Phân lập vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym llactete oxidase

DANH MỤC BẢNGBảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic Bảng 2.1 Các test sinh hóa khi định danh vi khuẩn lactic...28Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn lacti

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic

Bảng 2.1 Các test sinh hóa khi định danh vi khuẩn lactic 28Bảng 3.1 Bảng kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi khuẩn lactic phân lập

Bảng 3.2 Kết quả phản ứng màu khi định lượng LOX của các chủng LAB được phá

vỡ màng tế bào bằng phương pháp Lysozym 45Bảng 3.3 Bảng kết quả định lượng LOX của các chủng LAB của các chủng vikhuẩn LAB được phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp Acetone-SDS 46Bảng 3.4 Bảng kết quả định lượng enzym của các chủng LAB của các chủng vi khuẩn LAB được phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp Lysozym

Bảng 3.5 Kết quả định danh nhóm LAB lên men đồng hình nhóm A

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử của LOX từ A viridans

Hình 1.9 Vị trí ion Zn giữa hai tetramer của L-lactate oxidase

Hình 3.1 Các chủng vi khuẩn được làm thuần trên môi trường MRSA

Hình 3.2 Hình thái vi thể của một số chủng LAB

Hình 3.3 Phản ứng màu khi định tính LOX của các chủng LAB được phá vỡ màng

tế bào bằng phương pháp Acetone-SDS 41Hình 3.4 Phản ứng màu khi định tính LOX của các chủng LAB được phá vỡ màng

tế bào bằng phương pháp Lysozyme

Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường HHD

Hình 3.6 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MRSA 1% CaCO3

Hình 3.7 Hình dạng vi thể của các chủng vi khuẩn lactic

Hình 3.8 Thử nghiệm catalase đối chứng

Hình 3.9 Thử nghiệm oxidase đối chứng

Hình 3.10 Định tính acid lactic bằng thuốc thử Unphenment mẫu (+)

Hình 3.11 Định tính acid lactic bằng thuốc thử Unphenment mẫu (-)

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

E coli Escherichia coli

HHD Môi trường Homofermentative heterofermentative

MRS Môi trường deMan Rogosa and Sharpe

MRSA Môi trường deMan Rogosa and Sharpe agar

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lactate là một chất chuyển hóa chính được hình thành từ quá trình trao đổichất kị khí của glucose trong cơ bắp Khi lượng lactate được tạo ra đủ cao sẽ gây rahiện tượng nhiễm toan lactic (Kemp, 2005), các bệnh lý liên quan đến cường lactatehay các bệnh lý do thiếu hụt oxy như suy tim, suy hô hấp, suy thận, thiếu máu cấp,nhồi máu cơ tim…Vì vậy, việc kiểm soát nồng độ lactate là một trong những chỉ sốsinh hóa đóng vai trò vô cùng quan trọng Sự tích lũy của lactate trong cơ thể có thể

do nhiều lí do khác nhau như quá trình chuyển hóa acid pyruvate sinh ra trong quátrình đường phân của tế bào hoặc từ thức ăn, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩmlên men (Carr, 2002)

Trong những năm gần đây đa số nghiên cứu về lactate tập trung vào mối quan

hệ của lactate đối với khối u Một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đến từnhiều trường đại học đã phát hiện lactate-chất tuần hoàn tích tụ trong mô và máu,gây cứng cơ và cản trở quá trình trao đổi chất là một trong những tác nhân khiến tếbào ung thư phát triển mạnh và đẩy nhanh tốc độ di căn của các khối u ác tính trong

cơ thể người bệnh (Joanne và cs, 2013) Trong nghiên cứu mới này, các nhà nghiêncứu đã phần nào làm sáng tỏ vai trò của lactate trong quá trình hình thành các mạchmáu mới trong khối u, cách thức chất này can thiệp vào hệ miễn dịch của cơ thểphản ứng với các tế bào ung thư cũng như cách thức lactate hình thành môi trường

vi mô có tính acid hay một khu vực bên ngoài tế bào ung thư, có thể đẩy nhanh tốc

độ di căn của khối u ác tính (Hirschhaeuser, 2011) Vì vậy việc kiểm soát hàmlượng lactate là rất quan trọng

Trong sự hiện diện của oxy hòa tan, L-lactate oxidase xúc tác quá trình oxy hóacủa L-lactate thành pyruvate và tạo thành hydrogen peroxide (Haccoun và cs,2004) LOX là nguyên liệu của các cảm biến sinh học được dùng để phát hiện vàđịnh lượng lactate (Palmisano, 2000) L-lactate oxidase lần đầu tiên được phát hiện

ở chủng vi khuẩn Streptococcus pneumoniae vào năm 1959 (Udaka và cs, 1959).

Enzym này được dùng để phát hiện lactate trong máu của các bệnh nhân có bệnh lýliên quan đến việc thiếu hụt oxy như xuất huyết cấp tính, nhồi máu cơ tim, thiếumáu oxy cấp… (Biryukova và cs, 2009) L-lactate oxidase được tìm thấy ở nhiều vi

sinh vật nhất là ở các chủng vi khuẩn thuộc các loài như Aerococcus viridans (Yorita và cs, 1996), Pseudomomas sp (Gu và cs, 2002) Ở các chủng vi khuẩn lactic như Streptococcus iniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Seki và cs, 2004), (Taniai và cs, 2008), Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris (Toda và cs, 1998) Ngoài ra nó còn được tìm thấy ở nấm men Yarrowia lipolytica (Biryukova và cs, 2009) và nấm mốc Goetrichum candidum (Kupletskaya và cs, 2007), (Sztajer và cs, 1996).

Hiện nay trên thế giới, L-lactate oxidase đã được tinh chế và thương mại hóabởi các công ty hóa chất như Sigma, Genzym Diagnostic… dùng làm nguyên liệucho cảm biến sinh học để phát hiện và kiểm soát hàm lượng lactate Tuy nhiên, ởViệt Nam vẫn chỉ có rất ít nghiên cứu về L-lactate oxidase Chính vì vậy, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh L-lactate oxidase”.

