Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá .... 31 Phương pháp nghiên cứu tính kháng giữa các loài vi khuẩn lactic với những chủng Bacillus phâ

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Thị Hai khoa CNSH-TP-MT trường Đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Minh

Mọi số liệu cũng như hình ảnh trong đồ án đều là những số liệu và hình ảnh của riêng tôi, không sao chép của ai dưới bất cứ hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong

đồ án này đều hoàn toàn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án của tôi

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016

Sinh viên thực hiện

Phan Thị Gìn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai, người đã tận tình giúp

đỡ, chỉ bảo em hoàn thành tốt bài đồ án tốt nghiệp Em cũng chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành đã hỗ trợ hết mình trong quá trình em làm đồ án tại phòng thí nghiệm của trường Đại học Công Nghệ Tp HCM

Đồng thời em cũng xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học-Thực Phẩm - Môi Trường của trường đại học Công Nghệ thành phố Hồ Chí Mnh

đã truyền tải kiến thức cho em trong quá trình học tập ở trường để em có những kiến thức để hoàn thành đồ án tốt nghiệp của minh Kiến thức đó không những giúp em hoàn thành đồ án tốt nghiệp mà nó còn là nền tảng hữu ích cho công việc của em sau này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đinh của em, những người luôn là chỗ dựa tinh thần quý báo của em giúp em vượt qua mọi khó khăn trong công việc hoc hành cũng như trong cuộc sống

Em cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm đã giúp đỡ, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp

Và cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn của mình đến Hộ đồng phản biện đã giành thời gian theo đọc và nhận xét đối với đồ án tốt nghiệp của em Em xin kính chúc quý Thầy Cô nhiều sức khỏe

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm2016

Sinh Viên thực hiện

Phan Thị Gìn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Đặt vấn đề 1

2.Nội dung nghiên cứu 2

3.Mục đích nghiên cứu 2

4.Phương pháp nghiên cứu 2

5.Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

6.Ý nghĩa của đề tài 4

7.Các kết quả của đề tài 4

8.Kết cấu đồ án tốt nghiệp 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 6

Đặc điểm hình thái 6

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 6

1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon 6

1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ 7

1.1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng về vitamin 8

1.1.2.4 Nhu cầu về các muối khoáng 8

1.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic 9

1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Lactic 10

Ảnh hưởng của oxy 10

Ảnh hưởng của nhiệt độ 11

Ảnh hưởng của pH 12

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 13

Ảnh hưởng của nồng độ glucose 13

1.4 Lên men lactic ở vi khuẩn lactic 13

1.5 Sự phân bố vi khuẩn lactic trong tự nhiên 14

1.6 Môt số ứng dụng của vi khuẩn lactic 14

Trong công nghiệp thực phẩm 14

Trong công nghiệp 15

Trong nông nghiệp và môi trường 16

Trong chăn nuôi 16

1.7 Tình hình nghiên cứu của thế giới 16

1.8 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

Nguồn vật liệu nghiên cứu 20

Thời gian nghiên cứu: 20

Chủng vi khuẩn đối chứng 20

Dụng cụ và thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

Phương pháp thu mẫu 21

Phương pháp phân lập mẫu 21

Phương pháp làm thuần 21

Thử nghiệm sinh hóa 22

2.2.4.1 Thử nghiệm khả năng tiết enzyme catalse 22

2.2.4.2 Phương pháp nhuộm Gram 23

2.2.4.3 Phương pháp nhuộm bào tử 24

2.2.4.4 Phương pháp thử khả năng phân giải CaCO3 25

2.2.4.5 Phương pháp thử khả năng di động 25

2.2.4.6 Khảo sát khả năng lên men các loại đường khác nhau 26

2.2.4.7 Thử nghiệm idole 27

2.2.4.8 Thử nghiệm methyl red 28

2.2.4.9 Thử nghiệm voges proskauer 29

2.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ

ruột cá 31

Khảo sát khả năng kháng khuẩn 31

Phương pháp nghiên cứu tính kháng giữa các loài vi khuẩn lactic với những chủng Bacillus phân lập từ ruột cá 32

Khảo sát khả năng sinh acid lactic và mối liên hệ với mật độ tế bào 33

Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá 35

Hình thái khuẩn lạc 35

Kết quả nhuộm Gram 35

Kết quả nhuộm bào tử 35

Kết quả test sinh hóa 38

3.1.4.1 Kết quả thử catalase 38

3.1.4.2 Kết quả thử indole 39

3.1.4.3 Kết quả thử nghiệm Methyl Red 40

3.1.4.4 Kêt quả thử nghiệm Voges Proskauer (VP) 41

3.1.4.5 Kết quả thử nghiệmsimmon citrate 41

3.1.4.6 Kết quả khả năng di động 42

3.1.4.7 Kết quả lên men cacbohydrate 43

3.1.4.8 Kết quả lên men Glucose 43

3.1.4.9 Kết quả lên men Lactose 44

3.1.4.10 Lên men Sucrose 45

3.1.4.11 Lên men Arabinose 45

3.1.4.12 Kết quả khả năng phân giải CaCO3 46

3.2 Mối liên hệ giữa mật độ tế bào và khả năng sinh acid tổng 49

3.3 Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập được 50

kháng E.coli 50

3.4 Kết quả khả năng đối kháng với vi khuẩn Staphylococcus 53

3.5 Kết quả khả năng đối kháng đối với chủng Bacillus 55

3.6 Kết quả ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào vi khuẩn latic 57

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG THỬ SINH HÓA TRONG CÁC THÍ NGHIỆM 1

PHỤ LỤC B: ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA 5 CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP ĐƯỢC 4

PHỤ LỤC C KẾT QUẢ MẬT ĐỘ TẾ BÀO TRONG CÁC ĐỘ MẶN KHÁC NHAU 7

PHỤ LỤC D KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 8

PHỤ LỤC E: HÌNH ẢNH 21

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khuẩn lactic 11

Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp của các vi khuẩn lactic 12

