tóm tắt luận án Nghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất điều tiết sinh trưởng và một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng 2 loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà Nội

- Kết quả nghiên cứu của ựề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về khả năng nhân giống in vitro không sử dụng chất ựiều tiết sinh trưởng và những chỉ dẫn ảnh hưởng của giá thể, chế phẩm

 

VŨ NGỌC LAN

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG INVITRO

KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ðIỀU TIẾT SINH TRƯỞNG

VÀ MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NUÔI TRỒNG

HAI LOÀI LAN BẢN ðỊA (DENDROBIUM NOBILE LINDL.,

Chuyên ngành : Trồng trọt

Mã số : 62 62 01 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2012

Người hướng dẫn: 1 PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh

2 TS Nguyễn Văn Giang

Luận án ñược bảo vệ tại hội ñồng chấm luận án cấp trường họp tại:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

MỞ đẦU

1 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Hoàng Thảo là một trong những chi lớn nhất của của họ Lan (Orchidaceae) Ở Việt Nam hiện biết 107 loài và 1 thứ thuộc chi Hoàng thảo, phân bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số ựảo ven biển (đào Thị Thanh Vân, đặng Thị Tố Nga, 2008) [55]

Do vừa có giá trị làm cây hoa cảnh vừa làm cây dược liệu nên hai loài lan

bản ựịa của vùng núi và trung du phắa Bắc là Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl.) thuộc chi Hoàng thảo

ựã bị khai thác kiệt dẫn ựến nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt nam, phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống cây lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành cây giống hợp lý (Trần Hợp, 1990) [12] và (Lê Văn Hòa, 2008) [9] Tuy nhiên, cho ựến nay ở nước ta, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ựặc biệt sử

dụng nuôi cấy mô cải tiến hai loài lan bản ựịa: Dendrobium nobile Lindl (D.nobile)

và Dendrobium chrysanthum Lindl (D.chrysanthum) chưa có ựề tài nghiên cứu nào

ựề cập ựến một cách chắnh tắc (Trần Văn Huân, Văn Tắch Lượm, 2007) [16]

Xuất phát từ những vấn ựề nêu trên, chúng tôi ựã tiến hành ựề tài:

ỘNghiên cứu nhân giống in vitro không sử dụng chất ựiều tiết sinh trưởng và

một số biện pháp kỹ thuật nuôi trồng hai loài lan bản ựịa (Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum Lindl.) tại Hà NộiỢ với mong muốn góp phần

làm cơ sở cho việc tạo ựược nguồn cây giống không chứa các chất ựiều tiết sinh

trưởng thực vật tổng hợp phục vụ cho sản xuất nguyên liệu dược

2 Mục tiêu và yêu cầu của ựề tài

2.1 Mục tiêu của ựề tài

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất ựiều tiết sinh

trưởng thực vật tổng hợp ựể góp phần làm cơ sở duy trì, phát triển nguồn gen

ựồng thời thúc ựẩy việc nuôi trồng cây lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl như một nghề sản xuất nguyên liệu

dược mang lại hiệu quả kinh tế

2.2 Yêu cầu của ựề tài

+ Xác ựịnh ựược phương pháp thắch hợp ựể tạo nguồn vật liệu in vitro ựối với loài lan bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

+ Xác ựịnh ựược các bước kỹ thuật nhân nhanh in vitro theo hướng không

sử dụng chất ựiều tiết sinh trưởng tổng hợp ựối với loài lan bản ựịa Dendrobium

nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

+ Xác ựịnh ựược một số khâu kỹ thuật cải tiến trong nhân giống loài lan

bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl ựể có hệ

số nhân giống cao và chất lượng cây in vitro tốt

+ Xác ựịnh ựược một số khâu kỹ thuật nuôi trồng loài lan bản ựịa Dendrobium

nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl trong giai ựoạn vườn ươm

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Kết quả của ựề tài có thể ựược sử dụng làm tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu, giảng dạy về hoa lan nói chung và chi lan Hoàng Thảo nói riêng