 Mục tiêu nghiên cứu:

Sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh L-lactate oxidase

 Nội dung thực hiện:

− Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên men truyền thống

− Định tính khả năng sinh enzym L-lactate oxidase

− Xác định hoạt tính enzym L-lactate oxidase

− Định danh chủng bằng phương pháp sinh hóa

−

ỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC

1.1.1 Giới thiệu

LAB (tên gọi chung của nhóm vi khuẩn lactic) đóng vai trò quan trọng đối vớisức khoẻ con người, được sử dụng khá nhiều trong công nghiệp là chế phẩm sinhhọc an toàn cho con người (David, 2013)

Nhóm vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động,không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm tính, oxydase âm tính Những vi khuẩnnày không có khả năng sản xuất những hợp chất cần thiết để tồn tại và phát triển,cho nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, basenucleotic, nhiều loại vitamin…, bình thường chúng không có cytochrome Vì vậy,chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi hoặc gọi là vi hiếu khí, vikhuẩn có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí (Kenneth,1990)

Nhóm vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào nhiềuyếu tố môi trường như: pH, nhiệt độ và sự tích lũy các sản phẩm chuyển hóa Chúngđòi hỏi các vitamin như: thimine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic và các acidamin Do đó, người ta thường nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trên môi trườngchứa một lượng tương đối cao nấm men, nước chiết cà chua, nước chiết giá, caothịt… (Kenneth, 1990)

LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và

động vật LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005)

Giống I: Lactobacillus Giống II: Pediococcus

Họ II: Enterococceae Giống: Enterococcus

Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc

Họ IV: Streptococcaceae Giống I: Streptococcus Giống II: Lactococcus

Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau Tế bào của chúng

có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus hoặc hình que như Lactobacillus Theo Kandler và Welss (1986), nhóm vi khuẩn lactic còn được bổ sung thêm vi khuẩn Bifidobacterium Ngoài ra

dựa vào khả năng lên men người ta chia LAB thành hai nhóm LAB đồng hình vàLAB dị hình (Kenneth, 1990)

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic

Giống

Tế bào

Kiểu lên men GC%DNA Tài liệu dẫn

Hìnhdạng Sắp xếp

Streptococcus Cầu Chuỗi Lactic đồnghình 34 - 46 Schleifer, 1986

Leuconostoc Cầu Chuỗi Lactic dị hình 36 - 43 Farrow và cộng

sự, 1989

Pedicoccus Cầu Tụ cầu Lactic đồnghình 34 - 42 Schleifer, 1986

Lactobacillus Que (tetrade)Chuỗi Lactic đồnghình và dị

Nhiềuhìnhdạng

Lên menlactic và lênmen acetic 55 - 67

Kandler vàWelss, 1986Scardovi, 1986

1.1.2.1 Giống Streptococcus

Theo Trivisan năm 1889 giống Streptococcus thuộc họ Streptococcaceae,

thuộc lớp vi khuẩn Gram (+) bao gồm các cầu khuẩn lên men lactic đồng hình (trừmột số ít loài) theo con đường hexose diphosphate tạo sản phẩm chủ yếu là acidlactic D (+), bất động (trừ một số ít loài), đường kính cầu khuẩn 0,5 - 1µm, sau khiphân chia theo một phương chúng tạo thành một chuỗi, sống hoại sinh trong đất, bềmặt cây, da người, ruột (Kenneth, 1990)

Hình 1.2 Leuconostoc

a: Leuconostoc dưới kính hiển vi điện tử b: Leuconostoc nhuộm Gram

(Nguồn: Internet)

Giống Pediococcus gồm những tứ cầu hoặc dạng song cầu, đường kính 1,0 –

2,0µm, lên men lactic đồng hình, hình thành acid lactic dạng DL hoặc dạng L (+)

Phần lớn Pediococcus không có khả năng sử dụng lactose vì vậy không làm acid hóa và đông tụ sữa Các loài Pediococcus khác nhau bởi tính chịu nhiệt, chịu pH,

chịu NaCl và phổ lên men đường (Kenneth, 1990)

Hình 1.5 Pediococcus

a: Pediococcus dưới kính hiển vi điện tử b: Pediococcus nhuộm Gram

(Nguồn: Internet)

1.1.2.6 Giống Lactobacillus

Giống Lactobacillus là giống lớn nhất trong 13 giống vi khuẩn sinh acid lactic

với hơn 100 loài được mô tả bởi Hugenholtz (1998)

Lactobacillus là những trực khuẩn có kích thước 0,5-1,2 x 1,0-10,0µm, không

sinh bào tử, không di động thuộc lớp vi khuẩn Gram dương Những trực khuẩn này

thường dạng que dài, mảnh hay dạng ngắn (coccobacilli) đứng riêng lẻ hoặc thành

chuỗi Trên môi trường agar, chúng thường tạo khuẩn lạc lồi, đục, mép trơn, đườngkính 2-5mm (Kenneth, 1990)

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, ở điều kiện 5-10% CO2

Lactobacillus phát triển mạnh trên môi trường MRSA, thuỷ phân đường saccharose

mạnh, hình thành acid lactic dạng D, L hoặc DL, không có catalase và cytochrome

oxydase Lactobacillus thu nhận năng lượng từ sự lên men carbonhydrate và sản

phẩm chuyển hóa cuối cùng chiếm hơn 50% lactate, còn lại là acetate, formate,succinate, CO2, ethanol (Kenneth, 1990)

