Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp

Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic LAB có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng vi sinh vật trong quá trình

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG MSSV: 1211100167 Lớp: 12DSH01

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Sinh viên thực hiện luận văn

Lưu Đại Kim Phượng

LỜI CÁM ƠN

Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ Cám ơn bố mẹ đã không quản khó khăn nuôi dưỡng con từng ngày, dạy cho con những điều hay lẽ phải Bố mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên to lớn cho con mỗi khi con vấp ngã và cũng là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong công việc cũng như trong cuộc sống

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn toàn thể quý Thầy Cô bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, cùng toàn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương – Trường bộ môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, người cô đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung cấp thông tin cũng kiến thức thật hữu ích cho em trong suốt quá trình thực hiện

đồ án

Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm của đồ án

Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ

và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này

TP.HCM, tháng 8 năm 2016

SVTH: Lưu Đại Kim Phượng

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Ngoài nước 2

2.2 Trong nước 3

3 Mục tiêu nghiên cứu 3

4 Mục đích nghiên cứu 3

5 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

6 Phương pháp nghiên cứu 4

6.1 Phương pháp luận 4

6.2 Phương pháp xử lý số liệu 4

7 Kết quả đạt được của đề tài 4

8 Kết cấu đồ án 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về nấm 6

1.1.1 Giới thiệu chung 6

1.1.2 Độc tố nấm 6

1.1.3 Tác hại của nấm 7

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật 7

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật 8

1.1.4 Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm 8

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 9

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 9

1.2.1.1 Giới thiệu chung 9

1.2.1.2 Khái niệm 10

1.2.1.3 Đặc tính chung 12

1.2.1.4 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu 14

1.2.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 24

1.2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 24

1.2.2.2 Qúa trình trao đổi chất 26

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 31

1.2.3 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập 32

1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R Fennema et al 2004) 32

1.2.3.2 Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R Fennema et al 2004) 33

1.2.3.3 Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại 37

1.2.4 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 38

1.2.4.1 Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic 38

1.2.4.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 40

1.2.5 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 40

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.1 Địa điểm nghiên cứu 46

2.2 Thời gian thực hiện 46

2.3 Vật liệu 46

2.3.1 Thiết bị và dụng cụ 46

2.3.2 Hóa chất 46

2.3.3 Giống nấm 50

2.4 Phương pháp luận 50

2.5 Phương pháp thí nghiệm 53

2.5.1 Thu thập mẫu 53

2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 53

2.5.2.1 Tăng sinh 53

2.5.2.2 Phân lập 53

2.5.3 Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic 55

2.5.3.1 Nhuộm Gram 55

Kết quả: 55

2.5.3.2 Nhuộm bào tử 55

2.5.3.3 Thử nghiệm Catalase 56

2.5.3.4 Thử nghiệm khả năng sinh acid 56

2.5.3.5 Thử nghiệm khả năng di động 57

2.5.3.6 Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 57

2.6 Xác định hàm lượng acid tổng 58

2.7 Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của chủng Lactobacillus sp với nấm bệnh 59

2.8 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt 63 2.8.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: 63

2.8.2 Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm 65

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 66

3.1 Kết quả phân lập 66

3.2 Định danh các chủng phân lập 68

3.2.1 Thử nghiệm Catalase 68

3.2.2 Nhuộm Gram 69

3.2.3 Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm 76

3.2.4 Nhuộm bào tử 77

3.2.5 Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 79

3.3 Xác định Hàm lượng acid tổng 83

3.4 Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương

pháp khuếch tán 86

3.5 Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập được trong bảo quản hạt 92

3.5.1 Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng 92

3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

FDA Fructose-bisphosphate aldolase

ATP Adenosin triphosphat

LAB lactic acid bacteria/Lactobacillales

DNA Deoxyribonucleic acid

rRNA ribosomal Ribonucleic acid

MRS de Man, Rogosa and Sharpe

PDA Potato Detrose Agar

DMSO Dimethyl sulfoxide

Bacillus sb Bacillus subtilis

E coli Escherichia coli

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus 14

Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) 17

Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus 19

Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc 22

Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus 23

Bảng 1.6 Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 42

Bảng 1.7 Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men 43

Bảng 1.8 Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh (Holzapfel và cộng sự, 1995) 44

Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập 53

Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập 68

Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi x100 73

Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn 81

Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được 83

Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Nem chua 84

Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập từ Cơm mẻ 85

Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic 85

Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn 89

Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem chua 90

Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm

mẻ 91

Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm 92 Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và

Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng 93

Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform 97

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic (Owen R Fennema et al 2004) 12

