Nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan hài có nguy cơ tuyệt chủng paphiopedilum dianthum

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu: 26 3.1 Nhóm thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu: 33 3.1.1 Xác định tuổi quả đến khả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ MINH TRÂM

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LOÀI LAN HÀI CÓ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG

PAPHIOPEDILUM DIANTHUM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ MINH TRÂM

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LOÀI LAN HÀI CÓ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG

HÀ NỘI - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Minh Trâm

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn của mình, tôi đã nhận được sự chỉ bảo tận tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy giáo, cô giáo, các nhà khoa học, các nhà quản lý, cán bộ công nhân viên Viện sinh học nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Hoàng Thị Nga- Trưởng phòng Công nghệ sinh học Thực vật, Viện Sinh học nông nghiệp; GS TS Nguyễn Quang Thạch – Chủ tịch Hội đồng Khoa

học Viện sinh học nông nghiệp– Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, đánh giá kết quả và hoàn thành luận văn đồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu

Với tình cảm sâu sắc, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo, cán bộ công nhân viên Viện Sinh học nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn này

Để hoàn thành luận văn này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy giáo,

Cô giáo, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ sinh học –Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè, anh em, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Thị Minh Trâm

1.1.1 Một số đặc điểm của họ Lan (Orchidaceae) 3 1.1.2 Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của lan Hài 4

1.2.2 Những nét chính của chi Paphiopedilum 7 1.3 Thực trạng cây lan Hài trên thế giới và ở Việt Nam 11 1.3.1 Sự phân bố của Lan Hài trên thế giới 11

1.3.3 Thực trạng của Lan Hài ở Việt Nam 13

1.3.3 Một số nét chính về cây lan Hài P.dianthum 19 1.4 Những nghiên cứu về nhân giống cây lan Hài 22 1.4.1 Những nghiên cứu về nhân giống cây lan Hài trên thế giới 22 1.4.2 Những nghiên cứu về nhân giống cây Lan Hài ở Việt Nam 25

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu: 26

3.1 Nhóm thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu: 33 3.1.1 Xác định tuổi quả đến khả năng nảy mầm của hạt loài Lan

3.1.2 Xác định nền môi trường thích hợp cho khả năng nảy mầm của

3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới sự phát sinh hình

thái của hạt lan Hài Paphiopedilum dianthum sau nảy mầm 37 3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐTST đến sự phát sinh hình thái của

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất ĐTST đến khả năng nhân

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số dịch chiết dinh dưỡng được bổ

sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh của Lan Hài

3.3 Nhóm thí nghiệm tạo cây hoàn chỉnh 52

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến sự ra rễ của chồi 54

3.3 Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của hạt lan Hài

3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh hình thái của

3.5 Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của callus 40 3.6 Ảnh hưởng của TDZ đến sự phát sinh hình thái của callus 41 3.7 Ảnh hưởng của TDZ kết hợp với K tới sự phát sinh hình thái của

3.8 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân nhanh của PLBs và chồi lan

3.9 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh của PLBs và chồi lan

3.10 Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến quá trình nhân nhanh của

3.11 Ảnh hưởng của TDZ kết hợp với NAA đến quá trình nhân nhanh của

3.12 Ảnh hưởng của dịch chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến quá

trình nhân nhanh loài lan Hài P.dianthum 50 3.13 Ảnh hưởng của dịch chuối kết hợp với khoai tây bổ sung vào môi

trường nuôi cấy đến quá trình nhân nhanh lan Hài loài lan Hài

DANH MỤC HÌNH

1.2 Một số hình ảnh về lan Hài P.dianthum 22 3.1 Hạt lan Hài P.dianthum sau 12 tuần theo dõi 34 3.2 Hạt lan Hài P.dianthum trên các nền môi trường (sau 12 tuần ) 36 3.3 Sự phát sinh hình thái của hạt lan HàiP.diathum sau nảy mầm (sau 12

3.4 Một số hình ảnh về sự phát sinh hình thái của callus loài lan

HàiP.diathum (sau 12 tuần nuôi cấy) 43 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐTST đến quá trình nhân nhanh của PLBs và

chồi lan Hài P.dianthum (sau 12 tuần nuôi cấy) 49 3.6 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của

chồi loài lan Hài P.dianthum (sau 10 tuần nuôi cấy) 54

CTTD Chỉ tiêu theo dõi

TGTD Thời gian theo dõi

CTTN Công thức thí nghiệm

PLB Protocorm like body: Thể sinh chồi

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ Lan bởi cấu trúc hoa khác thường của chúng với một cánh hoa giữa (còn gọi là môi hay cánh hoa) hình túi sâu, trông giống như một chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, do đó trở thành tên chung của nhóm lan này(Averyanov et al., 2003)

Các kết quả của quá trình nghiên cứu thực vật của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật thuộc trung tâm khoa học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam và nghiên cứu các mẫu thu mua để buôn bán thì có 18 loài lan Hài và 4 dạng lai tự nhiên đã được biết đến một cách chắc chắn ở Việt Nam Trong số 18 loài lan Hài đã được biết đến tại Việt Nam thì có tới 15 loài phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc chủ yếu tập trung ở các tỉnh như: Thái Nguyên, Tuyên Quang, Lai Châu, Sơn La, Cao Bằng chỉ có 3 loài có khu vực phân bố là: Đắc Lắc, Khánh Hòa, Quảng Trị(Averyanov et al., 2003)

Việt Nam là một trung tâm đa dạng và đặc hữu lan ở vùng Đông Nam Á Nhiều loài lan Hài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn có những loài đặc hữu hẹp, là báu vật quốc gia có tầm quan trọng quốc tế Tuy nhiên tình hình thực tế hiện nay do việc khai thác rừng bừa bãi, nạn cháy rừng thường xuyên, xuất bán tràn lan sang Trung Quốc xảy ra trên diện rộng đã làm trữ lượng của cây bị giảm sút, không gian sống của các loài lan Hài đang bị thu hẹp, sự đa dạng sinh học đang bị suy giảm nghiêm trọng dẫn tới nguồn tài nguyên quý mà thiên nhiên ban tặng này đang

có nguy cơ tuyệt chủng.Lan Hài còn tồn tại rất ít trong vùng phân bố tự nhiên, phần lớn ở những vách núi hiểm trở, khó tiếp cận(Averyanov et al., 2003) Vì vậy việc bảo tồn và phát triển các loài lan Hài của Việt Nam nói chung đặc biệt là các loài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc là nhiệm vụ vô cùng cấp thiết vì nó có vai trò cực kỳ quan trọng đối với đời sống vật chất, tinh thần của con người cũng như duy

trì cân bằng sinh thái tự nhiên Trong đó, phương pháp nhân giống vô tính in

vitrolan Hài đã và đang mở ra triển vọng tốt cho việc bảo tồn gen và phát triển giống lan quý này đồng thời mở ra triển vọng phát triển kinh tế nâng cao thu nhập