- Kết quả nghiên cứu của ựề tài là dẫn liệu khoa học có giá trị về khả năng

nhân giống in vitro không sử dụng chất ựiều tiết sinh trưởng và những chỉ dẫn

ảnh hưởng của giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ựến sinh trưởng của hai loài lan

bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl thuộc chi

Hoàng Thảo ựang có nguy cơ tuyệt chủng ở Việt Nam

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Góp phần bảo tồn và phát triển loài lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

- đề tài ựã ựề xuất ựược quy trình nhân giống in vitro không sử dụng chất

ựiều tiết sinh trưởng và bước ựầu ựưa ra kỹ thuật chăm sóc cây thu thập của loài

lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium chrysanthum Lindl

tại Gia Lâm - Hà Nội

4 đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài

4.1 đối tượng nghiên cứu của ựề tài

- Hai loài lan rừng bản ựịa Dendrobium nobile Lindl và Dendrobium

chrysanthum Lindl thuộc chi Hoàng thảo

- Các nền môi trường nuôi cấy cơ bản của Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE)

- Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chắn

- Các yếu tố ảnh hưởng ựến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tắnh,

- Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus có thể tắch tối ựa 10 lắt

- Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ

- Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, đầu trâu

4.2 Phạm vi nghiên cứu của ựề tài

Các nghiên cứu ựược tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội; Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Long Biên - Hà Nội

5 đóng góp mới của luận án

- đã xây dựng ựược quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan bản ựịa

D.nobile Lindl và D.chrysanthum Lindl có nguy cơ tuyệt chủng không sử dụng chất

ựiều tiết sinh trưởng

- đã sử dụng thành công kỹ thuật cải tiến trong nhân nhanh hai loài lan bản ựịa bằng kỹ thuật thoáng khắ và biorector ựạt hệ số nhân cao

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và hai loài lan bản ựịa Dendrobium nobile Lindl (D.nobile) và Dendrobium chrysanthum Lindl (D.chrysanthum)

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của chi Hoàng Thảo (Dendrobium)

Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) ựược ựặt tên vào năm 1799, Dendrobium ựược hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là chi lan Hoàng Thảo, là chi lan phong phú nhất, trong họ lan có 1600 loài nguyên thủy ựược phân chia thành

40 nhóm, phân bố ở các vùng nhiệt ựới châu Á, tập trung nhiều nhất ở đông Nam Á và châu Á

1.1.2 Phân bố của chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) tại Việt Nam

Chi lan Hoàng thảo ở Việt nam rất ựa dạng và phong phú nhưng sự phân bố của chúng khá ựặc thù cho các vùng ựịa lý khác nhau Hai loài lan Thạch hộc

(D.nobile) và Ngọc vạn vàng (D.chrysanthum) chỉ ựược tìm thấy ở vùng Tây

bắc, đông bắc và trung du Bắc bộ nước ta (Phạm Hoàng Hộ, 2000) [10]

1.1.3 đặc ựiểm thực vật học chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium)

Rễ: có lớp mô xốp màu trắng ngà, nhiều công dụng như: hút nước, các muối khoáng, ngoài ra còn còn có khả năng bám chặt vào các giá thể mà chúng cần tiếp xúc Thân: thuộc loại ựa thân, hình chùy hoặc hình trụ, lóng dài

Lá: Lá hình mác có ựỉnh chia 2 thùy tù lệch, mọc cách hoặc mọc ựối nhau Hoa: thuộc cụm hoa bên, 2- 4 hoa, mọc trên thân còn lá, màu trắng tắm trắng,

có ựường kắnh 5- 6 cm Cánh môi hình phễu, viền trắng, giữa môi có 1 ựốm lớn màu tắm, khi trải phẳng có hình bầu dục, nở hoa vào các tháng trong năm

Quả: loại quả nang hình chùy, vỏ quả vừa phải, quả có 4 khối phấn, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh

1.1.4 Một số ựặc ựiểm chắnh về 2 loài lan bản ựịa D.nobile và D.chrysanthum

Ngoài các ựặc ựiểm chung ra, 2 loài lan ựều thuộc loài có nguy cơ tuyệt chủng

do chúng còn là nguyên liệu trong các bài thuốc gia truyền Loài D.nobile chuyên trị ho khan, khô cổ; ựau lưng mỏi gối, thiểu năng sinh dục, còn loài