Hình 1.2: Lactobacillus (L acidophilus) 15

Hình 1.3: Lactobacillus salivarius 15

Hình 1.4: Streptococcus 19

Hình 1.5: Leuconostoc 22

Hình 1.6: Pediococcus 24

Hình 1.7: Con đường lên men Glucose 30

Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic 54

Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 54

Hình 2.3 : Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán 60

Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch 62

Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 63

Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic 67

Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 67

Hình 3.3: Chủng Bacillus sb Có Catalase dương tính (Trái) Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) 69

Hình 3.4: Mẫu đối chứng với nước cất (Trái) Chủng phân lập có Catalase âm tính (Phải) 69

Hình 3.5: Vi khuẩn Bacillus sb Gram dương bắt màu tím 70

Hình 3.6: Vi khuẩn E.Coli Gram âm bắt màu hồng 70

Hình 3.7: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn 77

Hình 3.8: Vi khuẩn Bacillus sb sinh bào tử 78

Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử 78

Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 79

Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường 80

Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường 81

Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy 84

Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày 87

Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày 87

Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày 88

Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày 88

Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn 89

Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 95

Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) 96

Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 98

Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 98

Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 99

Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4) 99

Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100 Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%) 101

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ Thế nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được nâng cao Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì

họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe

Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người Theo thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày càng phức tạp Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc

từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống…

Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn Thay vì sử dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học Bản thân thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay Mặc dù

áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008) Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm

Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm Các phương pháp này không những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng

vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997) Và việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ Vì các LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng minh là an toàn

Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong

đó

Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm Do đó, người

thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên

men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”

2 Tình hình nghiên cứu

2.1 Ngoài nước

Phân lập các chủng Lactobacillus fermentum từ bột ngô có khả năng phân giải

tinh bột (Agati et al , 1998)

Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng

kháng nấm (Lavermicocca et al , 2000)

Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003)

Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al , 2008)

Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi

khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới

2.2 Trong nước

Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic

từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua Tạp chí Khoa học

và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204

Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm rơm (Hồng Thị Hiền, 1998)

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương, 2012)

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô Thị Phương Dung, 2011)

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men

chua (Nguyễn Văn Chương, 2008)

3 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt

4 Mục đích nghiên cứu

Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

5 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống

 Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic

 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic

 Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu phộng

6 Phương pháp nghiên cứu

 Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành

 Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri, 2011)

 Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng

6.2 Phương pháp xử lý số liệu

 Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị

 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lý số liệu

7 Kết quả đạt được của đề tài

 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh khối và có hoạt tính kháng nấm tốt từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ 2 nguồn thực phẩm lên men truyền thống là cơm mẻ và nem chua

 Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi khuẩn lactic

 Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu phộng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm

1.1.1 Giới thiệu chung

Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có thành tế bào bằng chitin Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium) Nấm thường sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể) Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật

chất

1.1.2 Độc tố nấm

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người

Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu Tuy nhiên chỉ

có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến

an toàn thực phẩm Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium,

Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:

 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),

ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và

axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon

 Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2

toxin - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion

 Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin Chúng là độc tố vi nấm do

nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số

hạt (như lạc) Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan Nếu mức độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài lâu sẽ gây ung thư

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium và

Aspergillus tiết ra Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết,

độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết

1.1.3 Tác hại của nấm

1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật

 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm

Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng Chúng có thể là

nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,

Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium ,

chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm có thể gây ra những chứng

như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng

có thể tử vong

 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp

Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida,

Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở

người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh

nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii

1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật

Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông

nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho

lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và

Cochliobolus Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm

giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,

1.1.4 Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm

Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm

mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và

Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm Một trong những nguyên nhân

được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc

tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm Vậy aflatoxin

là gì?

Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus Các

chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia cầm như ngô, lạc, đậu… trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện thời tiết ở Việt Nam Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến

từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm Người có thể

bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc ô nhiễm aflatoxin Các trường hợp bị ngộ độc do chất độc tự nhiên có trong thực phẩm thường xảy ra trong tình trạng cấp tính rất nặng, tỷ lệ tử vong khá cao hoặc nếu bị nhiễm lâu dài có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người Trên thực tế nếu bị nhiễm độc tố aflatoxin của vi nấm có trong thực phẩm có thể gây nên bệnhung thư gan, giảm năng suất sinh sữa và trứng ở các động vật nuôi như

bò, cừu, gia cầm Loại độc tố này khá bền vững ở nhiệt độ cao, đun nóng thường không phá hủy được chúng

Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết tế bào, ở những bệnh nhân mắc ung thư gan

Có 4 tác động chính gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan, rối loạn chức năng hoạt động của thận và có thể gây tử vong đối với trường hợp nặng Ngoài ra, các độc tố vi nấm còn tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép DNA và gây hậu quả là

đột biến hoặc quái thai

1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic

1.2.1.1 Giới thiệu chung

Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân

lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus

lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình

thành

Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm Và một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một

số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002)

Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa

bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người

1.2.1.2 Khái niệm

Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ

Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng

khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987) Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm

Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc

biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống

thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella Trong khóa phân loại của Bergey 1957,

giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic, trong đó chúng được xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung

của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae - một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men khác với vi khuẩn lactic Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại

Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau

- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an toàn với con người

1.2.1.3 Đặc tính chung

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống

Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic (Owen R Fennema et al 2004)

không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ

chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác

Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic,

thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus,

Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus Trước đây giống Bifidobacterium cũng được

xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng

được xem là Lb bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một

nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu

nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Đây là

những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không sinh bào tử Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0.5 – 1.5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl,

có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 – 3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3.8 – 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5.5 – 6

Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 35oC, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 45oC, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( 5o

C) Khi gia nhiệt đến 60 – 80oC thì hầu hết chúng bị chết sau 10 –

30 phút Một số vi khuẩn lactic có khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm Như vậy, ngoài khả năng tạo ra acid lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất

có hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin)

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…)

1.2.1.4 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình

cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L acidophilus, L brevis, L

casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus …

Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng

riêng lẻ hoặc ở dạng que kép Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động,

không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp

Trên môi trường agar, khuẩn lạc lồi, mép trơn, đục có đường kính 2-5mm Hiếm khi tạo sắc tố nhưng khi tạo sắc tố thì thường là màu vàng, màu cam hay màu gỉ sắt và màu đỏ gạch

Hình 1.3: Lactobacillus salivarius Hình 1.2: Lactobacillus (L acidophilus)

Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L plantarum khi ở điều kiện nhất

định Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao

Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật

và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm này thường sử dụng như:

Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum

Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi

chất của chúng Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:

- Nhóm I – Lên men đồng hình bắt buộc: Chúng được gọi là Thermobacterium,

cófructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có

phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC

- Nhóm II – Lên men dị hình tùy nghi: Chúng được gọi là Streptobacterium (có

FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase) Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic

- Nhóm III - Lên men dị hình bắt buộc: Chúng được gọi là Betabacterium (có

phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình

Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)

L.casei L.curvatus L.plantarum L.sake

L.brevis L.buchneri L.fermentum L.reuteri

a: Khi lên men b: Cảm ứng khi có pentose

Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong

việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích

thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium

difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: bang đỏ do sốt, chàm,

viêm loát da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp

 Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình:

 Lactobacillus acidophilus: trực khuẩn dài Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng là 20oC và tối thích là 37 – 40oC Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ

 Lactobacillus bulgaricus: trực khuẩn tròn (đôi khi dạng hạt), thường kết thành chuỗi rất dài được tìm ra do Metchnikoff ở sữa chua Bungari Có khả năng lên men được đường glucose, không lên men được đường saccharose

Đây là loài ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển là 45 – 50oC, nhiệt

độ tối thiểu là 15 – 20o

C, có khả năng tạo acid rất cao (từ 2.5 – 3.7% acid lactic)

 Lactobacillus plantarum: trực khuẩn nhỏ, thường kết thành đôi hoặc chuỗi

Là loài ưu ấm, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 30oC, tích tụ được khoảng 1.3% acid Loại này tìm thấy chủ yếu trong rau muối chua và ủ chua thức ăn xanh dùng cho chăn nuôi Flening (1969) đa kết luận rằng sự đóng góp quan trọng nhất của vi khuẩn này là việc tạo mùi vị cho sản phẩm lên men và sinh ra hàm lượng acid để bảo quản, ngăn cản những vi sinh vật không mong muốn có thể sinh ra mùi xấu cho sản phẩm

 Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình:

 Lactobacillus brevis: tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột, nên nó còn được gọi là "trực khuẩn bắp cải" Trong lên men, ngoài tạo thành acid lactic (1.2%) nó còn tạo thành acid acetic, rượu ethylic (2.4%) và

CO2 Đồng thời tạo hương làm sản phẩm có hương vị dễ chịu

 Lactobacillus pentoaceticus: là trực khuẩn, không sinh bào tử Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 30 – 35oC Vi khuẩn này lên men một số đường như: glucose, fructose, galactose, mannose

 Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi tạo thành từng đôi một khi lên men tạo thành rượu, acid latic, acid acetic và CO2, chúng có khả năng tạo bào tử Tế bào sinh dưỡng thường chết ở 77 – 80oC