Lactobaccillus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp về amino acid, peptide, các

dẫn xuất nucleic acid, vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồncarbonhydarte Nhiệt độ phát triển từ 5-53oC, nhiệt độ tối ưu là 30-40oC Chúng

phát triển tốt ở pH 5,0 và pH tối ưu là 5,5-5,8 Lactobacillus được tìm thấy trong

các sản phẩm sữa, thịt, hạt, nước, nước thải, bia, rượu vang, nước ép trái cây, hoaquả, dưa chua và một số cơ quan trong cơ thể như: miệng, âm đạo, hệ thống dạ dày-ruột người và động vật (Kenneth, 1990)

Giống Lactobacillus chia thành 3 nhóm:

 Nhóm I: Thermobacterium, lên men đồng hình và ưa nhiệt Không một

pentose hay gluconate nào được chủng lên men Những vi khuẩn này cófructose-1,6- diphosphate aldolase, phát triển ở 45oC

 Nhóm II: Streptobacterium, đây là những trực khuẩn lên men đồng hình và

ưa ấm, nhiều loài trong nhóm này có khả năng lên men dị hình, vì vậy nhómnày được gọi là nhóm lên men đồng dị hình Các hexose được lên men theocon đường EMP thành acid lactic, nhưng các pentose có thể được phân giải

nhờ con đường lên men dị hình để tạo thành acid lactic, acid acetic dophosphocetolase được cảm ứng.

 Nhóm III: Betabacterium, là những vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc.

Chúng sinh ra acid lactic, acid acetic, CO2 và ethanol Những vi khuẩn này

có phosphocetolase nhưng không có aldolase (Isolauri và cs, 1991)

Giống Lactobacillus gồm nhiều loài được sử dụng làm probiotic, lợi ích của

nhóm này đã được công nhận bằng nhiều công trình nghiên cứu Một trong nhữngứng dụng tiềm năng nhất là trong điều trị bệnh tiêu chảy, bệnh này do rotavirustrong đường ruột gây nên… (Isolauri và cs, 1991) Nhóm tác giả Isolauri (1991) đã

chứng minh Lactobacillus casei có khả năng làm giảm thời gian bị bệnh tiêu chảy

do Rotavirus Nghiên cứu của nhóm tác giả Shornikowa và cộng sự (1997) cũng

cho kết quả tương tự

Bifidobacterium là những trực khuẩn kỵ khí không sinh bào tử, Gram (+), bất

động Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thể phân nhánh có dạng chữ

Y, V, tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy chuyền chúng trở thành trực khuẩnthẳng hoặc hơi uốn cong với những hạt dự trữ nhuộm màu bởi xanh methylen

(Bauman và cs, 1994) Trước đây chúng được đặt trong nhóm Lactobacillus, nhưng theo Bergey’s (1986) chúng được tách thành giống riêng mang tên Bifidobacterium

và xếp vào họ Actinomycetaceae lên men lactic dị hình, sản phẩm chính của chúng

là acid acetic và acid lactic, cùng với lượng nhỏ acid formic, ethanol, acid succinic.Khác biệt với các vi khuẩn khác là chúng không sinh CO2, catalase âm, nitratedương, indole và gelatine âm Chúng không hình thành acid từ các đườngrhamnose, sorbose, adonitol, dulcitol, erythritol và glycerol Chúng là vi khuẩn ưa

ấm (31 – 41oC), không chịu được pH 4,5 – 5,0 Đây là nhóm vi sinh vật chính trong

hệ tiêu hóa chiếm 25% trong tổng số vi sinh vật ở người trưởng thành và trên 95% ởtrẻ sơ sinh (Bauman và cs, 1994)

Theo Gibson và Roberforid (1995) những tiềm năng của Bifidobacteria đối

với sức khoẻ con người như: hạ mức ammoni trong máu, làm giảm lượngcholesterol trong máu Chúng có tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch bởi những

tế bào ác tính, ngăn chặn sự phát triển những bệnh truyền nhiễm tiềm năng do tạo rađược lactate, acetate và tác dụng cân bằng hệ vi sinh đường ruột do sử dụng khángsinh lâu dài Về mặt dinh dưỡng, chúng sản sinh ra các loại vitamin nhóm B,vitamin K và acid folic được hệ thống ruột hấp thu lại cho cơ thể (Tanaka và cs,1999)

Hình 1.7 Bifidobacterium

a: Bifidobacterium dưới kính hiển vi điện tử b: Bifidobacterium nhuộm Gram

(Nguồn: Internet)

1.1.3 Sản phẩm của quá trình lên men lactic

Các vi khuẩn khác nhau về khả năng sinh ra acid lactic, là hỗn hợp của haiđồng phân quang học dạng D-lactic và L-lactic Chúng phụ thuộc vào sự hiện diệncủa lactate dehyrogenase và racemase (Badet, 2008)

Lactic acid có hai đồng phân quang học vì nguyên tử cacbon trung tâm liênkết với bốn nhóm khác Đồng phân L-(+) lactic acid hay (S)- lactic acid và đồngphân còn lại là D-(-) lactic acid hay là (R)- lactic acid (Badet, 2008)

Hình 1.9 Đồng phân quang học D-lactic acid và L-lactic acid ( Badet, 2008)1.1.4 Ứng dụng LAB

Vi khuẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men cónguồn gốc động vật hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng,cảm quan và cải thiện tuổi thọ sản phẩm Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợpchất kháng khuẩn Trong đó, việc sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọngnhất Tuy nhiên một số chủng vi khuẩn lactic còn được biết đến bởi việc sản sinhcác phân tử có hoạt tính sinh học như ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogenperoxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin,… Nhiều giống cũng sản sinh cácbacteriocin và những phân tử thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương tự bacteriocin(Devuyst và Leroy, 2007)

Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quátrình lên men ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng Sự chuyển hoálactose nhờ nuôi cấy vi khuẩn lactic đã làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hoá hơn.Nhiều hoạt tính biến dưỡng và enzym của LAB dẫn đến sự sản xuất các chất dễ bayhơi hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng cho sản phẩm lên men Các giống

của LAB chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus,

Teragenococcus, Vagococcus, Weisella… Một vài giống quan trọng như: Lactobacillus sp, Lactococcus sp, Leuconostoc sp, Streptococcus sp, Pediococcus

sp, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee và cs, 1999).