Trên cơ sở đó, tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitroloài lan

Hài có nguy cơ tuyệt chủng Paphiopedilum dianthum”

2 Mục đích và yêu cầu

* Mục đích

- Nhân giống in vitrothành cây loài lan Hài Paphiopedilum dianthum

- Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng, chất hữu cơ bổ

sung vào môi trường nuôi cấy làm cơ sở cho việc xây dựng qui trình nhân giống in

vitro loài lan Hài Paphiopedilum dianthum

* Yêu cầu

- Xác định được tuổi quả thích hợp để đưa vào nhân giống loài lan Hài

P.dianthum

- Xác định được môi trường nền thích hợp cho việc vào mẫu và nhân nhanh

loài lan Hài Paphiopedilum dianthum

- Xác định được chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ tối ưu bổ sung vào môi

trường nhân nhanh giống loài lan Hài P.dianthum

- Xác định được môi trường tối ưu nhất cho sinh trưởng, phát triển và hình

thành rễ của cây in vitroloài lan Hài P.dianthum

3 Ý nghĩa của đề tài

* Ý nghĩa khoa học:

- Kết quả nghiên cứu sẽ đưa ra được một qui trình nhân giống loài lan Hài

P.dianthum bằng phương pháp nhân giống in vitro

- Đánh giá được tác động của một chất điều tiết sinh trưởng trong nhân

giống hoa lan P.dianthum

- Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và

sản xuất cây hoa lan P.dianthum

* Ý nghĩa thực tiễn:

Sản xuất được cây con sinh trưởng phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn, kịp thời phục vụ cho sản xuất Thuận lợi cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất hoa thương phẩm, từ đó kích thích sản xuất hoa phát triển

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về họ Lan nói chung và lan Hài nói riêng:

1.1.1 Một số đặc điểm của họ Lan (Orchidaceae)

Họ Lan (danh pháp khoa học Orchidaceae) được nhiều nhà phân loại học phân chia khác nhau, liên tục thay đổi cả về sắp xếp và số lượng chi, loài Nhà khoa học người Thụy Điển Carl von Linné công nhận 8 chi trong họ này năm

1753 Antoine Laurent de Jussieu xác nhận Orchidaceae là một họ thực vật năm

1789

Hiện nay các loài lan được xếp vào 5 hay 6 phân họ chính, ngoài ra là các tông, phân tông, chi và phân chi chưa thống nhất xếp cụ thể Số lượng loài và chi Phong lan hiện không ngừng tăng lên theo thời gian, đặc biệt là các loài lai làm cho

họ Orchidaceae trở thành một trong những họ thực vật lớn nhất thế giới với khoảng

28.000 loài tự nhiên và 100.000 lai ghép

Đặc điểm hình thái:

- Cơ quan sinh dưỡng:

+ Giả hành (thân giả): chỉ xuất hiện trên các loài lan đa thân Giả hành là bộ phận hết sức cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, đây là bộ phận dự trữ nhiều chất dinh dưỡng, rất cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Giả hành cũng là cơ quan dự trữ nước

+ Thân: Thân vảy giả có nhiều hình dáng khác nhau tùy theo giống lan Trên thân có đốt, trên mỗi đốt mọc một nhánh lá hoặc lá bao Thân là cơ quan dự trữ nước và chất dinh dưỡng, mầm hoa và mầm lá đều mọc từ gốc của bộ phận thân rễ Các loài lan có thân thường không có cơ quan dự trữ nước và chất dinh dưỡng + Lá: Lá là cơ quan dinh dưỡng của lan, là nhà máy chế tạo chất dinh dưỡng thông qua quá trình quang hợp Phiến lá thường có hình lưỡi kiếm dài, số lượng và hình dạng lá khác nhau tùy vào chủng loại lan khác nhau Lá có thể mọc đối xứng hoặc không đối xứng qua thân chính, lá sát nhau ở gốc hay xếp cách có bẹ úp lên

+ Căn hành (thân-rễ): chỉ gặp ở các loài lan đa thân Căn hành là nơi cấu tạo các cơ quan dinh dưỡng mới, trên căn hành có nhiều mắt sống, chết hoặc hưu niên Mắt lá là nơi hình thành và cũng mang rất nhiều rễ để nuôi sống cây lan

+ Rễ: Ở các loài lan đa thân, rễ thường được hình thành từ căn hành Ở các loài đơn thân, rễ mọc ra từ thân và thường xen kẽ với lá Rễ trên không của các loài lan phụ sinh có một trục chính bao quanh bởi mô không chặt, giống bọt biển bao quanh gọi là mạc Mạc có thể hấp thụ hơi nước từ không khí, cũng như tích trữ nước mưa và sương đọng (Nguyễn Thiện Tịch, 2001)

- Cơ quan sinh sản:

+ Hoa: Hoa thường tập hợp thành cụm hoa chùm hay bông Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành 2 vòng: 3 mảnh vòng ngoài (đài hoa) và 2 mảnh vòng trong (cánh hoa) bé hơn mảnh thứ 3 ở vòng trong Mảnh này có hình dạng và màu sắc khác hẳn được gọi là cánh môi, lúc nở bầu vặn

180o cánh môi quay ra trước làm chỗ đứng cho côn trùng Ở những loài có cụm hoa treo thõng không có hiện tượng quay Ở góc cánh hoa mới có mật Nhị thường chỉ

có 1 hoặc 2, ít khi có 3 hoặc 5 Có trường hợp nhị một trụ gọi là trụ nhị - nhuỵ Nhị gồm 2 phần: khối phấn và hốc phấn Bầu dưới 3 ô, chứa nhiều noãn dính trụ giữa hoặc noãn bên