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái và tế bào của vi khuẩn lactic nghi ngờ là vi khuẩn lactic

36

Bảng 3.2 Đặc điểm vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá 37

Bảng 3.3: khả năng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS 46

Bảng 3.4 Kết quả test sinh hóa của các loại vi khuẩn lactic 47

Bảng 3.5 Hàm lượng acid tổng có trong vi khuẩn phân lập từ ruột cá 49

Bảng 3.6 Bảng kết quả đối kháng E.coli 51

Bảng 3.7 Kết quả đối kháng Salmonella 52

Bảng 3.8: Kết quả đối kháng của vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá với vi khuẩn Staphylococcus 54

Bảng 3.9: Kết quả đối kháng của chủng vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột cá……….54

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic 31

Hình 3.1 Kết quả thử catalase của 5 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 39

Hình 3.2 kết quả thử nghiệm indole 40

Hình 3.4 kết quả thử nghiệm VP 41

Hình 3.5 Kết qua thử nghiệm simon citrate 42

Hình 3.6 Kết quả thử khả năng di động 43

Hình 3.7 Kết quả thử nghiệm lên men Glucose 44

Hình 3.8 Kết quả thử nghiệm lên men Lactose 44

Hình 3.9 Kết quả thử nghiệm lên men Sucrose 45

Hình 3.10 Kết quả thử nghiệm lên men Arabinose 44

Hình 3.11 Biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa hàm lượng % ai tổng và OD hiệu chỉnh .48

Hình 3.12 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn E coli 51

Hình 3.13 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Salmonella 53

Hình 3.14 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Staphylococcus 54

Hình 3.15 Biểu đồ ảnh hưởng của độ mặn đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật 58

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU: Colony forming unit

FAO: Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

NA: Nutrient agar

NB: Nutrient broth

OD: Optical Density

VP – MR: Voges – Proskauer – Methyl Red

VASEP: Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam (Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers)

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Vi khuẩn lactic là một trong những vi khuẩn được sử dụng nhiều ở quy mô công

nghiệp Chúng có khả năng sinh ra acid lactic và các sản phẩm phụ khác (Wood và Holzapfel, 1995) Sản phẩm của những vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi, môi trường và trong nông nghiệp Nghiên cứu của

Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ

dạ dày – ruột của một số loài cá có khả năng ức chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở cá và một số loài vi khuẩn gây bệnh khác (Schillinger và Lucke, 1989;

Lewus et al., 1991; Karthikeyan và Santosh, 2009) Vì vậy, vi khuẩn lactic được sử

dụng rộng rãi trong sản xuất probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn lactic lại có tác dụng hổ trợ rất tốt

trong việc sản xuất phân bón giàu đạm từ cá, Patrix và ctv (2013) đã khuyến cáo sử

dụng lactobacillus recipe và lactobacillus recipe để sản xuất phân bón dạng lỏng từ

cá Phân bón dạng lỏng từ cá được cho biết có hiệu quả tốt kích thích sự tăng trưởng của cây trồng (Murray and Anderson 2004)

Việt Nam có một hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường bờ biển dài 3260km, với địa hình như vậy rất thuận lợi cho việc đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản

Hiện nay thì nghề đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản của nước ta phát triển rất mạnh Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy hải sản đạt 1,67 triệu tấn, xếp thứ 6 Châu Á

Ngày nay thì ý thức của người dân về sức khỏe đã được nâng lên, người tiêu dùng đã chuyển sang dùng cá thay vì thịt cho các bữa ăn hằng ngày, vì trong cá có

Bên cạnh việc lượng cá thành phẩm tăng mạnh ( cá fillet, cá viên,…) thì lượng phụ phế phẩm của cá cũng tăng lên không kém Đây là một bài toán được đặc ra vì lượng phụ phế phẩm này được thải vào môi trường thì sẽ gây ra ô nhiễm môi trường rất nặng nề Trong khi đó, phụ phế phẩm cá là nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất phân bón dạng lỏng, phun qua lá cho cây trồng ở nhiều nước trên thế giới (El-Tarabily et al 2003; Murray and Anderson 2004; Eric Weinert et al (2014) Tuy nhiên ở Viêt Nam, vấn đề này vẫn chưa được quan tâm

Chính vì vậy, sinh viên tiến hành đề tài” Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá” để làm vật liệu cho sản xuất phân amino acid từ phụ phẩm cá, thay thế phân hoá học và giúp làm giảm nguồn gây ô nhiễm môi trường

2 Nội dung nghiên cứu:

 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic

 Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn lactic

 Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được

 Đánh giá một số đặc tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic trong điều kiện invitro

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập các chủng vi khuẩn lactic có trong ruột cá

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tổng hợp tài liệu:

 Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài

 Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài

 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

 Thực hiện một số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh lý sinh hóa từ đó tuyển chọn chủng vi khuẩn mong muốn

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

 Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm

 Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm Statistical Analysis Systems (SAS)

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: những vi khuẩn lactic có trong ruột cá

 Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu những chủng vi sinh vật có trong ruột cá

6 Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Phân lập được chủng vi khuẩn Lactic từ ruột cá để làm nguồn

nguyên liệu cho những nghiên cứu tiếp theo

Ý nghĩa thực tiễn: Chủng vi khuẩn Lactic được sử dụng để phối hợp với những

chủng vi sinh vật khác trong các chế phẩm xử lý môi trường Vì vậy việc phân lập các chủng này sẽ gớp phần tạo ra chế phẩm để xử lý nguồn phế phẩm của thủy hải sản,

giảm thiểu việc ô nhiễm môi trường

7 Các kết quả của đề tài

Phân lập được 5 chủng vi sinh vật có khả năng tiết acid lactic và bacteriocine có trong ruột cá Từ kết quả phân lập và định danh sơ bộ cho thấy 5 chủng vi sinh vật

phân lập được đều là vi khuẩn lactic

Thu được kết quả khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của 5 chủng vi sinh vật

phân lập được

8 Kết cấu đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung liên

quan đến tài liệu nghiên cứu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập đến

các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án

Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề

tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được

Chương 4: Kết luận và kiến nghị - nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt

được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn lactic được xếp vào họ Lactobacilaceae, thuộc bộ Eubacteriales

Nhóm này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý chúng tương đối đồng nhất Tấc cả đều có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển hóa hydrate cacbon và sinh các acid lactic Khác với một số vi khuẩn khác như vi khuẩn đường ruột cũng sinh acid lactic, tất cả vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa các cytocrom và enzyme catalase, sinh trưởng tùy tiện Hình dạng của vi khuẩn lactic có thể hình cầu hay hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài khác nhau Tất

cả sự khác nhau về hình thái tế bào mày phụ thuộc vào môi trường, thời gian, sự có mặt của oxy cũng như các điều kiện nuôi cấy khác [12]

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Cacbon là thành tố chính trong hộp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể người của mọi loài sinh vật Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic sử dụng rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như glucose, fructose, manose, galactose, các loại đường đôi như saccarose, lactose, maltose cho đến các polysacrit nhu tinh bột, dextrin

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và disaccait Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như các acid glutamid và galacturonic tạo thành

CO2, acid acetic và acid lacti như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae Trong quá trình lên men các cơ chất như cacbon, vi khuẩn lactic

có thể sử dụng cả các acidamine như acid glutamic, arginine, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra các quá trình decacboxyl và tạo ra CO2 Các loài vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau Sự phát triển của vi khuẩn lactic trên các loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước trước những áp lực

của các quá trình sử lý sau này Khả năng sống sót của L bulgaricus trong và sau sấy

đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men tử maltose thì tỷ lệ tế bào chết sẽ nhiều hơn hẳn so với lên men

từ fructose và lactose Tuy nhiên việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào.[12]

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật Những vật chất

cơ bản của tế bào như protein, acid nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trường và phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều acid amine khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình Acid amine có thể dược đồng hóa dưới dạng peptide nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào hay nội bào

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn

vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa ni tơ nên hung đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn

lacic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguôn nitơ vo cơ như L helveticus

chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

phẩm thủy phân protein từ peptone, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiếc thịt, trypton,…Đây cũng là nguồn ni tơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn nitơ thích hợp để giúp giảm giá thành sản phẩm và nâng cao hiệu quả sản xuất Trong đó nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều [12]

Nhu cầu dinh dưỡng về vitamin

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobaillus, rất cần vitamin co sự sinh

trưởng Acid nicotinic và acid pantothenic rất cẩn cho sự sinh trưởng của tất cả các loài

vi khuân lactic Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [12], [32]

Các chất hữu cơ cần thiết cho sự phát triển cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

Acid aceric và acid citrate ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Acetate có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Acetate được dùng làm đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Một lọa acid hữu

cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic

là acid oleic, một dẫn xuất của oleic được sử dụng là Tween 80 trong thành phần môi

trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic Một vài loài vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần acid béo không no cho sự phát triển

[12],[50]

Nhu cầu về các muối khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magie

Đặc biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với vi khuẩn lactic thì mangan, magie và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [12], [45]

1.2 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại của vi khuẩn của Bergey’s [21] vi khuẩn lactic được phân

loại như sau:

Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli

Bộ: Eubacteriales

Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus

Vi khuẩn lactic gồm một số giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc

tính là vi khuẩn Gram dương và lên men cacbohydrate thành năng lượng và acid lactic

Vi khuẩn lactic rất đa dạng Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá bằng hàm lượng G+C trong AND của các loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phân lớn các giống khác là dạng hình que và khả

năng tạo acid lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic

còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm khi di động người ta

thấy rằng tế bào vi khuẩn lactic điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi

trong khoảng ( 0,5-1,2 )x(1-10)µm, đôi khi trông chúng có thể gần giống như hình cầu ( coccus) trong điểu kiện nào đó và có thể hình thành dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc

Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trên môi trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ

đục và không nhuộm màu Những tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có

Về nhu cầu oxy chúng là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có oxy Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát triển tốt trong điều kiện có 5% CO2 [22]

Về nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn lactic cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt, chúng

phát triển tốt trong môi trường có nhiểu phức chất, nhiệt độ phát triển tối ưu cho chúng

là 30-40oC, nhưng chúng cũng có thể phát triển trong phạm vi từ 5-53oC Chúng có khả năng chịu được môi trường có tính acid, pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 - 5,8, nhưng nhìn chung cũng có thể phát triển ở pH < 5

1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn Lactic

Ảnh hưởng của oxy

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, không có hệ enzyme hô hấp cytocrom cũng như hệ catalase Tuy nhiên cũng có khả năng oxy hóa rất nhiều hệ FAD (Flavin Adenin Dinucleotic)

Các nghiên cứu cho thấy, một số chất trong môi trường chỉ có thể được sử dụng

khi có mặt của oxy Chẳng hạn Pediococcus sp và L plantarum có thể đồng hóa được glycerin trong điều kiện hiếu khí Một số loài Leuconostoc có thể cần sự có mặt của oxy trong giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase L brevis và L buchneri phát triển tốt ở

30oC trong điều kiện yếm khí, trong khi ở 37oC chúng phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện Hiện tượng tương tự cũng gặp ở một số chủng thuộc loài S

pyogenes Các nghiên cứu cho thấy hệ enzyme peroxylase có trong vi khuẩn lactic có

thể thực hiện các chức năng thay thế cho hệ enzyme dehydrogenase, khi đó oxy được

sử dụng như chất nhận hydro Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic thường kèm theo việc tạo thành H2O Đồng thời một số vi khuẩn latic (S brevis, L mesenteroides) có

thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia cùng một số chất oxy hóa Như vậy vi khuẩn lactic có hệ peroxidase sử dụng NADH2 làm chất nhận điện tử và phân

Phương trình phản ứng như sau:

NADH2 + H+ + H2O2  NAD+ +2H2O Trong điều kiện hiếu khí năng lượng sinh ra cũng nhiều hơn so với điều kiện yếm khí (hơn 20 lần khi cùng phân hủy 1 mol glucose) Quan hệ với oxy giữa các loài

vi khuẩn khác nhau có sự khác nhau.Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các trực khuân lên men dị hình chậm sinh trưởng Các vi khuẩn lactic lên men dị hình khi lên men agrabinosease đạt tối ưu trong điều kiện kỵ khí, còn các loài khác không sử dụng được pentose lại sinh trưởng rất kém trong điều kiện này Trong quá trình lên men lactic, lượng oxy vượt quá giới hạn này làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, do vậy quá trình tạo thành acid lactic không xảy ra Trong quá trình lên men bảo quản các loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá thịt…), các vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường được sử dụng nhất là trong bảo quản bằng bao gói chân không Hình thức bảo quản này, mặt khác tránh sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm Trường hợp này vi khuân lactic sẽ ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ các sản phẩm trao đổi chất của nó [12], [18]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho các giống vi khuẩn lactic [12]

Nhóm vi khuẩn

lactic

Nhiệt độ sinh trưởng ( o C)

Giống Bình thường Tối ưu

Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium

Vogococcus, Lactococus

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic Khoảng nhiệt độ sinh trưởng của vi khuẩn khá rộng, một số loài có thể sinh trưởng ở 55oC trong khi một

số khác có thể sinh trưởng ở 5oC Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic thường sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 15-40oC (bảng 1.1)

Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là hệ enzyme của chúng, chị tác động mạnh mẽ của sự thay đổi pH của môi trường Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt tính sinh học cao nhất

Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp của các vi khuẩn lactic [12]

Lactobacillus, Pediococccus và Leuconostoc lần lượt là 5,6-6,2; 5,6-6,5 và 5,6-6,5 Giá

trị pH thấp nhất của mỗi loài vi khuẩn lactic chịu được là khác nhau Chẳng hạn

Lactobacillus chịu được pH= 3,2-3,5, Pediococcus chịu được pH= 3,2- 3,5, trong khi

đó, Leuconostoc chịu được pH=5,0 ( bảng 1.2) Trong quá trình lên men lactic, acid

lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế hoạt động cua các vi sinh vật khác Sau đó,

khi lượng acid tích lũy đủ lớn thì chính vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, sự ức chế, sự acid hóa tế bào chất gây ra do sự tích lũy nội bào acid lactic [12]

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất của vi khuẩn Với nồng độ NaCl lớn hơn hoặc bằng 5%, sự sinh trưởng của phần lớn vi khuẩn lactic bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch giữa áp suất thẩm thấu nội bào và ngoại bào của vi khuẩn lactic tăng lên , đồng thời ức chế hoạt tính enzyme của tế bào Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với nồng độ muối NaCl hơn các vi khuẩn Gram Dương, nguyên nhân là do các enzyme của vi khuẩn bị ức chế bởi ion Cl-. Một số chủng P pentosaceus

sinh trưởng ở nồng độ NaCl 9- 10%.[12],[45]

Ảnh hưởng của nồng độ glucose

Đường là nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp acid lactic Nồng độ đường trong môi trường càng cao thì lượng acid sinh ra càng nhiều tuy nhiên nồng độ đường quá cao làm áp suất thẩm thấu môi trường cao gây ra hiện tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn lactic do giảm acid lactic tạo ra [12],[18]

1.4 Lên men lactic ở vi khuẩn lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật,

điển hình là vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic ncó khả năng lên men nhiều loại đường

đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của chúng cần sự có mặt của peptone, acid amin hay muối amon.Vi khuẩn lactic có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Qúa trình lên men tốt nhất trong môi trường có pH từ 5,5- 6 , khi pH mà

Quá trình lên men lactic diến ra trong tế bào vi khuẩn Đầu tiên, đường sẽ được

vi khuẩn đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide rồi mới vào chu trình chuyển hóa Sau đó phân tử đường này sẽ đi vào chu trình chuyển hóa khác nhau và cuôi cùng là cho sản phẩm là acid lactic, acid acetic, CO2

Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men mà người ta chia chúng ra làm hai nhóm là vi khuẩn lên men đồng hình hay vi khuẩn lên men dị hình

1.5 Sự phân bố vi khuẩn lactic trong tự nhiên

Vi khuẩn lactic phân bố rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt là trong các sản phẩm lên men, chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm: các sản phẩm chế

biến từ sữa và bia Người ta có thể tìm thấy Lactobaillus ở cá, động vật và thực vật Ở người, Lactobacillus thường tìm thấy ở ruột và âm đạo [12]

1.6 Môt số ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm [1], [30]

Trong công nghiệp thực phẩm

Vi khuẩn lactic được tìm thấy trong một số sản phẩm thực phẩm (sữa lên men, rau củ lên men, phomat ) với vai trò bảo quản, cung cấp chất dinh dưỡng hoặc mùi vị cho sản phẩm Trong các sản phẩm từ sữa, chúng có thể hoạt động một mình hoặc kết hợp với các vi khuẩn lactic khác Sữa acidophilus là một ví dụ điển hình về các sản

phẩm lên men từ sữa này với sự tham gia của L acidophilus Ngoài ra, sự kết hợp L bulgaricus với Streptococcus thermophiles có thể tạo nên sản phẩm sữa chua [1]

Rau củ lên men là một món ăn phổ biến của nhiều nước trên thế giới như: dưa cải chua, dưa cải bắp và nhiều loại rau củ lên men khác là những món ăn thường ngày trong các gia đình ở Việt Nam; Kimchi là một sản phẩm lên men lactic khác của hơn