D.chrysanthum thì chuyên trị khô miệng, phổi kết hạch; dạ dày thiếu vị chua; di

tinh, ra mồ hôi trộm, thắt lưng ựau mỏi

1.1.5 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác một số loài lan Hoàng Thảo bản ựịa tại miền Bắc Việt Nam

Hai loài lan D.nobile, D.chrysanthum vừa có giá trị thẩm mỹ và ựặc biệt là giá

trị làm dược liệu cao nên chúng ựều ở mức ựộ nguy cấp tuyệt chủng trong tự

nhiên Các loài lan rừng Dendrobium nobile Lindl., Dendrobium chrysanthum

Lindl rất cần ựược ưu tiên nghiên cứu nhân giống, nuôi trồng nhằm bảo tồn phát triển ựược nguồn tài nguyên thực vật quý giá của Việt Nam

1.2 Cơ sở khoa học của các kỹ thuật nuôi cấy nhân giống trong ựề tài

1.2.1 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô, tế bào (nhân giống in vitro) dựa

trên cơ sở về tắnh toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào, mô

thực vật đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật ựã thực sự mang lại hiệu quả kinh tế to lớn (Vũ Văn Vụ và cs, 2001) [57], (Hoàng Minh Tấn và cs,

2006) [37] Ngoài ra, nhân giống vô tắnh in vitro cho phép nhân giống cây trồng

ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các ựối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), hệ số nhân cao và cho ra các cá thể sạch bệnh, hoàn toàn ựồng nhất về mặt di truyền đó là ưu việt mà các phương pháp nhân giống khác không có ựược (Razan MK , 1994) [89], (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2004) [18], (Võ Hà Giang, Ngô Xuân Bình, 2010) [8]

1.2.2 Nhân giống bằng bioreactor

Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống, thường ựược sử dụng trên môi trường có agar (thạch) phải trải qua nhiều công ựoạn nuôi cấy, tỷ lệ mẫu nhiễm tăng, nhân công lao ựộng nhiều qua các khâu trong quá trình nhân giống, do ựó cần có một hệ thống nhân giống hiện ựại bioreactor có thể nâng tần suất nhân giống lên quy mô công nghiệp là cần thiết ựể giảm thấp chi phắ sản xuất, giảm giá thành cây giống (Trần Văn Minh, 1999) [3] và (Nguyễn đức Lương và cs, 2002) [26]

1.2.3 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro

Môi trường nuôi cấy là ựiều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết ựịnh cho sự phân hóa tế bào và cơ quan trong nuôi cấy Có nhiều loại môi trường nuôi cấy cho các loại thực vật khác nhau và mục ựắch nuôi cấy khác nhau Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các môi trường nuôi cấy

thành bốn nhóm sau (Trigiano R.N và Gray D.J., 1999) [101], (Nguyễn Quang

Thạch, 2009) [43]

1.3 Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây lan

1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn mẫu nuôi cấy

để tạo các dòng vô tắnh mang ựặc tắnh di truyền của cơ thể mẹ, bắt buộc nguồn mẫu cấy ban ựầu phải là các mô, cơ quan sinh dưỡng của cây mẹ Từ các

mô, cơ quan sinh dưỡng này cần phải tạo ựược thể sinh chồi (protocorm) nhờ môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất ựiều tiết sinh trưởng thắch hợp Theo

George, 1993 [62] ựã tổng hợp một số công trình nhân giống vô tắnh in vitro các

loài lan chi Hoàng Thảo của các tác giả nước ngoài

1.3.2 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy

Các tác giả Bùi Thị Tường Thu và Trần Văn Minh (2010) [47] cũng ựã thu ựược kết quả tương tự khi nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau ựến nuôi cấy mô lan Trong năm loại môi trường nghiên cứu (MS, VW,

KC, Orchmax và Lindemann), môi trường tốt nhất cho cây Dendrobium lai là

MS và cho cây Cymbidium lai là Orchimax

Nền môi trường nuôi cấy với nồng ựộ và tỷ lệ khác nhau của các nguyên tố

khoáng ựa, vi lượng, vitaminẦcó ảnh hưởng rất rõ ựến kết quả nuôi cấy in vitro

cây lan Nhiều tác giả ựã xác nhận dùng các môi trường Vacin và Went (VW), Murashige và Skoog (MS), Knudson C (KC) rất tốt cho cấy mô các loài thuộc

họ lan Khi nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại môi trường trên ựối với nuôi cấy

mô cây Dendrobium “Sonia”, các nhà nghiên cứu tại ðại học Mauritius kết luận

môi trường MS có hiệu quả nhất trong nhân nhanh PLB (Puchoa, 2004)

1.3.3 Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ

Ảnh hưởng của nguồn các bon hữu cơ ñến nuôi cấy in vitro cây lan ñã ñược

nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu Roslina Jawan và cộng sự ñã chứng minh

ñược chồi Vanda dearei sinh trưởng tốt hơn trên môi trường nuôi cấy bổ sung

ñường saccharose so với ñường glucose và fructose ðồng thời trong 3 nồng ñộ ñường saccharose nghiên cứu (1, 2, 4%) thì nồng ñộ 2% là thích hợp nhất (Roslina Jawan et al., 2010) [91] Nồng ñộ ñường 2% cũng ñược cho là phù hợp

nhất trong nuôi cấy lan Cymbidium (Mamoru, 1980) [81] Với cây Cattleya

granulosa thì nồng ñộ saccaroza thích hợp cho sự sinh trưởng của chồi là 1,5%

và cho sự tạo rễ là 3% (Pinto et al., 2010) [87]

1.3.4 Ảnh hưởng của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên

Ở nước ta, việc sử dụng các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên trong nuôi cấy in

vitro cây lan ñã ñược nhiều tác giả thực hiện Nguyễn Quang Thạch và cộng sự

(2003) [39] ñã khẳng ñịnh các hợp chất BA, Kinetin không có tác ñộng tích cực trong giai ñoạn nhân nhanh thể PLB và chồi của lan Hồ ñiệp Mặt khác ñể tăng

hệ số nhân và chất lượng của chồi in vitro nên sử dụng các loại dịch nghiền của khoai tây, cà rốt, chuối… Khi nuôi cấy in vitro D.pirimulinum, Nguyễn Thị

Trang (2009) cũng chứng minh ñược môi trường MS không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng là thích hợp ñể hình thành PLB từ hạt và ñể nhân nhanh PLB thì môi trường (MS+10% nước dừa+1g pepton+30g khoai tây+30g cà rốt)/l là hiệu quả nhất Hiệu quả của các hỗn hợp chất hữu cơ tự nhiên cũng ñược khẳng ñịnh

trong nuôi cấy in vitro cây Paphiopedilum hangianum Gurss (Nguyễn Quang

Thạch và CS., 2010) [43]

1.3.5 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy

Với cây lan nói chung, một số tác giả ñã bước ñầu nghiên cứu nhân giống in

vitro trong bioreactor, nhằm nâng cao hệ số nhân, nâng cao chất lượng và giảm

giá thành Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng hệ thống bioreator ñể nhân giống cây trồng còn ít, mới mẻ Các nghiên cứu ñược thực hiện thời gian gần ñây ở trong và ngoài nước chỉ trên một số ñối tượng, ñặc biệt chưa có nơi nào

thực hiện nghiên cứu trên các ñối tượng lan rừng D.nobile và D.chrysanthum

1.3.6 Nhân giống in vitro D.nobile và D.chrysanthum

Năm 2002, Nihar Ranjan Nayak và cộng sự ñã nghiên cứu tạo protocorm từ

lát cắt chồi lan D.nobile trên môi trường MS bổ sung một trong ba chất ñiều tiết

sinh trưởng ZR 14.0 µM, N6-benzyladenine (BA) 11.0 µM hoặc kinetin (Kn) Kết

quả 80% mẫu cấy của D.nobile hình thành protocorm Kết quả tương tự cũng ñã

thu nhận ñược bởi Malabaddi và cộng sự (2004) [92] Cũng thời gian này, Ricardo

T de Faria và cộng sự (2004) [102] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng

ñường trong môi trường ñến nuôi cấy in vitro lan D.nobile Các tác giả Trung Quốc

ñã tạo ñược thể PLB từ ñỉnh chồi D.nobile khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ

sung 1-3mg/l hợp chất BA Các tác giả này cũng ñã thiết lập ñược hệ thống nhân

nhanh PLB với hai công ñoạn là: ñầu tiên cảm ứng tạo PLB trên môi trường lỏng

và sau ñó nhân PLB trên môi trường ñặc (Liao et al., 2006) [88] Năm 2009,

Rajeswari Vasudevan và Johannes van Stade [103] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả D.nobile ñến khả năng nảy mầm của hạt trên môi trường MS và P668

Sana Asghar và cộng sự (2011) [104] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin,

IBA, αNAA và nước dừa ñến sự sinh trưởng in vitro của chồi D.nobile Họ ñã xác

ñịnh ñược môi trường MS bổ sung 2mg/ BA là tốt nhất ñể nhân nhanh chồi và môi trường MS+2mg/ IBA là tốt nhất cho sự ra rễ của chồi

Các công trình công bố về nuôi cấy in vitro D.chrysanthum còn khá hạn chế

Kalyan Kumar De và cộng sự [85] ñã nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa (15 và 25%) và αNAA (0,1mg/l và 0,5mg/l) ñến sự nảy mầm của hạt tách từ quả 70 ngày tuổi trên môi trường KC Các tác giả này ñã thu ñược kết quả là: môi trường KC+

15% nước dừa+0,1% αNAA cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất (90%) và các cây con in

vitro khi chuyển ra vườm ươm có tỷ lệ sống ñạt 98-99% (Kalyan Kumar De et al.,

2006) [85] Koravisd Nathalang (Thái Lan) [86] ñã gieo hạt của quả D.chrysanthum

trên môi trường KC bổ sung 15% nước dừa và 1g/l than hoạt tính Các chồi mầm sau

8 tháng ñã ñược chuyển sang môi trường KC+15% nước dừa và bổ sung thêm αNAA (0, 0.5, 1, 1.5, 2 và 2.5 ppm), các axít amin (200 ppm của glutamine, alanine

và methionine) và saccarose (20, 40 và 60 g/l)

1.4 Các nghiên cứu về nuôi trồng lan Hoàng thảo

1.4.1 Các ñiều kiện cơ bản ñể trồng lan Dendrobium

Chi Dendrobium gồm nhiều loài thích nghi với các ñiều kiện sinh thái khác nhau Yêu cầu nhiệt ñộ có thể chia Dendrobium làm 2 nhóm chính: nhóm ưa lạnh và nhóm ưa nóng (Dương ðức Huyến, 2007) [17] Dendrobium cũng như

ña số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong ñiều kiện không khí ẩm nhưng thoáng khí, vào ban ngày cây cần ñộ ẩm khoảng 40-60%, ban ñêm ñộ ẩm thích hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn (http://orcchid.com.vn.) [110] Thời gian chiếu sáng trong ngày cũng là ñiều kiện quyết ñịnh sự ra hoa của một số loài chịu ảnh hưởng bởi quang kỳ, ví dụ: lan Giả Hạc, Long Tu, Kim ðiệp chỉ ra hoa với ñiều kiện ánh sáng có thời gian chiếu ít hơn 10 giờ trong ngày

(http://orcchid.com.vn.) [110] Giá thể của Dendrobium cần ñảm bảo chậu trồng

phải thoáng, không úng nước Ngoài ra, Dinh dưỡng ñóng vai trò rất quan trọng ñối với cây lan, nhất là ñối với việc trồng qui mô lớn nhằm khai thác hàng hoá Trong

cả chu kỳ sống của cây lan cần 13 chất dinh dưỡng khoáng, thuộc các nhóm ña, trung và vi lượng Dinh dưỡng ña lượng là ðạm (N), Lân (P) và Kali (K) Dinh dưỡng trung lượng bao gồm Lưu huỳnh (S), Magiê (Mg) và Canxi (Ca) Dinh dưỡng vi lượng là Sắt (Fe), Kẽm (Zn), ðồng (Cu), Mangan (Mn), Bo (B), Molypñen (Mo) và Clo (Cl) (Nguyễn Hạc Thủy, 2000) [48] và (Trần Văn Huân, 2002) [15] Khi nuôi trồng cây tại vườn ươm và vườn sản xuất, cây lan thường gặp một số sâu bệnh phổ biến do nấm, vi khuẩn, sâu, chúngta phải thực hiện chế

ñộ vệ sinh vườn, phun phòng trừ ñịnh kỳ (www.hoacaycanh.com) [107]

1.4.2 Nghiên cứu về nuôi trồng cây lan Dendrobium sau nuôi cấy mô

Giá thể có ý nghĩa quan trọng ñối với nuôi trồng cây lan, ñặc biệt là trong giai ñoạn vườm ươm Sử dụng giá thể phù hợp sẽ giữ ẩm giúp cho cây sinh trưởng, phát triển tốt Nhiều tác giả Trung quốc ñã quan tâm nghiên cứu về ảnh

hưởng của giá thể ñến sinh trưởng, phát triển của cây lan Dendrobium Gong

Jian-ying và cộng sự (2007) [63] nhận thấy giá thể gồm ñá núi lửa + xơ dừa +

than củi theo tỷ lệ 1:2:1 thích hợp cho trồng lan Dendrobium Theo Pan

Chun-xiang và cộng sự (2009) [85] các loại giá thể vỏ cây, mùn cưa, gạch vụn…ñã

ảnh hưởng ñến cấu trúc rễ của cây D.chrysanthum Fan Min Fu Yulan (2008)

[60] cho rằng giá thể phù hợp ñể trồng D.nobile là vỏ cây + rong biển (dớn)

Trong khi Zhang Feng-yin và cộng sự (2009) [105] kết luận, sau khi ra cây trên

6 loại giá thể khác nhau lại khẳng ñịnh giá thể tốt nhất cho cây D.nobile cấy mô

là xơ dừa Wen Gang và cộng sự (2009) [106] cho rằng mùn cưa là giá thể tốt

hơn cho D.nobile so với vỏ cây, rêu hay ñất mùn Ngoài ra, trong giai ñoạn vườn

ươm, cây lan cấy mô ñược cung cấp dinh dưỡng dưới dạng phun dung dịch phân bón lên toàn bộ bề mặt cây Theo Ken Leonhardt (1999) [72] cây lan

Dendrobium cấy mô sau khi ra cây 2 tuần mới cần cung cấp dinh dưỡng và tỷ lệ

phân bón N:P:K phù hợp là 3:1:1 hoặc 3:1:2 với chu kỳ phun là 01lần/tuần, khi cây chuyển sang chậu ñơn thì dùng tỷ lệ phân bón N:P:K là 14:14:14 Fan Min

Fu Yulan (2008) [60] cũng nhận ñược kết quả tốt nhất khi dùng tỷ lệ phân bón

N:P:K là 1:1:1 với nồng ñộ 0,7% cho cây lan D.nobile một năm tuổi Bên cạnh

phân bón, một số chế phẩm sinh học cũng ñã ñược sử dụng ñể kích thích sinh

trưởng, phát triển của lan Dendrobium Leena Kechacupt (1987) [78] ñã phun Triacontanol cho cây Dendrobium Hepa ở giai ñoạn tám tháng tuổi và kết luận

rằng dung dịch Triacontanol nồng ñộ 1mg/l ñã làm tăng số số lượng cành

hoa/cây và làm cây ra hoa sớm hơn ñối chứng Uthairatanakij và cộng sự (2008)

[104] ñã sử dụng dung dịch Chitosan với nồng ñộ từ 200 ñến 600mg/l ñể làm

tăng khối lượng cành hoa, kích thước cánh hoa của lan Dendrobium “Sonia”

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) ñược thu thập tại: Hòa Bình

+ Chồi mầm, quả, cây thu thập của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và

D.chrysanthum

+ Các nền môi trường nuôi cấy mô cơ bản theo Vacin and Went, 1949 (VW); KnudsonC, 1965 (KC), Murashige-Skoog, 1962 (MS), Robert Ernst, 1979 (RE) + Dịch chiết hữu cơ từ các loại củ quả: khoai tây, cà rốt, táo, chuối chín