+ Quả : Quả khi khô thường mở thành 3-6 mảnh Hạt rất nhỏ và nhiều, thường không có nội nhũ Do nhẹ nên hạt dễ phát tán nhờ gió Ở nhiều loài, trong quả thường có lông hút nước dùng để bắn hạt đi Phôi trong hạt phát triển yếu, thường không phân hóa thành cơ quan, sau 2-8 tháng hạt mới chín, phần lớn hạt bị thui không nảy mầm được Hạt muốn nảy mầm cần có nấm cộng sinh(Nguyễn Thiện Tịch, 2001)

1.1.2 Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của lan Hài

Lan Hài là môt nhánh nhỏ nhưng rất nổi bật trong quá trình tiến hóa của Lan

Họ Lan (Orchidaceae) thể hiện một trong những dòng chuyên hóa nhất của thực vật

có hoa Tất cả các loài Lan đều bắt nguồn từ các tổ tiên kiểu Hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao hoa ngoài gọi là lá đài và ba mảnh bao hoa vòng trong gọi là cánh hoa) và 6 nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Một

số xu hướng chuyên hóa về hình thái có thể quan sát được trong sự tiến hóa và hình

thành của các nhóm Lan khác nhau Tuy nhiên, sự giảm số lượng nhị đực và sự dính liền giữa nhị (các nhị) đực hữu thụ còn tồn tại với nhị cái là sự biến đổi cơ bản nhất dẫn đến sự tiến hóa của họ Sự giảm liên tục số lượng nhị đực dẫn đến sự hình thành các nhóm Lan có ba, hai hay một nhị đực duy nhất tồn tại trong hoa(Averyanov và cs., 2008)

Các đại diện của các nhóm hoa Lan nguyên thủy nhất có hai hoặc ba nhị đực

trong hoa Các loài này, còn được gọi là lan Apostasia, được xếp dưới họ

Apostasioideae Đây là một nhóm nhỏ bao gồm các loài địa lan sống ở vùng nhiệt

đới châu Á và bắc Australia và có hai chi, Apostasia và Neuwiedia, với khoảng 16 loài Hoa của chúng đều và phần nào giống Hypoxis

Nhóm thứ hai cũng có hai nhị đực tồn tại trong hoa Đó là lan Hài (dưới bộ

Cypripedioideae) và nó cũng đại diện cho một dòng tiến hóa riêng Dưới họ này bao

gồm khoảng 5 chi (Cypripedium, Mexipedium, Paphiopedium, Phragmipedium và

Selenipedium) và có khoảng 150 loài phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới Á-Âu, Bắc

Mỹ và Nam Mỹ(Averyanov và cs., 2008)

Các loài thuộc dưới họ Apostasioideae và Cypripedioideae (lan Hài) đã từng

có những lúc được tách ra khỏi họ Lan và thành lập họ riêng là Apostasisceae

Lindl và Cypripedioideae Lindl Tuy nhiên, hầu hết các tác giả vẫn xếp chúng vào trong họ Lan Orchidaceae như một nhóm tự nhiên về mặt phát sinh Họ Lan

Orchidaceae, ước tính có khoảng 25000 loài thuộc khoảng 800 chi, là họ lớn nhất

trong các họ Thực vật có hoa, ngang với họ Cúc (Asteraceae, hay

Compositae)(Averyanov và cs., 2008)

Có đến hơn 99% các loài Lan chỉ có một nhị duy nhất trong hoa và đó là một trong các đặc điểm chính của họ Lan Trong các tài liệu phân loại học gần đây nhất

các loài Lan có một nhị thường được xếp vào ba dưới họ: Vanilloideae,

Orchidoideae và Epidendroideae(Averyanov và cs., 2008) Chúng phân bố khắp

nơi trên thế giới ngoại trừ hai vùng địa cực và vùng hoang mạc khô cằn

Quá trình thích nghi tiến hóa với các hình thức thụ phấn nhờ côn trùng

cách rõ rệt Trong những trường hợp này cũng như trong các hoa đều khác, tất cả các nhị đều có vai trò gần như nhau trong quá trình thụ phấn Điều này không giống như các loài Lan khác(Averyanov và cs., 2008)

Sự thụ phấn của hoa đối xứng hai bên là kết quả của sự tiêu giảm các bao phấn đến mức chỉ còn một hoặc hai bao phấn được giữ chức năng sinh sản Khuynh hướng tiến hóa này dẫn đến sự tiến hóa của lan Hài và các Lan một nhị thuộc các

dưới họ Vanilloideae, Orchidoideae và Epidendroideae

1.2 Phân loại lan Hài

1.2.1 Phân loại học

Lan Hài (Paphiopedium) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ Lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành Hạt kín (Angiospermatophyta) Lan Hài là một nhóm rất đặc biệt trong họ

Lan Chúng dễ dàng được nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa ở giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài, mà trong chuyên môn thường được gọi

là môi hay cánh môi, nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ ngoài đặc sắc

Và do vậy nó trở thành tên chung của nhóm này Chiếc môi đắc sắc và hình dạng khác thường của hoa làm cho lan Hài dễ dàng phân biệt với các loài lan khác

Lan Hài gồm 5 chi:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, chủ

yếu phân bố ở vùng núi và vùng ôn đới của bắc bán cầu

- Chi Mexipedium, Phragmipedium và Selenipedium có khoảng 25 loài,

phân bố ở vùng nhiệt đới châu Mỹ

- Chi Paphiopedium gồm khoảng 75 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á

từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon

Các loài lan Hài ở Việt Nam đều thuộc chi Paphiopedium, tính đa dạng của

lan Hài ở Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào trên thế giới Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp, có tầm quan trọng quốc tế(Averyanov và cs., 2008)

1.2.2 Những nét chính của chi Paphiopedilum

1.2.2.1 Sự phân bố

Khu phân bố của Paphipeodilum kéo dài từ vùng nhiệt đới ở chân núi

Himalaya chạy ngang sang phía đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống đông nam đến hầu khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo Solomon

Paphipeodilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á Sự mở rộng khu phân bố của nó về phía nam và phía đông đến vùng Malaixia và tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly toả tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương, và thường có khu vực phân bố xa nhau

Vùng tập trung nhiều loài của chi Paphiopedilum là ở Nam Trung Quốc

(Vân Nam, Quảng Tây) và Bắc Việt Nam với 18-20 loài đã được phát hiện (Averyanov và cs., 2008)