1.2 TỔNG QUAN LACTATE

Lactate là kết quả sự phân ly của acid lactic, là một chất chuyển hóa nội bàoglucose, đặc biệt là sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân kị khí glucose, từchuyển đổi pyruvate thành lactate bởi enzym lactate dehydrogenase (LDH), tích tụtrong trường hợp thiếu oxy và mệt mỏi Lactate trong dịch thể và mô, phản ánh các

mô cục bộ có ở trong trạng thái bị thiếu oxy không Trong tình trạng thiếu oxy cấptính, nồng độ lactate cao được tìm thấy trong cơ tim của thai nhi, đại não, ở một số

cơ quan: thận, gan, ruột, phổi Do đó, phát hiện lactate nhanh, dễ và chính xác làđiều quan trọng để chẩn đoán bệnh và quản lý sức khoẻ Chẳng hạn như thiếu máu

cơ tim, tổn thương não và suy hô hấp (Qianwei, 2017)

Có nhiều nguyên nhân gây tăng lactate nhưng phổ biến nhất là tăng sản xuấtlactate từ thủy phân kị khí glucose do giảm oxy đến tế bào mô (thiếu oxy mô).Thiếu oxy do mô là kết quả của quá trình truyền dịch không đủ và làm giảm lượngoxy trong máu (thiếu oxy huyết), là một đặc điểm chung của nhiều loại bệnh tậtquan trọng, việc đo hàm lượng lactate được sử dụng nhiều nhất để theo dõi oxy hoá

mô ở các bệnh nặng (Higgins và cs, 2010)

Trong cơ thể người, nồng độ L-lactate máu dao động trong khoảng 0.5 – 1.5

mM khi ở trạng thái nghỉ ngơi và có thể tăng đến 12 mM khi vận động (Martin1990), thậm chí nó có thể đạt mức 25 mM khi tập các bài tập toàn thân trong nhữngđiều kiện đặc biệt (Gibello, 1999) Nồng độ lactate trong huyết tương đòi hỏi sự kếthợp một cách hài hòa giữa các yếu tố có ảnh hưởng đến sự cân bằng giữa lượnglactate được tạo ra và lượng lactate bị đào thải Nếu sự cân bằng này bị phá vỡ sẽgây ra hiện tượng nhiễm toan lactic Lượng acid lactic được tạo ra có thể tăng trongbất kì trường hợp nào có liên quan đến quá trình trao đổi chất kị khí như sốc do mấtmáu hoặc nghẽn mạch phổi (Valenza, 2005) Nồng độ lactate cũng có thể tăng ở cáctrường hợp bệnh lý như tim mạch, sốc nhiễm độc, suy hô hấp, bệnh gan, rối loạnchức năng, suy thận, giảm oxy máu ở mô (Rassaei và cs, 2013) Có thể nói, đối

với ngành y tế chỉ số lactate đóng vai trò như một thiết bị phát tín hiệu trong chẩnđoán tình trạng hô hấp của bệnh nhân Tầm quan trọng của việc xác định chỉ sốlactate trong chăm sóc y tế đã được chứng minh bằng thực tế Chỉ số lactate máu đã

từ lâu được sử dụng như một chỉ tiêu quan trọng trong cả thể thao và y tế (Lại ThịHồng Nhung, 2013)

Không chỉ có ý nghĩa trong thể thao và y tế, việc xác định chỉ số lactate trongcông nghiệp thực phẩm và sản xuất rượu vang cũng rất được chú ý Chỉ số lactatecho biết độ tươi, tính ổn định và chất lượng của các sảm phẩm thực phẩm như sữa,các sản phẩm khác từ sữa, hoa quả, thịt, rau củ (Naylor và cs, 2012) Trong côngnghiệp sản xuất rượu vang, thường diễn ra quá trình lên men acid malic, khi acidmalic bị chuyển hóa thành acid lactic sẽ dẫn đến việc giảm độ acid tổng và cả vịchát của rượu (Lloret và cs, 2002) Bởi thế việc giám sát liên tục nồng độ lactatetrong suốt quá trình lên men có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với chất lượng rượu.Hơn thế, lactate natri còn được dùng như một chất bảo quản thực phẩm(Stekelenburg và cs, 2001)

Một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ đến từ nhiều trường đại học đã pháthiện lactate - chất tuần hoàn tích tụ trong mô và máu gây cứng cơ và cản trở quátrình trao đổi chất là một trong những tác nhân khiến tế bào ung thư phát triển mạnh

và đẩy nhanh tốc độ di căn của các khối u ác tính trong cơ thể người bệnh (Joanne

Trong tất cả các động vật có xương sống, bao gồm cả con người, dạng lactate là chất có ý nghĩa sinh học L-lactate là dạng đặc biệt được đo bằng cảm biếnlactate trong các máy phân tích khí máu và thường dùng để đo lactate trong phòngthí nghiệm lâm sàng Các phương pháp thông thường dùng để đo lactate huyếttương dựa trên việc đo lường sản phẩm của hoạt động enzym đối với lactate Mộttrong hai loại enzym thường được sử dụng cho các phân tích này: lactatedehydrogenase, có nguồn gốc từ mô động vật và lactate oxidase có nguồn gốc từ vikhuẩn (Pascal và cs, 2009) So với lactate Oxidase thì lactate dehydrogenase có thờigian phản hồi chậm và phức tạp hơn (Eithne, 1992).

