Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ ruột cá

51 3.2.10.Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn đề tài phân lập được ..... Phụ phế phẩm trong sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần là

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS TỪ RUỘT CÁ

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN THỊ HAI

TP Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự

hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hai, giảng viên khoa Công nghệ sinh học – Thực

phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh

Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án

tốt nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào Các số liệu trích dẫn trong đồ

án tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ

án của mình

TP HCM, ngày 19 tháng 08 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Hồng Sếch Hếnh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây dựng đề cương, thực hiện và hoàn thành đồ án này

Em xin cám ơn đến thầy Huỳnh Văn Thành đã giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em thực hiện đồ án

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô khoa công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường đã tận tình chỉ bảo truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập để vận dụng kiến thức nền tảng ấy vào thực hiện đồ án này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã chăm sóc, dạy dỗ và làm chỗ dựa tinh thần động viên, hỗ trợ kinh tế cho em trong suốt những năm qua và trong quá trình thực hiện đồ án này

Em cũng xin cám ơn đến các bạn cùng thực hiện đề tài trong phòng thí nghiệm đã quan tâm, hỗ trợ em làm đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng em xin cám ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến quý Thầy Cô

Tp Hồ Chí Minh, 19 tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Hồng Sếch Hếnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 2

2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 3

3 Mục đích nghiên cứu 3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

7 Ý nghĩa đề tài khoa học 4

8 Các kết quả đạt được của đề tài 4

9 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1 Đại cương về Bacillus subtilis 6

1.1.Lịch sử phát hiện 6

1.2.Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis 6

1.2.1.Đặc điểm phân loại 6

1.2.2.Phân bố 7

1.3.Đặc điểm hình thái [36] 7

1.4.Đặc điểm phân lập, nuôi cấy 7

1.4.1.Đặc điểm phân lập 7

1.4.2.Đặc điểm sinh hóa 8

1.5.Đặc điểm tế bào và khả năng sinh bào tử 9

1.5.1.Đặc điểm tế bào 9

1.5.2.Cấu tạo bào tử 10

1.6.Tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin 11

1.7.Ứng dụng của Bacillus trong sản xuất và đời sống [9] 11

1.8.Giới thiệu enzyme amylase và protease của tế bào 12

1.8.1.Enzyme amylase [12] 12

1.8.2.Enzyme protease 15

1.9.Một số enzyme ở cá 19

1.10.1.Thành phần cá, phụ phế phẩm cá 20

1.10.2.Tình hình đánh bắt, sản xuất ở Việt Nam 21

1.11.Phân bón có nguồn gốc từ cá 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 24

2.1.1.Địa điểm nghiên cứu: 24

2.1.2.Thời gian nghiên cứu 24

2.2.Vật liệu nghiên cứu: 24

2.2.3.Thiết bị và dụng cụ 25

2.3.Bố trí thí nghiệm 26

2.3.1.Bố trí thí nghiệm chung 26

2.3.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết 26

2.4.Phương pháp nghiên cứu 30

2.4.1.Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 30

2.4.2.Phương pháp tăng sinh 30

2.4.3.Phương pháp pha loãng mẫu 30

2.4.4.Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein [14] 31 2.4.5.Phương pháp định tính khả năng sinh protease của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 31

2.4.6.Kiểm tra độ thuần khiết của giống : 32

2.4.8.Phương pháp cấy chuyền [38] 32

2.4.9.Phương pháp bảo quản lạnh sâu : 32

2.4.10.Các phương pháp xác định đặc điểm hình thái 33

2.4.11.Các thử nghiệm sinh hóa đối với các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ là Bacillus subtilis 34

2.4.12.Phương pháp đục lỗ thạch 37

2.4.13.Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein 38

2.4.14.Phương pháp xử lý số liệu thống kê 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1.Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng là Bacillus subtilis 39

3.2.Kết quả thử nghiệm sinh hóa 42

3.2.1.Kết quả test catalase 42

3.2.2.Nhuộm gram 42

3.2.3.Nhuộm bào tử 44

3.2.4.Kết quả thử nghiệm Citrate 45

3.2.5.Kết quả thử nghiệm Nitrate 46

3.2.6.Thử nghiệm MR - VP 47

3.2.7.Thử nghiệm indole 49

3.2.8.Thử nghiệm di động 50

3.2.9.Thử nghiệm lên men Carbohydrate 51

3.2.10.Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn đề tài phân lập được 52

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

4.1.Kết luận 58

4.2.Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis 9

Bảng 1 2 Phân loại protease theo Barret, 1984 18Bảng 1 3 Thành phần khối lượng cá tra và một số loài cá khác 22

Bảng 3 1 Đặc điểm hình thái cụ thể của 8 chủng vi khuẩn đồ án phân lập được 39Bảng 3 2 Kết quả định tính enzyme ngoại bào amylase và protease của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 53Bảng 3 3 Kết quả định danh sơ bộ bằng test sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cá 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Tế bào Bacillus subtilis 6

Hình 1 2 Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản của Việt Nam từ 1995 - 2015 22

Hình 2 1 Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm 26

Hình 2 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có trong ruột cá 27

Hình 2 3 Quy trình dịnh danh sơ bộ các chủng phân lập được 29

Hình 3 1 Kết quả thử nghiệm catalase 42

Hình 3 2 Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn phân lập khi nhuộm Gram 44

Hình 3 3 Kết quả nhuộm soi bào tử của chủng phân lập được 45

Hình 3 4.Thử nghiệm Citrate đối với các chủng phân lập được 46

Hình 3.5 Kết quả khảo sát khả năng khử nitrate của chủng vi khuẩn phân lập được 47

Hình 3 6 Hình ảnh test Methyl red của các chủng phân lập được 48

Hình 3.7 Kết quả phản ứng VP của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 49

Hình 3 8 Phản ứng test indol ở các chủng được phân lập 50

Hình 3 9 Khả năng di động của 8 chủng phân lập được 51

Hình 3 10 Hình ảnh đặc trưng của môi trường trong khảo sát khả năng lên men đường 52

Hình 3 11 Khảo sát định tính protease trên Casein agar với thuốc thử là TCA 10 % 54

