Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số lactobacillus spp

HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp.. Vì khả năng tạo màng sinh học là một y

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC

CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương

TS Nguyễn Hoàng Dũng

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Tuấn Anh

MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02

TP Hồ Chí Minh, 2017

Đồ án tốt nghiệp

i

LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài: Nguyễn Tuấn Anh

Hồ Chí Minh Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hoàn toàn trung thực, không sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình thức nào Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu trích dẫn được công bố công khai trên các bài báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án

Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo này, người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tuấn Anh

TS Nguyễn Hoài Hương, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy

mà em có thể hoàn thành được tốt đồ án tốt nghiệp lần này Từ tận đáy con tim, em

xin chân thành cám ơn cô Hoài Hương

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng đã mở lòng nhận hướng dẫn em thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới (VSHND) Đây là một cơ hội cực kỳ quý báu mà thầy đã dành cho em, em xin cám

ơn thầy Dũng rất nhiều

Ngoài ra, trên VSHND em còn nhận không ít sự giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan Suốt thời gian làm việc và nghiên cứu tại VSHND, chị là người luôn bên cạnh

và nhắc nhở em rất nhiều những điều cần thiết khi thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu Em xin cám ơn chị Loan

Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người

đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt

nghiệp

Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

TP.HCM, ngày … tháng … năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tuấn Anh

Đồ án tốt nghiệp

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CÁM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 10

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 14

1.1 SÂU RĂNG 14

1.1.1 Bệnh học 14

1.1.2 Men răng 20

1.2 VI KHUẨN RĂNG MIỆNG 27

1.2.1 Streptococcus spp 27

1.2.2 Lactobacillus spp 29

1.2.3 Vi khuẩn lactic 35

1.3 MÀNG SINH HỌC 36

1.3.1 Sự hình thành 36

1.3.2 Thành phần 38

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành màng sinh học 40

1.3.4 Tính chất của màng sinh học 42

1.3.5 Phân bố 43

1.3.6 Giả thuyết về cơ chế bảo vệ răng miệng của probiotic và LAB nói chung 45

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 47

1.4.1 Ngoài nước 47

1.4.2 Trong nước 50

CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 51

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51

2.2 Vật liệu nghiên cứu 51

Đồ án tốt nghiệp

iv

2.2.1 Dụng cụ và thiết bị 51

2.2.2 Giống vi khuẩn 51

2.2.3 Hóa chất 51

2.2.4 Các phần mềm sử dụng 54

2.3 Phương pháp nghiên cứu 55

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 55

2.3.2 Thu mẫu 56

2.3.3 Tăng sinh 58

2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn lactic 59

2.3.5 Bảo quản 59

2.3.6 Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh 59

2.3.7 Định danh các chủng BG 60

2.3.8 Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của NBG 64

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65

3.1 Tình trạng răng miệng của các đối tượng thu mẫu 65

3.2 Phân lập vi khuẩn Lactic 65

3.3 Chọn lọc các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh 67

3.4 Định danh 71

3.4.1 Ly trích, thu nhận DNA 71

3.4.2 Nhân sợi DNA bằng phương pháp PCR 71

3.4.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI 72

3.5 Khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của vi khuẩn NBG đối với L fermentum 76

CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN 82

4.1 Kết luận 82

4.2 Kiến nghị 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

PHỤ LỤC BẢNG 1

PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 7

Bảng 1.3 Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc

bảo vệ răng miệng 48

Bảng 2.1 Thành phần môi trường LBS (g/l) 52 Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS (g/l) 52 Bảng 2.3 Thành phần môi trường tạo màng sinh học của Lactobacillus spp –

Lactobacillus biofilm medium (LBM) 52

Bảng 2.4 Thành phần môi trường thử khả năng lên men các nguồn

Bảng 3.5 So sánh kết quả thử khả năng lên men các nguồn carbonhydrates khác

nhau của 3 chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số loài Lactobacillus có trong kết quả hiển thị khi so sánh DNA trên ngân hàng gen NCBI 75

Bảng 3.4 So sánh độ tương đồng DNA của 3 chủng L fermentum 1B, 12R2 và

30B2 (%) 76

Đồ án tốt nghiệp

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng 15

Hình 1.2 Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng 16

Hình 1.3 Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 17

Hình 1.4 Cấu trúc của răng người 20

Hình 1.5 Các cấp kết cấu của men răng 21

Hình 1.6 Mô phỏng cột tinh thể HA 22

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C 22

Hình 1.8 Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37] 23

Hình 1.9 Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod 24

Hình 1.10 Mặt cắt dọc men răng 24

Hình 1.11 Mô tả sự hình thành lỗ khóa bởi Rod và Interrod 25

Hình 1.12 Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn bởi acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu sự ăn mòn: C: bị ăn mòn hoàn toàn 26

Hình 1.13 Cơ chế bảo vệ răng của các ion F- 26

Hình 1.14 Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp 30

Hình 1.15 Tỷ lệ các Lactobacillus spp phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu răng và của người mẹ 34

Hình 1.16 Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát tán 37

Hình 1.17 Các giai đoạn hình thành màng sinh học 38

Hình 1.18 Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các polysaccharides 39