1.2.2.2 Đặc điểm nhận dạng

Là loài thân cỏ lâu năm, có 4-6 lá thường mọc chùm Lá chất da, dầy, hình thuôn-dải, cỡ 20-50 x 2-5 cm, mặt trên màu lục thẫm mặt dưới màu lục nhạt Cụm hoa có cuống dài đến 0,4 – 0,7 m, thường mang 2 hoa, ít khi chỉ 1 hoặc ngược lại đến 4-5 hoa Lá bắc hình trứng rộng, cỡ 1,2 - 3 cm Hoa rộng 8-10 cm, hơi có lông

ở mặt ngoài Lá đài ở gần trục hoa màu trắng chuyển thành màu lục ở gốc, hình bầu dục cỡ 3,8 –4,3 x 2,2 -2,5 cm lá đài kia màu lục nhạt với mạng gân màu lục thẫm hơn, hình trứng rộng cỡ 3,5 – 3,8 x2,3-2,6 cm; cánh hoa hình dải xoan, màu trắng hay vàng lục nhạt, cỡ 8-10 x 1 – 1,1 cm môi màu vàng nâu- nhạt, hình túi sâu, cỡ 4

- 4,5 x 2-2,5 cm với hai thùy bên hình tam giác; nhị lép màu trắng với mạng gân màu lục thẫm ở giữa, hình trứng ngược, cỡ 0,9 -1,1 x 0,6 – 0,75 cm, bầu dài 2,5 – 3,5 cm, nhẵn (Averyanov và cs., 2008)

1.2.2.3 Đặc điểm hình thái

Các loài Lan Hài có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng Một số đại diện

ở vùng ôn đới của chi Cyripedium là các loài thân cỏ lùn nhỏ, các loài

Selenipedium, loài Cyripedium irapeanum và C.subtropicum là các loài có thân

+ Rễ: Thường cộng sinh với một loài nấm Rễ đầu tiên có ít xylem nhưng có rất nhiều floem được bao phủ bởi các rễ giả và đã nhiễm nấm ngay từ khi mới hình thành Tuy nhiên các rễ càng xuất hiện muộn càng ít nhiễm nấm, và đến tháng thứ năm thì rễ trở thành đặc trưng dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các bụi nấm (Averyanov và cs., 2008)

+ Dạng cây: Các loài Paphiopedilum là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân bị thu rất ngắn Tuy nhiên, một số loài như P.malipoenes và

P.micranthum lại hình thành thân rễ kéo dài liên kết với rất nhiều gốc với nhau hình thành một mạng lưới ngầm dưới đất Đối với những loài này một dòng sinh sản vô tính cũng có thể bao phủ tới một vài mét vuông nếu như có điều kiện sống thuận lợi

Đối với các loài khác, ví dụ như P.hirsetissmum hay P.dianthum, một cây có thể từ

một đến hai mươi gốc mọc chụm thành bó dày đặc (Averyanov và cs., 2008)

+ Lá: Lá của các loài Paphiopedilum thường có dạng lá dài gấp đôi, hình

trứng ngược hay hình bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có một đốt ở gốc, dưới đó

là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân Ở một số loài như P.dianthum hay P.hirsutissimum các lá có thể dài tới 50cm, nhưng ở một số loài khác như

P.helennae, cây trưởng thành đôi khi có lá không dài quá 3cm Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây cùng màu, hay khảm bởi các mảng xanh lá cây đậm nhạt không đều nhau với các gân lá màu xanh lá cây thẫm nổi rõ Các vân kiểu khảm

màu của lá này rất đặc trưng cho các đại diện thuộc các dưới chi Parviselum và

Brachypetalum và tông Barbata của dưới chi chuẩn Mặt dưới của hầu hết các loài thuộc các dưới chi Parviselum và Brachypetalum có các đốm tím dày đặc Ở một số

loài khác các vết tím chỉ thấy rõ ở gần gốc lá Rất ít loài có mặt dưới lá thuần màu xanh lá cây Chất màu tím ở lá cây cũng có rất ít ở các cây cớm nắng Rõ ràng là đặc điểm và mật độ của vết khảm màu trên lá rất khác nhau ở mỗi loài Mép lá non

ở một số loài, ví dụ P.malipoense có lông Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô hạn như P.helenae và P.dianthum đều dày mọng nước và cứng

(Averyanov và cs., 2008)

+ Cụm hoa: Cụm hoa của các loài Paphiopedilum thường thẳng đứng hay cong Một số loài như P.dianthum có cụm hoa gồm nhiều hoa, thường có từ hai đến

năm hoa Một số loài khác thường có một hoa trong cụm hoa, ví dụ như P.delenati

và P.conolor, nhưng lại phát triển thành cụm hoa với hai hoa trong điều kiện thuận

lợi Phần lớn các loài còn lại thường có một hoa Lá hoa của cụm hoa gập đôi và có hình dạng khác nhau tuỳ từng loài, từ hình mũi giáo hay hình trứng và có hình chóp nhọn đến hình bầu dục tròn Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng dọc gân giữa ở mặt ngoài của lá

+ Hoa: Hoa của các loài Paphiopedilum có hai lá đài ở vòng ngoài, một lá đài lưng (Dorsalsepal) và một lá đài hợp (Synsepal) và ba cánh hoa ở vòng trong

Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trời và thường nổi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong Đôi khi nó ôm lấy phía trên môi hình thành túi tạo thành nắp trên che cho môi khỏi bị nước mưa chảy vào Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nổi bật hơn so với lá đài lưng Cả lá đài lưng và

lá đài hợp đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang, chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng hay tròn tuỳ

từng loài Ví dụ P.dianthum cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp, hay một số

loài mép trên của cánh hoa uốn gợn sóng rõ rệt Cánh hoa của tất các loài đều có lông mềm dài dễ nhận thấy ở mép

Cánh hoa giữa thứ ba của hoa ở các loài Paphiopedilum biến dạng rõ rệt để

hình thành một môi giống như cái bao hay hình chiếc hài có vai trò như một cái bẫy đối với các loài côn trùng có khả năng thụ phấn

Môi ở dạng túi sâu và phồng lên, hình giầy (hài) hoặc hình vại với những thuỳ bên ít nhiều cuộn vào bên trong, có lông ở mặt bên ngoài

