PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA

Chính vì các lý do trên, đề tài luận án: “Phân lập vi khuẩn kết tụ sinh học, khử nitơ, photpho và ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy sữa” được thực hiện nhằm tìm ra các dòng vi khuẩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

-

BÙI THẾ VINH

PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG

XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA

CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62 - 42 - 40 - 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Năm 2012

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CAO NGỌC ĐIỆP

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, ĐHCT

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1 Bùi Thế Vinh, Phan Thanh Quốc, Cao Ngọc Điệp 2010 Phân lập và

nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trong chất thải sữa và

ứng dụng trong xử lý nước thải Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A),

pp 805 – 809

2 Cao Ngọc Điệp, Khổng Thị Thu Vân, Bùi Thế Vinh 2010 Phân lập và

nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P trong nước rỉ rác Tạp chí Công

nghệ Sinh học, 8(3A), pp 915-922

3 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toànvà Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập, nhận

diện vi khuẩn tích lũy polyphosphate từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất

thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải Tạp chí Khoa học, Trường

Đại học Cần Thơ, 18a, pp 185-193

4 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toànvà Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập và

nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất

thải sữa và ứng dụng trong xử lý nước thải Tạp chí Khoa học, Trường

Đại học Cần Thơ, 18a, pp 194-200

5 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp 2011 Biological

treatment of dairy processing wastewater The second Conference on

Food Science & Technology, Can Tho University, Viet Nam

Đề tài cấp Trường Thời gian

thực hiện

Ngày nghiệm thu

Kết quả

Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sản xuất

chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ,

photpho và ứng dụng trong xử lý nước

thải nhà máy sữa

01/04/2010 – 31/12/2010

30/12/2010 Tốt

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành sữa có vai trò rất quan trọng không chỉ đối với nền kinh tế mà còn đối với đời sống của người dân bởi nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe

và trí tuệ của thế hệ tương lai của đất nước Theo Quyết định của Thủ Tướng Chính Phủ số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 về việc phê duyệt Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 thì đến năm 2015 đạt 700 tấn sữa và đến năm 2020 đạt trên 1.000 tấn sữa; và theo Quyết định của Bộ Công Thương số 3399/QĐ-BCT ngày 28/06/2010 về việc Phê duyệt Quy hoạch phát triển Ngành công nghiệp chế biến sữa Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2025 thì cả nước sẽ sản xuất ra sản lượng sữa (quy ra sữa tươi) 2,6 tỷ lít vào năm 2020 và 3,4 tỷ lít vào năm 2025 Ngành công nghiệp sữa phát triển sẽ có nhiều nhà máy sữa được thành lập, sản xuất ra số lượng lớn sản phẩm để đáp ứng nhu cầu cho xã hội, đồng thời cũng tạo ra một lượng lớn chất thải và nước thải

Trong các thành phần của nước thải nhà máy sữa, các thành phần chứa nitơ, photpho được chú ý nhiều nhất bởi vì chúng ảnh hưởng đến quá trình phát triển tảo ở các ao hồ Tảo ở các ao hồ phát triển quá mức sẽ làm giảm chất lượng nước, ảnh hưởng đến đời sống động vật, thực vật nước Phương pháp thực tiễn duy nhất và hiệu quả nhất để kiểm soát qúa trình phú dưỡng hóa là tập trung kiểm soát hàm lượng nitơ và photpho trong nước Do vậy, cần phải loại bỏ nitơ, photpho đến mức tối thiểu trước khi đưa ra môi trường

Trong thực tế hiện nay, người ta sử dụng các phương pháp hóa lý và sinh học để xử lý nước thải nhà máy sữa Tuy nhiên, do sử dụng hóa chất có khả năng gây ung thư như aluminum sunphat, polyacrylamid,…gây ra ô nhiễm thứ cấp trong áp dụng thực tế; chi phí các thuốc thử cao và quá trình loại bỏ COD hòa tan kém trong các quá trình xử lý hóa lý nên các quá trình

xử lý sinh học thường được ưu tiên

Chính vì các lý do trên, đề tài luận án: “Phân lập vi khuẩn kết tụ sinh

học, khử nitơ, photpho và ứng dụng trong xử lý nước thải nhà máy

sữa” được thực hiện nhằm tìm ra các dòng vi khuẩn bản địa có ích trong tự

nhiên, đặc biệt là các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn có

khả năng chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho (tích lũy polyphotphat

