặc đầu tuổiL4, kích thước đồng đều, chiều dài 5 – 6 mm, 7 – 8 ngày tuổi
Trang 38 Thiết kế các thí nghiệm sinh học kiểm tra công hiệu Bti
được tính vào khoảng 15.000 ITU/mg Cũng có thể dùng sinh phẩm Bti nguồn gốc
rõ ràng có ghi rõ hàm lượng ITU/mg, sinh phẩm Bti này đang trong hạn sử dụng.Công hiệu của sinh phẩm “X” = Công hiệu chuẩn (ITU) x LD50(mg/l) chuẩn
LD50(mg/l) của “X”
Trang 39chủng muỗi khác để tiến hành thí nghiệm nhưng phải thận trọng, bởi khó tránh khỏicác kết quả khác nhau do sai số Chủng Bti chuẩn hay các loại Bti khác dùng làmchuẩn được chọn lọc phải bảo quản cẩn thận, ghi chép rõ ràng vì có thể gây nhiễmchéo Nhân viên thực hành các thử nghiệm này cần có năng lực và các kỹ năng làmthí nghiệm thành thục.
Chuẩn bị dãy đậm độ gây nhiễm Bti lên LQ A Aegypti
- Ban đầu, LQ muỗi được thử nghiệm phơi nhiễm với một loạt các đậm độ 1%,0,1%, 0,01% và đối chứng để tìm hiểu phạm vi hoạt tính của vật liệu được thửnghiệm
- Sau khi xác định tỷ lệ chết của ấu trùng trong các loạt đậm độ này, một phạm vihẹp (4-6 liều/1 đậm độ) có từ 10% đến 95% LQ chết trong 24 giờ phơi nhiễm được
sử dụng để xác định giá trị LD50và LD90
Chuẩn bị huyền dịch chế phẩm Bti chuẩn (standard) gây nhiễm LQ
Chuẩn bị loạt pha loãng tạo “huyền dịch” (stock suspension): Cân 1000mgsản phẩm cho vào chai có vạch thể tích, thêm vào 100 ml nước cất, huyền dịch này
là huyền dịch 1%, (hay có đậm độ 10 mg/l) Lắc hoặc khuấy kỹ để huyền dịch đồngnhất Huyền dịch này có thể bảo quản đông băng để dùng lại sau này Khi để đôngbăng lấy ra phải được đồng nhất trước khi dùng
Huyền dịch 1% được dùng để chuẩn bị các độ pha khác nhau 0,1% và0,01% Ta có các độ pha 1%, 0,1% và 0,01%, tương ứng 10 mg/l 1mg/l; 0,1mg/l đểthực hiện thí nghiệm gây nhiễm LQ
Rót 100 ml nước khử khoáng (hoặc nước cất) vào các cốc nhựa dùng 1 lần,
cho vào mỗi cốc 25 LQ A aegypti loại L2, L3.
Dùng micropipette hút 400 µl, 300 µl, 200 µl, 100 µl, 80 µl, và 50 µl Btichuẩn từ độ pha ban đầu 10mg/l cho vào từng cốc đã có lăng quăng Ta có 6 hàmlượng cuối cùng tương ứng trong các cốc là: 0,04 mg/l, 0,03 mg/l; 0,02 mg/l; 0,01mg/l; 0,008 mg/l và 0,005 mg/l cho mẫu chuẩn
Trang 40Thực hiện tương tự với các liều pha loãng từ đậm độ 1 mg/l và 0,1 mg/l Cứmỗi liều dùng 4 cốc, mỗi cốc 25 LQ, mẫu đối chứng chỉ có LQ và 100ml nước.
Chuẩn bị huyền dịch chế phẩm được kiểm định (X) gây nhiễm LQ
Để thực hiện các kỹ thuật thí nghiệm sinh học các sản phẩm chưa biết cônghiệu phải làm đồng nhất huyền dịch từ đầu bằng cách trộn đều mà không cần làmgiảm kích thước hạt sản phẩm
Tiến trình thực hiện tương tự như với mẫu Bti chuẩn
Để tìm dãy giá trị liều đáp ứng gây nhiễm, chỉ những đậm độ cho giá trị tỷ lệ
LQ chết giảm dần thì dữ liệu mới được xử lý Tối thiểu phải có 2 đậm độ trên vàdưới mức LD50liên tiếp
Tỷ lệ chết được tính bằng cách đếm LQ chết/sống sau 24 giờ phơi nhiễm với
B thuringiensis var israelensis Các kết quả của các thử nghiệm với các đậm độ
khác nhau (bao gồm cả các giá trị LD) được ghi vào phiếu mẫu (phần phụ lục) Nếu
có trên 10% LQ hoá nhộng, hay >20 % LQ đối chứng chết thì thử nghiệm không cógiá trị, bị loại bỏ Tất cả các thử nghiệm được để ở nhiệt độ 25 - 280C, và 12 giờ cóánh sáng, 12 giờ trong tối Thức ăn không được thêm vào các cốc LQ trong khiđang phơi nhiễm 24 giờ
Bố trí thí nghiệm
- Nhóm thí nghiệm I. LQ A aegypti được gây nhiễm Bti chuẩn hoặc Bti
thử ở đậm độ 1% (10mg/l)
Dùng micropipette hút ra 6 liều 400 µl, 300 µl, 200 µl, 100 µl, 80 µl, 50 µl từhuyền dịch Bti chuẩn hoặc Bti thử có đậm độ 1% (10 mg/l) cho vào mỗi cốc đựng
100 ml nước cất, mỗi liều như trên được thử nghiệm trong 4 cốc, mỗi cốc có 25 LQtuổi L2, L3
Sau 24 giờ phơi nhiễm, đếm số LQ chết/sống, số LQ hoá nhộng
Thí nghiệm được thực hiện nhắc lại 3 lần