Cột nhị- nhụy ngắn, có cuống; bao phấn 2, 2 ô, đính trên chỉ nhị ngắn khối phấn dạng bột dính; nhị lép ở đỉnh cột, không cuống hoặc có cuống ngắn, hình thận nằm ngang, thuôn tới hình dải, phẳng, lồi hoặc gập đôi, nhẵn hoặc có lông nhú thường là lông mịn ở mép; núm nhụy có cuống, gần như 3 thuỳ, có lông nhú

+ Quả : Quả của Lan Hài là dạng quả nang khổ, dài, có một ô ba van rộng và

ba van hẹp Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rảnh nứt Quả thường chín trong điều kiện tự nhiên khi thụ phấn khi thụ phấn được từ sáu đến tám tháng

+ Hạt: Hạt của các loài Paphiopedilum có hình dạng rất khác nhau, từ bầu

dục hay hình con suốt chỉ ngắn đến dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dài 0,4-1,1mm Phôi nhỏ, dài 0.3-0.4mm, được bao bởi vỏ hạt chất Hạt chín rất nhẹ và

dễ dàng phát tán nhờ gió Hạt của Lan không có nội nhũ (Averyanov và cs., 2008)

1.2.2.3 Yêu cầu điều kiện sinh thái

+ Nhiệt độ: Có hai nhóm, nhóm có lá đốm phát triển ở điều kiện khí hậu ấm thì phát triển tốt ở nhiệt độ trung bình 24-27oC vào ban ngày, khoảng 16oC vào ban đêm; còn đối với nhóm có lá xanh phát triển khí hậu lạnh nhiệt độ trung bình 22oC vào ban ngày, khoảng 12oC vào ban đêm

+ Ánh sáng: Hầu hết các loại lan Paphiopedilum đều cần ánh sáng yếu, thích

hợp nơi có bóng râm Trong điều kiện tự nhiên thường sống dưới tán cây rừng, hốc đá… Còn trong nuôi trồng thì thích hợp ở trong nhà hay bên cửa sổ Vì vậy không nên để chậu Lan trực tiếp dưới ánh nắng, lá nhanh chóng sẽ bị cháy nếu ánh sáng quá nhiều

+ Nước: Lan Paphiopedilum cần bổ sung lượng nước tưới cho cây đều đặn,

cần duy trì ẩm độ khoảng 60-70% Tưới 1-2 lần trong một tuần là đủ Nên tưới vào buổi sáng sớm Nước mưa rất tốt cho cây phát triển Tuỳ vào điều kiện nhiệt độ và ánh sáng của từng mùa mà lượng nước tưới vào mỗi mùa có khác nhau Vào mùa khô, cần tưới thêm để gia tăng độ ẩm cho cây Nếu trồng ở trong nhà thì nên đặt cây trên khay nước chứa đá sỏi để cây không bao giờ bị úng nước Nếu trong nhà kính, chỉ cần tưới trên sàn nhà hoặc sử dụng hệ thống bốc hơi nước để gia tăng độ ẩm

+ Không khí và đất: Lan Paphiopedilum yêu cầu bảo đảm thoáng khí tốt,

nhất là vào mùa đông, để tránh nhiễm nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây Vào mùa đông đất cần giữ độ ẩm thấp để tránh rễ bị thối; và tăng độ ẩm vào mùa nóng để rễ

không bị cháy Đa số giống Lan Paphiopedilum yêu cầu đất nhiều mùn, PH = 6,5- 7

(Averyanov và cs., 2008)

+ Dinh dưỡng: Ở giai đoạn cây sinh trưởng, ta cần phân bón cho Lan có hàm lượng Nitơ cao, tốt nhất bón theo tỉ lệ N: P: K = 30: 10:10 Ngay khi cây đã trưởng thành ta có thể bón theo tỉ lệ N: P: K = 10: 20: 10 để kích thích trổ hoa Chỉ nên tưới phân cho Lan từ 2-3 lần trong một tháng vào mùa hè và 1-2 lần trong tháng vào mùa đông

+ Thay chậu hoa lan: Việc thay chậu hoa lan là một việc làm cần thiết vì hoa lan được trồng trong chậu một thời gian thường có rễ bị thối, giá thể bị mục, rêu bám đầy chậu là môi trườmg thích hợp cho các loài sâu bệnh hoạt động Chậu không còn đủ đáp ứng nhu cầu về sinh trưởng và phát triển của cây vì thế việc thay chậu phải được tiến hành định kỳ

Thường thì nên thay theo chu kỳ 2 năm một lần, như vậy sẽ tạo điều kiện tốt nhất cho cây lan phát triển

1.3 Thực trạng cây lan Hài trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Sự phân bố của Lan Hài trên thế giới

Khu phân bố của Paphiopedilum kéo dài từ vùng nhiệt đới ở chân núi Himalaya

chạy ngang sang phía đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống đông nam đến hầu khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai, New Guines và quần đảo Solomon Chỉ

một loài P.druryi có khu phân bố rất nhỏ và biệt lập ở nam Ấn Độ

Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á Sự mở rộng khu phân bố của nó về phía nam và phía đông đến vùng Malaixia và tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương và thường có khu phân bố xa nhau

Các loài nguyên thủy nhất của chi này thuộc dưới chi Parvisepalum được tìm

thấy ở vùng lục địa Đông Nam Á, chủ yếu ở nam Trung Quốc và bắc Việt Nam (chỉ

có một loài ở nam Việt Nam) Mỗi loài đều có khu phân bố hạn chế, và do vậy dưới chi này có khu phân bố rất tập trung Và đây có thể là vùng nguồn gốc có khả năng

của chi Paphiopedilum

Dưới chi Brachypetalum có khu phân bố hạn chế ở nam Trung Quốc, đông

phân bố rộng nhất, gần như trùng với khu phân bố của toàn bộ dưới chi

Brachypetalum

Hầu hết các loài Paphiopedilum đều thuộc vào một trong các tổ của dưới chi Paphiopedilum có khu phân bố gần như trùng với khu phân bố của

chi nói chung

Các loài thuộc tổ chuẩn (tổ Paphiopedilum) có khu phân bố ở vùng lục địa châu

Á từ Ấn Độ đến nam Trung Quốc, Thái Lan và Đông Dương với một số lượng loài tập

trung cao nhất ở tây nam và nam Trung Quốc PaphiopedilumHirsutissimun và

P.villosum là các loài có khu phân bố rộng nhất, có mặt ở hầu hết mọi nơi trong khu phân bố của tổ Hầu hết các loài còn lại trong tổ này ít nhiều là các loài đặc hữu hẹp