[poy-P]) trong chất thải từ trại nuôi bò sữa, nhà máy sữa và trạm thu mua sữa, để

ứng dụng vào trong xử lý nước thải nhà máy sữa, góp phần giải quyết vấn

đề ô nhiễm môi trường nước thực sự rất cần thiết trong tình hình hiện nay

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích tìm ra các dòng vi khuẩn bản địa

gồm vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi

khuẩn chuyển hóa photpho hiệu quả nhất từ chất thải lỏng và rắn của trại

chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long, nhà máy sữa

Vinamilk Cần Thơ và trạm thu mua sữa ở thành phố Hồ Chí Minh để ứng

dụng vào trong xử lý nước thải sữa ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở

khoa học cho việc đề xuất một quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa

1.3 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn

chuyển hóa nitơ, photpho từ các chất thải lỏng và rắn của trại chăn nuôi bò

sữa, trạm thu mua sữa bò tươi và nhà máy sữa

2 Kiểm tra khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa

photpho của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa

nitơ, chuyển hóa photpho từ các dòng vi khuẩn phân lập được, từ đó chọn ra

một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, một số dòng vi khuẩn

chuyển hóa nitơ và một số dòng vi khuẩn chuyển hóa photpho

3 Định danh các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển

hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã chọn bằng phương pháp sinh học phân tử

4 Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhà máy sữa của các dòng vi

khuẩn tổng hợp kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã

với dòng LV1 có sục khí 6 giờ/ngày, trong thời gian 4 ngày Nước thải sau

xử lý đạt loại B (QCVN 24: 2009/BTNMT) ở quy mô khảo sát và 80 lít/mẻ

5.2 Đề nghị

Tiếp tục thử nghiệm trên thể tích nước thải nhà máy sữa tổng hợp lớn hơn

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Từ 19 mẫu chất thải lỏng và rắn, phân lập được tổng số 36 dòng vi

khuẩn để tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và

tổng số 47 dòng vi khuẩn từ môi trường tối thiểu để tuyển chọn các vi

khuẩn chuyển hóa nitơ và phopho

Qua quá trình tuyển chọn, chọn được hai dòng vi khuẩn (P11 và P14) có

khả năng tạo kết tụ sinh học với hiệu quả cao; hai dòng vi khuẩn chuyển

hóa nitơ (LV1 và TR3) có khả năng oxy hóa ammonnium và khử nitrat tốt ở

nồng độ 700 mM; hai dòng vi khuẩn (LV1 và LV8b) có khả năng tích lũy

photpho

Kết quả định danh 05 dòng vi khuẩn cho thấy:

+ dòng P14 và dòng P11 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Enterobacter

aerogenes dòng CTSP30 16S rDNA (EU855208.1) là 99%

+ dòng vi khuẩn LV1 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Arthrobacter

mysorens 16S rRNA dòng LMG 16219T (AJ639831.1), Arthrobacter

mysorens dòng DSM 12798 16S rRNA (NR 025613.1) là 99%

+ dòng TR3 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Acinetobacter

calcoaceticus dòng PVAS6 16S rRNA (GU130530.1), Acinetobacter

calcoaceticus 16S rRNA, dòng MTCC:9488 (FM210755.1) là 99%

+ dòng LV8b có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium

dòng NY-3 16S rRNA (EU918562.1), Bacillus megaterium dòng EI-6 16S

rRNA (FJ613535.1) là 99%

Qua đánh giá khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho của

05 dòng vi khuẩn đã qua tuyển chọn và định danh trong nước thải nhà máy

sữa, hai dòng vi khuẩn P11 và LV1 được chọn để xử lý nước thải nhà máy

sữa nhân tạo Qui trình xử lý (bên dưới) gồm các bước xử lý kết tụ sinh học

nước thải với dòng P11, sau đó xử lý nitơ, photpho còn lại trong nước thải

qua tuyển chọn và định danh Từ đó, chọn ra trong mỗi loại vi khuẩn 01 dòng vi khuẩn có khả năng tạo kết tụ, chuyển hóa nitơ và chuyển hóa photpho ưu việt nhất