100 loại rau củ và là một món ăn truyền thống nổi tiếng của Hàn Quốc Trong quá

trình muối chua rau củ, các vi khuẩn Lactobacillus trong rau củ tươi tạo ra một lượng

axid lactic đáng kể góp phần làm chua rau củ và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn

gây hư hỏng thực phẩm [30], [48] Ngoài ra, Lactobacillus còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm bánh mì Nhiều loài Lactobacillus được tìm thấy trong bột chua làm bánh mì gồm: L acidophilus, L farciminis, L casei, L plantarum, L rhammosus,

L brevis, L sanfrancisco và L fermentum Vi khuẩn lactic được sử dụng như một chất

bảo quản sinh học vì một số sản phẩm trao đổi chất của các vi khuẩn lactic có hiệu quả kháng khuẩn như: các axít hữu cơ, các axít béo, hydrogen peroxide, diacetyl người ta đặc biệt chú ý đến các bacterioxin, là các chất tạo bởi một số vi khuẩn lactic có khả

năng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh như: Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus, Enterococcus Do đó các bacterioxin được nhận định là có hiệu quả cao và

an toàn trong quá trình bảo quản các loại thực phẩm Các nhà nghiên cứu nhận thấy

Lactobacillus là một trong những vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra nhiều loại bacterioxin Các bacterioxin của Lactobacillus có thể đưa vào thực phẩm để ngăn chặn

sự phát triển của nhiều loài vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh [48]

Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axít lactic Axít lactic là axít hữu

cơ đầu tiên được sản xuất bởi vi sinh vật vào năm 1880 Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng được dùng để axít hóa rượu vang và hoa quả nghèo axít, ngoài ra còn được

Người ta có thể sử dụng các loài Lactobacillus lên men tự nhiên các loại cơ chất khác nhau để tạo ra axít lactic, như: L bulgaricus có thể tạo ra axít lactic bằng cách lên

men nước sữa (whey) Acid lactic là một trong những axít hữu cơ được dùng đầu tiên trong thực phẩm Acid lactic được sử dụng theo một số cách như dùng trong đóng gói ô liu Tây Ban Nha nhằm ngăn chặn sự hư hỏng và sự lên men, giúp bảo quản bột trứng khô, cải thiện vị của dưa chua khi thêm vào giấm, làm chua nước ép trái cây trong quá trình làm rượu vang [1], [58]

Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu và là

cơ hội gây bệnh cho cây trồng Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm

vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề

ô nhiễm môi trường [37]

Trong chăn nuôi

Vi khuẩn lactic có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế

vi sinh vật gây thối nhiễm vào đường ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trưởng ở thú nuôi Ngoài ra, người ta còn dùng L casei và L plantarium để ủ rơm, rau,

cỏ cho gia súc ăn Trong quá trình lên men vi khuẩn lactic sản sinh ra một số sản phẩm

có giá trị như vitamin, chất thơm, kháng sinh làm cho thức ăn gia súc ủ chua có giá trị dinh dưỡng cao làm tăng năng suất vật nuôi [37], [58]

1.7 Tình hình nghiên cứu của thế giới

Hiện nay vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá đã được nghiên cứu rộng rã trên thế

giới Các nhà khoa học đã ứng dụng các vi sinh vật này trong sản xuất chế phẩm sinh

Năm 2013, Yashap Kumar và ctv đã nghiên cứu sự hiện diện của Lactobacillus

có trong ruột cá nước ngọt và đặc tính probiotic của Lactobacillus [49] Dharumaduari

Dhanasekaran và ctv (2008), đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn gây bệnh của

Lactobacillus trên cá trê nhờ vào hoạt tính probiotic [50]

Trong năm 2010, cũng có nhiều nghiên cứu liên quan đến vấn đề này trong đó

có thể kể đến là nghiên cứu của Hoque và ctv đã cho thấy Lactobacillus spp có khả

năng chống chịu với các nồng độ NaCl (1% - 9%), muối mật (0,05% - 0,1% - 0,15% - 0,3%), có khả năng chống chịu ở pH khác nhau (2,2 và 6,6) và mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh (như amoxicillin, gentamicin, tetracyclines, clindamicins, kanamycin, axít nalidixic, metronidazole, azithromicin và cefradine) [35] Nghiên cứu của Tambekar và ctv (2010), cũng đã chỉ ra rằng Lactobacillus sp có khả năng chống chịu trong môi

trường axít (pH= 2, 3, 4, 5), trong môi trường muối mật (0,5%; 1%; 1,5%; và 2%), có

khả năng kháng khuẩn tốt (với Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhi và Shigella flexneri) và mẫn cảm với nhiều loại

kháng sinh (như ampicillin, cephalothin, co-trimoxazole, gentamicin, axít nalidixic, nitrofurantoin, norfloxacin và tetracycline) [51] Nghiên cứu của Xiao-Hua Guo và ctv

(2013), đã cho thấy Lactobacillus có khả năng kháng khuẩn (với E coli, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus), chống chịu ở ngưỡng pH axít (pH = 2 và pH=

3) và đặc biệt giữa các chủng lựa chọn không có sự đối kháng lẫn nhau [52] Đồng quan điểm với Xiao-Hua Guo nghiên cứu của Sameh H.M và ctv (2003), cũng đề cập

đến sự kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus và khảo sát khả năng sinh trưởng

của chủng này trong các điều kiện như: ở pH=1, 2 và 3; ở nhiệt độ là 37oC, 40oC, 45oC,

50oC, 55oC và 60oC; ở nồng độ muối mật là 1%, 2% và 4% [47] Năm 2011, nghiên

cứu của Sahadeva và ctv sự đã chỉ ra một số đặc tính probitoic của chủng Lactobacillus