 Lactobacterium – coli – aerogenes: là giống đại diện của lên men lactic dị hình Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp cho phát trển là 35 – 38oC Thường gặp loại này trong nước, trên bề mặt rau quả, trong ruột người và động vật, trong sữa chua,… Sản phẩm của vi khuẩn này là acid lactic, acid acetic, acid succinic, rượu ethylic, CO2, H2O và indole

 Giống Streptococcus

Phân loại khoa học

Bảng 1.3 : Phân loại khoa học giống Streptococcus

Có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0.5 – 1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là loại vi khuẩn không nha bào, Gram dương, không di đông, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose,…

Trong môi trường lỏng, sinh khối có thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường Trên môi trường agar, khuẩn lạc

thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng min và tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi

Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic…khi lên men glucose trong môi trường

có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942)

Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có

trong nhóm enterococcus Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh

dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các aminoacid trong khi số khác có nhu cầu về các acid béo không no và gia tăng lượng CO2 Vì vậy nhu cầu về dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài (Dubos, 1948)

Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus (Sherman, 1937) Theo đó, chúng được

Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc mà ta có thể đặt nó vào nhóm Enterococcus Trong khi Streptococcus

acidominimus Ayers và Streptococcus Mudge cũng thuộc nhóm viridans, nhưng cũng

có thể xem như thuộc nhóm pyogenic

 Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình:

 Steptococcus cremoris: thường tạo thành một chuỗi dài Tế bào có kích thước

0.6 – 0.7µm, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn

 Streptococcus lactis Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25 – 35oC, nhiệt độ tối đa là

35 – 38oC Lên men glucose và galactose

 Steptococcus lactis: cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết song đôi thành chuỗi ngắn Đây là loại ưu ấm, nhiệt độ tối ưu 30 – 35o

C, Nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 10oC và tối đa là 40 – 50oC Trong môi trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0.8 – 1% acid Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh được dùng trong bảo quản thực phẩm

 Streptococcus thermophillus: hình cầu kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất

ở 40 – 45o

C, trong quá trình lên men chúng có khả năng tích tụ được khoảng 1% acid

 Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình:

 Streptobacterium brassicae fermentati: thường thấy chúng có trong dịch lên men chua rau cải Thường tồn tại tế bào đơn hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn và thường tạo thành chuỗi dài hình sợi Đuôi tế bào thường uốn cong lại Khi lên men rau cải chua tạo thành acid lactic, acid acetic và rượu (đến 2.4%) và CO2 Chúng lên men saccharose tốt hơn lactose

 Giống Leuconostoc

Phân loại khoa học

Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc

Đặc điểm: ( Van Tieghem, 1878), (Orla-Jensen, 1919), (Hucker và Pederson, 1930)

Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan đơn lẻ, cặp đôi đường kính từ

0.5 – 0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm.Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính acid, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que., chiều dài khoảng 1 - 3µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo

thành đám tập trung Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến

rau muối chua Một số loài tạo chất nhờn đặc trưng khi sống trong môi trường chứa

sucrose Đối với môi trường bình thường, sự tăng trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ

Leuconostoc là một loài kỵ khí không bắt buộc Khi lên men tạo ra một lượng

hạn chế acid lactic Luôn tạo L- lactic acid nhưng đôi khi cũng tạo D-lactic acid Acid acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng lượng glucose lên men được chuyển thành CO2 Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm

thấy trong lên men sữa và rau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides

(Cienkowski) Van Tieghem

 Giống Pediococcus

Phân loại khoa học

Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus

Gồm các loài nhƣ: P acidilactici, P cellicola, P claussenii, P damnosus, P

ethanolidurans, P inopinatus, P parvulus, P pentosaceus, P stilesii

Đặc điểm: ( Balcke, 1884)

Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẻ hoặc dạng

chuỗi ngắn Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, không di động, âm tính với catalase

Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25 – 32oC, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí

Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình.Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy nghi, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí Chúng không có khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém cũng không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể vì vậy chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường

Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu acid và chịu NaCl

Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae (Balcke,1884)

1.2.2 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

1.2.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Hình 1.6: Pediococcus

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Để sinh trưởng bình thường chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ, các chất sinh trưởng…

 Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrate carbon từ các monosaccaride (glucose, fructose, manose), các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy

để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các baz nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng

vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối

vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

 Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí (Wood B.J.B and Holzapfel W.H 1995) Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

 Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP

 Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

1.2.2.2 Qúa trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai

nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.7)

 Lên men lactic đồng hình

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo

ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

di-C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas

pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III

Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ

FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và

glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy,

pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

 Lên men lactic dị hình

Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate và được gọi chung là 6-phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK) Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn

so với lên men lactic đồng hình

Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường

glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK Tuy nhiên

nó không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R Fennema et al 2004)

Chú thích hình 1.7

(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)

(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)