L-1.3 TỔNG QUAN L-LACTATE OXIDASE

L-lactate oxidase (LOX) có mã số trong hệ thống phân loại enzym là EC1.13.12.4 LOX là một enzym flavin có chứa nhân flavin mononucleotide (FMN)với đường kính trung bình 5 nm (Haccoun và cs, 2004), có thể thu được từ một loạt

các vi khuẩn nguồn, chẳng hạn như Pediococcus, Aerococcus viridans, và Mycobacterium smegmatis Trong sự hiện diện của oxy hòa tan, L-lactate oxidase

xúc tác quá trình oxy hóa của L-lactate thành pyruvate và tạo thành hydrogenperoxide trong phản ứng sau:

L-lactate + O2 Pyruvate + H2O2

L-lactate oxidase được tìm thấy ở nhiều vi sinh vật nhất là ở các chủng vi

khuẩn thuộc các loài như Aerococcus viridans (Yorita và cs, 1996), Pseudomomas

sp (Gu và cs 2002), ở các chủng vi khuẩn lactic như Streptococcus iniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (Seki và cs 2004; Taniai và cs, 2008), Lactococcus lactis subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris (Toda và

Nishiya, 1998) Hiện tại trong GenBank có hơn 1500 trình tự gen L-lactate oxidase

(LOX) từ các vi sinh vật khác nhau Trong đó, LOX từ Aerococcus viridans được

quan tâm nghiên cứu nhiều hơn cả Lox từ các chủng của loài này đã được tách

dòng, tinh chế, xác định tính chất Enzym tái tổ hợp của Aerococcus viridans hiện

đã được thương mại hóa trên thị trường bởi các công ty hoá chất như SigmaAldrich, Genzym Diagnostic Enzym này bao gồm 374 acid amin, có khối lượngphân tử 44 kDa L-lactate, D-lactate, glycolate được xác định là cơ chất đặc hiệucủa LOX dưới sự tham gia của FMN (Flavin mononucleotide)

LOX của chủng Lactoccocus lactis subsp cremoris IFO3427 đã được tinh

sạch và nghiên cứu tính chất Điểm đẳng điện của enzym được xác định khoảng 4,3

± 0,2 Enzym từ chủng này nhiều đặc điểm tương đồng như enzym từ Aerococcus viridans, nhưng nó chỉ có khả năng chuyển hóa L-lactate chứ không thể chuyển hóa

được D-lactate (Toda và Nishiya, 1998)

LOX có khối lượng phân tử 44.000Da và sử dụng FMN làm cofactor, đặc hiệu cao đối với L-lactate, D-lactate, glycolate và D, L-2-Hydroxybutyrate không bị oxy hoá bởi LOX LOX bị bất hoạt khi ủ với bromopyruvate ( Pernet , 2008).

Cấu trúc tinh thể của LOX được công bố lần đầu tiên năm 1998 bởi Morimoto

Đến năm 2006, cấu trúc 2.1 Å của LOX từ Aerococcus viridians cũng đã được xác

định và công bố Trong cấu trúc của LOX 8 tiểu phần protein (A, B, C, D, E, F, G,H) gắn kết với nhau tạo thành 2 tetramer thể hiện cấu trúc không đối xứng củaenzym Sự tiếp xúc giữa các tinh thể protein tạo nên các vùng liên kết với kim loạigiữa 2 tetramer (Hình1.8) những vùng này sẽ bị loại bỏ trong quá trình biểu hiện vàtinh sạch protein

Hình 1.8 Cấu trúc phân tử của LOX từ A Viridans (Leiros và cs, 2006)

Bốn tiểu phần protein gắn kết với nhau tạo nên cấu trúc của phân tử LOX thểhiện một nửa không đối xứng của enzym

Hình 1.9 Vị trí ion Zn giữa hai tetramer của L-lactate oxidase

Ion kim loại gắn kết 2 acid amin là Glu229 và His233 của tiểu đơn vị D và E (Leiros và cs, 2006)

Vùng liên kết FMN của L-lactate oxidase có vị trí tương tự như ở glycolateoxidase, nó nằm sâu bên dưới vùng cơ chất dạng phễu, bên cạnh hoặc ở dưới cơchất khi nó bị giới hạn Trong cả 8 tiểu phần L-lactate oxidase cofactor FMN bị uốn

cong khoảng 15º quanh các nguyên tử trung tâm, tạo thành hình dạng chữ U chonhóm flavin (Leiros và cs, 2006).

1.4 ỨNG DỤNG CỦA LOX ĐỂ CHẾ TẠO BIOSENSOR

1.4.1 Khái quát về biosensor

Biosensor hiện đang là một trong những hướng nghiên cứu nhận được nhiều

sự chú ý của các nhà khoa học trên thế giới Được công bố lần đầu tiên trên thế giớibởi Clark và Lyons vào năm 1962 (Palmisano, 2001), biosensor là sự kết hợp giữamột thành phần sinh học (enzyme, axit nucleic, tế bào, kháng thể) và bộ cảm biếnhóa lý để nhận biết, phân tích một chất nào đó (Palmisano, 2000) Nói cách khác,biosensor là thiết bị phân tích chuyển đổi một phản ứng sinh học thành tín hiệu(Hình 1.10) Thuật ngữ "biosensor" thường được sử dụng chung cho các thiết bịcảm biến dùng để xác định nồng độ các chất và các thông số khác liên quan đếnsinh học, ngay cả khi không sử dụng trực tiếp một hệ thống sinh học (Park, 1997)

*Nguyên lý hoạt động của biosensor:

Chất cần phân tích trong mẫu sẽ đi vào điện cực, sau đó thấm qua màng ngoàicủa biosensor Thành phần sinh học trong bộ thụ cảm (Bioreceptor) sẽ phản ứng vớicác chất cần phân tích và tạo ra các đáp ứng mà bộ biến năng (Transducer) có thểphát hiện và chuyển nó thành tín hiệu điện Tín hiệu điện này sẽ được khuếch đại và

xử lý thông qua hệ thống điện tử (Parra, 2006)