Khu phân bố của tổ Barbata rất rộng, gần như trùng với khu phân bố của chi Các loài Paphiopedilumappletonianum, P.callosum, P.bullenianum,và P.javanicum

có khu phân bố rộng nhất của tổ này Hai loài đầu phân bố rộng khắp vùng lục địa châu Á, còn lại hai loài sau rất phổ biến ở các đảo của vùng tây Mã Lai Nơi có nhiều loài đặc hữu nhất của tổ này đã được xác định là Sumatra, Borneo, và Philippin

Tổ Pardalopetalum có hai loài ở vùng lục địa Đông Nam Á, cột loài đặc hữu

của Philippin còn loài kia phân bố rộng khắp vùng tây Mã Lai và các đảo Sunda lớn của quần đảo Mã Lai

Năm loài lan Hài có quan hệ họ hàng rất gần gũi thuộc tổ Cochlopetalum có khu

phân bố giới hạn ở các đảo Sumatra và Java Ngoài ra, các loài có liên quan thuộc tổ

Coryopetalum phân bố tại Borneo nhưng còn mở rộng tới Philippin, Sulawesi và New

Guinea Chúng đều là các loài đặc hữu hẹp trừP.philippinense phân bố rộng hơn tại

Philippin và phân bắc của Borneo

Vùng tập trung nhiều loài nhất của chi Paphiopedilum là ở nam Trung Quốc

(Vân Nam, Quảng Tây) và bắc Việt Nam với 18-20 loài đã được phát hiện Các trung tâm đa dạng khác nhau ở bắc Sumatra và bắc Borneo, mỗi nơi có 9 loài Tuy không phong phú bằng các vùng kể trên, nhưng các vùng đa dạng của chi lan Hài cũng được phát hiện tại các vùng chân núi Himalaya, bắc Mianma và Thái Lan, trung tâm của bán đảo Mã Lai và Philippin Trong mỗi vùng này đầu gặp từ 4 đến 6 loài lan Hài

Tính đặc hữu hẹp là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi Paphiopedilum

Có đến 72% số các loài đã biết là đặc hữu hẹp với khu phân bố rất hạn chế như

Paphiopedilumdelenatii, P.helenae, P.henryanum, P.tranlienianum, P.vietnamense

và P.hangianum Rất nhiều loài trong số này mới được phát hiện tại một hoặc một vài địa điểm Chưa đến 12% tổng số các loài của chi Paphiopedilum có khu phân bố tương đối rộng Đó là Paphiopedilumvillosum, P.hirsutissimun, P.appletonianum và

P.callosum (Nguyễn Thiện Tịch, 2001; Averyanov và cs., 2008)

1.3.2 Sự phân bố lan Hài ở Việt Nam

Tại các vùng ở Việt Nam nơi có lan Hài phân bố lượng mưa lớn kéo theo độ

ẩm cao Tuy nhiên, mưa thường thay đổi theo mùa và như vậy, thực vật ở các vùng này thường phải trải qua một giai đoạn khô hạn Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót qua đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ phục hồi nhanh chóng khi mùa mưa trở lại

Các sườn bắc, đông bắc và tây bắc của núi là nơi sống ưa thích của các loài lan Hài Tuy nhiên, trong rừng nguyên sinh chúng phân bố đều nhau trên các hướng sườn Nhưng dù sao thì lan Hài thường có điều kiện tốt nhất và hoa nở tốt hơn ở sườn nam ấm và nhiều ánh sáng hơn Thường thì lan Hài ngày nay mọc thành những đám nhỏ

Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn phù hợp và cường độ sáng là các nhân tố quan trọng trong việc hình thành

và diễn thế của các quần thể Paphiopedilum Các nơi sống tự nhiên bị phá hủy bởi

con người, sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán đang là nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của các loài lan Hài ở khắp cả nước(Averyanov và cs., 2008)

1.3.3 Thực trạng của Lan Hài ở Việt Nam

Với số lượng trên 20 loài bản địa, các loài lan Hài Việt Nam gặp ở cả 2 miền Nam Bắc Thời điểm nở hoa của các loài này lại vào các tháng khác nhau, rải rác trong năm

Các giống lan Hài Việt Nam và mùa nở hoa

Loại Hài

(tên Latinh)

Mùa nở hoa

Loại Hài (tên Latinh) Mùa nở hoa Paphiopedilum

appletonianum Xuân Bargigerum Thu

Callosum Hạ Concolor Cuối Xuân, đầu Hạ Delenatii Xuân Dianthum Cuối thu

Emersonii Xuân Gratrixianum Xuân

Hangianum Cuối thu Helenae Thu

hirsutissimum Xuân Malipoense Xuân

Micranthum Xuân Purpuratum Thu

tranlienianum Thu Vietnamense Đông

Hemannnii Thu

(Nguồn: www.vuonhoalan.net)

Lan Hài của Việt Nam được thế giới biết đến vào đầu thế kỷ 20 Pháp, khi

một sĩ quan Pháp thu mẫu loài lan Hài hồng (Paphiopedilum delenatii) đưa sang

châu Âu, vào khoảng năm 1913-1914 Đây là loài lan có hoa màu hồng phớt trắng hay hay hồng tía, màu sắc được ưa chuộng đối với các loài lan Hài

Cuối những năm 1990, Việt Nam trở thành điểm hấp dẫn các nhà nghiên cứu nhờ một loạt phát hiện mới và lạ về lan Hài được công bố Đầu tiên là Hài hê len

(P.helenae), loài lan Hài nhỏ hoa vàng có ở Cao Bằng Tiếp đến là một loạt những

loài lan Hài khác cũng từ khu vực núi đá vôi Đông Bắc như Hài hằng

(P.hangianum) cho hoa trắng, Hài hương lan (P.emersonii) hoa trắng vàng, Hài trần liên (P.tranlienianum) hoa nâu

Trong cuốn sách tổng quan về lan Hài Việt Nam (2004), đã xác nhận và giới thiệu 18 loài lan Hài và 4 loài lai tự nhiên có ở Việt Nam Đến năm 2007, Sách Đỏ