5 Ứng dụng kết hợp các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn chuyển hóa photpho để xử lý nước thải nhà máy sữa ở quy mô phòng thí nghiệm

1.4 Những đóng góp của luận án này

- Cung cấp thông tin về một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho bản địa có khả năng kết tụ các chất rắn lơ lửng, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho trong nước thải nhà máy sữa

- Đã tuyển chọn được 02 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ sinh học cao

là P11 và P14 (Đồng hình với Enterobacter aerogenes dòng CTSP30); 03

dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ, photpho là LV1 (chuyển hóa

nitơ và photpho, đồng hình với Arthrobacter mysorens dòng LMG 16219T), TR3 (chuyển hóa nitơ, đồng hình với Acinetobacter calcoaceticus dòng PVAS6), LV8b (chuyển hóa photpho, đồng hình với Bacillus

megaterium dòng NY-3) Trong đó, dòng P11 và LV1 có khả năng kết hợp

để xử lý nước thải nhà máy sữa

- Xây dựng một quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa mới bằng con đường sinh học, trong đó có sử dụng kết hợp 01 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (để loại bỏ một phần dưỡng chất trong nước thải ở công đoạn tiền xử lý thay cho hóa chất có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp) với 01 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (xử lý hiếu khí lượng nitơ, photpho còn sót lại trong nước thải với thời gian sục khí 6 giờ/ngày – thời gian sục khí ngắn so với các quy trình xử lý đang áp dụng tại Việt Nam 18

-20 giờ/ngày)

- Đóng góp tư liệu cho giảng dạy và nghiên cứu vi sinh vật trong xử lý

nước thải bằng con đường sinh học

1.5 Cấu trúc của luận án này

Luận án gồm các chương mở đầu, tổng quan tài liệu, phương tiện và

phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và đề nghị; các

công trình của tác giả có nội dung liên quan đến luận án; danh mục tài liệu

tham khảo và phần phụ chương Toàn bộ nội dung của luận án được trình

bày trong 101 trang, 19 hình, 39 bảng và 95 tài liệu tham khảo Phần lớn

nội dung của luận án đã được công bố trong các bài báo khoa học

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong chương này chúng tôi trình bày các kiến thức nền tảng về vi

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn khử nitơ, vi khuẩn khử

photpho cũng như quá trình trình tạo kết tụ sinh học, khử nitơ, photpho

trong nước thải Bên cạnh đó, chúng tôi đã điểm qua một số công trình

nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về ứng dụng một số hệ thống thiết

bị phản ứng sinh học trong xử lý nước thải nhà máy sữa

CHƯƠNG 3 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nguyên liệu

Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn: 19 mẫu chất thải rắn và lỏng (vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học – 6 mẫu; vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho -

13 mẫu chất thải) thu nhận từ trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh, thành ở

Đồng Bằng Sông Cửu Long, trạm thu mua sữa bò tươi tại TP Hồ Chí Minh

và nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.21 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

sục khí 6 giờ/ngày có tỷ lệ loại bỏ các thành phần như N_tổng số, N_NH4+,

PO43- tăng, P_tổng số cao nhất

Hình 4.2 Độ đục của mẫu nước thải trước và sau xử lý

Hình (A) : Trước xử lý Hình (B): Sục khí 2 giờ/ngày, xử lý 4 ngày Hình (C): Sục khí 4 giờ/ngày, xử lý 4 ngày Hình (D): Sục khí 6 giờ/ngày, xử lý 4 ngày

Qua kết quả trên, chọn qui trình xử lý có sục khí 6 giờ/ngày để thực hiện

xử lý nước thải với thể tích 80 lít Kết quả sau 4 ngày xử lý (Bảng 4.4) cho thấy tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số, NH4+, PO43-, P_tổng số lần lượt là 79,67%; 55,82%; 58,13%; 76,00%; 83,07%; 82,55% Nước thải sau xử lý đạt loại B

