NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN PHI ĐIỆP (Dendrobium anosmun Lindl)

Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kinetin, kết quả nhân nhanh chồi in vitro lan Phi điệp được thể hiện ở bảng 1.. Tạo cây in vitro hoàn chỉnh[r]

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN PHI ĐIỆP

(Dendrobium anosmun Lindl)

La Việt Hồng * , Nguyễn Thị Hồng Huế

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

TÓM TẮT

Lan Phi điệp (Dendrobium anosmun Lindl) là một trong những loài phong lan rừng có giá trị của

Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy, quả lan Phi điệp được khử trùng bề mặt bằng NaOCl 1% trong 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt Hạt được gieo trên môi trường MS + 30 g/l sucrose + 7g/l agar nảy mầm tốt, tỷ lệ nảy mầm đạt 81,25% Hệ số nhân nhanh chồi tốt nhất trên môi trường

MS + 30 g/l sucrose + 7g/l agar + 10%(v/v) nước dừa và 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA sau 12 tuần tạo được 4,71 chồi Trên môi trường cơ bản MS bổ sung 30 g/l sucrose + 7g/l agar và 0,7

mg/l NAA các chồi in vitro tạo rễ tốt nhất (5,29 rễ/chồi) sau 6 tuần Cây con được trồng trên giá

thể xơ dừa ở chế độ che sáng 50% và tưới nước phun sương sau 6 tuần theo dõi, cây cứng, xanh

hơn tỷ lệ sống sót cao

Từ khóa: Dendrobium anosmun Lindl, hạt lan, in vitro, nhân nhanh, tái sinh.

MỞ ĐẦU*

Lan Phi điệp (Dendrobium anosmun Lindl)

thuộc họ Phong lan (Orchidaceae) là một

trong những loài lan đang rất được ưa

chuộng, do loài lan này có hoa rất to, đẹp, lâu

tàn và có hương thơm [1] Họ Phong lan có

hơn 800 chi và 25.000 loài, là họ lớn nhất của

thực vật có hoa Hoa lan được đánh giá cao

bởi vẻ đẹp lôi cuốn, quyến rũ và sự đa dạng

về kích thước, hình dạng, màu sắc và có tiềm

năng thay đổi tình hình kinh tế của một quốc

gia [4] Tuy nhiên, nhiều loài lan đang có xu

hướng giảm đi bởi ảnh hưởng bất lợi của điều

kiện môi trường và nạn khai thác quá mức

Một quả lan chứa hàng triệu hạt nhưng chỉ có

vài hạt nảy mầm trong tự nhiên do hạt không

có nội nhũ và nảy mầm phụ thuộc vào sự

cộng sinh với loài nấm cụ thể [12] Phương

pháp nuôi cấy không cộng sinh được phát

triển sau nghiên cứu của Knudson [7], hạt lan

có thể nảy mầm trên môi trường muối khoáng

đơn giản có chứa đường Phương pháp này đã

trở thành kỹ thuật chuẩn cho nảy mầm hạt lan

[8], [11] và nhiều công trình nghiên cứu nhân

giống các loài lan được sử dụng như

hookerianum [9], [14] Xuất phát từ lý do trên,

*

Tel: 0973 376668, Email: laviethong.sp2@gmail.com

chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhân giống in

vitro lan Phi điệp từ hạt nhằm góp phần phát

triển quy trình nhân giống lan Phi điệp

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tạo vật liệu khởi đầu

Hạt của quả lan Phi điệp (5 tháng tuổi) khử trùng bằng dung dịch javen được sử dụng làm

vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro và

cấy lên môi trường cơ bản MS (Murashige, Skoog, 1962) [12] có 30g/l sucrose, 7g/l agar

Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

Chồi hình thành từ hạt sau 40 ngày được cấy lên môi trường MS [12] có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar, 10% nước dừa có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật riêng rẽ hoặc kết hợp gồm: Kinetin (KI) (0,1-5,0 mg/l) hoặc 6-benzylaminopurine (BAP) (0,1-5,0 mg/l) hoặc BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + Naphthalene acetic acid (NAA) (0,2 mg/l) Đánh giá chỉ tiêu thí nghiệm sau 12 tuần nuôi

cấy gồm chỉ tiêu: số chồi/ mẫu, số lá/chồi

Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi in vitro có chiều cao 2-3 cm được

nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l agar và NAA (0,1-1,0 mg/l)

để khảo sát khả năng tạo rễ in vitro Đánh giá

thí nghiệm sau 6 tuần nghiên cứu gồm chỉ

tiêu số rễ/chồi, chiều dài rễ

Rèn luyện cây in vitro thích nghi môi

trường tự nhiên

Các cây con in vitro có chiều cao 3-4 cm, có

từ 3-5 rễ được rèn luyện thích thi với điều

kiện bên ngoài trên giá thể xơ dừa Đánh giá

tỷ lệ sống của cây con sau 6 tuần nghiên cứu

Phân tích thống kê

Số liệu thực nghiệm được xử lý theo các tham

số thống kê và kiểm tra sự sai khác giữa giá

trị trung bình bằng phương pháp LSD của

Fisher trên phần mềm Excel 2010 [3] Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, trong cùng một cột, các chữ theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai khác

có ý nghĩa thống kê với α=0,05

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tạo vật liệu khởi đầu - khử trùng quả

Sử dụng NaOCl 1% để khử trùng bề mặt quả lan trong thời gian 10 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đạt 81,25%.

Hình 1 Tạo vật liệu khởi đầu

(a) Quả lan Phi điệp (b) Hạt lan nảy mầm và (c) cây lan quan sát dưới kính hiển vi 100X

Sau 12 tuần nuôi cấy, 90% hạt được gieo trên môi trường MS + 30g sucrose + 7g agar/lít môi trường nảy mầm (hình 1) Kết quả này tương tự với công bố trước đây [2]

Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro

Kết quả nhân nhanh chồi in vitro lan Phi điệp sau 12 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 1, 2, 3

và hình 2

Hình 2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro lan Phi điệp

(a) Công thức K5, (b) Công thức B4, (c) công thức BN3

Ảnh hưởng của kinetin đến quá trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro

Trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kinetin, kết quả nhân nhanh chồi in vitro lan Phi điệp được

thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Ảnh hưởng của KI đến quá trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp

Kết quả bảng 1 cho thấy sau 12 tuần nuôi cấy,

môi trường K4, K5 là môi trường có số chồi

xuất hiện nhiều nhất đạt 3,55 chồi/mẫu (hình

2a) Kết quả này tương tự nghiên cứu của

Ersan (2013) [5] Về số lá, mẫu được nuôi cấy

trên môi trường K1 cho số lá nhiều nhất (5,44

lá/chồi), mẫu nuôi trên môi trường K7 cho số

lá thấp nhất đạt 3,34 lá/chồi

Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân

nhanh chồi lan Phi điệp in vitro

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến

quá trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in

vitro sau 12 tuần nuôi cấy được trình bày ở

bảng 2 Phân tích bảng 2 cho thấy, mẫu nuôi

cấy trên môi trường B4, B5 là môi trường có

số chồi xuất hiện nhiều nhất đạt 4,11

chồi/mẫu (hình 2b), trong khi đó môi trường

B1 là môi trường có số chồi thấp nhất (1,56

chồi/mẫu) Về số lá, mẫu nuôi cấy trên môi

trường B1 là công thức cho số lá nhiều nhất

(5,44 lá/chồi), trong khi đó môi trường B7

cho số là ít nhất (2,56 lá/chồi) Như vậy, mẫu nuôi cấy môi trường MS có BAP nồng độ 1 mg/l và 1,5mg/l cho khả năng nhân chồi tốt nhất Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự như nghiên cứu của Fangmuang & Kongbangkerd (2012) [6]

Bảng 2 Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân

nhanh chồi lan Phi điệp

Công thức

Nồng độ BAP (mg/l)

Số chồi/mẫu Số lá/chồi

B1(ĐC) 0,0 1,55 ± 0,28c 5,44 ± 0,28a B2 0,1 1,67 ± 0,25c 4,44 ± 0,28b B3 0,5 2,78 ± 0,45b 4,34 ± 0,25b B4 1,0 4,11 ± 0,11a 4,22 ± 0,19b B5 1,5 3,67 ± 0,25b 4,00 ± 0,25b B6 2,0 2,67 ± 0,52b 2,78 ± 0,19c B7 5,0 1,89 ± 0,11c 2,56 ± 0,28c

Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến quá trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp in vitro

Kết quả nhân nhanh chồi sau 12 tuần nuôi cấy của mẫu lan Phi điệp dưới ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA được trình bày ở bảng 3

Bảng 3 Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA đến quá trình nhân nhanh chồi lan Phi điệp

Kết quả bảng 3 cho thấy sau 12 tuần nuôi cấy, BN3 là môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4,71chồi/mẫu (hình 2c) Trong khi đó môi trường BN1 có số chồi thấp nhất 2,36 chồi/mẫu nhưng trên môi trường này chỉ tiêu về số lá/chồi lại đạt cao nhất (4,14 số lá/chồi) Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Pant &Thapa (2012) [13]

Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết quả cho thấy, môi trường có bổ sung NAA đã thúc đẩy quá trình hình thành và phát triển rễ

từ chồi in vitro (bảng 4)

Bảng 4 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi lan Phi điệp in vitro

Công thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ/chồi Chiều dài rễ

Tuy nhiên ở các mức nồng độ khác nhau thì

khả năng cảm ứng tạo rễ in vitro cũng khác

nhau Đặc biệt, ở môi trường bổ sung NAA

0,7 mg/l tỷ lệ và khả năng hình thành rễ là tốt

nhất đạt 5,29 rễ/chồi

Rèn luyện cây con in vitro thích nghi điều

kiện tự nhiên

Cây con được trồng trên giá thể xơ dừa ở chế

độ che sáng 50 % và tưới nước phun sương Sau

4 tuần, cây con bắt đầu hình thành rễ mới và

hình thành lá mới Kết quả sau 6 tuần theo dõi,

cây cứng, xanh lơ Tỷ lệ sống sót của cây lan

Phi điệp in vitro đạt 89,8 % trên giá thể xơ dừa

KẾT LUẬN

Khử trùng quả lan trong NaOCl 1% trong 10

phút, gieo hạt trên môi trường MS, sau 8 tuần

tỷ lệ nảy mầm đạt 81,25% Môi trường MS có

30 g/l sucrose, 7 g agar/l, 10% nước dừa bổ

sung BAP (1,5 mg/l) và 0,2 NAA để cho sự

nhân nhanh chồi in vitro Số chồi hình thành

đạt 4,71 chồi/mẫu sau 12 tuần nuôi cấy Môi

trường cơ bản MS có 30 g/l sucrose, 7 g

agar/l, bổ sung NAA (0,3 mg/l) thích hợp cho

tạo rễ in vitro, đạt 5,29 rễ/chồi sau 6 tuần nuôi

cấy Cây con được trồng trên giá thể xơ dừa ở

chế độ che sáng 50% và tưới nước phun

sương sau 6 tuần theo dõi, cây cứng, xanh

hơn tỷ lệ sống sót đạt 89,8%

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Trần Hợp (1998), Phong Lan Việt Nam, Nxb

Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh

2 Ngô Thị Nguyệt, Tô Phương Thảo, Đặng Thị

Chinh, Hoàng Thị Thế, Đinh Thu Huế, Nguyễn

Thị Thu Trang, Trần Thùy Dung, Trần Thị Hà

(2013), Thu thập và lưu trữ nguồn gen và ứng

dụng công nghệ sinh học trong bảo tồn và phát

triển một số loài lan quý ở Quảng Ninh, Trung

tâm khoa học và sản xuất Lâm Nông nghiệp

Quảng Ninh

3 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân

Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý

học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội

4 Chugh S., Guha S., Rao I U.,

(2009), “Micropropagation of orchids: A review

on the potential of different explants”, Sci Hortic., 122, pp 507-520

5 Ersan B., Mustafa C., Atalay S., (2013), “In vitro germination, protocorm formation, and plantlet development of Orchis coriophora (Orchidaceae), a naturally growing orchid species

in Turkey”, Turkish Journal of Botany, 37, pp

336-342

6 Fangmuang W., Kongbangkerd A., (2012),

“Effect of plant growth regulators on development

of in vitro shoot culture of Dendrobium lamellatum Lindl”, Phayao research conference,

pp 96-102

7 George E F., Hall M A., Jan De Klerk G.,

(2008), Plant Propagation by Tissue Culture,

3rd Edn Springer, The Netherlands, pp 29-64

8 Hossain M M., Kant R., Van P T., Winarto B., Zeng S J., (2013), “The application of

biotechnology to orchids”, Crit Rev Plant Sci., 32, pp 69-139

9 Teixeira da J A., Silva Elena A., Tsavkelova, (2015), “Asymbiotic in vitro seed propagation of

Dendrobium”, Plant Cell Reports, 34(10), pp

1685-1706

10 Kalimuthu K., Senthilkumar R., Vijayakumar

S., (2007), “In vitro micropropagation of orchid, Oncidium sp (Dancing Dolls)”, Afr J Biotechnol., 6(10), pp 1171-1174

11 Kauth P J., Dutra D., Johnson T R., Stewart

S L., Kane ME, (2008), “Techniques and

applications of in vitro orchid seed germination”

In: Teixeira da Silva, J A (ed.) Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues (1st Edn, Vol V), Global Science Books, Isleworth, UK, pp 375-391

12 Murashige T., Skoog F (1962), “A revised medium for rapid growth and bio-assays with

tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15, pp

473-497

13 Pant B., Thapa D (2012), “In vitro mass propagation of an epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl through shoot tip culture”, African Journal of Biotechnology, 11(42), pp

9970-9974

14 Paul S., Kumaria S.,Tandon P (2012), “An effective nutrient medium for asymbiotic seed

germination and large scale in vitro regeneration

of Dendrobium hookerianum, a threatened orchid

of northeast India”, AoB Plants, DOI:

10.1093/aobpla/plr032.

SUMMARY

STUDY ON IN VITRO PROPAGATION OF Dendrobium anosmum Lindl

La Viet Hong * , Nguyen Thi Hong Hue

Hanoi Pedagogical University N 0 2

Dendrobium anosmum Lindl is the valuable wild orchid which cultivated in Vietnam In this study, fruit of D anosmum Lindl was sterilized to provide aseptic initial in vitro The results

showed that surface of fruit was sterilized by 1% (v/v) NaOCl solution in 10 minutes for effective disinfection Seeds of orchid shown good germination on MS + 30 grs/l sucrose + 7 grs/l agar

After 12 weeks, capability of in vitro shoot multiplication was the highest (4.71 shoots) on MS +

30 grs/l sucrose + 7 grs/l agar + 10% CW and 1.5 mg/l BAP + 0.2 mg/l NAA The highest frequency of roots (5.29 roots/shoot) was observed in the MS medium supplemented with 30 grs/l sucrose + 7 grs/l agar and 0.7 mg/l NAA after 6 weeks Seedlings are grown on coconut fiber at 50% shading mode to light and irrigation misting after 6 weeks more green and hard trees high survival rate

Keywords: Dendrobium anosmum Lindl, immature seeds, in vitro, multiplication, propagation

Ngày nhận bài:3/4/2017; Ngày phản biện:15/4/2017; Ngày duyệt đăng: 31/7/2017

*

Tel: 0973 376668, Email: laviethong.sp2@gmail.com