Hình 1.3: Cấu tạo một biosensor (Parra, 2006)

1.4.2 Lactate biosensor

Trước đây L-lactate thường được xác định trong phòng thí nghiệm bằngphương pháp quang phổ Tuy nhiên, phương pháp này lại bộc lộ nhiều nhược điểmnhư giá thành cao, kỹ thuật phức tạp Do đó, để đáp ứng với nhu cầu xác định chỉ sốlactate trong các lĩnh vực, đòi hỏi phải phát triển một hệ thống gồm các lactatebiosensor có khả năng phân tích nhanh nhạy, chính xác, độ đặc hiệu cao nhưng nhỏgọn, dễ sử dụng và giá thành thấp (Parra, 2006)

Lactate biosensor có thể được thiết kế trên L-lactate oxidase hoặc L-lactate

dehydrogenase Thậm chí, cytochrome b 2 và lactate monooxygenase cũng từngđược sử dụng là nguyên liệu để chế tạo lactate biosensor ở quy mô nhỏ hơn Trong

đó, L-lactate oxidase luôn là lựa chọn hàng đầu bởi cơ chế hoạt động của nó đơngiản, nhạy cảm, phù hợp với nhiều phương pháp thiết kế và dễ dàng tìm thấy ởnhiều nguồn vi sinh vật Phương pháp được sử dụng để thiết kế biosensor từ L-lactate oxidase rất đa dạng như phương pháp thẩm thấu (Rahman, 2010), xuyên quamàng (Rassaei, 2013), liên kết cộng hóa trị (Sambrook, 1989), tạo thành dạng

polymer (Seidman, 1997), hoặc cố định enzyme trên các mạng lưới sol-gel (Stanley,1985) Ngoài ra, các phương pháp dựa vào sự phân tích sức phun của dòng chảy(Stekelenburg, 2001) hoặc đóng vai trò là chất xúc tác (Sztajer, 1996), hoặc liên kếtvới các hợp chất khác trong quá trình oxy hóa khử cũng đã được tiến hành thửnghiệm cho kết quả rất khả quan (Taniai, 2008).

Khi lactate biosensor tiếp xúc với mẫu phân tích, với sự có mặt của oxy hòatan, L-lactate oxidase sẽ xúc tác quá trình oxy hóa L-lactate thành pyruvate vàhydrogen peroxide Trong phản ứng điện hóa này, sự suy giảm nồng độ oxy cùngvới quá trình oxy hóa hydrogen peroxide sẽ làm thay đổi hiệu điện thế và do đó cóthể phát hiện bằng thiết bị chuyên dụng (Taurino, 2013)

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2013, nhóm tác giả Lại Thị Hồng Nhung thuộc Viện hàn lâm khoa học

và công nghệ Việt Nam - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật đã nghiên cứu thànhcông tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cho L-lactate oxidase của chủng

Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 trong Escherichia coli Đã tuyển chọn

được 2 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp L-lactate oxidase cao làchủng VLSH-12 và VLSH-18 với hoạt độ lần lượt là 51,3492 U/ml enzym và40,3549 U/ml enzym Từ các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, Kit phân loạiAPI 50 CHL và trình tự gen 16S rRNA đã định tên được chủng VLSH-12 là

Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 và chủng VLSH-18 là Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii VLSH-18 Đã nhân dòng và giải trình tự gen LOX của chủng Lactococcus lactis subsp lactis VLSH-12 Gene có kích thước 1152 bp,

mã hóa cho 384 amino acid, có độ tương đồng 98 - 100 % so với các gene Lox của

các chủng Lactococcus lactis subsp lactis khác được công bố trên GenBank.

1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Năm 1959 Udaka và cộng sự đã phát hiện đầu tiên L-lactate oxidase ở chủng

vi khuẩn Streptococcus pneumoniae Ephrussi-Taylor (1954) đã mô tả một tác nhân

biến đổi phế cầu khuẩn mà tác giả gọi là các tác nhân LC (khuẩn lạc lớn), vì đầu

tiên được công nhận tác dụng là để tăng kích thước các khuẩn lạc phế cầu khuẩnphát triển trên môi trường thạch máu Tác giả cũng cho thấy huyền phù tế bào củaphế cầu có chứa tác nhân LC có khả năng giảm hô hấp trong sự hiện diện củaglucose, không bị oxy hóa lactate và sản xuất ít H2O2 trong quá trình oxy hóaglucose hơn so với các cầu phổi bình thường mà không có tác nhân này Tác nhân

LC xuất hiện nhằm mục đích để mô tả enzym LOX Nhóm tác giả mô tả một phầntinh sạch của lactic oxidase từ phế cầu khuẩn, và cung cấp bằng chứng cho thấy nó

là một flavoprotein điển hình và cho thấy rằng nó không xuất hiện trong các chủngkhuẩn lạc lớn (Udaka và cs, 1959)

Năm 1989, Duncan và nhóm cộng sự đã tinh sạch và xác định tính chất của

L-lactate oxidase của Aerococcus viridans L-L-lactate oxidase được tinh sạch từ các tế bào của Aerococcus viridans sử dụng ammonium sulfate phân đoạn, sắc ký DEAE

Sepharose CL-6B, và Sephadex G-100 sắc ký, đồng nhất bởi SDS-polyacrylamidegel electrophoresis Enzym này là một tetramer với một tiểu đơn vị trọng lượngphân tử 44.000 và sử dụng FMN như một cofactor LOX là enzym đặc hiệu với L-lactate, bị bất hoạt khi ủ với bromopyruvate (Duncan và cs, 1989)

