Phân lập vi khuẩn LACTIC có ngườn góc từ thực phẩm và dược phẩm mang hoạt tính PROBIOTIC

Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 6 năm 2009

LỜI MỞ ĐẦU

Cùng với nhiều lĩnh vực khoa học phục vụ lợi ích của con người, cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật đưa con người bước vào nền văn minh hiện đại Khi những nhu cầu về vật chất được đáp ứng, con người ngày càng quan tâm đến sức khỏe của mình hơn Vì vậy, con người đã và luôn đi tìm một sản phẩm hoàn thiện vừa chăm sóc và bảo vệ sức khỏe, vừa có thể là dược phẩm để trị liệu một số bệnh của thời đại Probiotics là sản phẩm đáp ứng được các yêu cầu đó Dù ngàn năm trước con người

đã biết sử dụng probiotics như một thưc phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào những năm gần đây probiotics mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn

Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống” Probiotics là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật số lượng đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ” (FAO 2001) Các nhà khoa học mỗi ngày hiểu biết nhiều hơn về vai trò của vi khuẩn trong việc giữ cho sức khỏe con người và nhiều lợi ích về sức khỏe liên quan đến sử dụng đúng loại hình và mức độ của vi sinh sống Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện Probiotics với phương cách là bổ sung những chủng vi sinh vật hữu dụng vào thành phần thức ăn (của động vật, loài thuỷ sản, gia cầm…) nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng và đảm bảo tính an toàn về sức khoẻ

Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotics đang chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác Vì rằng tính hiệu quả của probiotics (tính trị bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh, tồn dư tác hại trong sinh vật chủ Mà với sự khắt khe của con người thì điều này là số một Hiệu quả tác dụng của probiotics không chỉ đơn thuần là làm thức ăn ngon hơn mà

có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dịch; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số

Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa Với ý nghĩa đó tôi mong muốn làm phong phú thêm nguồn vi khuẩn probiotic để đóng góp thêm vào ngành công nghiệp probiotics những chủng vi khuẩn lactic mới từ những nguồn chứa vi khuẩn lactic an toàn như thưc phẩm và dược phẩm, có tính kháng khuẩn cao và những hoạt tính probiotic tốt nhất qua đồ án tốt nghiệp của tôi “Phân lập các vi khuẩn lactic có nguồn gốc thưc phẩm và dược phẩm mang hoạt tính probiotic”

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày càng cao của con nguời Trên phương trình thăng tiến này, con người đòi hỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ của chính bản thân họ Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp thúc đẩy khoa học học phát triển “ Probiotics” là một phần của sự phát triển ấy

Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life” nghĩa là “dành cho cuộc sống”.Probiotics là “vi sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật độ đem lại lợi ích cho sức khỏe trên vật chủ (FAO 2001).” Cơ chế tác động của probiotics gần như giống với kháng sinh nhưng so với các nhược điểm tính hóa học và xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotics là an toàn,

tự nhiên, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào

Các nhà khoa học mỗi ngày hiểu biết nhiều hơn về vai trò của vi khuẩn trong việc giữ cho sức khỏe con người và nhiều lợi ích về sức khỏe liên quan đến sử dụng đúng loại hình và mức độ của vi sinh sống là những vi khuẩn sống trong đường tiêu hoá Chúng được mệnh danh là “vi khuẩn tốt bụng” bởi vì giúp cơ thể bảo vệ chống lại một số các vi khuẩn có hại, nấm và siêu vi [72], [73] Vi khuẩn dùng rộng rải trong

sản xuất probiotics và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loại

Lactobacillus (như L acidophilus, L rhamnosus, L bulgaricus, L reuteri và L casei); nhiều chủng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi nấm

không gây bệnh Như vậy vi khuẩn lactic là một trong những nguồn vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu thế cao

nhiều bệnh khác nhau Vì vậy nguồn vi khuẩn probiotic càng phong phú sẽ góp thêm khả năng phòng và trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người

1.2 Mục tiêu đề tài

- Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm và dược phẩm

- Định danh các chủng vi khuẩn lactic đến cấp giống và hướng đến định danh cấp loài

- Kiểm tra tính kháng khuẩn của những chủng vi khuẩn lactic phân lập được nhằm xác định những chủng có tiềm năng probiotic

ở quy mô công nghiệp hoặc nuôi cấy để tách chiết bacteriocin đối với những chủng

có khả năng sinh bacteriocin cao

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng Quan Về Probiotics

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics

Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người không phải

là mới Trên hàng nghìn năm về trước, rất lâu trước khi có sự tìm ra thuốc kháng sinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men Các bằng chứng cho thấy quá trình sản xuất sữa lên men được ghi trong “Book of Genesis” Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là vào khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt [16] Các nhà khoa học đầu tiên, như Hippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày [26]