1.8 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam tinh hình nghiên cứu về Lactobacillus cũng đã được nghiên cứu

rộng rãi.Tuy nhiên, việc phân lập từ ruột cá cũng như ứng dụng enzyme ngoại bào của

lactobacillus để thủy phân nguồn phụ phế phẩm của cá còn rất hạn chế

Việc nghiên cứu chế phẩm probitoic ngày càng trở nên phổ biến ở Việt Nam Lê

Hoàng Bảo Vi và ctv (2006), đã nghiên cứu thành công các chủng Lactobacillus, Bacillus, Aspergillus, Saccharomyces mang đặc tính probiotic được đề cập đó là: sự đề

kháng với kháng sinh; khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, NaCl tới khả năng tăng trưởng của vi khuẩn; xác định khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp; xác định độ kháng khuẩn; xác định vi sinh vật gây bệnh Dựa trên sự nghiên cứu này tạo cơ sở sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong thức ăn chăn nuôi [16] Nghiên cứu của Mai Thị Đàm Linh và ctv (2008); Nguyễn Thúy Hương và ctv (2008), đã chỉ ra rằng bằng việc ra bacteriocin chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng được nhiều vi khuẩn gây

bệnh như Bacillus sp., E coli, [6], [8] Hồ Trung Thông và ctv (2010), đã đánh giá

khả năng sống của các chủng vi sinh vật trong đường tiêu hóa ở điều kiện in vitro bao gồm các điều kiện như khả năng sống trong môi trường có pH thấp, trong môi trường

có pepsine, trong môi trường pancreatine và trong môi trường có muối mật 0,3% [15]

Trần Quốc Việt và ctv (2009), đã cho thấy chủng vi sinh vật (vi khuẩn lactic và nấm men) có khả năng chịu nhiệt (300C; 370C; 450C; 550C), khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau (2,2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối mật khác nhau (0,2%; 0,5%; 1%;1,5%; 2%; 3%) [17] Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ in vitro của một số chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic” của Hồ Lê Quỳnh Châu và ctv

(2010), đã đề cập đến khả năng bám dính của 9 chủng vi sinh vật (B pumilus N1, B pumilus B2/1, B clausii B1, B clausii B2/2, L suntoryeus LII1, E faecium LII3/1, B subtilis LII4, L casei LII5/1 và nấm men S cerevisiae LA5) và khả năng đối kháng

giữa vi sinh vật thử nghiệm với vi khuẩn gây bệnh [2] Đào Thị Lương và ctv (2010),

đã nghiên cứu được khả năng sinh axít lactic, kháng khuẩn của dịch nuôi vi khuẩn

lactic (E coli, M luteus, Salmonella typhi và Shigella flexneri) và khả năng đối kháng

giữa các chủng lựa chọn [9] Ngô Thị Phương Dung và ctv (2011), đã cho thấy

Lactobacillus acidophilus có khả năng sinh bacteriocin kháng lại vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis [3]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu

Nguồn vật liệu nghiên cứu được thu ở chợ Văn Thánh và chợ Bà Chiểu thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 3 tháng 4 đến ngày 2 tháng 8 năm 2016

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu

Mẫu khi thu ở chợ được chứa trong bịch nilon Khi đem về phòng thí nghiệm, mẫu được khử trùng bằng cồn 70 độ

Mẫu sau khi khử trùng được đựng trong từng cốc riêng lẻ, ghi rõ thời gian thu mẫu, tên mẫu, nơi thu mẫu Mẫu đem về cần bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC

Phương pháp phân lập mẫu

Môi trương phân lập mẫu là môi trường MRS agar có bổ sung thêm CaCO3, được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó dung dao phẫu thuật rạch một đường trên ruột cá rồi dùng que cấy vòng lấy mẫu trong ruột cá ria lên môi trường MRS agar, nuôi cấy trong tủ ủ ở 37oC trong 48 giờ

Sau 48 giờ, kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vòng trong suốt xung quanh (acid phân giải CaCO3 tạo vòng trong suốt) Nhận dạng các khuẩn lạc này bằng đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm Gram, phản ứng catalase, nhuộm bào tử

Phương pháp làm thuần

Các vi khuẩn nghi ngờ là vi khuẩn lactic được cấy sang đĩa petri mới bằng phương pháp cấy ria nhằm làm thuần giống Khi vi khuẩn đã được làm thuần ta tiến hành giữ giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng hoặc trong môi trường MRS lỏng có bổ sung15% glyxerol và bảo quản ở -200C để chuẩn bị cho những thí nghiệm tiếp theo

Thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm khả năng tiết enzyme catalse

❖ Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase

Catalase là một homoprotein gồm 4 cấu tử protein và một nhân Fe2+ có khả năng phân hủy hydroperoxide, là một phân tử có độc tính cao trong tế bào, thành H2O

và O2 giải độc cho tế bào.Trong phản ứng này, một phân tử hydroperoxide đóng vai trò

là một chất cho điện tử và một phân tử hydroperoxide khác đóng vai trò là chất nhận điện tử Phân tử H+ tử chất cho điện tử sẽ khử cơ chất tạo nước và oxy phân tử theo cơ chế sau:

2H2O2 + catalase → 2H2O + O2

❖ Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối lên miếng lam sạch và nhỏ lên

một giọt H2O2 30% lên mặt kính, quan sát khả năng sinh catalase của vi khuẩn

Thuốc thử: dung dịch 3% H2O2 (hydrogen peroxide)

Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có

xytochrome đều có enzyme catalase (trừ Streptococcus spp.) Catalase thủy phân H2O2

thành H2O và O2 (được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí)

Tiến hành: Dung dịch H2O2 3% cần được giữ lạnh trong chai màu nâu, tránh ánh sáng, dung dịch đệm photphate pH 7,0 Nhỏ một giọt H2O2 3% lên sinh khối vi

sinh vật trên đĩa môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật thuần cần kiểm tra Ghi nhận sự sủi bọt nếu có

Lưu ý là tất cả các quá trình phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh hiện tượng dương tính giả Đồng thời không được dùng que cấy bạch kim để thực hiện quá trình này

❖ Kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí đó O2 được tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sự sủi bọt khí Vi khuẩn lactic cho phản ứng catalase âm tính [53]

Phương pháp nhuộm Gram

❖ Nguyên tắc: Nhuộm Gram có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phân loại vi

khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iốt bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram

âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iốt và làm cho vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc (đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin)

Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím-iốt bị giữ lại bên trong tế bào

❖ Tiến hành: Lấy một giọt nước cất vô trùng nhỏ lên lam kính Dùng que cấy

vòng lấy mẫu Hòa mẫu vào giọt nước và dàn đều trên lam kính có đường kính khoảng 1-2cm Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút, rửa bằng nước Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước Tẩy màu bằng dung dịch etanol (etanol 95% - axeton 1:1) trong 30 giây Sau đó nhuộm tiếp bằng safranin trong 30 giây, rửa qua nước, thấm

❖ Kết quả: Khi soi dưới kính hiển vi điện tử vi khuẩn Gram dương có màu tím, vi

khuẩn Gram âm có màu hồng [4]

Phương pháp nhuộm bào tử

❖ Nguyên tắc: Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh lục malachite với tiêu

bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vào nội bào tử và làm chúng nhuộm màu lục Khi rửa vêt bôi bằng nước cất các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu lục Khi nhuộm bổ sung bằng đỏ safranin hay fuchsin sẽ làm phần bao quanh bào tử bắt màu phân biệt (màu đỏ hồng)

❖ Tiến hành: sử dụng phương pháp Schaefera và Fulton cải tiến theo các bước

sau:

- Làm vết bôi và cố định tiêu bản: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ

ống giống thạch nghiêng (hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn), hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, hơ nhanh vết bôi trên ngọnlửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính Sau đó, cố định vết bôi bằng cách nhỏ lên vết bôi 1-2 giọt cồn 900, đốt cháy và dập tắt ngay khoảng 10 giây Cuôi cùng, đặt tiêu bản lên trên giá đỡ (giá đỡ đặt trên cốc bese) có chứa một ít nước đang đun nóng 85-900C (không để cho sôi) trên bếp

- Tiến hành nhuộm tiêu bản: đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2-3 giọt

dung dịch lục malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ hơi nước nóng trong 5-10 phút Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung Sau đó, rửa vết bôi bằng nước cất trong 30 giây (lúc đó các tế bào dinh dưỡng sẽ bị mất màu còn bào tử vẫn giữ lại màu), đặt tiêu bản lên giá đỡ (giá đỡ được đặt trên chậu rửa) Đặt giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2-3 giọt dung dịch safranin hay fuchsin lên trên miếng giấy lọc, để 30 giây Cuối cùng, rửa nước rồi thấm khô hay để khô tự nhiên vết bôi

- Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu (x100)

Kết quả: vi khuẩn không có khả năng sinh bào tử nên tế bào bắt màu hồng, còn vi

khuẩn có khả năng sinh bào tử bắt màu xanh Tiêu bản nhuộm đúng thì vi khuẩn sinh bào tử sẽ bắt màu xanh lục, vi khuẩn không sinh bào tử bắt màu đỏ hồng

Phương pháp thử khả năng phân giải CaCO 3

Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra acid lactic phân hủy CaCO3 trong môi trường MRS agar như phương trình sau:

2H+ + CO32- CO2 + H2O Dựa vào khả năng phân hủy CaCO3 trên đĩa thạch mà người ta biết được khả năng sinh acid lactic

Tiến hành: dùng que cấy thẳng lấy sinh khối của vi khuẩn lactic trên môi

trường thạch cấy lên ba điểm lên môi trường MRS agar có 10% CaCO3, nuôi ủ ở nhiệt

độ 37oC trong 48 giờ

Phương pháp thử khả năng di động

❖ Nguyên tắc: Vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao (flagella)

có ở nhiều vi khuẩn thuộc giống trực khuẩn và cầu trực khuẩn Khả năng di động là một trong những căn cứ để phân biệt vi sinh vật Khả năng này có thể được quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật bên trong môi trường thạch mềm

Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiên mao Tiên mao thường được tìm thấy ở các vi sinh vật hình que, tuy nhiên, có một số vi sinh vật hình cầu cũng

có khả năng di động có thể có một hoặc vài tiên mao có thể phân bố tại các vị trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật Một số vi sinh vật có khả năng chuyển từ trạng thái không

di động thành trạng thái di động nhưng không có khả năng chuyển từ trạng thái di động sang không di động do mất tiên mao

khử trùng ở 1210C trong vòng 15 phút sau đó để nguội Các ống môi trường này được làm nguội ở trạng thái đứng và bảo quản ở 4-100C Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần Chủng được cấy bằng cách đâm sâu đầu que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm đến độ sâu khoảng 2/3 môi trường Các ống môi trường được ủ ở 370C trong 24-48h

❖ Kết quả: Thử nghiệm là dương tính (+) vi khuẩn có khả năng di động khi vi sinh

vật mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh; là âm tính (-) vi khuẩn không có khả năng di động khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong [4], [43]

Khảo sát khả năng lên men các loại đường khác nhau

Vi khuẩn lactic có khả năng lên men các loại đường khác nhau để chuyển hóa đường thành acid lactic, ATP và các sản phẩm trung gian khác

Tiến hành: dùng môi trường MRS lỏng nhưng không bỏ 20% đường gluose

vào, sau đó tiến hành bổ sung thêm đường succrosse, arabinose, glucose, lactose,,… vào các ống nghiệm có bỏ vào đó ống duhan để khảo sát khả năng lên men đồng hình hay dị hình của vi khuẩn lactic Sau khi phối môi trường MRS có bổ sung đường vào thì tiến hành hấp vô trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó cấy giống vào, nuôi ủ từ 2-3 ngày để khảo sát quá trình lên men của vi khuẩn lactic thuộc loại đồng hình hay dị hình

Cơ sơ sinh hóa: Vi sinh vật có khả năng khác nhau trong lên men các loại

cacbohydrate khác nhau để tăng trưởng khác nhau Cacbohydrate được chia làm ba nhóm:

- Nhóm 1: Monossaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone

- Nhóm 2: Polysaccharic hay oligosaccharide

- Nhóm 3: Polyhydride alcohol và các cycitol

Các nguồn carbohydrate thường được sử dụng trong thử nghiệm lên men bao gồm:

- Glucose – Arabinose – Trehalose – Sorbitol

- Lactose – Xylose – Mannitol – Inulin

- Saccharose – Cellobinose – Inositol

Thử nghiệm idole

❖ Nguyên tắc: Nhằm phát hiện vi sinh vật có khả năng tạo vòng indole trong môi

trường canh tryptone

Thử nghiệm indole nhằm xác định vi sinh vật có khả năng tiết indole hay không

từ đó rút ra kết luận rằng vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme tryptophana hay không

Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi mốt số vi sinh vật có một hệ enzyme trytophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indole

Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic, từ đó indole được hình thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol (methyl indole) là quá trình khử cacboyl của acid indole acetic

Enzyme trytophanase xúc tác phản ưng khử amine của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indole Việc phát hiện indole được thực hiện bằng phản ứng giữa phân tử này với thuốc thử dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB) Nhân pyrrol của indole chứa nhóm –CH2 sẽ liên kết với nhân benzene của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ

❖ Tiến hành: Cấy sinh khối chủng thuần vào môi trường MRS lỏng, ủ 370C trong

24 - 48 giờ Nhỏ vài giọt Kovac’s (2 - 4 giọt) vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút,

Thử nghiệm methyl red

Môi trường được sử dụng là các ống nghiệm môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR – VP Broth) Dùng que cấy vòng lấy 1 lượng sinh khối từ khuẩn lạc thuần trên môi trường MRS cấy vào mô trường lỏng MR - VP broth, ủ 370C trong 48 giờ Bổ sung vài giọt thuốc thử metyl vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay

Thử nghiệm methyl red xác định vi sinh vật có khả năng sản xuất và duy trì acid bền có trong Glucose với chất chỉ thị là Phenol red

Cơ sở sinh hóa: Thử nghiệm Methyl red dựa trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH

là methyl red để nhận biết được ion H+ có trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men đường glucose Hàm lượng H+ có trong môi trường phụ thuộc vào tỷ lệ CO2 và H2, hàm lượng hai chất này lại phụ thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loại vi sinh vật

Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy cho thử nghiệm này từ 18-24 giờ Các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường khi chúng băt đầu phát triển

Đối với các vi sinh vật cho phản ứng methyl red âm tính, ngay ban đầu một lượng acid hình thành trong môi trường nhưng khi thời gian nuôi cấy kéo dài, chúng sẽ chuyển hóa các sản phẩm acid này bằng các phản ứng decacboxyl tạo nên các sản phẩm trung tính như cetoin làm pH môi trường trung tính

Thử nghiệm methyl red phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự khác nhau trong con đường chuyển hóa glucose Thử nghiệm này được tiến hành trong thời gian từ 2-5 ngày ở 37OC

Thử nghiệm voges proskauer

Dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường MR - VP đã hấp khử trùng 1210C/15 phút Ủ 370C trong 24 - 48 giờ Nhỏ 6 giọt α-napthol, sau đó nhỏ 2 giọt KOH 40%, lắc nhẹ Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ

Có sở sinh hóa: thử nghiệm Voges Proskauer nhằm mục đích phát hiện acetone, một sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật Ở tế bào vi sinh vật, sự phân hủy glucose tạo ra tạo thành sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đó có thể chia vi sinh vật ra thành hai nhóm theo hai con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau như sau: nhóm trao đổi không tạo thành 2, 3- butanediol như E.coli

là nhóm VP (-), và nhóm trao đồi tạo thành 2,3- butanediol, như Klebsiella là nhóm VP (+) Tuy nhiên, phản ứng VP nhằm mục đích phát hiện ra acetone là một tiền chất của

2, 3- butanediol nên trong quá trình nuôi cấy tích lũy quá ít Để dễ dàng cho quá trình phát hiện, vi sinh vật phải được nuôi cấy trong điểu kiện hiếu khí Quá trình chuyển hóa acetone và 2, 3- butanediol là quá trình thuận nghịch, có thể biểu diễn như sau:

2, 3-butanediol dehydrogennase

2, 3- butanediol acetone

Diactyl reductase

Thử nghiệm Simmon citrate

❖ Tiến hành: đun môi sôi môi trường Simmon citrate rồi phối vào ống nghiệm

đem hấp ở 121oC trong 15 phút, sau đó lấy ra để nghiên rồi cấy giống vào

❖ Kết quả: kết quả âm tính khi môi trường không chuyển màu và dương tính khi

môi trường chuyển sang màu xanh dương

❖ Cơ sở sinh hóa: Sự biến dạng citrate thông qua sự kết hợp với acetylCoA thành

lactate và CO2 giảm Ở pH trung tính, sản phẩm chủ yếu là CO2 và acetate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường

Mặt khác do vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate như là cacbon duy nhất có khả năng sử dụng muối ammonium như làm nguồn đạm duy nhất vì thế sẽ sinh ra NH3

làm kiềm hóa môi trường

Như vậy trong mỗi thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như là nguồn cacbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium sẽ làm pH môi trường tăng thể hiện trong sự chỉ thị màu của môi trường

2.3 Sơ đồ quy trình phân lập mẫu

Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn lactic 2.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được

từ ruột cá

Khảo sát khả năng kháng khuẩn

❖ Nguyên tắc: dùng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Aly and Abo-Amer,

2007) Nguyên tắc của phương pháp này chỉ dựa vào khả năng ức chế của hợp chất thứ cấp do vi khuẩn lactic sinh ra lên vi khuẩn gây bệnh

❖ Tiến hành: nuôi cấy các dòng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá trong

môi trường MRS broth trong 48 giờ, sau khi tăng sinh tiến hành hút dịch bỏ vào lỗ

thạch với thể tích 0,2 µl Các chủng vi khuẩn gây bệnh như E.coli, Salmonella,

Nhuộm gram, bào tử, thử

Giữ giống

Tiến hành thí nghiệm

Rửa cồn 70 độ Cắt mẫu Dùng que cấy ria để phân lập