Năm 2006, Leiros và nhóm cộng sự đã nghiên cứu thành công cấu trúc của

L-lactate oxidase của Aerococcus viridans Cấu trúc tinh thể của L-L-lactate oxidase (LOX) từ Aerococcus viridans đã được xác định tại độ phân giải 2.1 A˚ LOX xúc

tác mononucleotide flavin (FMN) oxy hóa lactate thành pyruvate và hydrogenperoxide LOX thuộc về nhóm hydroxy acid oxidase flavoenzyme LOX kết tinhgồm hai tetramer nén chặt trong đơn vị bất đối xứng (Leiros và cs, 2006)

ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 2 năm 2017 tháng 06 năm 2017tại phòng thí nghiệm vi sinh 01 – Cơ sở 3, Trường Đại Học Mở – Tp Hồ Chí Minh

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường

2.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, máy đo OD,

tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lò viba, bộ lọc,…

Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette,micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, que cấy trang, đũa khuấy,kéo, kẹp sắt,…

2.1.2.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất: Ethanol 70°, ethanol 96°, NaCl, NaOH 2M, HCl 2M, PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride), K2HPO4, KH2PO4, DMA (N,N-dimethylaniline),4-AAP (4-Aminoantipyrine), đĩa giấy oxidase…

Thuốc nhuộm: tím kết tinh (Crystal Violet), Lugol, Safranin O

Thuốc thử: Catalase (H2O2 5%), Gress A, Gress B, Methyl Red, Phenol Red,Unphenment …

Môi trường: môi trường MRSA, môi trường MRS, môi trường lên men sinhtổng hợp L-lactate oxidase, môi trường HHD (homofermentativeheterofermentative), môi trường Arginine, môi trường khử nitrat, môi trườnggelatin

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Sơ đồ thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu của đề tài được thực hiện theo

sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

2.2.2 Quy trình thu mẫu

Chúng tôi thu nhận các mẫu thực phẩm lên men tự nhiên (cải muối chua, kimchi muối chua, măng muối chua, nem chua) tại chợ Thủ Dầu Một

Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm đến nhóm vi khuẩn lactic (LAB)được phân lập và chọn lọc từ hệ vi sinh vật đa dạng trong nhóm mẫu thực phẩm lênmen mà chúng tôi chọn

Th

LàN

Th

Th

Đị

LAB được phá vỡ màng tế bào

bằng phương pháp acetone-SDS LAB được phá vỡ màng tế bàobằng phương pháp Lysozym

ĐịĐịnh lượng khả khả năng sinh enzym L-lactate

oxidaseĐịnh danh chủng vi khuẩn bằng sinh hóa

2.2.3 Phân lập và làm thuần vi khuẩn

2.2.3.1Nguyên tắc

Do CaCO3 sẽ tan khi phản ứng với acid vì vậy có thể xác định sơ bộ khả năngsinh acid của giống phân lập bằng cách dựa vào vòng phân giải trong suốt xungquanh khuẩn lạc khi chủng được cấy trên môi trường MRSA bổ sung 1% CaCO3(Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002)

− Giống thu đuợc nuôi trên môi trường MRS và giữ giống trên môitrường MRSA

2.2.4 Nhuộm Gram

2.2.4.1 Nguyên tắc

Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và vách tế bào Gram (-) làm cho khảnăng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau giữa hai nhóm vi khuẩn này.Dựa vào đặc điểm này người ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn (Nguyễn Đức Lượng

− Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây, sau đó rửa nước Phủ hoàn toàn vết bôi vớiSafranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước.

Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sátdưới kính hiển vi với vật kính dầu (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2013)

2.2.4.3 Kết quả

− Tế bào vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím

− Tế bào vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng

− Vi khuẩn có bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu (Nguyễn Đức Lượng và

cs, 2013)

2.2.5 Thử nghiệm catalase

2.2.5.1 Nguyên tắc

Các vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy nghi chứa chuỗi điện tử có cytochrome

đều có enzym catalase (trừ các Streptococcus spp) Enzym này là một trong những

enzym có vai trò bảo vệ tế bào khỏi những tổn thương bởi những dẫn xuất độc tínhcao của oxi phân tử trong tế bào Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng nănglượng theo phương thức là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử,tạo H2O2 Catalase sẽ thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2 ngănchặn sự tích tụ của các phân tử có độc tính cao này trong tế bào (Trần Linh Thước

Thử nghiệm: Dương tính (+) có bọt khí do O2 tạo ra

Âm tính (-) không có sủi bọt khí

Thử nghiệm đối chứng: Dương tính (+) Staphylococcus aureus.

Âm tính (-) Streptococcus fecalis (Trần Linh Thước

và cs, 2005)

2.2.6 Thử nghiệm oxidase

2.2.6.1 Nguyên tắc

Các loài vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym oxidase Enzym này phản ứngvới N-Dimethyl-Para phenylenediamine được tẩm trong đĩa giấy làm đĩa giấychuyển sang màu tím đen (Trần Linh Thước và cs, 2005)

Thử nghiệm: Dương tính (+) khi đĩa giấy chuyển sang màu tím đen

Âm tính (-) đĩa giấy không đổi màu

Thử nghiệm đối chứng: Dương tính (+) Bacillus cereus

Âm tính (-) Streptococcus (Trần Linh Thước và cs, 2005).