Khoa học giải thích cho ảnh hưởng có lợi của các vi khuẩn lactic có trong sữa lên men được cung cấp lần đầu tiên vào năm 1907 bởi người đoạt giải Nobel, nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff Trong bài thảo luận xuất sắc của ông " Việc kéo dài cuộc sống " („The prolongation of life‟), Metchnikoff đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích [38] Người ta đề xuất rằng sự tiêu hóa một vài

vi khuẩn được chọn lựa có thể có ích lợi ảnh hưởng đến vùng dạ dày ruột người Metchnikoff tin vào lý do chính gây ra quá trình lão hóa của con người là do chất độc tạo thành bởi sự thối rữa và sự lên men trong ruột [42] Và khi nhận thấy quá trình lên men acid lactic của sản phẩm sữa ngăn chặn sự thối rữa, ông ta đã tin rằng

sự tiêu thụ sản phẩm sữa lên men như thế sẽ tương tự với việc ngăn chặn lại quá trình thối rữa ruột Metchnikoff đưa ra giả thuyết rằng cuộc sống khoẻ mạnh và lâu dài của

kết, giảm hoạt động của vi khuẩn độc, bằng cách ấy dẫn đến cuộc sống thọ Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông rằng uống đồ uống chẳng hạn như sữa chua chứa vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão hóa

Một điều thú vị là một vài năm trước bài thảo luận cuả Metchnikoff [45], trong khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã nhận thấy sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra, cùng một thời gian,

Henry Tissier đã phân lập Bifidobacteria, trước ki được xếp vào thành viên của

nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ và nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột [29] Tissier tin rằng sự thống trị của

Bifidobacteria trong cơ thể trẻ sẽ chiếm chỗ của các vi khuẩn thối rữa liên quan đến

sự xáo trộn dạ dày và sự tự thành lập của chúng để chiếm chỗ của các vi khuẩn có ích trong ruột [60] Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả thuyết ảnh

hưởng lớn của Bifidobacteria tới số trẻ em này [42] Lý thuyết của ông được khẳng

định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ được nuôi bằng sữa hộp [47]

Mặc cho sự diễn ra Thế chiến I và cái chết của Metchnikoff làm giảm sự quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn của ông ấy, nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotics rõ ràng đã được thành lập Nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống đã được tiếp tục suốt cả thế kỷ vừa qua Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày ruột và các loại thực phẩm để vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người[36]

Các kiến thức có được về probiotics thông qua những nghiên cứu này đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa Từ các quan sát từ sớm của Eli Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản phẩm sữa lên men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại

2.1.2 Định nghĩa về Probiotics

Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống” Tuy nhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian Lilly và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm dịch chiết

tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật [23] Sau đó, Parker (1974) [44] đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó Vì vậy, khái niệm “probiotics” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”

Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989) [21], ông định nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic

và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” [24]

Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh thái vi sinh vật ở người trưởng thành [59]; mặc dù phương pháp trị liệu kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này, nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh ( Tannock, 2005) [59] Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn cũng không đủ để trở thành chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi được phát hiện trong mẫu ruột hoặc phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa

Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của probiotic có thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít gắn bó hơn và tạm thời hơn so với hệ vi sinh vật đường ruôt ở người Vì vậy, định nghĩa về probiotics hiện tại là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe của người

hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp nhận”

2.1.3 Thành phần vi sinh của chế phẩm probiotics

Vi khuẩn dùng rộng rải nhất và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loài

thuộc giống Lactobacillus như: L acidophilus, L rhamnosus, L bulgaricus, L

reuteri và L casei; tuy nhiên cũng có cả các loài không thuộc vi khuẩn lactic như: Bacillus cereus, B clausii, B pumilis, Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P jensenii, P acidopropionici, P thoenii, và một số nấm men không

gây bệnh Saccharomyces boulardii , Saccharomyces cerevisiae

Đối tượng cạnh tranh của vi khuẩn probiotic

Những vi khuẩn probiotic này có hoạt động chống lại những vi khuẩn có hại Đó

là sự ngăn chặn hoạt động của một số vi khuẩn sau: Serratia marcescens, Proteus

vulgaris, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa ,Staphylococus auerus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio comma

2.1.4 Cơ chế hoạt động của probiotics

2.1.4.1 Tác động kháng khuẩn của probiotics

cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh đồng thời tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxide và đăc biệt là bacteriocin Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic

Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn

để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng

trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase Chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào

Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn

trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào Đó là nguyên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế bào Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết

Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng

nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng Một vài bacteriocin của lớp I như nisin,

nó có hai kiểu hoạt động, chúng có thể kết hợp với lipid II, như xe chuyên chở các tiểu đơn vị peptidoglycan từ tế bào chất đến thành tế bào, vì thế ngăn cản sự tổng hợp thành tế bào, dẫn đến tế bào chết Ngoài ra, chúng có thể sử dụng lipid II như cắt phân tử để bắt đầu quá trình gắn vào màng và hình thành kênh dẫn đến tế bào chết nhanh chống Lantibiotic có hai chuỗi peptid như lacticin 3147, chúng có thể có hai hoạt động này do cả hai peptid tham gia Nhưng ngược lại, mersacidin có duy nhất một hoạt động gắn vào lipid II nhưng không hình thành kênh Thông thường những peptid lớp II có cấu trúc như một xoắn anpha lưỡng tính và được cài vào tế bào gốc của màng dẫn đến bị khử cực và chết Bacteriocin của nhóm III như là lysostaphin có thể tác động trực tiếp vào thành tế bào của vi khuẩn gram dương dẫn đến chết và làm tan tế bào gốc [37]

2.1.4.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột

- Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô

- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn

2.1.4.3.Tác động miễn dịch của probiotics [48]

- Probiotics như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột

- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm

- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng [32], bệnh chàm [10]

2.1.4.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột

Probiotics điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột Ở những phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn probiotic khác nhau Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic

sẽ giảm xuống Điều này đúng cho tất cả các loại probiotics

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột

2.1.5 Chức năng của probiotics

Vì có nhiều cơ chế tác dụng, nhiều probiotics khác nhau có những ứng dụng cho

nhiều bệnh khác nhau

- Tiêu hóa thức ăn và làm giảm bớt sự rối loạn tiêu hóa: Trong tất cả trường hợp tiêu chảy do nhiễm trùng, điều trị bằng probiotics có thể giảm thời gian bệnh cũng như mức độ trầm trọng của bệnh, dựa trên hồi cứu lớn của Cochrane và phân tích meta gồm cả nghiên cứu tiêu chảy do siêu vi và tiêu chảy ở người

- Đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B

- Bảo vệ chống lại E coli, Salmonella và sự lây nhiễm những vi khuẩn khác:

Probiotics được xem vừa an toàn vừa công hiệu để phòng ngừa và điều trị tiêu chảy

do nhiễm trùng Cơ chế tác dụng khả dĩ có thể là kết hợp tranh chỗ trực tiếp với vi trùng gây bệnh trong ruột và điều hòa và tăng cường hệ miễn nhiễm

- Cải thiện dung nạp lactose và hoạt động của các enzyme khác: Hiện tượng

không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới do cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose Enzyme này được giải phóng khi vi khuẩn bị dung giải do tác dụng của acid mật [64] Triệu chứng của bệnh thường gây phìn bụng, đầy hơi, tiêu chảy Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal et al 2000 vi khuẩn

Latobacillus và Bifidobacteria làm tăng enzyme lactase trong ruột non tạo khả năng

phân giải lactose

- Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh [25]: khoảng 20% người dùng thuốc kháng

sinh, đặc biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy Nguyên nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân bằng

hệ vi sinh đường ruột Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là những tác nhân

gây bệnh chính, khi hệ vi sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lượng ít trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh

tiêu chảy do kháng sinh kết quả cho thấy chủng S bolardii, S boulardii,

Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng

làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L acidophilus để trị

bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả

- Tác dụng trong trị tiêu chảy cấp : nguyên nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở các nước đang phát triển Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lb.rhamnosus GG,

Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng rotavirus

trong hệ tiêu hóa [43] Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em ở châu Á,

cho thấy rằng khi sử dụng Lb rhamnosus GG có thể rút ngắn một nữa thời gian chữa trị Tuy nhiên, ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L rhamnosus đã bị bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L rhamnosus sống điều này chứng tỏ

L rhamnosus sinh ra những hợp chất có khả năng ngăn ngừa sự hoạt động của các rotavirus

- Ngăn ngừa chứng viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi

khuẩn, virus, kí sinh trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và

dưỡng Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nước nghiêm trọng gây nguy hiểm cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi và trẻ suy dinh dưỡng [43], [31]

- Kích thích hệ miễn dịch: mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, tuy nhiên việc

sử dụng probiotics có tác dụng làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự

nhiên Nhiều vi khuẩn Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích

hình thành bạch cầu trung tính, kích thích tế bào tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma [43]

- Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng tiết ra

chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư hoạt hóa Những

nghiên cứu trên người sử dụng L acidophilus hoặc L casei làm giảm đáng kể hoạt

động của các enzyme trên [64], [11]

- Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất

cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật khi lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch như xơ vữa động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi máu cơ tim, đột quỵ Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C có trọng lượng phân tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C có trọng lượng phân tử cao (hay còn gọi là cholesterol có lợi) HDL vận chuyển cholesterol đến các cơ quan, vì vậy nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành Ngược lại LDL-C vận chuyển cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên nếu nồng độ LDL-C trong máu cao là có nguy cơ mắc bệnh cao LDL-C luôn tạo ra các mảng xơ vữa trên thành các động mạch nói chung và động mạch vành tim nói riêng Các mảng xơ vữa này làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có thể bít tắc, từ đó gây nên tình trạng thiếu máu đến nuôi dưỡng tế bào cơ tim, gây ra các cơn đau thắt ngực và nhồi máu cơ tim Nghiên cứu của Gilliland SE, Walker DK(1990) [22] trong điều kiện thí nghiệm vi khuẩn có thể làm giảm lượng cholesterol trong môi trường nuôi cấy Một nghiên cứu của Lin et al về khả năng làm

giảm cholesterol trong máu của L bulgaricus và L acidophilus [22], [49]

2.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic [35], [70]

Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm Và một đặc tính khác của

vi khuẩn lactic đã được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002)

Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

Sơ đồ 2.1:[27] Cây phân loại vi khuẩn lactic, gồm một số vi khuẩn hiếu khí và

kỵ khí tùy nghi, gram dương

Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau

toàn với con người

2.2.2 Đặc tính chung

Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và acid Phần lớn chúng không lên men được tinh bột

và các polisaccharid khác

Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua Vi khuẩn lactic thuộc

họ Lactobacillaceae, thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que

Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn

lactic, thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của

Bergey 1957, trong đó chúng được xem là Lb bifidum mặc dù Bifidobacterium

không phù hợp với các mô tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều

hơn đến nhóm Actinomycetaceae một nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường

lên men đường khác với vi khuẩn lactic

Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu

nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Đây là

những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không tạo bào tử Tất cả vi khuẩn lactic đều không chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2†3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8†4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng

pH 5,5÷6

chúng bị chết sau 10†30 phút

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại rau, quả, sữa, thịt,…)

Bảng 2.1:Phân loại khoa học giống Lactobacillus [8]

Hình 2.1: Lactobacillus (L acidophilus) [61]

* Đặc tính: Tế bào có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ là giống được sử dụng rộng rãi, là loài có khả năng chịu đựng pH acid thấp Kích thước tế bào 0,5-1,2 x 1,0-10,0μm Ở phase tăng trưởng, tế bào thường tạo chuỗi Không di động, không tạo bào tử, tế bào non gram dương và gram âm khi

mạnh trong môi trường agar, kỵ khí có 5-10% O2 Các thử nghiệm catalase, cytochrome và benzidine âm tính

• Hơn 50% sản phẩm cuổi cùng của chuyển hóa carbohydrate là lactate, phần còn lại là acetate, formate, succinate, CO2 hoặc ethanol Không tạo acid dễ bay hơi

có số nguyên tử carbon hơn hai Khả năng khử nitrate kém và tạo pH dưới 6,0 Không hóa lỏng gelatin Không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan Không tạo indole và H2S

• Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp: amino acid, peptide, các dẫn xuất acid nucleic, vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồn carbohydrate và đặc

triển tốt ở pH khoảng 5 và pH tối ưu là 5,5-5,8 Tìm thấy trong các sản phẩm sữa, hạt kefir, sản phẩm thịt, nước, nước thải, bia, rượu vang, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua, miệng, đường tiêu hóa người và nhiều loài động vật Ít khi gây bệnh Hàm lượng G+C của DNA là 34,7 ± 1,4 đến 53,4 ± 0,5 mol%

* Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic đồng hình:

- Lactobacillus acidophilus: trực khuẩn dài Đây là loại ưa nhiệt, nhiệt độ tối

từ ruột trẻ em và bê mới đẻ

- Lactobacillus bulgaricus: trực khuẩn tròn (đôi khi dạng hạt), thường kết thành

chuỗi rất dài được tìm ra do Metchnikoff ở sữa chua Bungari Có khả năng lên men được đường glucose, không lên men được đường saccharose Đây là loại ưa nhiệt,

khả năng tạo acid rất cao (từ 2,5†3,7% acid lactic)

- Lactobacillus plantarum: trực khuẩn nhỏ, thường kết thành đôi hoặc chuỗi Là

C, tích tụ được khoảng 1,3% acid Loại này tìm thấy chủ yếu trong rau muối chua và ủ chua thức ăn xanh dùng cho chăn nuôi Flening (1969) đa kết luận rằng sự đóng góp quan trọng nhất của vi khuẩn này là việc tạo mùi vị cho sản phẩm lên men và sinh ra hàm lượng acid để bảo

* Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình:

- Lactobacillus brevis: tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa

chuột,

nên nó còn được gọi là "trực khuẩn bắp cải" Trong lên men, ngoài tạo thành acid lactic (1,2%) nó còn tạo thành acid acetic, rượu ethylic (2,4%) và CO2 Đồng thời tạo hương làm sản phẩm có hương vị dễ chịu

- Lactobacillus pentoaceticus: là trực khuẩn, không sinh bào tử Nhiệt độ thích

fructose, galactose, mannose

- Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo

thành chuỗi hay đơn, có khi tạo thành từng đôi một khi lên men tạo thành rượu, acid latic, acid acetic và CO2, chúng có khả năng tạo bào tử Tế bào sinh dưỡng thường

- Lactobacterium – coli – aerogenes: là giống đại diện của lên men lactic dị hình

Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp cho phát trển là

động vật, trong sữa chua,… Sản phẩm của vi khuẩn này là acid lactic, acid acetic,

Hình 2.2: Streptococcus [71]

Gồm các loài: S agalactiae, S anginosus, S bovis, S canis, S equi, S iniae, S

mitis, S mutans, S oralis, S parasanguinis, S peroris, S pneumoniae, S pyogenes,

S ratti, S salivarius, S salivarius ssp thermophilus, S sanguinis…

* Đặc tính: có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào 0.5-1µm

Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn Là loại vi khuẩn không nha bào, có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose,…

* Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình:

+ Steptococcus cremoris: thường tạo thành một chuỗi dài Tế bào có kích thước

Rosenbach, 1884

+ Streptococcus lactis Nhiệt độ phát triển tối ưu là 25†350C, nhiệt độ tối đa là

+ Steptococcus lactis: cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn non, kết song

tích tụ được khoảng 0,8†1% acid Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin,

là một hợp chất có tính kháng sinh được dùng trong bảo quản thực phẩm

+ Streptococcus thermophillus: hình cầu kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất ở

* Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình:

- Streptobacterium brassicae fermentati: thường thấy chúng có trong dịch lên men

chua rau cải Thường tồn tại tế bào đơn hoặc ghép thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn và thường tạo thành chuỗi dài hình sợi Đuôi tế bào thường uốn cong lại Khi lên men rau cải chua tạo thành acid lactic, acid acetic và rượu (đến 2,4%) và CO2 Chúng lên men saccharose tốt hơn lactose

2.2.3.3 Giống Leuconostoc

* Phân loại:

Bảng 2.3: Phân loại khoa học giống Leuconostoc [62]

Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes

Hình 2.3: Leuconostoc [68]

Gồm các loài nhƣ: L carnosum, L citreum, L durionis, L fallax, L ficulneum,

L fructosum, L garlicum, L gasicomitatum, L gelidum, L inhae, L kimchii, L lactis…

* Đặc tính: có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0.5-0.8µm và chiều

dài khoảng 1.6µm trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3 µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo

thành đám tập trung Trong số đó, Leuconostoc mensenteroides cùng với một số vi khuẩn lactic đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến

rau muối chua

Giống: Pediococcus

Claussen 1903

Hình 2.4: Pediococcus sp [67]

Gồm các loài nhƣ: P acidilactici, P cellicola, P claussenii, P damnosus, P

ethanolidurans, P inopinatus, P parvulus, P pentosaceus, P stilesii

* Đặc tính: là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt tính thủy phân

protein rất yếu Gram dương, thường dính lại với nhau thành cặp đôi hoặc bốn Quá trình trao đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình.Chúng là những vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường Vì chúng không

có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể Các loài

Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu acid và chịu NaCl

2.2.4 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa

2.2.4.1 Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

2.2.4.1.1 Nhu cầu dinh dƣỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

2.2.4.1.2 Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy

để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

2.2.4.1.3 Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không

có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

2.2.4.1.4 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid xitric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

2.2.4.1.5 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình

tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

2.2.4.1.6 Nhu cầu dinh dƣỡng oxi

Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy

+ Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn

ATP,

cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

2.2.4.2 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic

Dựa vào khả năng lên men lactic người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

2.2.4.2.1 Lên men lactic đồng hình

Lên mem lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl, …………

Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá theo chu trình Embden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả các loai enzym aldolase, còn hydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat dược chuyển đến pyruvat

Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pynivic không phân huỷ nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic theo sơ đồ chuyển hoá dưới đây:

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành acid lactic

Cũng có một số tác giả cho rằng lên men lactic đồng hình tiến hành theo hai giai đoạn :

Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ sự oxi hoá photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide (PN) để tạo acid photphoglyceriaic

Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự có mặt của lactataxemase mà loại acid lactic dạng nào được tạo ra D(-), L(+) hoặc DL

2.2.4.2.2 Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic, etanol, acid succinic, CO2,………

Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 … Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các laọi khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình

Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

2.2.5 Sản phẩm của quá trình lên men ở vi khuẩn lactic

2.2.5.1 Các enzyme tiêu hóa

Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase, glycolase và lactic dehydrogenase

• Proteolysis (khả năng phân giải protein): Vi sinh vật tổng hợp protease giúp phân hủy protein thành những hợp chất đơn giản có thể tiêu hóa được.Hoạt

tính này của Lactobacilli trong đường ruột giúp phân hủy protein và vật chủ có

thể tiêu thụ dễ dàng

• Lipolysis: Vi sinh vật tổng hợp lipase giúp phân hủy các chất béo phức tạp thành những hợp chất đơn giản Điều này có thể hữu ích trong việc tạo ra các khẩu phần ăn dinh dưỡng và hợp lý cho trẻ em, người già và người đang dưỡng

• Biến dưỡng lactose: Vi khuẩn sinh acid lactic có enzyme b-galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase có thể sản sinh acid lactic từ lactose Acid lactic

có những lợi ích như sau:

- Chữa trị bệnh không dung nạp lactose do thiếu các enzyme biến dưỡng enzyme

- Tăng cường khả năng tiêu hóa protein trong sữa bằng việc làm đông tụ sữa

- Tăng cường việc sử dụng canxi, phospho, sắt

- Kích thích sự bài tiết

- Kích thích sự tiêu hóa trong dạ dày

- Bảo tồn nguồn năng lượng trong quá trình hô hấp

2.2.5.2 Các vitamin và các chất trao đổi có lợi cho sự tăng trưởng

• Vitamin: Vi sinh vật dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K

• Khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn

• Bacteriocin: Bacteriocin là những hợp chất có bản chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn gram âm hoặc gram dương Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:

- Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng

vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm và vì tính an toàn của chúng

- Bacteriocin được sản xuất bởi LAB được chia thành 4 lớp:

Lớp I: (Lantibiotic) là những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chứa những amino acid hiếm và một số amino acid khử nước Lantibiotic được tạo thành ở

trạng thái bất hoạt với trình tự leader peptide ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa

Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa), thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa Lanthionine và bền nhiệt, phổ kháng khuẩn hẹp

Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt, lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của

bacteriocin Bacteriocin lớp III được thu nhận từ một số giống Lactobacillus

Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid và carbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch

2.2.5.3 Các chất khác có khả năng kháng bệnh

Vi khuẩn sinh acid lactic cũng có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh thông qua một số các sản phẩm biến dưỡng khác như: hydrogen peroxide, cacbon dioxide và diacetyl

Quá trình biến dưỡng của vi khuẩn sinh acid lactic có ảnh hưởng đến khả năng kháng lại các vi sinh vật có hại và các dạng hoạt động khác của chúng được tổng kết ở bảng 2.5

Bảng 2.5: Sản phẩm biến dƣỡng và kiểu hoạt động đối kháng

tính thấm của màng

Hydrogen peroxide

Lactoperoxide

Oxy hóa các protein cơ bản

vào màng làm giảm pH nội bào Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như:

oxidative phosphorylation

tổng hợp protein

2.2.6 Đối tƣợng cạnh tranh của vi khuẩn probiotics

gây bệnh nguồn gốc thực phẩm như:

2.2.6.1 Escherichia coli

Escherichia coli (E coli 0157:H7) là vi khuẩn gram âm, hình que, kỵ khí không

bắt buộc, không sinh bào tử, sống trông hệ đường ruột con người và động vật Dưới một điều kiện nào đó nó có thể trở thành tác nhân gây bệnh và gây nhiễm độc thức

ăn, tiêu chảy xuất huyết và suy thận E coli O157:H7 sinh ra độc tố làm hại đến mạng

ruột Những loại này bắt đầu từ đường ruột của gia súc và lan nhiễm sản phẩm thịt bò

và sữa

Hình 2.5: Escherichia coli

E coli là dạng trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ

biến trong tự nhiên và đặt biệt trong đường tiêu hóa của người và động vật Chúng lên men đường lactose và glucose, cho phản ứng dương tính với indol và methyl red song có phản ứng âm tính với Voges Proskauer và citrate Cách hữu hiệu nhất để định danh loài là xác định kiểu huyết thanh, dùng kháng thể tương hợp với kháng