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH 4 , PO 4 3- và P_tổng số của nước thải nhà máy sữa tổng hợp [80 lít] sau 4 ngày xử lý, thời gian sục khí 6 giờ/ngày

Thời gian sục khí (giờ/ngày)

Chỉ tiêu

COD (mgO 2 /l)

TSS (mg/l)

N_tổng

số (mg/l)

NH 4 (mg/l)

PO 4 3-(mg/l)

P_tổng

số (mg/l)

Tỷ lệ giảm (%) 79,67 55,82 58,13 76,00 83,07 82,55

(A) (B) (C) (D)

Trước xử lý

Hình 4.1 Hình ảnh nước thải sau xử lý 2 ngày, sục khí 2 giờ/ngày

Khi kéo dài thời gian xử lý từ 2 ngày lên 4 ngày (so sánh kết quả trên

Bảng 4.2 và Bảng 4.3), tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số và P_tổng số

tăng lên (COD từ 73,71% tăng lên 83,54%; TSS từ 52,19% tăng lên

90,16%; N_tổng số từ 42,51% tăng lên 51,57%; P_tổng số từ 31,91% tăng

lên 82,40%) Nước thải đầu ra đều đạt loại B ở tất cả các nghiệm thức có

sục khí 2 giờ/ngày, 4 giờ/ngày và 6 giờ/ngày Sau khi tăng thời gian xử lý

lên 4 ngày, nước thải đầu ra trong hơn (không màu) (Hình 4.1 và Hình 4.2)

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và

photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH 4 , PO 4 3- và P_tổng số của nước thải nhà

máy sữa tổng hợp sau 4 ngày xử lý, thời gian sục khí 2, 4, 6 giờ/ngày

Thời gian sục khí

(giờ/ngày)

Chỉ tiêu

COD (mgO 2 /l)

TSS (mg/l)

N_tổng

số (mg/l)

N_NH 4 (mg/l)

PO 4 3-(mg/l)

P_tổng

số (mg/l)

2

Trước xử lý 480,00 36,56 43,40 22,01 11,23 6,76

Sau xử lý 79,00 a 4,50 c 21,02 a 4,96 a 8,34 a 1,19 a

Tỷ lệ giảm (%) 83,54 90,16 51,57 77,46 25,73 82,40

4

Trước xử lý 480,00 36,56 43,40 22,01 11,23 6,76

Sau xử lý 70,00 a 6,50 b 21,02 a 4,13 a 6,82 b 1,21 a

Tỷ lệ giảm (%) 85,42 81,81 51,57 81,24 39,27 81,10

6

Trước xử lý 480,00 36,56 43,40 22,01 11,23 6,76

Sau xử lý 77,00 a 7,50 a 19,61 b 3,86 b 6,31 c 0,84 b

Tỷ lệ giảm (%) 83,96 79,49 54,82 82,46 43,81 87,57

Các trung bình trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức α = 0,01.

Và trong cùng thời gian xử lý 4 ngày, khi tăng số giờ sục khí trong ngày

từ 2 giờ/ngày lên 4 giờ/ngày, 6 giờ/ngày, tỷ lệ loại bỏ N_tổng số, N_NH4+,

PO3- tăng, P_tổng số tăng cùng với thời gian sục khí, trong đó nghiệm thức

Đối chứng Sau xử lý

- Địa điểm thí nghiệm: tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học Phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện đề tài: 01/03/2009 đến 30/06/2011

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Đĩa petri, tủ cấy vi sinh vật, máy chạy PCR,

3.2.3 Hóa chất

Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn, chạy PCR,

3.2.4 Phân lập vi khuẩn

Tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid

và môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein; phân lập các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho trên môi trường tối thiểu Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sau khi phân lập được nuôi trong 50 ml môi trường lỏng (môi trường cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid hay protein ứng với từng dòng vi khuẩn) Vi khuẩn tạo ra chất kết tụ sinh học được trữ lạnh và sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm sau không qua quá trình ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn

3.2.5 Tuyển chọn vi khuẩn 3.2.5.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học: Đánh giá khả năng kết tụ

sinh học với dung dịch Kaolin thông qua tỷ lệ kết tụ

Lấy 90 ml dung dich Kaolin (5 g/l, Kaolin có độ mịn tốt < 4 µm), bổ sung 10 ml dung dịch 1% CaCl2 trong bình tam giác 250 ml, chỉnh pH 7,0; sau đó thêm 0,1 ml (0,1%) dung dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn sản

xuất chất kết tụ sinh học Khuấy hỗn hợp trên trong 30 giây ở 60 vòng/ phút

bằng máy lắc Sau đó, để yên hỗn hợp trong 5 phút, lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đo OD ở độ dài sóng 550 nm Xác định tỷ lệ kết tụ theo công thức: Tỷ lệ kết tụ (%) = ((OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng) x 100

Chọn các dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao nhất để thực hiện thí nghiệm

tiếp theo

3.2.5.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Đem các dòng vi khuẩn phân lập được từ môi trường tối thiểu (trong các

ống trữ giống) cấy ria trên môi trường tối thiểu có bổ sung lần lượt

ammonium (N_NH4+), nitrit (N_NO2-) và nitrat (N_NO3-) ở dạng hợp chất

(NH4Cl, NaNO2, NaNO3) qua các nồng độ tăng dần (100, 200, 300, 400,

500, 600 và 700 mM) nhằm kiểm tra khả năng oxi hóa ammonium và khử

nitrat, khử nitrit của các dòng vi khuẩn trên Chọn các dòng vi khuẩn có khả

năng oxi hóa N_NH4+ và khử N_NO3- ở cao nhất để thực hiện thí nghiệm

tiếp theo

3.2.5.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho

Đem các dòng vi khuẩn phân lập được từ môi trường tối thiểu (trong các

ống trữ giống) cấy ria trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa

photpho có bổ sung 2% agar, chọn những dòng có khả năng phát triển trên

môi trường này Để kiểm tra nhanh khả năng hình thành poly-P của các

dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa

photpho, các dòng vi khuẩn này được cấy trên môi trường lân khó tan với

chất chỉ thị pH (Bromothymol blue 0,5%), quan sát trong 2 đợt, mỗi đợt 2

ngày, lặp lại 2 lần (không phát triển hoặc phát triển nhưng không hòa tan

lân (không tạo vòng halo) trên môi trường lân khó tan) Đồng thời, các dòng

vi khuẩn này được nuôi trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa

photpho (lỏng) trong 15 ngày trên máy lắc xoay vòng (150 vòng/phút) để

kiểm tra sự hình thành poly-P của các dòng vi khuẩn Sau đó, đo hàm lượng

poly-P trong dung dịch vi khuẩn tại phòng thí nghiệm Chuyên sâu, trường

Đại học Cần Thơ Chọn 02 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P (01

dòng có poly-P cao nhất và 01 dòng có poly-P thấp nhất) để thực hiện thí

nghiệm tiếp theo

xuống đáy) đem xử lý nitơ, photpho còn lại trong nước thải với dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (LV1) trong thời gian 2 ngày, có sục khí

2 giờ/ngày

Kết quả (Bảng 4.2) cho thấy sau khi xử lý với dòng P11, hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, P_tổng số, N_NH4+, PO43- trong phần trong phía trên đã giảm đi một phần so với ban đầu Lấy phần nước trong phía trên để

xử lý tiếp tục với dòng LV1 trong 2 ngày, hàm lượng COD, TSS, N_tổng

số, N_NH4+, PO43-, P_tổng số trong nước thải còn lần lượt là 127 mg O2/l; 17,45 mg/l; 24,98 mg/l; 3,15 mg/l; 2,14 mg/l; 4,63 mg/l Nước thải sau xử

lý có màu nâu đỏ nhạt (Hình 4.1), chứng tỏ sinh khối vi khuẩn còn lơ lửng trong nước thải sau xử lý Vì thế cần nghiên cứu các biện pháp bổ sung để nước thải đầu ra đạt loại B theo mục tiêu đề ra

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH 4 , PO 4

và P_tổng số của nước thải nhà máy sữa tổng hợp sau 2 ngày, sục khí 2 giờ/ngày

Kết quả sau 2 ngày xử lý

Chỉ tiêu

COD (mgO 2 /l)