Hình 3 12 Kết quả test định tính enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập được 55

FAO Food and Agriculture Organization of

the United Nations

TCA Trichloroacetic acid

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành chế biến thủy sản của nước ta sản lượng ngày càng tăng, mang lại nguồn lợi lớn cho quốc gia, song bên cạnh đó, việc chế biến thủy sản không sử dụng hết toàn bộ các phần của chúng mà để lại nguồn phụ phế phẩm rất lớn, nếu không được xử lý sẽ lãng phí và gây ô nhiễm môi trường do quá trình phân giải các protein, lipid…theo Trần Duy 2014, hiện nay trên toàn cầu có khoảng 70 triệu tấn thủy sản đang được chế biến ở dạng phi lê, đông lạnh, đóng hộp hoặc ngâm tẩm Trong năm 2011, sản lượng cá ngừ toàn cầu đạt 4,6 triệu tấn, tuy nhiên sản phẩm cá ngừ đóng hộp chỉ có gần 2 triệu tấn [32], điều này có nghĩa là lượng phụ phẩm cá ngừ thải ra từ công nghiệp chế biến cá ngừ này lên đến hơn 2 triệu tấn Việc đánh bắt, chế biến thủy sản xuất khẩu luôn đi kèm theo một lượng phụ phế phẩm khá lớn, theo thống kê của Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) lượng phụ phế phẩm bao gồm: đầu, xương, da, vây, vẩy, thịt vụn và nội tạng cá thải

ra trong quá trình chế biến đồ hộp chiếm từ 30 – 65 %, trong sản xuất cá phi lê, cá khô, cá muối, cá xông khói lượng phụ phế phẩm thải ra chiếm từ 50 – 75 % Sản xuất chế biến cá lấy phi lê, dùng đóng hộp thường chỉ lấy phần cơ, các phụ phế phẩm sản xuất cá ngừ đóng hộp có thế chiếm khoảng 65 % lượng nguyên liệu ban đầu, trong ngành sản xuất thịt cá ngừ cho thấy các phế phẩm, phụ phẩm chiếm khoảng 50 % tổng nguyên liệu ban đầu, đối với cá basa thì phụ phế phẩm trong chế biến cá phi lê gồm đầu, xương, mỡ, da, nội tạng, thịt vụn… và chúng chiếm khoảng

65 – 70 % lượng nguyên liệu ban đầu [19]

Phụ phế phẩm trong sản xuất chế biến thủy sản cá có thành phần là các chất hữu cơ giàu Nitơ, nếu sử dụng không đúng mục đích và xử lý không tốt chúng dễ bị phân hủy thành các chất gây ô nhiễm không khí (các protein khi bị vi sinh vật phân giải sẽ hình thành H2S, NH3…) và nhiều chất khác gây ô nhiễm cả nguồn đất, nguồn nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống, sức khỏe con người và môi trường, chính vì vậy cần có giải pháp khắc phục vần đề trên Tìm ra được các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein là một giải pháp hữu hiệu, an toàn, tận dụng hiệu quả nguồn phụ phế phẩm từ ngành công nghiệp chế biến thủy sản nói chung và chế biến cá nói riêng, từ đó có cách tận dụng hiệu quả

Trong ruột cá có hiện diện vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân

giải tốt protein cá, đặc biệt là các chủng Bacillus [19] Nhiều chủng Bacillus đã

được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, sản xuất enzyme, probiotic… Và cả trong sản xuất phân bón vi sinh phân giải lân, silicat, ức chế vi sinh vật gây bệnh, phân giải cellulose… (Lê Thị Hồng Nhung, 2015)

Các chủng vi sinh vật này có sẵn trong môi trường và cả ruột cá, (Rahul Krishnan, 2014), chúng tự phát triển hỗ trợ tiêu hóa cho cá khi còn sống và cùng các loài khác tiết enzyme phân giải cá khi cá chết đi Trong điều kiện tự nhiên chúng sinh trưởng được nhưng cần thời gian dài nhưng chúng sẽ phát triển nhanh chóng, tối ưu nếu như được tăng sinh hoạt hóa giống từ chủng thuần khiết, lúc này các chủng vi sinh vật này cho sản phẩm enzyme nhiều và tốt hơn, rút ngắn được thời gian xử lý phân giải nguồn phụ phế phẩm cá và cho ra sản phẩm tốt hơn, hiệu quả lên men tốt hơn

Sản xuất nông nghiệp hữu cơ là một phương pháp canh tác tiến bộ, chứa đựng trong đó là hàm lượng khoa học công nghệ và tính nhân văn cao (Lê Văn Hưng, 2001) Tính nhân văn cao ở chỗ là tất cả các công đoạn trong sản xuất nông nghiệp hữu cơ đều hướng đến sự an toàn cho con người, vật nuôi và môi trường sinh thái xung quanh, hướng đến một hành tinh xanh và sạch [5] Việt Nam là một nước có dân số sản xuất nông nghiệp lớn, diện tích đất sản xuất nông nghiệp lớn Theo thống

kê năm 2013, tổng diện tích đất nông nghiệp là 262.805 km2 (chiếm tới 79,4 %) bao gồm đất sản xuất nông nghiệp là 101.511 km2, đất lâm nghiệp là 153.731 km2, đất nuôi trồng thuỷ sản là 7.120 km2 [7] Vì vậy nhu cầu phân bón cho sản xuất nông nghiệp lớn Mặt khác sử dụng phân bón hóa học không có lợi cho đất, phân bón hóa học làm giảm pH của đất, chúng được hấp thụ nhanh, bón lượng lớn và ít các chất dinh dưỡng, cây hấp thụ không hết làm ô nhiễm môi trường đất

Từ những cơ sở trên, đề tài “phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ ruột cá”

được thực hiện để tận dụng hiệu quả và an toàn nguồn tài nguyên này là cần thiết

2 Tình hình nghiên cứu

2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bacillus subtilis được nghiên cứu khá rộng rãi trong nước nhằm sử dụng cho

mục đích sản xuất probiotic, thu nhận enzyme…

Một số công trình nghiên cứu như phân lập và ứng dụng Bacillus subtilis tiết

các loại protease như:

Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009 Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng Bacillus

phân lập từ đất vườn sinh protease kiềm

Bùi Thị Phi, 2007 Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng trong thức

ăn nuôi tôm, cá của Đặng Thị Mộng Quyên và Trần Thị Xô, 2006

Nghiên cứu khảo sát khả năng thủy phân protein phụ phẩm cá tra bằng

enzyme protease từ Bacillus subtilis S5 của Nguyễn Thị Nếp, 2005

2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Syeda Azeem Unnisa sản xuất phân bón từ thức ăn thừa có bổ sung đường nâu

Mrunmaya Kumar Panda cùng cộng sự đã nghiên cứu phân lập Bacillus sp

ưa nhiệt từ suối nước nóng có hoạt tính protease cao Cũng đã có một số công trình

nghiên cứu phân lập Bacillus subtilis từ ruột cá như của Jamal K.H Al Faragi và

Sundus A.A Alsaphar, 2012 hay của Rahul Krishnan phân lập từ cá nước ngọt,

2014

3 Mục đích nghiên cứu

Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme

protease mạnh từ ruột cá

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập và chọn lọc được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng sinh

enzyme protease mạnh từ ruột cá

Định danh sơ bộ bằng các test sinh hóa

Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng vi khuẩn phân lập được

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tổng hợp tài liệu:

+ Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài

+ Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu của đề tài

- Phương pháp nghiên cứu:

+ Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease và tuyển chọn các chủng có khả năng sinh enzyme mạnh nhất từ nguồn ruột cá

+ Thực hiện một số khảo sát về hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trưng cho các

chủng Bacillus subtilis để tuyển chọn chủng mong muốn, loại các vi sinh vật có

nguy cơ gây bệnh

+ Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme protease phân hủy protein từ các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

+ Khảo sát khả năng thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá từ chủng phân lập được

- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

+ Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát

+ Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System (SAS)

6 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng:

Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ nguồn ruột cá thu thập từ chợ

- Phạm vi giới hạn đề tài:

Vi khuẩn Bacillus subtilis phân giải protein có nguồn gốc từ cá

7 Ý nghĩa đề tài khoa học

- Ý nghĩa khoa học:

Phân lập được chủng vi khuẩn B.subtilis có khả năng phân giải protein đạt

hiệu quả cao, góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế bào và hình thái

khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn nhóm B.subtilis, xác định được điều kiện yếu

tố pH tố nhất đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn phân lập được

- Ý nghĩa thực tiễn:

Dựa trên kết quả thí nghiệm nghiên cứu thu được để góp phần tìm ra chủng

vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease mạnh ứng dụng để tạo ra các sản phẩm phân bón tận dụng phụ phế phẩm từ cá và bảo vệ môi trường

8 Các kết quả đạt được của đề tài

- Phân lập được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease phân

giải protein từ cá, từ kết quả phân lập sau khi định danh sơ bộ bằng các phản ứng

test sinh hóa đặc trưng của Bacillus subtilis thì trùng khớp

-Kết quả khả năng tổng hợp enzyme protease được thực hiện cho các chủng

vi khuẩn phân lập được trên môi trường nhân tạo giàu protein làm cơ sở để sản xuất chế phẩm phân bón từ nguồn phụ phế phẩm cá

-Bước đầu ứng dụng vi khuẩn phân lập tuyển chọn được vào xử lý thủy phân protein từ phụ phế phẩm cá

9 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

-Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được

-Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Đại cương về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis lần đầu tiên được phát hiện năm 1835 và được đặt tên là “vibrio subtilis” bởi nhà khoa học là Christian Gottfried Ehrenberg

Vào năm 1972 nó được đổi tên thành Bacillus subtilis bởi Ferdinand Cohn

Ngày nay, vi khuẩn này đã được sử dụng rất rộng rãi trong y học, chăn nuôi và thực phẩm (Lý Kim Hữu, 2005)

1.2.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:

Loài: Bacillus subtilis

Hình 1 1 Tế bào Bacillus subtilis

(Nguồn: http://www.bharatvyapar.in/mitushi-pharma/bacillus-subtilis)

1.2.2 Phân bố

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí túy nghi [21], chúng phân bố rộng khắp

mọi nơi trong tự nhiên, chúng được tìm thấy trong các tầng trên của đất, đường tiêu

hóa của động vật nhai lại và của con người [36], Bacillus subtilis thường được tìm

thấy nhiều ở cỏ khô nên chúng cũng còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu

cfu/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus

subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử

và tế bào Bacillus subtilis (trích Bùi Thị Phi, 2007) Trong ruột cá cũng có sự tồn tại

của chủng loài vi khuẩn này [19], [40]

Bacillus subtilis là một trực khuẩn có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột, chúng ức

chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại đối với đường tiêu hóa [11]

Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương, hai đầu tròn, phản ứng catalase

dương tính, chúng có khả năng tạo bào tử để tồn tại trong môi trường khắc nghiệt

B.subtilis có các roi giúp chúng di chuyển, vì vậy chúng có khả năng di chuyển

nhanh chóng trong chất lỏng Kích thước tế bào của chúng khoảng 0,5 - 0,8 µm × 1,8 - 3 µm [37]

Khi gặp điều kiện bất lợi, Bacillus subtilis sẽ hình thành bào tử để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ sống mới Bào tử B.subtilis có hình bầu dục,

kích thước khoảng 0,6 - 0,9 µm Phân bố không theo quy tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm

1.4.1 Đặc điểm phân lập

Bacillus subtilis phát triển tốt nhất trong điều kiện có oxy và nhiệt độ thích hợp

của chúng là 36 – 50 0C, tối đa khoảng 60 0C (trích Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009), nhiệt độ tối thích cho loài vi khuẩn này sinh trưởng là 37 0C (Bùi Thị Phi, 2007) Trong điều kiện thiếu oxy loài vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại, phát triển yếu nhờ khả năng lên men các nguồn carbonhydrate của chúng

Độ pH: pH tối ưu của Bacillus subtilis là trong khoảng 7 - 7,4

Khi nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch, khuẩn lạc B.subtilis khô, không màu

hoặc màu xám trắng, có dạng tròn, không đều hay phân tán, rìa răng cưa không đều, mép nhăn, tâm có màu sẫm, sau 1 - 4 ngày thì bề mặt khuẩn lạc trờ nên nhăn nheo

và khô, màu hơi nâu

Trên môi trường lỏng NB thì B.subtilis phát triển mạnh làm đục môi trường,

song song đó vi khuẩn kết màng phía trên bề mặt môi trường nuôi cấy

1.4.2 Đặc điểm sinh hóa

Bacillus subtilis có một số test sinh hóa đặc trưng sau:

Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Sucrose, Xylose, Arabinose

Indol (-), VP (+), Nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), Catalase (+), Amylase (+), Casein (+), Citrate (+), có khả năng di động và hiếu khí

Bảng 1 1 Kết quả định danh Bacillus subtiblis

(Theo Holt, 1992) (trích bởi Lý Kim Hữu, 2005)

1.5.1 Đặc điểm tế bào

Tế bào Bacillus subtilis hình que, là tế bào gram dương, chúng có khả năng sinh

ra bào tử để tồn tại qua thời điểm khó khăn, điều kiện môi trường khắc nghiệt như nhiệt độ tăng cao, môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn…

Thành phần hóa học chủ yếu của vách tế bào là lớp peptidoglycan dày mang diện tích dương đóng vai trò là duy trì cấu trúc của vách tế bào

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Gelatin +

Di động + Amylase +

1.5.2 Cấu tạo bào tử

Bacillus subtilis sinh bào tử, chiều ngang bào tử không vượt quá chiều ngang

của tế bào vi khuẩn nên không làm thay đổi hình thái tế bào mang bào tử [11] Bào tử là một cấu trúc hình thành do sự biến đổi của tế bào sinh dưỡng trong một giai đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn như điều kiện môi trường không thuận lợi, tế bào phát triển đến một giai đoạn nhất định Hai chủng vi

khuẩn gram dương có khả năng tạo bào tử là Bacillus và Clostridium

Bào tử vi khuẩn là một cấu trúc rất phức tạp [38], bào tử có nhiều lớp màng bao bọc, lớp ngoài cùng gọi là lớp màng khá mỏng và đó là lớp vỏ của tế bào mẹ, ngay dưới đó là lớp áo bào tử, lớp áo bào tử gồm nhiều lớp protein mỏng và không có tính thấm, lớp áo bào tử này đảm bảo tính kháng của bào tử

Vỏ của bào tử gồm nhiều lớp peptidoglycan chiếm một thể tích khá lớn, ít cầu nối nội peptide và ít liên kết chéo Trong cùng của bào tử là lõi bào tử được vách bào tử bao bọc có cấu trúc như một tế bào bình thường nhưng đang trong tình trạng bất hoạt [38]

1.5.2.1 Đặc điểm của bào tử

Bào tử ở Bacillus subtilis không phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng

là dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chuyên biệt giúp chủng loài tồn tại qua giai đoạn điều kiện sống bất lợi Bào tử không chỉ có khả năng lưu tồn tốt trong những điều kiện khó khăn của môi trường sống mà chúng còn có khả năng sống rất lâu (bào tử trong xác sinh vật cổ đại 1000 năm hoặc dưới đáy băng hà 3000 năm hoặc trong quặng mỏ 250 triệu năm đến nay vẫn còn sống) [11]

Nhiệt độ 100 0C, bào tử của một số loài Bacillus có thể chịu đựng được từ 2,5 -

Trong bào tử nước liên kết chiếm đến 40 % và chứa nhiều ion Ca2+

Sự nảy mầm của bào tử

Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử Quá trình này gồm 3 giai đoạn là: hoạt hóa, nảy mầm và sinh trưởng [11]

Khả năng tạo bào tử: theo Bùi Thị Phi, 2007 thì một trong những đặc điểm quan

trọng nhất của Baciluss subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện nhất định Bacillus subtilis hình thành bào tử theo chu kỳ sống hay khi gặp điều kiện bất

Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ

Lớp vỏ sơ khai hình thành giữ hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều peptidoglycan và tổng hợp DPA (acid dipicolinic), tích lũy calci, tính chiết quang cao

Kết thúc việc hình thành áo bào tử

Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt

Bào nang vỡ ra giải phóng bào tử ra ngoài [38]

Trong mỗi môi trường và điều kiện môi trường khác nhau, mỗi chủng loài vi khuẩn lại có khả năng sinh trưởng và phát triển khác nhau Khi thay đổi môi trường sống của chúng hay các yếu tố môi trường bất lợi làm điều kiện môi trường sống thay đổi theo chiều hướng bất lợi cho vi sinh vật sẽ làm chúng sinh trưởng và phát triển kém đi hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật

Theo Bùi Thị Phi, nếu môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của

Bacillus subtilis với số lượng lớn sẽ cạnh tranh sinh dưỡng và không gian sống giữa

vi khuẩn và nấm Bacillus phát triển khá nhanh nên sẽ phát triển trước so với nấm

nên sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng và sinh ra một số chất ức chế sự phát triển của nấm bệnh

Trong nông nghiệp, Nhật Bản có sản phẩm EM dùng sản xuất phân bón hữu cơ

1983 Viện vaxcin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng

Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội

đã sản xuất chế phẩm subtin từu Bacillus subtilis để phòng trừ nấm bệnh Ostriniaa

furnacalis trên bắp

1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Kumura từ

Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm Aspergillus Flavus, A paraciticus

1977, Nguyễn Vĩnh Phước, Bacillus subtilis tạo kháng sinh Subtilin và

Bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr + và Gr -

Vi khuẩn Bacillus subtilis có tiềm năng lớn về enzyme ngoại bào, nhiều trong số

enzyme ngoại bào này là những enzyme có tác dụng thủy phân các phân tử hữu cơ lớn và chúng được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp sản xuất thực phẩm, dược phẩm, dệt, công nghiệp thuộc da….[12] nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất protease, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase [13]