nguyên O, H và K của các chủng E coli khác nhau

Phần lớn E coli phân lập từ môi trường là loại không gây bệnh Nhóm E coli gây bệnh đường ruột EPEC (enteropathogenic E coli diarrheagenic E coli) thuộc

nhóm huyết thanh đã được xác định về mặt dịch tễ là những tác nhân gây bệnh tuy vẫn chưa chứng minh được cơ chế gây bệnh của chúng thuộc dạng nội độc tố không chịu nhiệt hay nội độc tố chịu nhiệt hay thuộc nhóm xâm nhiễm dạng Shigella Một

nhóm E coli gây bệnh khác là EIEC (enteroinvasive E coli) rất giống với Shigella bởi khả năng gây bệnh lỵ do xâm nhiễm và chứng tiêu chảy ở người Nhóm E coli gây bệnh cuối cùng là ETEC (enterotoxigenic E coli) có khả năng sinh một hoặc cả

hai loại độc tố ruột từng được biết rõ là loại không chịu nhiệt và loại bền nhiệt không

có tính kháng nguyên

2.2.6.2 Salmonella

Salmonella enteritidis được phân lập từ năm 1884 và hiện vẫn là một tác nhân

gây bệnh do thực phẩm quan trọng Đây là loại trực khuẩn gram âm kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử , di động bằng chu mao

Có ba dạng bệnh thực sự do Salmonella Sốt thương hàn do Salmonella typhy, nhiễm trùng máu do Salmonella cholera-suis, rối loạn tiêu hóa do Salmonella

typhimurium và Salmonella enteritidis Các triệu chứng bệnh do Salmonella như nôn

mửa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy, sốt xuất hiện 12-24 giờ sau khi ăn phải thức ăn

chứa 1-10 triệu Salmonella trong 1 g Bệnh kéo dài 2-3 ngày Phần lớn bệnh nhân hồi

phục song cũng có những trường hợp tử vong, đặt biệt ở người già, trẻ sơ sinh, người suy yếu hệ miễn dịch

Hình 2.6: Salmonella enteritidis 2.2.6.3 Listeria monocytogenes

Đây là vi khuẩn gram dương, không bào tử, yếm khí và có thể phát triển trong tế bào (intracellulaire facultatif)

Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có L monocytogenes mới là tác

nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩn từ thực phẩm (infection alimentaire) Có tất

cả 11 chủng huyết thanh trong đó 90% trường hợp bệnh Listeriosis ở người đều do

các serotype 1a, 1b và 4b gây nên Trong ba nhóm vừa kể, thì 4b là serotype độc hại

nhất.Vi khuẩn L monocytogenes sống rất dai và có thể phát triển ở nhiệt độ từ 3°C

đến 45°C

Vi khuẩn L monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh Chúng được thấy trong

đất cát, trong nước, trong phân thú vật và cả trong phân người Rau cải, salade, có thể bị nhiễm từ nước bẩn và từ phân gia súc Thú vật có thể chứa vi khuẩn nhưng không bị bệnh Chúng có thể lây nhiễm vào tất cả thực phẩm như thịt, sữa, thịt nguội

và đồ biển

Sữa tươi không được hấp khử trùng (raw milk, unpasteurized milk) có thể chứa

vi khuẩn L monocytogenes

Khác với đa số vi khuẩn khác , L monocytogenes có thể tăng trưởng chậm

trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từ tay đã bị nhiễm trùng

Hình 2.7: Listeria monocytogenes

2.2.6.4 Staphylococcus aureus

Là các cầu khuẩn gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1 μm,

được các nhà vi khuẩn học nổi tiếng quan tâm nghiên cứu, tỉ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng kháng sinh rất mạnh Các nhà vi khuẩn học lừng danh như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẫu Thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng

khái niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng

nhiễm Staphylococcus aureus thường là thực phẩm giàu protein, có độ ẩm cao như:

thịt chế biến sẵn, cá, gia cầm, sản phẩm từ sữa, các thức ăn ngọt

Kết quả điều tra mới đây của Bộ NN-PTNT cho thấy, có rất nhiều mẫu thịt bị nhiễm khuẩn vượt quá mức cho phép: Các loại vi khuẩn tìm thấy trong các mẫu thịt

được đưa đi xét nghiệm là Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng), Clostridium

perfringens (vi khuẩn yếm khí), và Salmonella (vi khuẩn gây bệnh phó thương

hàn).[15]

2.2.6.5 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập đầu tiên trên cá

nheo(Hawke,1979) Loài vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh trên cá nheo và hiện nay

là cá tra ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam Khi cá bị nhiễm bệnh,

tỉ lệ chết tăng cao từ 10-90% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân thường gọi là bệnh trắng gan [1]