TSS (mg/l) N_tổng số (mg/l)

N_NH 4 (mg/l)

PO 4

3 (mg/l) P_tổng

số (mg/l)

Sau xử lý kết tụ (P11) 286,00 16,50 36,43 21,86 2,11 5,95

Tỷ lệ giảm (%) 40,80 54,79 16,16 3,80 82,25 12,50

Sau xử lý nitơ, photpho(LV1) 127,00 17,45 24,98 3,15 2,14 4,63

Tỷ lệ giảm chung (%) 73,71 52,19 42,51 86,14 82,00 31,91

Chính vì các lý do trên, tiến hành xử lý nước thải theo qui trình trên nhưng kéo dài thới gian xử lý ở công đoạn xử lý nitơ và photpho từ 2 ngày lên 4 ngày và tăng thời gian sục khí từ 2 giờ/ngày lên 4 giờ/ngày, 6 giờ/ngày, sau đó đánh giá hiệu quả xử lý của các dòng vi

Qua kết quả thí nghiệm trên cho thấy khả năng xử lý PO43- (tích lũy

poly-P) trong nước thải nhân tạo của các dòng vi khuẩn tốt nhất trong điều

kiện có sục khí 2 giờ/ngày, đặc biệt là dòng vi khuẩn LV1 và thời gian xử lý

2 ngày có khả năng loại bỏ photpho hòa tan trong nước thải

ii Kết quả xử lý photpho của các dòng vi khuẩn trong nước thải nhà

máy sữa tổng hợp

Sử dụng hai dòng vi khuẩn LV1, LV8b để xử lý photpho trong nước thải

nhà máy sữa tổng hợp có bổ sung 9 ÷ 11 mg/l ở điều kiện xử lý có sục khí 2

giờ/ngày Đồng thời cũng tiến hành bố trí các nghiệm thức kết hợp hai dòng

vi khuẩn LV1+LV8b, Đối chứng để xử lý photpho trong nước thải nhà máy

sữa tổng hợp Sau 2 ngày xử lý, hàm lượng PO43- trong nước thải đều giảm

xuống so với ban đầu 11,96 mg/l ở tất cả các nghiệm thức Trong đó, ở

nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1 giảm xuống nhiều nhất (3,96 mg/l), sau

đó đến các nghiệm thức bổ sung LV1+LV8 (4,02 mg/l), LV8b (4,11 mg/l)

Trong khi đó nghiệm thức đối chứng còn ở mức cao (9,62 mg/l) Tỷ lệ loại

bỏ photpho tổng số ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1, LV8b,

LV1+LV8b lần lượt là 26,34%, 23,81%, 24,26%, trong khi đó nghiệm thức

đối chứng chỉ đạt 7,30%

Dòng vi khuẩn LV1 được chọn để xử lý nước thải trong điều kiện có sục

khí 2 giờ/ngày cho thí nghiệm tiếp theo

4.5 Kết quả ứng dụng kết hợp các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho vào trong xử lý nước thải nhà máy

sữa tổng hợp

Ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (dòng

P11) và dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ và photpho (dòng LV1) vào trong

xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp Nước thải nhà máy sữa tổng hợp

được chỉnh về pH 9,0; bổ sung dung dịch muối CaCl2 (1%) và 0,1% dung

dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (P11), sau đó khuấy đều trong 1

phút và để yên 30 phút Lấy phần nước trong bên trên [3 lít] (bỏ phần lắng

3.2.6 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA

Được thực hiện qua các giai đoạn gồm ly trích DNA của vi khuẩn, thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, điện di sản phẩm PCR trên agrose gel, nhận diện vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự đoạn DNA có sử dụng chương trình BLASTn để so sánh trình tự đoạn DNA của dòng vi khuẩn với trình tự DNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI

3.2.7 Đánh giá khả năng tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho đã qua tuyển chọn và định danh trong nước thải nhà máy sữa

3.2.7.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

i Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu quả kết tụ

* pH ban đầu của môi trường: Nhằm xác định giá trị pH thích hợp để

vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được chọn ở thí nghiệm trước cho hiệu quả kết tụ cao nhất