Việt Nam với phiên bản mới cũng đã đưa vào 12 loài lan Hài bản địa có giá trị khoa học cao cần được bảo vệ

Trong một nghiên cứu của mình năm 2003, Averyanov L., đã cảnh báo tiếp theo sự tuyệt chủng của lan HàiViệt sẽ là một loạt các loài lan Hài khác hiện đang

bị đe dọa nghiêm trọng; trong đó sẽ có Hài vân (P.callosum), Hài hồng (P.delenatii), Hài tía (P.purpuratum), và cả loài Hài hương lan (P.emersonii) của

Tuyên Quang mà phân bố của loài phần lớn nay đã bị chia cắt và ngập trong làn

nước của hồ thủy điện Na Hang (Nguồn: www.vuonhoalan.net)

Tất cả các loài lan Hài của Việt Nam đều nằm trong Danh mục các loài động vật, thực vật hoang dã quy định trong Phụ lục của Công ước về buôn bán quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) Điều này có nghĩa là việc xuất khẩu các loài lan Hài phải được thông qua Cơ quan quản lý CITES Việt Nam

Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)

Đã bị tuyệt chủng P malipoense var hiepii

Đã tuyệt chủng ngoài thiên

P.aspersum, P.barbigerum var.Lokianum,

P callosum, P.dianthum, P emersonii,

P gratrixianum, P hangiannum, P helenae,

P hanryanum, P herrmannii, P malipoense var.Jackii, P malipoense var.malipoense,

P micranthum, P purpuratum, P tralienianum

Sắp tuyệt chủng P appletoniaum, P concolor, P hirsutissimum var

Chiwuawnum, P hirsutissimum var Esquirolai, P villosun var Annamense

Thiếu dẫn liệu P affine, P datalanse, P villosum var boxalli

(nguồn: www.thiennhien.net)

Lan Hài kim P.armeniacum Lan Hài vân P.callosum

Lan Hài helen P.helenae Lan Hài henry P.henryanum

Lan Hài râu Paphiopedilum dianthum Hình 1.1: Một số loài lan Hài ở Việt nam

(Nguồn: www.thiennhien.net)

1.3.3 Một số nét chính về cây lan Hài P.dianthum

1.3.3.1 Lịch sử phát hiện

Mẫu Paphiopedilum dianthum được W Hancock thu sớm nhất ở Mengtsz

(Mengtze), Vân Nam vào tháng 11 năm 1894 ở độ cao 1800-2100 m, hiện nay được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật Kew

Paphiopedilum dianthum được các nhà thực vật học Trung Quốc T.Tang và F.T.Wang mô tả lần đầu tiên năm 1940 dựa trên mẫu chuẩn được C.W.Wang thu ở Mông Cổ (Mengtze) tỉnh Vân Nam và mẫu thứ 2 ở Tsingsi Hsien (Chinghsi) tỉnh Quảng Tây

Paphiopedilum dianthum, trước đây vẫn được coi là loài đặc hữu của Trung Quốc, đã được phát hiện ở các khu vực đá vôi bắc Việt Nam vào thời gian gần đây thông qua các đợt điều tra thực vật của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia (Averyanov & Averyanova, 2003; Averyanov, 2005)

Trong nhiều năm, rất nhiều cây Paphiopedilum dianthum đã được trồng rất

nhiều trong các vườn Lan ở thị trấn Sapa Một số lớn các cây trong số đó chắc chắn được thu từ khu vực núi đá vôi của dãy Hoàng Liên Sơn ở các tỉnh Lai Châu và Lào

Cai Tuy nhiên, nguồn gốc chính xác của P.dianthum ở khu vực này còn bị giữ kín Trước đây, P.dianthum được cho là một thứ của P.parishii Nhưng hiện nay

nó được công nhận rộng rãi là một loài riêng biệt (Cribb et al., 2000)

Tại Việt Nam, P.dianthum mọc trong rừng nguyên sinh cây lá kim, hỗn

giao và cây lá rộng, thường xanh, rêu ẩm trên núi đá vôi kết tinh bị bào mòn mạnh Hiện nay nó thường được tìm thấy ở độ cao 1000-1450 m, nơi có thể sống tốt hơn Tuy nhiên, nó có thể gặp ở độ cao 600-700m Trước đây, loài lan Hài này có phạm vi phân bố rộng ở các độ cao thấp, nhưng bị tuyệt chủng ở nhiều nơi do con người làm suy giảm thảm rừng nguyên sinh trên núi đá vôi

Trong các khu rừng nguyên sinh núi, P.dianthumhiện vẫn là loài cây phổ

biến ở nhiều điểm ở Việt Nam Ở những nơi chưa bị tàn phá, nó có thể tạo thành

P.dianthumhiện đang biến mất với tốc độ rất nhanh sau khi rừng nguyên sinh bị tàn phá Đôi khi, còn sót lại một vài cây ở các hẻm núi râm mát và trên các hố của sườn bắc Tuy nhiên, chúng thường biến mất ngay sau đó bởi sự suy thoái của nơi sống vẫn tiếp tục diễn ra Rất ít địa điểm mà con người tới được hiện nay còn các đám

lớn P.dianthum Việc thu mẫu nhằm mục đích thương mại cũng là một nhân tố làm

kiệt quệ loài này ở ngoài thiên nhiên trên toàn quốc, bao gồm ở các khu bảo tồn thiên nhiên Tất cả những điều trên dẫn đến việc loài lan Hài đẹp này bị tuyệt chủng nhanh chóng ở ngoài thiên nhiên (Nguyễn Thiện Tịch, 2001; Averyanov và cs., 2008)

1.3.3.2 Đặc điểm nhận dạng

Là loài thân cỏ lâu năm, có 4-6 lá thường mọc chùm Lá chất da, dầy, hình dải, cỡ 20-50 x 2-5 cm, mặt trên màu lục thẫm mặt dưới màu lục nhạt Cụm hoa có cuống dài đến 0,4 – 0,7 m, thường mang 2 hoa, ít khi chỉ 1 hoặc ngược lại đến 4-5 hoa

thuôn-Lá bắc hình trứng rộng, cỡ 1,2 - 3 cm Hoa rộng 8-10 cm, hơi có lông ở mặt ngoài thuôn-Lá đài ở gần trục hoa màu trắng chuyển thành màu lục ở gốc, hình bầu dục cỡ 3,8 –4,3 x 2,2 -2,5 cm lá đài kia màu lục nhạt với mạng gân màu lục thẫm hơn, hình trứng rộng cỡ 3,5 – 3,8 x2,3-2,6 cm; cánh hoa hình dải xoan, màu trắng hay vàng lục nhạt, cỡ 8-10 x 1 – 1,1 cm môi màu vàng nâu- nhạt, hình túi sâu, cỡ 4 - 4,5 x 2-2,5 cm với hai thùy bên hình tam giác; nhị lép màu trắng với mạng gân màu lục thẫm ở giữa, hình trứng ngược, cỡ 0,9 -1,1 x 0,6 – 0,75 cm, bầu dài 2,5 – 3,5 cm, nhẵn (Averyanov và cs., 2008)