Hình 1.19 Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử 40

Hình 1.20 Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học 44

Đồ án tốt nghiệp

viii

Hình 1.21 Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong

hồ nước nóng Mickey, Oregon 44

Hình 1.22 Cơ chế tác động của Lactobacillus spp lên những vi khuẩn trong khoang miệng 47

Hình 2.1 Mô tả phương pháp thu mẫu nước bọt 57

Hình 2.2 Một số vị trí lấy mẫu mảng bám răng 58

Hình 2.3 Dùng lực chảy của dịch môi trường để tác động lên màng sinh học 60

Hình 2.4 Mô tả giai đoạn loại bỏ protein và tủa DNA 62

Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 63

Hình 3.1 Hình thái tế bào của một số chủng trong nhóm vi khuẩn lactic phân lập được dưới vật kính 100x 67

Hình 3.2 Mật độ màng sinh học hình thành dưới đáy giếng của của 3 chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều hơn so với chủng 21B2i 68

Hình 3.3 Các ống giống khảo sát khả năng hình thành màng sinh học sau 24 giờ ủ: 70

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA của vi khuẩn đã bị gãy thành rất nhiều đoạn có kích thước khác nhau 71

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn cho 1 vệt DNA đơn và rõ hơn hẳn kết quả điện di sản phẩm tách DNA 72

Hình 3.6 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA của chủng 1B, 12R2 và 30B2 với một số các chủng khác trên ngân hàng gen NCBI 73

Hình 3.7 Hình thái tế bào của các chủng 1B, 12R2, 30B2 và L fermentum YB5 74 Hình 3.8 Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L fermentum 1B 78 Hình 3.9 Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L fermentum 12R2 78

Hình 3.10 Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên L fermentum 30B2 79

Đồ án tốt nghiệp

ix

Hình 3.11 Kết quả khả năng kháng màng sinh học của NBG lên C.albicans 79

Hình 3.12 Kết quả so sánh khả năng tạo màng sinh học của một số chủng NBG và

BG ở thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học 80

Hình 3.13 Tổng hợp khả năng kháng sự tạo thành màng sinh học của các chủng

NBG 81

Đồ án tốt nghiệp

10

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh sâu răng là bệnh khá phổ biến, gây hậu quả ở nhiều mức độ về sức khoẻ răng miệng và sức khoẻ chung Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) xếp vào loại tai họa thứ ba của loài người sau bệnh ung thư và tim mạch Tháng 5 năm 2007, tại hội nghị sức khỏe răng miệng thế giới lần thứ 60, các nước thành viên của Tổ chức Y tế Thế giới đã thông qua nghị quyết, đưa xúc tiến

và phòng ngừa bệnh sâu răng vào quy hoạch phòng ngừa và điều trị tổng hợp bệnh mãn tính Hiện nay, sức khỏe răng miệng là một trong 10 tiêu chuẩn lớn về sức khỏe theo xác định của Tổ chức Y tế Thế giới [1] Vì vậy, việc chăm sóc, dự phòng bệnh sâu răng là một vấn đề lớn được chính phủ các nước quan tâm

Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp và sâu răng đã được xác định hơn một thế

kỷ qua Một số nhà khoa học cũng đã khảo sát và nhận thấy rằng mật độ Lactobacillus

spp trong khoan miệng sẽ tăng lên sau giai đoạn đầu của bệnh sâu răng [2] Sigurjons

và cộng sự xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp trong mảng bám răng miệng chiếm

tới 62% [3] Beighton và cộng sự cũng đã tiến hành một cuộc khảo sát răng miệng ở

trẻ từ 3 - 4 tuổi, kết quả là tỷ lệ phân lập được Lactobacillus spp trong trẻ sâu răng

là 54%, trong khi ở trẻ không sâu răng chỉ chiếm 7% [4] Ngoài ra Matee và cộng sự

cũng đã nhận định trong kết quả nghiên cứu của họ rằng tỷ lệ Lactobacillus spp trong miệng trẻ sâu răng cao gấp 100 lần trẻ không sâu răng [5] Chủ yếu L fermentum là

loài chiếm đa số trong miệng của trẻ lẫn người lớn đang bị sâu răng [6] [7]

Mảng bám răng là một màng sinh học hình thành trong miệng, bao gồm nhiều loài vi sinh vật khác nhau và gắn kết với nhau bởi mạng lưới polysacchrides không tan Vì khả năng tạo màng sinh học là một yếu tố chính quyết định sự hình thành mảng bám răng, nên các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu tìm ra các mối liên hệ giữa

Lactobacillus spp và sự hình thành mảng bám răng miệng Wilcox và cộng sự đã

phát hiện ra được 2/4 chủng L salivarius và 2/3 chủng L fermentum của họ có khả năng gắn kết màng sinh học với S salivarius, S gordonii, S crista, S sanguis (một

Đồ án tốt nghiệp

11

số loài trong chi Streptococcus có khả năng gây sâu răng) [8] Filoche và cộng sự cũng đã phát hiện ra rằng, khả năng hình thành màng sinh học của các Lactobacillus

spp khi nuôi cấy đơn lẻ thì rất thấp, nhưng khi đồng nuôi cấy với một số loài

Actinomyces thì lại tăng gấp 4 – 20 lần [9]