Ngoài ra probiotics con có tính đối kháng với một số loài khác như: Serratia

marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae , Vibrio comma

2.3 Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic 2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới

Trong những năm gần đây, khả năng kháng cự lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong sự điều trị bệnh của con người và động vật Vì thế sự tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh Trong số đó, sự sản xuất probiotics từ vi khuẩn lactic

đã thu hút nhiều sự chú ý do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm

2.3.2 Các tiêu chuẩn để chọn các chủng probiotics

Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau:

- Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch mât)

2.3.3 Các phương pháp tìm kiếm các nguồn probiotics mới

Hiện nay trên thị trường có nhiều sản phẩm probiotics dùng trong dược phẩm, chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm đều giống nhau

về thành phần vi sinh, chỉ khác nhau về nhà sản xuất mà các chủng vi sinh mang đặc tính probiotic lại rất đa dạng, mỗi chủng lại có phổ tác dụng khác nhau vì vậy việc phân lập để tuyển chọn ra những chủng, giống mới sẽ góp phần làm phong phú thêm nguồn probiotics, làm tăng khả năng phòng và trị bệnh cho người và động vật Viêc lựa chọn và phân lập các chủng vi khuẩn sản xuất probiotics là một quy trình lựa chon cẩn thận

Phân lập các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên biệt đặc trưng, tìm kíếm

và lựa chọn các khuẩn lạc mang đặc điểm hình thái như những giống mà mình đang tìm kiếm

Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm Và một đặc tính khác của vi khuẩn lactic đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002) Vì các chủng vi khuẩn lactic thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp

kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên, đồng thời vì chúng có nguồn gốc từ thực phẩm nên đa số là đảm bảo về mặt an toàn cho con người và vật nuôi

Vì vậy vi khuẩn lactic thường được chọn để trở thành probiotics

Vi khuẩn lactic được phân lập trên môi trường chuyên biệt MRS (DeMan, Rogosa,

Sharpe) [18] từ nhiều nguồn khác nhau:

- Từ các sản phẩn thực phẩm lên men như: kefir, sữa chua, dưa chua, nem chua, kim chi…

- Từ phân của các gia cầm: thỏ, gà, heo…

- Từ sữa mẹ

Một chủng vi khuẩn sau khi đã được tuyển chọn, tạo dòng thuần thì viêc quan trọng kế tiếp là phải xác định chúng thuộc giống nào, loài nào Vì vậy, các phương pháp định danh được áp dụng

Công việc tuyển chon ngoài việc tìm ra chủng đảm bảo những thuộc tính đặc biệt của probiotics, đảm bảo sự ổn định và độ thuần khiết cao và từ đó lự chon chủng có hoạt lực cao nhất theo từng mục đích sử dụng, từng đối tượng cho phù hợp

Khảo sát tính an toàn của chủng trước khi mang đi sử dụng Sự an toàn cho con người, cho động vật và cho môi trường

2.3.4 Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập

2.3.4.1 Các phương pháp định danh cổ điển đối với vi sinh vật [2]

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v và dựa theo khoá phân loại của Bergey để xác định chủng vi khuẩn vừa phân lập có phải thuộc họ mình cần tìm hay không

* Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:

- Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)

- Kiểm tra khả năng di động: Nhuộm tiên mao, phương pháp kiểm tra trên môi

- Nhuộm bào tử: Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton) Nhuộm Carbolic Fuchsin

- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): Phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp Đỏ Congo,

Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)

- Nhuộm thành tế bào

- Nhuộm hạt dị nhiễm

- Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)

- Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)

- Nhuộm vi khuẩn kháng acid

* Các phương pháp dựa trên điều kiện nuôi cấy và đặc điểm sinh lý:

- Hình thái khuẩn lạc

- Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt

- Nhu cầu oxygen

* Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa: Tùy thuộc vào nguồn phân

lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: Khả năng đồng hóa các nguồn carbon, Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa Citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidaza, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, sorbitoi, phản ứng M.R (Đỏ Methyl - Methyl Red), phản ứng V.P (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG-aza

Ngoài ra còn một số dựa trên phản ứng sinh hóa chuyên biệt hơn như:

- API20E KIT

Nguyên tắc: dựa vào 20 phản ứng khác nhau Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gene quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả

- Phân biệt bằng thực khuẩn thể:

Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu

Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ

- Phân biệt theo Typ huyết thanh:

Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt) Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ) Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chung đây là phương pháp khá

ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại

- Phân biệt bằng loại hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin):

Bacteriocin bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu bacteriocin

2.3.4.2 Các phương pháp định danh vi sinh vật dựa theo kỹ thuật sinh học phân tử [3]

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng