Nghiên cứu chế biến glucosamin từ vỏ tôm

Nghiên cứu chế biến glucosamin từ vỏ tôm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 5

1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên .5

1.2 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin 6

1.2.1 Cấu trúc hoá học của chitin .6

1.2.2 Tính chất lý hoá của chitin. 8

1.3 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan. 8

1.3.1 Cấu trúc hoá học của chitosan .9

1.3.2 Tính chất lý hoá của chitosan 10

1.3.3 Tính chất sinh học của chitosan. 11

1.3.4 Độc tính của chitosan. 11

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên thế giới. 12

1.5 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin. 15

1.6 Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý một số muối của glucosamin. 17

1.6.1 Glucosamin hydroclorua. 17

1.6.2 Glucosamin sulfat 17

1.6.3 Acetyl glucosamin. 18

1.7 Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó. 18

1.8 Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và ở tại Việt Nam. 21

1.8.1 Trên thế giới. 21

1.8.2 Ở Việt Nam. 23

1.9 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) .25

1.9.1 Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến. 25

1.9.2 Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng. 26

Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu. 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu. 27

CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29

3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua. 29

3.2 Điều chế chitin từ vỏ tôm. 30

3.3.Điều chế chitosan bằng cách deacetyl chitin. 31

3.4 Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl). 32

3.4.1.Điều chế glu.HCl từ chitin 32

3.4.2.Điều chế glu.HCl từ chitosan 33

3.4.3 Tinh chế glu.HCl. 34

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin 39

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin 39

3.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit HCl đến hiệu suất điều chế glu.HCl từ chitin. 40

CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

4.1 Điều chế chitin từ vỏ tôm. 41

4.1.1.Quá trình khử khoáng. 41

4.1.2 Quá trình loại bỏ protein. 41

4.1.3 Quá trình tẩy màu (loại bỏ Astaxanthin). 42

4.2 Điều chế chitosan. 43

4.3 Điều chế glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 43

4.3.1 Điều chế glu.HCl đi từ chitin. 44

4.3.2 Điều chế glu.HCl từ chitosan .45

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 - 80% công suất chế biến Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm [3]

Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất

chitin 1, chitosan 2, glucosamin 3 và các sản phẩm có giá trị khác Do vậy việc

nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất quan trọng, để nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường

Sản phẩm chitin - chitosan đã có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế Chitin có ứng dụng làm da nhân tạo và là nguyên liệu trung gian cho các chất quan trọng như chitosan, glucosamin và các chất có giá trị khác Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược

và bảo vệ môi trường như: sản xuất glucosamin, chỉ khâu phẫu thuật, thuốc kem, vải, sơn, chất bảo vệ hoa quả, bảo vệ môi trường…Với khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước trên thế giới và cả Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này

Glucosamin là một hoạt chất quý được sản xuất từ vỏ tôm thông qua nguyên liệu trung gian là chitin hoặc chitosan Glucosamin chủ yếu được sử dụng trong y học chữa bệnh thoái hoá khớp

Ở người già, chức năng cũng như cấu tạo của khớp có nhiều thay đổi, các

tế bào của khớp thoái hoá, trở nên kém linh động Gân và dây chằng phân đoạn, đóng vôi, khô cằn, trở nên kém bền bỉ, kém co dãn, không chịu được căng lực và

dễ bị tổn thương Sụn trở nên đục màu, xơ hóa, gai xương, khô nước, rạn nứt với nhiều tinh thể canxi làm khớp đau Khớp co duỗi khó khăn vì màng hoạt dịch mỏng và khô dần [1]

Trước đây, trong điều trị các bệnh thoái hóa khớp người ta thường dùng các thuốc thuộc nhóm corticoid hoặc nhóm kháng viêm giảm đau không steroid NSAID (Non - Steroidal Anti - Inflammatory Drugs), nhưng các thuốc thuộc

nhóm này chỉ điều trị triệu chứng và có nhiều tác dụng phụ Với các thuốc thuộc nhóm corticoid thường gây nên các tác dụng phụ: loãng xương, viêm loét dạ dày, giảm miễn dịch… Đối với các NSAID thì gây viêm loét dạ dày…[12] Từ thập

kỷ 90 người ta đã phát hiện ra glucosamin phục hồi được các sụn khớp, tức là chữa được căn nguyên của bệnh viêm, thoái hoá khớp [2]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu với nhiều thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh tác dụng điều trị tận gốc bệnh thoái hoá khớp của glucosamin, nhất

là dạng phối hợp với dược liệu thiên nhiên Trên thực tế glucosamin thường được

sử dụng ở các dạng: glucosamin hydroclorua 4, glucosamin sulfat 5, N - Acetyl glucosamin 6 Hiện nay thuốc chứa glucosamin đã được lưu hành trên 70 quốc

gia

Tại Việt Nam, glucosamin và các thành phẩm đi từ glucosamin vẫn chủ yếu là nhập khẩu và xu thế sử dụng ngày càng nhiều Trong khi đó nguồn nguyên liệu (vỏ giáp xác) chủ yếu để điều chế ra glucosamin thì dồi dào Để tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc chữa bệnh thoái hoá khớp và là nguyên liệu cho việc nghiên cứu các ứng dụng khác

của glucosamin chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều chế

glucosamin từ vỏ tôm”

Mục tiêu của đề tài nhằm giải quyết các vấn đề sau :

1 Phân lập chitin – chitosan từ vỏ tôm phế thải

2 Điều chế glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại chitin - chitosan trong tự nhiên

Chitin - chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xellulose) Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong

mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo [13]

Chitin - chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu

cơ khác

Hình 1 : Chitin và vỏ tôm

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [5]

Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose

O

NHCOCH3OH

CH2OH

O

NHCOCH3OH

CH2OH

O

O

NH2OH

CH2OH

O

NH2OH

CH2OH

O

O

OH OH

CH2OH

O

OH OH

CH2OH

O

2)

3) 1)

H×nh 2 :1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose

1.2 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitin

1.2.1 Cấu trúc hoá học của chitin

Chitin 1 có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp

nhiễu xạ tia X Người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở ba dạng cấu hình :α,

β, γ - chitin [15]

Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-chitin được mô tả như sau:

α - chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ - chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β - chitin) và hai song song một ngược chiều (γ - chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β - chitin cũng có thể chuyển sang dạng α - chitin nhờ quá trình axetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzym hay axit HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn

vị N-Acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-(1-4) glucozit

Công thức cấu tạo của chitin:

O O

HO

NHCCH3

O OH

Công thức phân tử: [C8H13O5N]n

Phân tử lượng : Mchitin = (203,09)n

Chitin có màu trắng hay màu trắng phớt hồng, dạng vảy hoặc dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu …Nhưng tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và thioxianat canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid - LiCl 8% [4], tan trong hexafluoro-isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafluoracetone sesquihydrate (CF3COCF3.H2O) [16] Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng

884 - 890cm-1

Chitin ổn định với các chất oxy hoá mạnh như thuốc tím (KMnO4); oxy già (H2O2); nước javen (NaOCl - NaCl)…, lợi dụng tính chất này mà người ta sử dụng các chất oxy hoá trên để khử màu cho chitin

Khi đun nóng trong dung dịch NaOH đậm đặc (40 - 50%), ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan:

- Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

- Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat

1.3 Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá sinh và độc tính của chitosan

1.3.1 Cấu trúc hoá học của chitosan [3]

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan 2 là một trong những dẫn

xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực

tế

Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2

Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu

độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD

HO

NH2

O OH

2

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose

poly(1-4)-2-Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Qua cấu trúc của chitin - chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2,

do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp

1.3.2 Tính chất lý hoá của chitosan [3]

Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5% Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) [6] Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím

Một số dẫn xuất chitosan [26]:

O O

HO HN O

OH

O O

HO NH O

OH O

O

3

O OH

O O

3

O OCH2CH2SO3-

O O

HO NHCHO2COOH

OCH2COOH

O O

HO NHAcO

OCH2CH2CN

O O

HO NHAcO

OCS2- Na +

O O

HO N=CHROOH

O O

HO NHROOH

O O

HO NHCHO2COOHOH

O O

HO NHAcOOCH2CHOHR

O O

HO NH

2

O OH

O O

- O NHAcO

O-Na+

O O

RH2CO NHAcO

HO NHAcOOCH2COOH

O O

HO NHAcOOH

Na+

Chitosan

Chitin

Crosslinked Chitosan Chitosan salts

Schiff base

Hình 3 : Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan

1.3.3 Tính chất sinh học của chitosan [5]

Chitosan không độc, dùng an toàn cho người [18] Chúng có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể [19], có khả năng tự phân huỷ sinh học [20]

Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u [21]

Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, hạ huyết áp [22], điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết [23]

Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit - insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường

hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa… của chitosan [24]

Vào năm 1968, K Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [25]

Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [25]

Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích luỹ ở gan Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách

Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương [27]

1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và chitosan ở Việt Nam và trên Thế giới [3]

Trước đây người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ được dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [16]

Việc nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phuc vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta Vào những năm 1978 đến 1980 Trường đại học Thuỷ sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin - chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới

về chitin - chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin

- chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin - chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm - thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme - Viện Khoa Học Việt Nam; Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản 2

Ở miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp thuỷ sản

Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ

Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một

số cơ quan khác: Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa Học

Việt Nam, Viện Khoa Học nông nghiệp miền nam,… đang nghiên cứu sản xuất

và ứng dụng chitin - chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng

cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [7] Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một

số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzym như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên

Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ xung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin - chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo [4], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu [10], trị bỏng nhiệt [11]…

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc

ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ

từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả

Chitin - chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin

và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang

để cố định enzym và tế bào Enzym cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzym trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzym cố định được

sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzym cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học

Do có cấu trúc tương tự như xellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in [5]

Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được axit và kiềm nhẹ

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col…

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+4 Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hóa của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học

đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng

để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước

Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau :

• Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+ Như vậy vi sinh vật sẽ

bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu

• Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào

• Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào

Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó

1.5 Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin

Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid

và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan)

Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể

bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn

Công thúc cấu tạo của glucosamin:

C C C C C

CH2OH

NH2H

H HO

OH H

H

O HO

HO

NH2

OH OH

Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol

Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine

Công thức phân tử: C6H13O5N

Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17

Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin

Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform

Một số phản ứng của glucosamin [14]:

• Phản ứng tráng bạc:

Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng:

C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH

CHO CHNH2CHO CHO CHOH

CH2OH

CHO CHNH2

CHOH

CH2OH

Cu H OHC

OHC H

+ 2 H2O

• Phản ứng với C6H5CH=O

Phản ứng xác nhận có mặt của NH2 Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu:

1.6 Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc

4

Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride

Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl

Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63

Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C

Tan được trong nước 0,1g/ml

Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate

Tan được trong nước, 0,1g/ml

1.7 Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9]

Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan

Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá

hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2

và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào

sụn Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản

Hình 5 : Đau

xương cột sống

mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9]

Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy

dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của

dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu

chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà

còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn

bệnh tiến triển [9]

Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của

thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương

khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp

và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn

khớp

Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80) Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]

Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp

Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là:

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald

Hình 7 :Các vị trí khớp nối

Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu

sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều

Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID Nhược điểm của thuốc

NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử

dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ Một

vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ

địa quá mẫn cảm với thuốc

Trước đây glucosamin được xếp vào

nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin,

chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng

chậm với các bệnh viêm khớp Hiện nay cơ

quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận

xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải

thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp Các loại

khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng

được các yếu cầu trên lâm sàng

Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng

một số loại thuốc có chứa glucosamin như :

Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]

Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ

nước ngoài

Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so

sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho

kết quả như sau [8]:

1 Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương

đương với NSAID trong thời gian ngắn

và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời

gian dài

Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt

Nam

2 Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID

3 Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính

4 Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó

5 Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy

Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có trong dạ dày Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl- và ion H+ Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày

1.8 Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt Nam

1.8.1 Trên thế giới

1.8.1.1 Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3]

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được

Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất

1.8.1.2 Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3]

Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ

Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem

ly tâm thu phần bã Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem

Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ

ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin

1.8.1.3 Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3]

Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt

độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với

ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác aceton

có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay

1.8.1.4 Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17]

Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trong thời gian 48 giờ Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7 Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5% Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7 Sản phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng

ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether Sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g Hiệu suất 44,3%

1.8.2 Tại Việt Nam

1.8.2.1 Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính

Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin

Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan

Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm

1.8.2.2 Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3]

Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau

Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan

Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn

1.8.2.3 Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3]

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa trung tính Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên Sản phẩm đem làm khô thu được chitin

Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất

xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm

1.8.2.4 Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học [3]

Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl

Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza

Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5giờ Rửa sạch đến pH= 7 Sau đó khử protein bằng papain 13%,

tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ Rửa sạch, tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch

Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác Tuy nhiên điều kiện khó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc

1.9 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

1.9.1 Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3]

Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7 Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ

95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ Tẩy màu rửa sạch, sấy khô Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C

1.9.2 Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14]

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô Chitin thu được có màu trắng