Năm 2001, Tổ chức lương nông thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO)

đã đưa ra định nghĩa cho probiotic: “Probiotic những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ” Hầu hết các vi

khuẩn probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, chúng đã được ứng dụng

trong gần 1 thế kỷ qua [10] Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống sâu răng đang rất được chú trọng Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11] Các phương thức bảo vệ răng miệng của probiotic được giả định bởi: khả năng tiết bacteriocin, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh diện tích sống Nhưng bản chất đối kháng thực sự với các vi khuẩn gây hại trong khoan miệng của probiotic vẫn chưa được thấu hiểu

Để góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn tìềm năng mới có thể ứng dụng để phòng ngừa bệnh sâu răng, đồng thời khảo sát khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn chi

Lactobacillus, nhóm thực hiện đồ án sẽ bước đầu phân lập một số vi khuẩn lactic

trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của các

Lactobacillus spp có trong mảng bám răng miệng

2 Tình hình nghiên cứu

Nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động

của vi khuẩn lactic trong khoang miệng Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic có khả năng này [12], khiến cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung

và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn

Đồ án tốt nghiệp

12

Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L acidophilus và L casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp khác và Streptococcus mutans

trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần

sử dụng [13] Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên

men pho – mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho – mát có thể

giảm được tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [14]

Tại Việt Nam, hiện tại chỉ có duy nhất TS Nguyễn Thị Mai Phương (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam) là đang tập trung nghiên cứu về vấn đề bảo vệ răng miệng, nhưng chủ yếu là các hợp chất thứ cấp ức chế

Streptococcus mutans như: Alpha-mangostin ức chế sự hình thành biofilm của vi

khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans UA159; Ethyl acetate extract from

(Rhodomyrtus tomentosa (Aliton) Hassk) leaves inhibits acid production and biofilm

formation by Streptcocccus mutans; H2O2 inhibits NADH oxidase activity purified

from streptococcus mutans, [15] [16]

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập các vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự hình

màng sinh học của Lactobacillus spp

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát mức độ sâu răng ở một nhóm đối tượng

- Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng

- Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic trong răng miệng

- Chọn ra các chủng có khả năng tạo màng sinh học mạnh có khả năng là tác nhân

gây sâu răng Định danh các chủng, chọn ra chi Lactobacillus

- Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic lên các

Lactobacillus spp phân lập được

5 Phương pháp nghiên cứu

- Thu mẫu răng miệng của 30 đối tượng từ 11 hộ gia đình Bên cạnh đó ghi nhận tình trạng răng miệng của các đối tượng

Đồ án tốt nghiệp

13

- Phân lập vi khuẩn lactic trên môi trường LBS thông qua việc quan sát hình thái tế bào, khuẩn lạc, các thử nghiệm sinh lý (khả năng di động, khả năng sinh bào tử)

và các thử nghiệm sinh hóa (catalase)

- Khảo sát khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa 96 giếng, từ đó phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh để chọn làm tác nhân gây sâu răng

- Tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lactic nghi ngờ có khả năng gây sâu răng, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R

- Gửi mẫu giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa

- Dựa vào hình thái kết hợp với kết quả thử nghiệm sinh hóa trước đó để định danh chính xác các chủng này

- Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của

Lactobacillus spp được thực hiện bằng phương pháp đồng nuôi cấy vi khuẩn lactic

và Lactobacillus spp trong môi trường LBM trên đĩa giếng 96 Màng sinh học

trong các giếng sẽ được nhuộm bằng Crystal violet, và định lượng bằng phương pháp đo mức độ hấp thụ màu tím ở bước sóng 570 nm

6 Các kết quả đạt được

- Từ 60 mẫu thu răng miệng đã chọn lọc ra được 30 chủng vi khuẩn lactic

- Chọn lọc được 3 chủng lactic có khả năng tạo màng sinh học mạnh

- Kết quả định danh 3 chủng 1B, 12R2, 30B2 đều thuộc loài L fermentum

- Chọn ra được 11 chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ít nhất 1 trong 4 vi

khuẩn gây sâu răng được khảo sát (3 chủng L fermentum phân lập được và nấm

Candida albicans)

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

- Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [17]

- Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khoáng xen kẽ nhau [18]

1.1.1.2 Lịch sử

Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [19] Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn

Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đó là sâu răng Cuối thế kỷ 19, với dự đoán : nếu một người sống

đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990) Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa Gần 50% trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ súng răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn 20% [20]

Đồ án tốt nghiệp

15

Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư)

1.1.1.3 Dấu hiệu và triệu chứng

Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [21] Khi các thương tổn tiếp tục diễn

ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu

Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong nước bọt Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [22]

Hình 1.1 Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng

Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước Lúc này tủy răng và mạch máu

có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt

Đồ án tốt nghiệp

16

Hình 1.2 Giai đoạn tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng

Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu) Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, … đe dọa đến tính mạng của người bệnh

1.1.1.4 Nguyên nhân

Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [23] Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, … Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose

Đồ án tốt nghiệp

17

Hình 1.3 Mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng

1.1.1.4.1 Vi khuẩn

Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có

khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus

sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus

Đặc tính để quyết định rằng vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [24]

Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng Nhưng nếu không trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám Lúc này mật độ của những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và gây sâu răng Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng

Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua việc bú sữa mẹ, hành động móm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [25]

Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose Dù rằng sucrose

là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose Lý do là vì

vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide bởi enzyme dextransucranase

n sucrose  (glucose) n + n fructose

1.1.1.4.3 Thời gian

Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa Vì thế sự khử khoáng gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp

1.1.1.4.4 Răng

Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng Sự khử khoáng bắt đầu xảy

ra khi pH môi trường đạt 5.5 [26] Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [27]

Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của cá thể Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [28] Nguyên nhân có thể là do yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị, bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng,… cũng ảnh hưởng đáng kể

Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt

để mảng bám vi khuẩn Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy Hơn nữa chỉ có nha sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mỗ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn

Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến Phương pháp này thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả năng diệt khuẩn [32] Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí

vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng

Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt) Ngoài ra trái cây,

Đồ án tốt nghiệp

20

rau quả còn có nhiều chất sợi (fiber) tác động làm sạch răng Bên cạnh đó có thể dùng đường xylitol thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn không thể lên men được xylitol Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển

Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian mà men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp

Nếu phải uống soda, cam chanh thì nên dùng ống hút, tránh tráng điều trong miệng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng) Nên súc miệng ngay sau ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid

Trong những năm gần đây, ứng dụng vi khuẩn probiotic vào công cuộc chống sâu răng cũng đang rất được chú trọng Một số các thử nghiệm lâm sàng trên động vật đã khẳng định được khả năng bảo vệ răng miệng của probiotic [11] Hứa hẹn cho một ứng dụng mới mẻ và đầy tiềm năng của probiotic

1.1.2 Men răng

Men răng là một trong bốn

vùng mô chính cấu tạo nên răng ở

người và nhiều động vật khác (các

vùng mô còn lại là ngà răng,

cementum và nướu răng) Men

răng có màu trắng, bao quanh toàn

bộ thân răng, là tổ chức cứng nhất

cơ thể do sự tạo khoáng hóa cao

độ Men răng làm lớp bảo vệ vững

chắc cho răng, nhưng vẫn có thể

bị suy thoái bởi acid thì thức

ăn/nước uống

Hình 1.4 Cấu trúc của răng người

Đồ án tốt nghiệp

22

HA kết tinh trong hệ tinh thể lục

giác (hình 1.2) Mỗi tinh thể

hydroxyapatite là một thành phần cơ

bản gồm 18 ion (hình 1.3), hình lục

giác dẹp cạnh 0,942 nm tạo góc 120o

và 60o, chiều cao (trục c) thẳng góc với

trục a và cao 0,688 nm, các đơn vị này

liên kết trồng lên nhau tạo thành cột

tinh thể hydroxyapatite [34] [35] [36]

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc lục giác của HA khi nhìn dọc theo hướng trục C

Hình 1.6 Mô phỏng cột tinh thể HA

Đồ án tốt nghiệp

23

Hình 1.8 Hình chụp cột tinh thể dưới kính hiển vi điện tử [37]

Khoảng trống nhỏ giữa những cột tinh thể là chất hữu cơ có chức năng liên kết Cột tinh thể HA là đơn vị nhỏ nhất của men răng, có độ lên tới 160 nm và rộng 15-

20 nm Tâm lục giác của cột là nơi dễ bị acid ăn mòn Mặt bên và mặt chóp cũng có thể bị phân hủy [38]

1.1.2.1.2 Rod

Khoảng 100 cột tinh thể xếp sát nhau, kết tinh hướng dần về mặt men, tạo thành một khối lăng trụ, gọi là một đơn vị Rod, đường kính khoảng 4-8 µm Rod chạy khắp vùng men, bắt đầu từ đường nối men ngà đến bề mặt của men Các Rod bắt đầu phát triển theo hướng vetor gần như vuông góc với mặt ngà, sau đó phát triển theo kiểu lượn sóng đến gần bề mặt ngoài của men răng và lại đi thẳng một lần nữa cho đến hết cho đến hết Vì thế độ dài các rod lớn hơn rất nhiều so với độ dày men Men răng được hình thành bởi các Rod song song với nhau, 5 triệu ở răng cửa, 12 triệu ở răng hàm [39]

Đồ án tốt nghiệp

24

Hình 1.9 Hình vẽ mô tả hướng phát triển của các rod

1.1.2.1.3 Interrod

Các cột tinh thể xếp sát nhau nhưng không tụ thành từng trụ như Rod, được xem

là vùng phân cách các rod ra, gọi là Interrod Rod và Interrod tuy có cùng đơn vị cấu thành nhưng hướng tâm trụ thì khác nhau (tức các tinh thể phát triển theo hướng khác nhau), vì thế ở mặt cắt dọc bề mặt men răng ta dễ dàng thấy được sự phân cách giữa vùng Rod và Interrod Đồng thời sự phân cách này tạo nên hình như một lỗ khóa ở

mặt cắt men răng – gọi là lỗ khóa (keyhole) Mỗi cao keyhole cao khoảng 9µm

Trong đó phần thân là Rod và đuôi là Interrod [39]