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và RNA nhưng chủ yếu vẫn là protein Vì là protein nên enzyme có cấu trúc không gian, không phải toàn bộ các phần của enzyme đều tham gia vào hoạt động xúc tác mà chỉ có những phần đặc biệt mới tham gia vào hoạt động xúc tác phản ứng được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme (tâm hoạt động của enzyme) [13] Trong nhiều trường hợp, các chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc ba có thể kết hợp với nhau tạo thành phân tử enzyme có cấu trúc bậc bốn Các enzyme bậc bốn là enzyme có cấu tạo từ nhiều tiểu đơn vị, mỗi tiểu đơn vị là một chuỗi polypeptide, các tiểu đơn vị này trong một enzyme có thể giống hoặc khác nhau và mỗi tiểu đơn vị này được gọi là một promoter

1.8.1 Enzyme amylase [12]

Amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và các polysaccharide tương tự diễn ra nhanh hơn, theo tính chất và tính đặc hiệu với liên kết glucoside, amylase được chia làm ba loại là α - amylase, β - amylase và

glucoamylase (γ - amylase) [13], tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả

năng tổng hợp được α - amylase mà không tổng hợp được β - amylase và glucose amylase [10] Trong số khoảng 100 enzyme công nghiệp thì có hơn một nửa là có nguồn gốc từ nấm mốc và 1/3 từ vi khuẩn Enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật

được ưa chuộng hơn so với từ những nguồn khác vì chúng rẻ hơn, dễ kiểm soát, nguyên liệu dễ tìm và khả năng thu hồi và tinh sạch đơn giản hơn do chúng không chứa các hợp chất không mong muốn như phenol (ở thực vật) và chất ức chế enzyme (ở động vật)

Tuy nhiên trên thực tế thì phần lớn enzyme được sản xuất từ một số nhỏ chi như

Aspergillus, Bacillus, Trichoderma, Saccharomyces…

1.8.1.1 Lịch sử phát hiện

Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm

1811 - 1814 Những nghiên cứu này do nhà bác học người Nga – viện sĩ K.S Kirhof thực hiện nhằm nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường

Amylase thường được tìm thấy trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn…

1.8.1.2 Cấu tạo enzyme và cơ chế hoạt động

α - amylase là enzyme xúc tác làm cho quá trình thủy phân liên kết α - 1,4 glucozid nội mạch ở trong phân tử tinh bột được diễn ra có cơ chất là amylose α - amylase cho ra sản phẩm thủy phân chủ yếu là Maltose (khoảng 87 %) và một ít Glucose với cơ chất là amylopectin, α - amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 mà

không thủy phân được liên kết 1,6 trong phân tử tinh bột, trong họ Bacillus thường

gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra α - amylase chịu nhiệt cao [10]

1.8.1.3 Vi sinh vật tiết amylase

Vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất và thu enzyme amylase

là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Các chủng nấm mốc hay được sử dụng như: Aspergillus, Rhizopus

Các chủng nấm men hay được sử dụng như: Candida, Saccharomyces,

Endomycospsis, Endomyces

Các chủng vi khuẩn hay được sử dụng như: Bacillus mesentericus, B.subtilis,

B.lichenformis, B macecassavarum, Clostridium acetobutylium… Và các chủng vi

khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh, phát triển tốt và ít bị nhiễm các vi sinh vật khác khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ cao

Bacillus subtilis là vi khuẩn ưa ấm sinh amylase mạnh được nghiên cứu sử dụng

rộng rãi nhất Theo Bùi Thị Phi, riêng ở Nhật, hằng năm sản xuất tới hàng chục

nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài Bacillus subtilis này

1.8.1.4 Đặc tính của enzyme

α - amylase phân giải các liên kết α - 1,4 glucoside ở giữa chuỗi mạch polysaccharide, vì vậy cũng gọi là “endo - amylase” tạo thành các phân tử dextrin phân tử thấp [13]

α - amylase không chỉ thủy phân được hồ tinh bột mà nó còn có khả năng thủy phân được cả hạt tinh bột còn nguyên nhưng tốc độ lại rất chậm Dưới tác dụng của amylase thì độ nhớt của dung dịch giảm mạnh do tinh bột đã bị α - amylase thủy phân thành các phân tử dextrin phân tử thấp, Maltose, Glucose…

α - amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng α - amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Tất cả enzyme α - amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Có một đặc điểm của enzyme

từ vi khuẩn là enzyme α - amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hóa trội hơn hoạt lực đường hóa so với α - amylase của nấm mốc

α - amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công được các hạt tinh bột bị vỡ, tuy nhiên đối với α - amylase từ vi khuẩn thì chúng lại có khả năng phân hủy được cả

hồ tinh bột lẫn các hạt tinh bột còn nguyên (theo Popadicts và cộng sự, 1971, trích

bởi Bùi Thị Phi) Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên nhanh

hơn 2 - 2,5 lần so với α - amylase của nấm mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969, trích bởi Bùi Thị Phi)

pH tối ưu của enzyme α - amylase thu được từ vi khuẩn là 5,8 – 6,0 và vùng hoạt động tốt là khoảng pH từ 5,8 – 7,0

α - amylase của vi khuẩn chịu nhiệt cao hơn rất nhiều so với enzyme này thu được từ nấm mốc (khoảng 92 0C so với 70 0C ở nấm mốc) [10]

β - amylase xúc tác các phản ứng thủy phân các liên kết α - 1,4 glucoside kể từ đầu không khử tạo thành chủ yếu là Maltose và dextrin phân tử lớn

β - amylase không thủy phân hạt tinh bột mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột, β - amylase chỉ phổ biến ở loài thực vật (hạt đang nảy mầm) mà không có ở vi khuẩn [10]

Glucose amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết α - 1,4 và α - 1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide và tạo ra sản phẩm

chủ yếu được tạo thành gồm glucose và dextrin [13] Loại enzyme này có tính chất acid thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5

1.8.1.5 Sinh tổng hợp enzyme và các yếu tố ảnh hưởng

Amylase ở vi khuẩn được có thể được sinh ra trong quá trình phát triển tăng sinh khối của vi sinh vật hoặc chúng có thể được tích trữ dần trong quá trình sinh trưởng

và phát triển của mình trong tế bào hay trong môi trường

Riêng đối với chủng Bacillus subtilis thì chỉ tìm thấy được Amylase khi vi

khuẩn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng vì amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển qua thời kỳ tự phân [10]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase [10]