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (pH với các mức 4,0; 5,0; 6,0;

7,0; 8,0 9,0), được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18

Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:

- Lấy 6 bình tam giác 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 90 ml dung dịch Kaolin (5 g/l) + 10 ml (1 g/l) dung dịch CaCl2

- Điều chỉnh pH của 6 bình ở các giá trị pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0 bằng dung dịch HCl hay NaOH

- Cho vào mỗi bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn hơn hoặc bằng 109 CFU/ml) Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn

- Lắc bằng máy lắc ở 60 vòng/phút trong 30 giây

- Để yên 5 phút

- Lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đem đo OD550nm

- Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1

* Các muối kim loại (ion kim loại) bổ sung vào môi trường: Nhằm

xác định muối kim loại bổ sung vào môi trường để vi khuẩn tổng hợp chất

kết tụ sinh học được chọn ở thí nghiệm trước cho hiệu quả cao nhất

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (Muối kim loại bổ sung gồm

KCl, NaCl, CaCl2, MgSO4, MnSO4, FeCl3), được bố trí theo thể thức hoàn

toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18

Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:

- Lấy 6 bình tam giác loại 250 ml, cho vào mỗi bình gồm: 90 ml Kaolin

(5 g/l) + 10 ml dung dịch 1 % từng loại muối trên

- Điều chỉnh pH tối ưu theo kết quả trên

- Cho vào mỗi bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn hơn

hoặc bằng 109 CFU/ml) Mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không

chủng vi khuẩn

- Lắc bằng máy lắc ở 60 vòng/phút trong 30 giây

- Để yên 5 phút

- Lấy phần trong cách mặt nước 2 ÷ 3 cm đem đo OD550nm

- Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức ở mục 3.2.2.1

* Tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sử dụng : Nhằm

xác định tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được chọn ở thí

nghiệm trước cho hiệu quả kết tụ cao nhất

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm 1 nhân tố (Tỷ lệ giống vi khuẩn ở các

nồng độ 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 %), được bố trí theo thể thức hoàn

toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : 6 x 3 = 18

Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu quả kết tụ như sau:

Trong điều kiện xử lý không có sục khí, hàm lượng PO43- trong nước thải giảm dần theo thời gian xử lý ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn So sánh quá trình xử lý trong điều kiện có sục khí và không có sục khí cho thấy hàm lượng PO43- giảm nhiều hơn trong điều kiện xử lý có sục khí ở các nghiệm thức bổ sung vi khuẩn

Đo hàm lượng poly-P trong nước thải nhân tạo sau 3 ngày xử lý, sục khí

2 giờ/ngày, kết quả cho thấy cả hai dòng vi khuẩn LV1 và LV8b đều có khả năng tích lũy lượng poly-P cao trong môi trường, 3 nghiệm thức có chủng

vi khuẩn vào nước thải có hàm lượng poly-P gần tương đương nhau và cao hơn nhiều so với nghiệm thức đối chứng (LV1 – 26,75 mg/l; LV8b – 26,31 mg/l; LV1 + LV8b – 25,56 mg/l; Đối chứng – 7,87 mg/l)

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn và sục khí đến hàm lượng PO 4

(mg/l) trong nước thải nhân tạo theo thời gian

Sục Khí Vi khuẩn Thời gian Trung bình

Vi khuẩn Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3

Có

LV8b 9,39 6,50 4,19 3,42 5,88 b LV1+LV8b 9,49 5,60 3,58 2,37 5,26 a Đối chứng 11,90 11,14 11,58 10,66 11,32 e

Trung bình thời

Không

LV1 10,76 7,91 5,28 4,88 7,21 cd LV8b 10,39 7,95 5,30 5,81 7,36 d LV1+LV8b 10,19 7,56 5,04 5,41 7,05 c Đối chứng 11,90 11,11 11,58 10,65 11,31 e

Trung bình thời gian (không sục) 10,81 8,63 6,80 6,69

Trung bình chung Thời gian 10,48 d 8,17 c 6,15 b 5,54 a

Các trung bình trong cùng một hàng hoặc trong cùng một cột có cùng chữ theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức α = 0,01