Hình 1.10 Mặt cắt dọc men răng

1.1.2.3 Cấu trúc hữu cơ

Chất căn bản hữu cơ của men răng chiếm 2 - 4% trọng lượng men răng ở người lớn Trong đó thành phần protein chiếm 58%, lipid 40%, nước 2% Amino acid cấu tạo nên protein chủ yếu là: glycine, glutamique, serine và aspartique; phosphoproteine Thành phần lipide chính là phospholipide và phospholipoprotein [39]

1.1.2.4 Sự khử khoáng ở men răng

Tâm trụ HA nơi dễ diễn ra quá trình khử khoáng nhất vì gốc OH- thường xuyên

bị phơi nhiễm với môi trường bên ngoài Dần dần các Rod và Interrod sẽ bắt đầu rỗng khiến cho cấu trúc men không còn bền vững, dễ bị phá vỡ hơn bởi ngoại lực Khi bị

răng, nước súc miệng,

không nên súc lại bằng

nước quá nhiều lần vì

như thế cuốn trôi đi hết

hoàn toàn

Đồ án tốt nghiệp

27

Khoang miệng là không gian có rất nhiều bề mặt tiếp xúc, ở đó mỗi bề mặt sẽ tồn tại một lượng lớn vi sinh vật Có hơn 700 loài vi khuẩn trong khoang miệng người, nhưng chỉ mới 50% trong số chúng là đã được phân lập [41] Đa số chúng có khả năng gây nên các bệnh đường miệng, điển hình là sâu răng và nha chu Tại Mỹ, có ít nhất 35% người lớn trong độ tuổi từ 30 đến 90 mắc bệnh nha chu [42] Ngoài ra, một

số vi khuẩn nguy hiểm hơn còn gây nên các bệnh: viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, viêm phổi, viêm tủy xương, sinh non, sinh thiếu ký, tim mạch [41] Rất hiếm vi khuẩn răng miệng có tác động tích cực đến sức khỏe của con người

Môi trường dinh dưỡng trong khoang miệng người tương đối đầy đủ để nhiều loại vi sinh vật phát triển [43] Chúng cư trú trong miệng chủ yếu bằng cách tạo mảng bám trên vỏ mô cứng (men răng) và mô mềm (nướu) trong khoang miệng để tránh bị nuốt vào trong dạ dày Khả năng bám dính này đặc biệt quan trọng đối với các vi sinh vật đường miệng

Các chi vi khuẩn kị khí tồn tại trong khoang miệng gồm: Actinomyces, Arachnia,

Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Leptotrichia, Peptococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Selenomonas, Treponema và Veillonella [44] Ngoài ra còn có sự có mặt của các loại nấm: Candida, Cladosporium, Aspergillus, Fusarium, Glomus, Alternaria, Penicillium và Cryptococcus [45]

1.2.1 Streptococcus spp

1.2.1.1 Giới thiệu chung

Hệ vi sinh vật trong khoang miệng cực kỳ đa dạng và sự phát triển của tất cả

các chúng phụ thuộc rất chặt chẽ vào sự có mặt của những Streptococcus spp – những loài dễ hình thành màng sinh học nhất Vì thế vai trò của Streptococcus spp trong

việc gây nên các bệnh răng miệng đã được các nhà khoa học nghiên cứu rất kỹ càng Mảng bám răng khi vừa mới hình thành ở giai đoạn đầu chiếm tới 80%

Streptococcus spp [46] Streptococcus spp trong khoang miệng được chia thành 5

Đồ án tốt nghiệp

28

nhóm khác nhau: (1) nhóm Mutans (Streptococcus mutans và Streptococcus

sobrinus); (2) nhóm Salivarius (Streptococcus salivarius); (3) nhóm Anginosus

(Streptococcus anginosus và Streptococcus intermedius); (4) nhóm Sanguinis (Streptococcus sanguinis và Streptococcus gordonii); (5) nhóm Mitis (Streptococcus

mitis và Streptococcus oralis) [47] Trong đó đáng chú ý đến nhất là Streptococcus mutans, loài này đã được xác minh là tác nhân chính gây sâu răng [48]

1.2.1.2 Streptococcus mutans – tác nhân chính gây sâu răng

Streptococcus mutans là một nguyên nhân chính gây sâu răng, được mô tả lần

đầu tiên bởi James Kilian Clarke năm 1924 khi ông đang nghiên cứu về bệnh mục xương Nhưng mãi đến những năm 1960 thì người ta mới biết tác hại chính của loài này khi bắt đầu nghiên cứu về bệnh sâu răng

S.mutans phân hủy đường và tiết ra dextran ngoại bào làm tăng dộ bám lên răng

Nhờ enzyme dextransucrase thông qua phản ứng:

n sucrose  (glucose) n + n fructose

Kế đó fructose sẽ được S mutans chuyển hóa làm nguồn năng lượng, cơ chất

để phát triển Glucose sẽ được chúng polymer hóa thành polysaccharide ngoại bào

(dextran) làm tăng độ nhớt Và sucrose là nguồn đường duy nhất mà S mutans dùng

để tổng hợp dextran S mutans còn có khả năng phân hủy dextran thành lại glucose

để sử dụng khi điều kiện khắc nghiệt

Người ta cho rằng S.mutans có được gen tạo màng bám dính là từ các vi khuẩn lactic khác, chẳng hạn như Lactobacillus spp

1.2.1.3 Ổ sinh thái trong khoang miệng

Lượng S.mutans có trong miệng người lớn nhiều hơn trẻ em, nhưng trẻ em thì lại dể bị tác động hơn S.mutans được truyền từ cha mẹ sang trẻ sơ sinh qua đường nước bọt, điển hình nhất là việc móm ăn cho trẻ S.mutans có tự nhiên trong đường

miệng của con người song song với ít nhất 25 loài khác thuộc nhóm streptococci răng miệng Các vi sinh vật nhóm streptococci này vừa có loài gây hại, vừa có loài vô hại

Đồ án tốt nghiệp

29

Tuy nhiên, nêu gặp điều kiện đặc biệt (sự mất cân bằng sinh thái vi khuẩn) thì chúng

có khả năng gây bệnh cơ hội

Nguyên tắc phân loài trong nhóm này còn trong tiến độ thực hiện Các khu vực khác nhau trong xoang miệng sẽ có các loài khác nhau, để tương ứng với các mặt sinh thái khác nhau

S.mutans có thể chung sống ôn hòa với Streptococcus sobrinus trong khoang

miệng, chúng cùng chi và cùng là tác nhân gây sâu răng Về mặt lâm sàng thì trong các xét nghiệm không cần phân biệt 2 loài này Do đó, chúng thường được gộp chung lại thành một nhóm gọi là mutans streptococci (số nhiều, không in nghiêng vì chưa phải là tên chính thức)

S.mutans là thường gặp nhất trong các rãnh nứt răng hoặc lỗ sâu và chiếm 39%

tổng vi sinh vật nhóm streptococci trong khoang miệng Ở những nơi khác trong khoang miệng chúng chỉ chiếm 2 – 9%

1.2.2 Lactobacillus spp

1.2.2.1 Đặc điểm chung

1.2.2.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào

Lactobacillus spp là những vi khuẩn gram dương, với kích thước bộ gen khoảng

1.23 đến 4.91 Mb, tỷ lệ GC từ 31.93% đến 57,02% [49] Tế bào của chúng có hình que dài, mảnh hoặc hình que ngắn uốn cong, tế bào thường liên kết tạo thành chuỗi

Khuẩn lạc của Lactobacillus spp trên môi trường thạch có đường kính 2 – 5

mm, bề mặt lồi, mịn, lấp lánh, màu trắng đục (trong một số ít trường hợp chúng có màu vàng hoặc đỏ) Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid Khi được nuôi cấy

trong môi trường lỏng, Lactobacillus spp phát triển đều khắp môi trường Sau khi

chết, tế bào của chúng sẽ chìm xuống đáy, tạo thành lớp bột mịn đồng nhất, hiếm khi vón cục hoặc nhớt [50]

Đồ án tốt nghiệp

30

Hình 1.14 Một số kiểu hình thái của Lactobacillus spp

A, Lactobacillus gasseri; B, Lactobacillus agilis; C, Lactobacillus curvartus; D,

Lactobacillus minor; E, Lactobacillus fermentum; F, dạng xoắn của Lactobacillus

spp trong hạt kefir [50].

1.2.2.1.2 Đặc điểm sinh lý

Lactobacillus spp thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi Các loài trong chi

không có khả năng di động, không sinh bào tử

Phổ nhiệt tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhưng tối ưu ở khoảng 30 – 40oC Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, nhưng vẫn có thể chịu được mức pH 5.0 hoặc thấp hơn Tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện

Đồ án tốt nghiệp

31

pH môi trường trung tính hoặc kiềm Vì Lactobacillus spp có khả năng chịu được

môi trường có pH cao, nên việc tiết ra acid lactic chính là yếu tố cạnh tranh của chúng đối với những vi khuẩn khác trong cùng một môi trường

Thường được tìm thấy trong các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa, ngũ cốc, thịt,

cá, bia, rượu, trái cây, nước trái cây, rau củ muối chua, bã thực phẩm, dưa cải bắp, cỏ

ủ, bột nhào chua, nước, đất, chất thải Chúng cũng xuất hiện trong cơ quan sinh dục

nữ, khoang miệng, hệ tiêu hóa ở người và nhiều động vật khác Đây là những môi trường được cung cấp thường xuyên nguồn carbohydrate và một số chất dinh dưỡng khác Chính là nơi thích hợp để chúng thực hiện các phản ứng lên men và cho ra sản phẩm chính là acid lactic [50]

1.2.2.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Lactobacillus spp âm tính với thử nghiệm nitrate, một số trường hợp hiếm

dương tính chỉ xảy ra khi pH môi trường cân bằng ở 6.0 trở lên hoặc bổ sung sắc tố

đỏ heme bào môi trường nuôi cấy Không có khả năng phân giải gelatin, casein Thử nghiệm Indole, Citrate và khả năng sinh H2S âm tính Thử nghiệm catalase âm tính

Lactobacillus spp thường sinh ra mùi đặc trưng khi có mặt trong thực phẩm

Một nửa sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là lactate Ngoài ra quá trình lên men còn sinh các sản phẩm khác như là: diacetyl, acetic acid, và acetaldehyde Bên cạnh đó quá trình dị hóa amino acid sẽ sinh ra H2S, amines, hợp chất carbonyl, cresol, skatol, benzaldehyde, và methanethiol Tất cả những sản phẩm của quá trình trao đổi chất này đã tạo ra nhiều loại hương đặc trưng của sản phẩm lên men

Lactobacillus spp thường không có khả năng gây bệnh, ngoài trừ một số ít

trường hợp có bệnh tiềm ẩn bởi khả năng sinh ra acid khử khoáng men răng [50]

Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng

chia thành hai dạng Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp từ nucleotide Homopolysaccharides chủ yếu

được tổng hợp từ loài lên men dị hình như L pontis, L frumenti, L sanfranciscensis,

Đồ án tốt nghiệp

32

và L reuteri Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L kefiranofaciens, L delbrueckii subsp

bulgaricus, L paracasei, L rhamnosus, L helveticus, và L sakei [50]

1.2.2.2 Ổ sinh thái trong khoang miệng

Mối quan hệ giữa Lactobacillus spp và sâu răng đã được xác định hơn một thế

kỷ qua Lactobacillus spp được tìm thấy trong miệng của trẻ còn đang bú sữa mẹ

nhiều hơn là trẻ bắt đầu bú bình [51] Sau khi cai sữa và trước khi mọc răng, không

dễ dàng để để tìm thấy Lactobacillus spp trong miệng trẻ [52]

Một khi răng được hình thành, kéo theo sự xuất hiện của nhiều khe hở, rãnh tạo điều kiện thích hợp cho sự neo bám của vi khuẩn Năm 1944, qua nghiên cứu của

Harrison và Opal đã xác định được tỷ lệ Lactobacillus spp phân lập ra từ mẫu nước

bọt được là 93% và mẫu phân là 66% (mẫu được lấy từ trẻ em bị sâu răng) Từ đây

họ cũng kết luận rằng, Lactobacillus spp hiện diện xuyên suốt từ đường miệng cho đến đường ruột Các nghiên cứu ở trẻ dưới 6 tuổi cũng cho thấy, Lactobacillus spp

hầu như chỉ có mặt trong những đối tượng bị sâu răng [53] [54] Năm 2010, Yang và

cs đã xác định rằng không có sự hiện diện của Lactobacillus spp trong mẫu mảng

bám răng và từ kẽ răng của những trẻ em không bị sâu răng [55] Một nghiên cứu gần

đây đã cho rằng, Lactobacillus spp cũng không xuất hiện trong khoang miệng của người lớn không bị sâu răng [56] Tóm lại, sự xuất hiện của Lactobacillus spp trong

khoang miệng trẻ là bắt nguồn từ sữa mẹ Trẻ em không bị sâu răng thì tỷ lệ

Lactobacillus spp trong khoang miệng ở mức cực tiểu Sự hiện diện của Lactobacillus spp trong khoang miệng sẽ quyết định sự hiện diện chúng ở đường

ruột

Các loài Lactobacillus chiếm đa số trong cả khoang miệng của người lớn và trẻ

em là L fermentum, L rhamnosus, L gasseri, L casei / paracasei, L salivarius, L

plantarum Chiếm tỷ lệ thấp hơn là L oris và vaginalis Và cực hiếm là L mucosae,

L crispatus, L ultunesis, L reuteri, L gastricus, và L parabuchneri, nhưng những

loài này chỉ xuất hiện với tỷ lệ 20%, nên người ta đưa ra giả định rằng những loài này

Đồ án tốt nghiệp

33

chỉ vô tình xâm nhiễm vào khoang miệng thông qua thực phẩm, mà không đóng bất

cứ vai trò gì trong việc gây sâu răng Hầu hết các loài đều tồn tại song song trong một quần thể vi sinh vật Riêng L fermentum, L casei/paracasei, và L salivarius thì có

thể tồn tại độc lập trong khoang miệng của đối tượng đang bị sâu răng nghiêm trọng

[57] Một số loài Lactobacillus được phân lập được sữa mẹ gồm có: L.rhamnosus, L

Caufield và

cs (2007)

Obata và cs (2014)

Nước bọt và mảng bám

L casei L casei L gasseri L gasseri

L casei L salivarius L casei L salivarius L gasseri L oris L paracasei

L salivarius L gasseri L gasseri L gasseri L paracasei L vaginalis L crispatus

L paracasei L oris L ultunensis L vaginalis L

Teanpaisan và cs (2012)

London, Anh Songkhla, Thái Boston, MA, Mỹ New York, NY,

Mảng bám Nước bọt Mảng bám Nước bọt và lỗ

sâu răng

Nước bọt của những trẻ có mẹ

bị sâu răng

L plantarum L rhamnosus L gasseri L rhamnosus L rhamnosus

L rhamnosus L mucosae L fermentum L casei L mucosae

L casei L salivarius L casei/paracasei L salivarius L plantarum

L fermentum L casei/paracasei L oris L casei/paracasei

1.2.2.3 Lactobacillus fermentum

Là một loài trong chi Lactobacillus được tìm thấy trong các sản phẩm lên men

từ thịt cũng như rau củ quả, trong khoang miệng và trong sữa mẹ Chúng có mối quan

hệ mật thiết đến bệnh sâu răng ở người [59] [60] [61]

Hình 1.15 Tỷ lệ các Lactobacillus spp phân lập được trong miệng của trẻ bị sâu

răng và của người mẹ [62]

Đồ án tốt nghiệp

35

Tuy vậy nhưng một số chủng trong loài đã được xét vào nhóm probiotic và đã

được thương mại hóa sản phẩm đó là: Lactobacillus fermentum ME-3, Lactobacillus

fermentum PCC, Lactobacillus fermentum CECT5716

Một đặc tính probiotic đáng chú ý của loài này là khả năng tạo màng sinh học bám dính chặt chẽ trên thành ruột không cho các mầm bệnh khác neo bám chung [63]

Lactobacillus fermentum được phân lập trong răng miệng đều có thể tạo màng sinh

học, bởi việc sở hữu đoạn gen glucosyltransferases (Gtf) tổng hợp nên glucans (thành

phần gắn kết trong màng sinh học) [64] Aoudia và cộng sự đã phát hiện ra rằng L

fermentum cũng có thể hình thành màng sinh học trên bề mặt không sinh học [65] L fermentum có thể gắn kết với chất nhầy của cả bao tử và đường ruột bởi khả năng

tổng hợp nên 1 loại protein 32-Mmubp [66]

Ngoài ra, các chủng L fermentum cón có khả năng cộng sinh với S gordonii và

S sanguis trong màng sinh học, tăng khả năng sinh màng cho cả cộng đồng vi khuẩn

và khả năng lên men các loại carbohydrate khác nhau để phân nhóm LAB Bốn chi

vi khuẩn được công nhận là LAB gồm có: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus

và Streptococcus [68]

1.2.3.2 Ổ sinh thái trong khoang miệng

LAB trong khoang miệng bao gồm một nhóm các loài thuộc chi Lactobacillus,

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus và Weissella Nhưng chủ

yếu Streptococcus spp và Lactobacillus spp là chiếm ưu thế Lactobacillus spp được phân lập ra từ khoang miệng nhiều nhất là L fermentum và L salivarius [69]

Đồ án tốt nghiệp

36

Vai trò bảo vệ răng miệng của LAB gần đây đang được quan tâm nghiên cứu, chủ yếu nghiêng về hướng tìm ra đặc tính probiotic của LAB Chúng không gây tác động tiêu cực lên bất cứ vùng mô nào trong khoang miệng, chúng có khả năng tồn tại lâu dài trong khoang miệng với khả năng tạo màng sinh học, bên cạnh đó tổng hợp nên một số chất kháng khuẩn hoặc trực tiếp tranh giành chất dinh dưỡng để ức chế các mầm bệnh khác Cho đến nay đã có một vài thử nghiệm lâm sàng chứng minh

được tiềm năng bảo vệ răng miệng của một số loài gồm L rhamnosus, L reuteri, L

Đồ án tốt nghiệp

37

Hình 1.16 Sự thay đổi về cấu trúc của màng sinh học khi bước qua giai đoạn phát

tán A, mạng lưới EPS đóng vai trò bảo vệ hệ vi sinh vật trong nó khỏi các tác nhân

bên ngoài như độc tố (kháng sinh), các tế bào nguyên sinh, các bacteriophage Mạng lưới EPS còn giữ được các chất dinh dưỡng, ổn định nồng độ các phân tử gradient (oxy), chất thải độc hại đối với tế bào (nitric oxide), tính hiệu giữa các tế bào vi khuẩn

B, giai đoạn phân tán tế bào bắt đầu chuyển sang dạng phù du và di chuyển dần ra

khỏi màng Bên cạnh đó còn có sự xuất hiện của các biến thể vi khuẩn, các siêu bacteriophage do các qua trình trao đổi vật chất di truyền phức tạp trong màng sinh

học [72]

Đồ án tốt nghiệp

38

Hình 1.17 Các giai đoạn hình thành màng sinh học

1.3.2 Thành phần mạng lưới polymer ngoại bào (EPS)

EPS là các polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống xung quanh chúng EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của màng sinh học [73] EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu

cơ của một màng sinh học [74] EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác

Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra,

mà còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic [75] Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [76]

Đồ án tốt nghiệp

39

Hình 1.18 Mô tả mạng lưới EPS ngoại bào và các lực tương tác giữa các

polysaccharides A, mạng lưới chính gồm các thành phần polysaccharides, protein và

DNA phân bố giữa các tế bào một cách không đồng nhất, tạo nên các vùng có tính

chất vật lý khác nhau B, các lực tương tác hóa lý và sực dày đặc của polysaccharides

quyết định độ ổn định của EPS [77]

EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau EPS chính là chìa khóa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học EPS còn có chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn [78]