+ Các yếu tố ảnh hưởng ñến nhân nhanh in vitro: saccaroza, than hoạt tính

+ Hệ thống bioreactor do hãng Sartorius sản xuất, mã hiệu máy Biostat Bplus, bình nuôi có thể tích tối ña 10 lít

+ Các giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi, gỗ nhãn, dương xỉ

+ Các chế phẩm dinh dưỡng: Antonic, Yogen, Komix, Growmore, ðầu trâu

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp khử trùng và cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn

vật liệu in vitro với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến khả năng nhân nhanh, tạo cây

hoàn chỉnh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum theo

phương pháp nuôi cấy mô truyền thống

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh in vitro ñối với hai loài lan bản ñịa nghiên cứu theo phương pháp nuôi cấy cải tiến

Nghiên cứu ảnh hưởng thời vụ ra cây, giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến tỷ

lệ sống và ñộng thái tăng chiều cao, số lá của cây con in vitro hai loài lan bản ñịa nghiên cứu D.nobile và D.chrysanthum tại vườn ươm, vườn sản xuất

Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể, chế phẩm dinh dưỡng ñến sinh trưởng phát

triển trong giai ñoạn nuôi trồng cây thu thập của hai loài lan bản ñịa D.nobile và

D.chrysanthum

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí các thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H2O2 2%

và HgCl2 0,1% của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 2: Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan trên hai loài

lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các nền môi trường cơ bản ñến khả năng nhân

nhanh cụm chồi của hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân

nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan bản ñịa D.nobile

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến khả năng nhân nhanh

cụm chồi của hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả

năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile

Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh

thể sinh chồi (protocorm) của loài lan D.nobile

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của dịch nghiền hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến khả

năng nhân nhanh cụm chồi của hai loài lan nghiên cứu D.nobile và

D.chrysanthum

Thí nghiệm 10: Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân

nhanh cụm chồi trên hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nền môi trường cơ bản ñến sinh trưởng của

chồi lan với hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ ánh sáng tới khả năng

sinh trưởng của chồi lan D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả

năng tạo rễ của chồi hai loài lan bản ñịa D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút

bông ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài lan rừng

D.nobile

Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy khi sử dụng nút

màng lọc thoáng khí ñến khả năng nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) ñối với loài

lan rừng D.nobile

Thí nghiệm 16: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá

trình nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy ñặc có màng lọc

thoáng khí ñối với loài lan rừng D.nobile

Thí nghiệm 17: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccaroza ñến quá trình

nhân nhanh thể sinh chồi (protocorm) trong nuôi cấy lỏng lắc có màng lọc thoáng khí

ñối với loài lan rừng D.nobile

Thí nghiệm 18: Nghiên cứu ảnh hưởng của các phương thức nuôi cấy ñến khả

năng nhân nhanh cụm chồi ñối với loài lan rừng D.chrysanthum

Các thí nghiệm từ thí nghiệm 1 ñến thí nghiệm 18 ñược bố trí theo phương pháp nuôi cấy mô tiêu chuẩn hiện hành

Thí nghiệm 19: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ ra cây ñến tỷ lệ sống cây in

vitro vườn ươm của hai loài lan rừng D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 20: Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh trưởng của

02 loài lan rừng thu thập D.nobile và D.chrysanthum

Thí nghiệm 21: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng ñến chiều

cao, số lá cây in vitro trên hai loài lan (D.nobile và D.chrysanthum) ngoài vườn ươm

Thí nghiệm 22: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng ñến sinh trưởng trên

hai loài lan rừng thu thập D.nobile và D.chrysanthum ở vườn sản xuất

Thí nghiệm 23: Ảnh hưởng của chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến sinh trưởng của

hai loài lan bản ñịa thu thập D.nobile và D.chrysanthum

Các thí nghiệm từ 19 ñến 23 ñược bố trí theo phương pháp thí nghiệm ñồng ruộng của Phạm Chí Thành

2.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp ñánh giá

2.3.2.1 Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy invitro

* Các chỉ tiêu theo dõi trong nuôi cấy in vitro

Tổng số mẫu nhiễm

- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)=

Tổng số mẫu cấy x 100 Tổng số mẫu sống

- Tỷ lệ mẫu sống (%) =

Tổng số mẫu cấy x 100

Số mẫu hình thành thể sinh chồi (protocorm)