Ảnh hưởng của nguồn carbon dinh dưỡng: các nguồn carbon và nguồn năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp amylase

Môi trường nuôi cấy dùng để thu amylase từ vi khuẩn có thể dùng tinh bột, Maltose, Saccharose…và nếu như bổ sung CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α - amylase được tổng hợp gấp 2 lần vì trong thành phần môi trường có

Ca2+ có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α - amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease [37]

Để tổng hợp α - amylase thì môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme này cần

có các dạng muối magie, phosphor, kali , mangan, kẽm… nồng độ muối MnSO4 thích hợp để vi sinh vật tổng hợp α - amylase là 0,05 %, thiếu muối thì α - amylase không được hình thành

Điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ và sự thông khí cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật [37]

1.8.1.6 Ứng dụng của amylase

Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp bia (thay thế một phần đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, công nghiệp sản xuất bánh mỳ (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp giấy, công nghiệp sợi…

Từ trước thế kỷ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các quy trình enzyme vào hoạt động thực tế như làm bánh mỳ, bia rượu… nhưng việc ứng dụng trong giai đoạn này hoàn toàn mang tính chất kinh nghiệm

Từ thế kỷ 18, các nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt

Năm 1936, Schawm đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Năm 1937, Covisar đã tách được Trypsin từ dịch tụy và cũng là protein đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm dù vẫn chưa được tinh sạch

1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin

1879, Wutz tách thành công protein từ thực vật, bằng phương pháp tủa cồn lạnh ông đã thu nhận được papain từ cây đu đủ

1918-1919, Waksman đã phát hiện ra khả năng phân giải protein của xạ khuẩn

Từ năm 1950 protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu và có một số công trình nghiên cứu như:

- Subtilizin A từ Bacillus subtilis của Guntelberg và Ottensen, 1950

- Peptidase A từ Streptococcus của Elliot, 1950

- Protein kiềm từ Aspergillus oryzae của Crewther và Lennox, 1950

- Aspergillopeptidase từ Aspergillus satoi của Yoshida, 1956

- Protease kiềm từ Pseudomonas aeruginosa của Morihara, 1957

- Subtilopeptidase từ Bacillus amyloliquefaciens của Hagihara cùng cộng

sự, 1958

- Keratinase từ Streptomyces fradiae của Nickerson và Durand, 1963

- Elastase từ Pseudomonas aeruginosa của Morihara Tsuzuli, 1965

- Protease từ Arthrobacter của Hoften và cộng sự, 1965

- Protease trung tính II từ Bacillus amylosacchariticus của Tsuru và cộng

sự, 1966

- Protease kiềm từ Aspergillus sydowi của Danno và Yoshimura, 1967

1.8.2.2 Phân loại

Có thể phân loại protease thành các dạng sau: [13]

Endopeptidase: cắt ngẫu nhiên nội phân tử sợi polypeptide hay còn gọi là proteinase

Exopeptidase cắt liên kết peptide ở đầu N (aminopeptidase) hoặc đầu C (carboxypeptidase)

Protease là nhóm enzyme phân giải protein mà phần lớn được tế bào tiết ra bên ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào là chủ yếu

Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống [10]

Protease là nhóm enzyme phân giải protein gồm các enzyme phân giải như trypsin (là endopeptidase tác động lên liên kết nội phân tử từ protein của amino acid

có tính kiềm như Agr, His, Lys), pepsin (là endopeptidase tác động lên liên kết peptide nội phân tử protein của aminoacid có vòng thơm như Phe, Tyr, Trp), chymotrypsin là nhóm endopeptidase tác động lên liên kết peptide nội phân tử mà nhóm carboxyl thuộc về một amino acid có vòng thơm, aminopeptidase là exopeptidase tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu N của sợi polypeptide, carboxypeptidase là exopeptide tác động lên liên kết peptide của amino acid ở đầu C của sợi polypeptide…

Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ năm 1950 đến nay cho thấy các protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất và có rất nhiều cách phân loại protein hiện nay như

Theo phân loại quốc tế thì protease được chia làm 4 phân nhóm phụ: Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Dipeptihydrolase, Proteinase

Nếu phân loại theo trung tâm hoạt dộng thì protease được chia làm 4 nhóm nhỏ (Barret, 1984):

Bảng 1 2 Phân loại protease theo Barret, 1984

Protease Aspatic

(EC 3.4.23.)

Là nhóm protease có nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động nhóm protease này hoạt động mạnh ở vùng pH acid Protease kim loại

(EC 3.4.24.)

Là những enzyme mà trung tâm hoạt động của nó có những ion kim loại, nhóm này thường hoạt động ở vùng pH trung tính

Theo nồng độ pH thì protease được chia làm 3 nhóm: protease acid, trung tính và kiềm [10]

Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cơ chế chung như sau:

E + S → E – S → E - S* + P1 → E + P2 Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất

− E - S là phức chất enzyme-cơ chất

− E - S* là phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa

− P1 là sản phẩm đầu tiên của phản ứng

− P2 là sản phẩm thứ 2 của phản ứng

1.8.2.3 Chức năng sinh học của protease vi sinh vật [9]

Vi sinh vật có protease ngoại bào và nội bào, mỗi loại có một vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật

Protease ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các phân tử thấp để vi sinh vật hấp thụ

Protease nội bào phân giải các peptide được đưa từ bên ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S

Tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme và việc này có thể có nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật, chúng còn có thể

phân hủy các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến hoặc tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

1.8.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi

sinh vật

Quá trình tổng hợp enzyme protease chịu nhiều tác động của các yếu tố vật lý môi trường khác nhau như nhiệt độ, độ pH, nồng độ oxy, thành phần môi trường… Mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng nhiệt độ khác nhau tối ưu cho loài, và cho từng chủng loài, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ và hoạt tính của enzyme được tổng

hợp, như ở loài Bacillus subtilis thì ngưỡng nhiệt độ tối ưu cho loài này phát triển

và sinh enzyme là 37 0C [9]

pH của môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men của vi sinh vật Thành phần môi trường cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme, để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N

thích hợp Đối với chủng Bacillus subtilis thì khi môi trường nuôi cấy tăng sinh có

bổ sung thêm rỉ đường nồng độ 2 % thì hiệu quả sinh tổng hợp protease sẽ là tốt nhất [37], trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thu enzyme protease cần phải có

chất cảm ứng và các nguồn nitơ hữu cơ, Bacillus subtilis sẽ tổng hợp được nguồn

enzyme protease có hoạt lực cao khi mà chúng được nuôi cấy trong môi trường có tinh bột, nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 – 2 % thì hoạt độ protease giảm vài lần và khi bổ sung chất cảm ứng Ca2+ thì khả năng tổng hợp amylase của chủng vi khuẩn này sẽ tăng cao hơn so với môi trường nuôi cấy thông thường [37]

1.8.2.5 Ứng dụng

Protease từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và dược phẩm như công nghiệp chế biến thực phẩm (chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì…hay sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người bị bệnh tiêu hóa

do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme… [37]

Protease còn được ứng dụng rộng rãi trong thức ăn chăn nuôi dưới dạng phối trộn hoặc probiotic như ENZYMEBIOSUB của công ty Vaxcin và sinh phẩm số 2, BACIFLORA for Shrimp, VIME…

Enzyme protease của cá là protein, chúng hoạt động xúc tác cho các phản ứng hoá học ở trong nội tạng và trong cơ thịt Enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất ở tế bào, quá trình tiêu hoá thức ăn và tham gia vào quá trình tê cứng Sau khi

cá chết enzyme vẫn còn hoạt động, vì thế gây nên quá trình tự phân giải của cá, làm ảnh hưởng đến mùi vị, trạng thái cấu trúc, và hình dạng bề ngoài của chúng Sản

phẩm của quá trình phân giải do enzyme là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật, làm tăng nhanh tốc độ ươn hỏng

Trong nguyên liệu có nhiều enzyme khác nhau Các nhóm enzyme chính ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu là: Enzyme thuỷ phân, Enzyme oxy hoá khử Nhiều loại protease được tách chiết từ cơ thịt cá và có tác dụng phân giải làm mềm mô cơ Sự mềm hoá của mô cơ gây khó khăn cho chế biến Các enzyme thuỷ phân protein quan trọng trong nguyên liệu gồm: Cathepsin, protease kiềm tính, collagenase, pepsin, trypsin, chimotrypsin

Các emzyme thuỷ phân lipid quan trọng trong cá gồm có: Lipase, phospholipase Chúng thường có trong các cơ quan nội tạng và trong cơ thịt Enzyme thuỷ phân lipid rất quan trọng đối với cá đông lạnh, ở các loài cá này lipid

có thể bị thuỷ phân khi độ hoạt động của nước thấp Trong quá trình bảo quản lạnh đông các acid béo tự do được sinh ra từ photpholipid và triglyceride, có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của cá Acid béo tự do gây ra mùi vị xấu, ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng giữ nước của protein cơ thịt

Các enzyme oxy hoá khử bao gồm: Phenoloxidase, lipoxygenase, peroxidase Polyphenoloxidase đặc biệt quan trọng trong tôm vì chúng là nguyên nhân gây nên đốm đen cho nguyên liệu sau thu hoạch [31]

1.10 Sơ lược về phụ phế phẩm cá, tình hình sản xuất và đánh bắt ở Việt

Nam

1.10.1 Thành phần cá, phụ phế phẩm cá

Phụ phế phẩm cá là các sản phẩm nguyên liệu cá được sinh ra trong quá trình sản xuất, chế biến cá và chúng có thể tận dụng được như: thịt vụn, xương, da, mỡ, nội tạng…

Phụ phế phẩm cá chứa nhiều chất dinh dưỡng dễ bị phân hủy bởi vi sinh vật, các phản ứng enzyme và oxy hóa rất nhanh nếu không được giữ ở điều kiện tốt [29] Thành phần cơ bản của cá [16]

Hàm lượng protein trong cá cao từ 16 – 17 % trong đó có đầy đủ các loại acid amin cần thiết và nhiều lysine

Trong cá cũng chứa nhiều lipid dao động từ 0,3 – 30,8 % tùy thuộc vào giống loài Những loài cá nhiều mỡ như cá basa có rất nhiều lipid

Hàm lượng nước trong cá khá cao từ 55 – 83 %, nước là thành phần chính của

cá

Hàm lượng khoáng trong cá cao từ 1 – 1,7 %

Protein cấu trúc gồm myosin, actin, actomyosin, tropomyosin chiếm khoảng 65 -

75 % tổng hàm lượng protein trong cá và 77 – 85 % tổng hàm lượng protein trong mực

Protein chất cơ gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzyme chiếm khoảng 25 – 30 % trong cá và 12 – 20 % trong mực

Protein mô liên kết bao gồm sợi collagen, elastin [31]

Theo Phạm Thị Hải Âu thì hàng năm có khoảng 25 - 30 triệu tấn trong tổng sản lượng cá thế giới bị loại bỏ do việc xử lý không tốt và nhiều lý do khác

1.10.2 Tình hình đánh bắt, sản xuất ở Việt Nam

Sản lượng cá tra tốc độ tăng trưởng bình quân là 18,1 %/năm

Năm 2012, diện tích nuôi đạt 5910 ha; sản lượng cá thu hoạch đạt 1255 nghìn tấn, tăng hơn so với năm 2011 [2]

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, năm 2015 tổng sản lượng thủy sản hơn 6,56 triệu tấn; trong đó, khai thác 3,03 triệu tấn, nuôi trồng 3,53 triệu tấn; diện tích nuôi trồng là 1,28 triệu ha; kim ngạch xuất khẩu khoảng 6,72 tỷ USD [27]

Ước diện tích cá tra năm 2015 khoảng 5000 ha, sản lượng 1,22 triệu tấn (bằng 98 % về diện tích và tăng 6,7 % về sản lượng so năm 2014) [27]

Tại một số địa phương, sản lượng khai thác thủy sản cả năm đạt khá, tập trung ở các tỉnh ven biển trong đó Quảng Ninh ước đạt 57120 tấn, tăng 4 % so với cùng kỳ, Hải Phòng đạt 56600 tấn bằng 103 % kế hoạch năm, Hà Tĩnh đạt 35490 tấn, tăng 12,1 %, Quảng Trị đạt 23000 tấn, tăng 17,9 %, Khánh Hòa đạt 91630 tấn, Bình Định đạt 199231 tấn, tăng 0,8 %, Phú Yên đạt 54000 tấn, tăng 10,2 %, Bình Thuận đạt 198312 tấn, tăng 5 % so với cùng kỳ Tại Cà Mau, sản lượng khai thác đạt 193563 tấn, tăng 8,1 % so với cùng kỳ, Bạc Liêu đạt 106916 tấn, tăng 3,2 % so với cùng kỳ, Tiền Giang đạt 97777 tấn, tăng 5,1 % so với cùng kỳ [27]

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản, tổng sản lượng thủy sản 6 tháng đầu năm 2016 ước đạt trên 3,1 triệu tấn; trong đó sản lượng khai thác đạt 1,5 triệu tấn và sản lượng nuôi trồng đạt gần 1,6 triệu tấn; kim ngạch xuất khẩu (tính đến 15/6) đạt 2,8 tỷ USD (tăng 4,6 % so với cùng kỳ năm 2015) Ước tính tổng giá trị sản xuất ngành thủy sản đạt trên 85700 tỷ đồng, tăng 1,1 % so với cùng kỳ [28]

Nguồn : vasep.com.vn Đơn vị: nghìn tấn Hình 1 2 Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản của Việt Nam từ 1995 - 2015

Thành phần khối lượng cá và thành phần của cá cũng thay đổi theo mùa, giống loài, môi trường sống, giới tính…[17]

Bảng 1 3 Thành phần khối lượng cá tra và một số loài cá khác

Cá tuyết 46,2 19,3 5,5 5,6

Theo bảng giá trị trên cho thấy tỷ lệ thịt cá tra phi lê chiếm chỉ khoảng 28,9 – 38,5 %, thấp hơn giá trị của cá khác nên tỷ lệ phụ phế phẩm cá tra trong chế biến cá phi lê sẽ có thể lên dến hơn 70 % nên cần đặc biệt quan tâm đến giá trị kinh tế từ phụ phẩm cá tra [17]

1.11 Phân bón có nguồn gốc từ cá

Eric weinert cùng cộng sự đã nghiên cứu sản xuất dịch amino acid từ thủy phân

cá bằng cách bổ sung đường nâu vào cá và sắp xếp chúng thành từng lớp và lên men chúng, sau một thời gian sẽ cho ra sản phẩm lên men lỏng [24]

Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy

phân phụ phẩm cá tra sản xuất dịch đạm, bột cá cho thấy có nhiều ưu điểm như quá trình thủy phân tương đối đơn giản, hiệu suất cao, có thể thu hồi được nhiều sản phẩm khác nhau và chi phí tương đối thấp [34] Điều kiện tối ưu cho việc thủy phân

phụ phẩm cá Tra từ enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis như sau nhiệt độ

50 0C, pH = 7,6, tỷ lệ nước 30 %, nồng độ muối 2 % [18]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu:

Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện từ tháng 4/2016 đến tháng 8/2016

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn

Mẫu ruột cá thu được tại chợ Bà Chiểu và một số chợ nhỏ khu vực phường 25, phường 26 quận Bình Thạnh, thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2 Hóa chất và môi trường

2.2.2.1 Hóa chất

- Gentian violet - Cao thịt

- Fushin - Pepton

- Lugol - Cao nấm men

- Malachite Green 5 % - NaCl

- Nước cất - Thuốc thử Kovac’s

- Thuốc thử Methylred - Thuốc thử Griess A, Griess B

- ether -

2.2.2.2 Môi trường

− Môi trường Nutrient Broth (NB)

− Môi trường Nutrient Agar (NA)

− Môi trường Citrate Broth

− Môi trường thu enzyme

− Môi trường Casein

− Môi trường Nitrate Broth

− Môi trường thạch mềm NA

− Môi trường Starch agar

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ

2.2.3.1 Thiết bị

− Tủ cấy vi sinh − Tủ lạnh

− Tủ ấm − Bếp từ

− Máy quang phổ − Nồi hấp Autoclave

− Bể điều nhiệt − Máy lắc

− Máy ly tâm − Kính hiển vi

− Cân phân tích −

2.2.3.2 Dụng cụ

− Ống nghiệm − Đèn cồn

− Đĩa petri − Dụng cụ đục lỗ thạch

− Đũa thủy tinh − Bông thấm nước

− Ống ly tâm − Bông không thấm

− Giấy đo pH − Cốc thủy tinh các loại

− Máy đo pH − Ống đong các loại

− Chai thủy tinh − Pipette thủy tinh 1ml, 5 ml, 10 ml

− Dây cấy vòng − Erlen 100 ml, 250ml

− Dây cấy thẳng − Chai đun môi trường 200 ml, 500 ml

− Que cấy trang − Micropipette 100µl, 1000µl

2.3 Bố trí thí nghiệm

2.3.1 Bố trí thí nghiệm chung

Hình 2 1 Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm

2.3.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết

Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Các bước tăng sinh phân lập Bacillus subtilis được trình bày như trên hình

Giữ giống

Nguồn mẫu

Phân lập

Nhuộm Gram Nhuộm bào tử

Test định danh sơ bộ bằng test sinh

hóa đặc trưng

Chủng thuần khiết

Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme: pH

Hình 2 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis có trong ruột cá

Định tính khả năng sinh protease

Mẫu ruột cá

Rửa sạch bằng nước muối sinh lý vô trùng

Thấm khô bằng gòn vô trùng

Đồng nhất rồi tiến hành pha loãng đến dãy nồng độ 10-4,

10-5, 10-6 và cấy trang dịch lên môi trường NA

ủ nhiệt độ 37 0C trong 48 giờ

Chọn các khuẩn lạc rìa nhăn, khô, màu