2.2.7 Định tính acid lactic của các chủng phân lập bằng thuốc thử

Cấy vi khuẩn đã làm thuần vào môi trường MRS Ủ 37oC, 5% CO2 trong 48h

Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút, thu dịch trong bên trên

Tiến hành đồng thời 3 ống đối chứng (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002):

− Ống 1: 0,3ml acid lactic tinh khiết + 0,2ml thuốc thử unphenment

− Ống 2: 0,3ml môi trường MRS + 0,2ml thuốc thử unphenment

− Ống 3: 0,3ml môi trường MRS nuôi E.coli + 0,2ml thuốc thử

Unphenment

2.2.7.3 Kết quả

Quan sát sự đổi màu của thuốc thử chọn ra những chủng có khả năng sinh raacid Màu vàng càng đậm chứng tỏ acid lactic tạo ra càng nhiều (Nguyễn Lân Dũng

và cs, 2002)

2.2.8 Phương pháp định tính enzym LOX

2.2.8.1 Giai đoạn 1: thu enzym

Vi khuẩn lactic được làm giàu trên môi trường MRS qua đêm ở 37ºC trước khilên men 100ml trong bình tam giác để xác định khả năng sinh tổng hợp LOX củachúng điều kiện 37oC trong 48h

Sử dụng 1ml dịch lên men ly tâm 12000 vòng/10 phút ở 4oC, thu cặn tế bào.Rửa tế bào trong 1ml NaCl 0,85%, ly tâm 12000 vòng/10 phút/4oC, thu cặn tế bào.Đệm phosphate 0,01M pH 7 được thêm vào mẫu để đạt giá trị OD 600 bằng 1.PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) được thêm vào mẫu đến nồng độ 1mM,mẫu được giữ ở nhiệt độ 0-5oC (Luis và cs, 2005) Sau đó tiến hành so sánh kết quảphá màng tế bào bằng 2 phương pháp sau:

 Các chủng LAB được phá vỡ màng tế bào bằng phương pháp Acetone-SDS:

- Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp tán sóng siêu âm ở điều kiệnnhiệt độ không đổi Tán siêu âm 6 lần, mỗi lần tán 30 giây Trước các lầntán siêu âm, mẫu phải đạt nhiệt độ 0-5oC

- Mẫu sẽ được ủ lạnh 5 phút trong 10 ml acetone-SDS lạnh (được giữ ở-20oC) Mẫu được tiến hành ly tâm ở 12000 vòng/10 phút/4oC, thu dịchnổi, phần dịch bên trên được thu thập sau khi đã loại bỏ tế bào (Bhaduri

- Mẫu được tiến hành ly tâm ở 12000 vòng/10 phút/4oC, thu dịch nổi

2.2.8.2 Giai đoạn 2: phản ứng của enzym xúc tác

Theo Lockridge và cộng sự năm 1972 phản ứng của enzym được thực hiệnnhư sau:

− Chuẩn bị hỗn hợp A gồm 1ml POD 50U/ml; 1ml 4-AAP 0,015M; 1mlacid lactic 0,05M; 3ml nước cất.

− Hút 0,8ml A và 0,2ml DMA 0,2% vào ống nghiệm trộn đều bằng máyvortex

− Cho tiếp 0,02ml dịch nổi thu được vào, trộn đều bằng máy vortex ủ

37oC 10 phút

− Hút 2ml DBS 0,25% vào để ngừng phản ứng, trộn đều bằng máy vortexHoạt tính L-lactate oxidase được xác định theo phương pháp quang phổdựa trên phản ứng:

Kết quả: Dương tính (+): xuất hiện màu tím

Âm tính (-): không đổi màu

2.2.9 Định lượng hoạt tính enzym LOX bằng phương pháp quang phổ

Một đơn vị hoạt tính L-lactate oxidase được định nghĩa là một lượng enzymoxy hóa 1 µmole L-lactate thành pyruvate và H2O2 trong một phút ở 37oC, pH 7 Dovậy, hoạt độ L-lactate oxidase được tính theo công thức: (Lockridge và cs, 1972)

Trong đó:

− 3,02: Tổng thể tích phản ứng

− Df: Hệ số pha loãng

− 35,33: Hệ số hấp thụ mol của Quinonediimine dye ở bước sóng 565nm

− 0,5: Hệ số chuyển hóa từ 1 mol H2O2 thành một nửa molQuinonediimine dye

− 10: Thời gian phản ứng (phút)

− 0,02: Thể tích dịch enzym sử dụng để xác định hoạt tính (Lockridge và

cs, 1972)

Đo OD từ kết quả định tính dương ở bước sóng 565nm ghi nhận kết quả Tính

hoạt độ enzym theo công thức trên Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử

lý thống kê ANOVA một yếu tố

2.2.10 Định danh

Các chủng được chọn lọc được định danh phương pháp sinh hóa theo khóa

phân loại The Prokaryote- A Handbook on the Biology of Bacteria và Bergey’s

Bảng 2.1 Các test sinh hóa khi định danh vi khuẩn lactic

Phát triển pH4,5Phát triển pH 5 Glucose Fructose Arabinose

15/450C ArginineNH3 từ Amydalin Cellobiose

15/450C ArginineNH3 từ Arabinose Cellobiose

Melezitose Melibiose Raffinose SucroseXylose

2.2.10.1 Phân nhóm LAB đồng hình và dị hình.( Martin và cs, 2006)

2.2.10.1.1 Nguyên tắc

Vi khuẩn lactic đồng hình lên men hexose tạo nhiều acid lactic hơn so với vi

khuẩn lên men dị hình Sử dụng môi trường HHD (homofermentative

heterofermentative) có chứa 0,25% fructose làm nguồn carbohydrate duy nhất để

nuôi cấy tạo nên sự khác biệt khoảng một đơn vị pH hoặc nhiều hơn Chất nhận biết

pH là bromcresol green Trên môi trường HHD, khuẩn lạc của vi khuẩn lactic lênmen đồng hình có màu xanh dương đến màu xanh lá cây Khuẩn lạc của vi khuẩnlactic lên men dị hình có màu trắng.

2.2.10.1.2 Cách thực hiện

Cấy ria vi khuẩn lactic vừa hoạt hóa trên môi trường MRSA ở 37oC / 5% CO2

từ 18-24h trên môi trường HHD Ủ ở 37oC / 5% CO2

2.2.10.1.3 Kết quả

Phân nhóm vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình

− Nhóm A: lên men đồng hình bắt buộc

− Nhóm B: lên men dị hình không bắt buộc

− Nhóm C: lên men dị hình bắt buộc

2.2.10.2 Khả năng lên men các loại carbohydrate