- Tỷ lệ mẫu tạo thể sinh chồi

(protocorm)(%) =

Tổng số mẫu sống

x 100

- ðường kính cụm thể sinh chồi (protocorm) (mm) = Sử dụng thước ño ñường chéo, lấy giá trị trung bình

- Hệ số nhân thể sinh chồi (protocorm) (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy

- Hệ số nhân chồi (lần): Sau 8 tuần nuôi cấy

Tổng số chồi sau 8 tuần nuôi cấy HSN =

Tổng số chồi ban ñầu

- Chiều cao cây(cm) là khoảng cách từ gốc rễ ñến ñầu mút lá

Tổng số lá trên các cây thí nghiệm

Số lá TB/cây =

Tổng số cây thí nghiệm Tổng số rễ trên các cây thí nghiệm

2.3.3.2 Nhóm thí nghiệm ở vườn ươm và vườn sản xuất

Các thí nghiệm ñược tiến hành trong ñiều kiện nhà nuôi trồng lan của Viện Sinh học Nông Nghiệp - Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội và Học viện Hậu Cần - Ngọc Thụy - Gia Lâm - Hà Nội

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu theo theo chương trình IRRISTART 5.0 và phần mềm Excel

2003

Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể tạo nguồn vật

liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và D.chrysanthum

Tổng số lượng thể sinh chồi (protocorm) sau 8 tuần nuôi cấy HSN =

Tổng số lượng thể sinh chồi (protocorm) ban ñầu

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác ñịnh lựa chọn phương pháp khử trùng, cơ quan nuôi cấy ñể tạo

nguồn vật liệu in vitro với hai loài lan D.nobile và D chrysanthum

3.1.1 Xác ñịnh hiệu quả khử trùng ñối với chồi mầm trong H 2 O 2 2% và HgCl 2 0,1%

Môi trường nuôi cấy = (MS + 100ml nước dừa + 10g sacaroza + 6g

agar)/lít, Dn: D.nobile; Dc: D.chrysanthum

Công thức 3 (sử dụng HgCl2 0,1% kép trong 3 phút, tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài và ngâm tiếp trong HgCl2 0,1% trong 1 phút) ñã cho tỷ lệ mẫu

sống cao nhất là 8,89% ñối với loài lan rừng D.nobile; 3,48% ñối với loài lan rừng D.chrysanthum (bảng 3.1)

Mẫu chồi mầm không có hiệu quả cao trong việc tạo nguồn mẫu sạch in

vitro với hai loài lan nghiên cứu

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng

ñến khả năng sống của chồi mầm lan D.nobile và D chrysanthum

(Sau 6 tuần, ðơn vị tính: %)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sống (%) Công thức thí nghiệm

Dn Dc Dn Dc Dn Dc

H2O2 2% kép, lần 1 trong 5

phút và lần 2 trong 2 phút 23,33 24,56 72,23 72,30 4,44 3,14 Lần 1 trong H2O2 2% 5 phút, lần

2 trong HgCl2 0,1% 1 phút 61,11 57,42 36,67 40,56 2,22 2,02 HgCl2 0,1% kép, lần 1 trong 3

phút và lần 2 trong 1 phút 37,78 40,02 53,33 56,50 8,89 3,48

3.1.2 Xác ñịnh phương pháp khử trùng ñối với quả lan

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ñến tỷ lệ mẫu sống

và nẩy mầm của quả 02 loài lan D.nobile và D.chrysanthum

(Sau 6 tuần, ðơn vị tính:%)

Tỷ lệ mẫu sống

và phát sinh protocorm (%)

Tỷ lệ mẫu sống

và phát sinh chồi (%) Công thức thí nghiệm

Công thức 1 khử trùng quả tốt nhất với cả 02 loài lan; loài lan D.nobile có

97% hạt phát sinh thể sinh chồi (protocorm), 3% nẩy cụm chồi; loài lan

D.chrysanthum Lindl 100% hạt nẩy mầm tạo chồi, cụm chồi (bảng 3.2)