1.3.3.3 Phân bố

Trên thế giới, lan Hài P.dianthumphân bố ở Nam Trung Quốc gồm các vùng:

đông nam Vân Nam, tây nam Quý Châu và tây Quảng Tây

Ở Việt Nam, P.dianthum được tìm thấy ở các vùng: Lào Cai (gần thị trấn

Sapa), Sơn La (Mộc Châu), Hà Giang (Quản Bạ: Bát Đại Sơn; Yên Minh: Lao và Chải), Cao Bằng (Nguyên Bình: Yên Lạc), Hòa Bình (Mai Châu: Pà Cò và Hang Kia) (Averyanov và cs., 2008)

1.3.3.4 Sinh học và sinh thái

Mùa nở hoa vào tháng 9 - 11 Cây tái sinh bằng hạt lan Hài P.dianthumthường

mọc dưới tán các khu rừng nguyên sinh hay rừng rậm nhiệt đới, rừng cây lá kim hay hỗn giao với cây lá rộng trên núi đá vôi, ở độ cao 900-1400m, mọc thành nhóm nhỏ ở

các vách dốc đứng gần đỉnh; đôi khi mọc bám trên cây khác

1.3.3.5 Tình trạng

Loài vốn có khu phân bố không hẹp nhưng nơi cư trú bị phân cắt rải rác với

số lượng cá thể ít Cũng như các loài lan Hài khác của Việt Nam, P.dianthumhiện đang

biến mất với tốc độ rất nhanh sau khi rừng nguyên sinh bị tàn phá Việc thu mẫu nhằm mục đích thương mại cũng là một nhân tố làm kiệt quệ loài này ở ngoài thiên nhiên trên toàn quốc (Averyanov và cs., 2008)

2.3.3.6 Biện pháp bảo vệ

Lan Hài P.dianthum đã được liệt kê vào phụ lục 1 của công ước CITES và

danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ-CP ngày 30/3/2006 để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Bảo vệ phần quần thể nhỏ nhoi còn sót lại ở các khu bảo tồn thiên nhiên Pà Cò- Hang Kia, Phong Quang và Bát Đại Sơn Cần nhân rộng việc gieo

ươm loài lan HàiP.dianthum để vừa tạo nguồn cây làm cảnh, đồng thời bảo vệ

nguồn gen

A, Các bộ phận của cây; B, Hoa lan Hài P.dianthum; C, Cây sinh trưởng ngoài tự

nhiên; D, Phân bố địa lý

1.4 Những nghiên cứu về nhân giống cây lan Hài

1.4.1 Những nghiên cứu về nhân giống cây lan Hài trên thế giới

Vì hạt lan Hài quá nhỏ, không chứa dữ liệu và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một phương cách bình thường được Tỷ lệnảy mầm trong

tự nhiên lại rất thấp do đó các loài lan Hài rất hiếm dạng dại (Arditti and Enst, 1993)

Sự cộng sinh của hạt lan chín trong tự nhiên thường rất khó khăn (Lee et al., 2006), với

tần số từ 35 đến 68% trong 12 loài lan Hài đã được nghiên cứu (Lee, 1998; Tay et al.,

1988; Chen et al., 2004b) Hai loài lan HàiP.villosum (Lindl ex Hook) Stein và

P.Barbigerum có tỷ lệ hình thành quả rất thấp tương ứng là 8 và 26% (Benziger, 1996; Shi et al., 2008).Vì vậy việc tạo cho hạt nảy nầm và phát triển thành cây lan trưởng

thành là vấn đề khó khăn trong giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển ngành Lan

Năm 1884, Neumann, người làm vườn Pháp, đã làm nẩy mầm một số hạt lan bằng cách rải đại chúng trên các cục đất ở quanh các gốc lan lớn Dminy là người đầu tiên đã tạo được các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan ấy trước năm 1853 Nhiều lúc ông chỉ tạo được vài cây, mọi trường hợp khác đều bị thất bại

Vào năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật học người Pháp, đã khám phá ra

rằng trong từng vùng Fontainebleau ở nước Pháp, hạt của lanNeottia nidus-avis nảy

mầm tự nhiên đều nhiễm nấm Người ta đã khám phá ra ba loại nấm giúp nảy mầm

ở hạt Lan: Rhizoctonia repens, R.mucorides, R.lanugiosa Mỗi loài chỉ giúp nẩy mầm

một giống lan nhất định

Khoảng 1922, Knudsonở Mỹ, lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt Knudson nhận thấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt lan là rất ít hay không có Nhưng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan xảy ra rất sớm Tiến hành thí nghiệm ông thấy rằng chỉ cần thêm 2% đường vào môi trường gieo hạt chỉ cần thạch và muối khoáng Như vậy vai trò chính yếu của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp chất dinh dưỡng Từ đó, phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm

đã hình thành

Việc nhân giống các loài lan Hài chủ yếu đạt được bằng cách tạo ra sự công sinh của hạt để thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt trong nuôi cấy mô (Stewart and Button, 1975; Chen et al., 2004; Huang et al., 2001)

Kết quả nghiên cứu của Long và cộng sự (2010) về ảnh hưởng của sự chín của hạt giống, môi trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu cơ đến sự

nảy mầm, phát triển protocorm, và sinh trưởng của 4 loài lan HàiP.var

densissimum, P.insigne, P.bellatulum , và P.Armeniacum đã cho thấy khi sử dụng

ra bởi Ding & cộng sự (2004)

Kết quả nghiên cứu của Long và cs (2010), Ren và Wang (1987), Lee (1998, 2007), Ding và cs (2004) cho thấy ảnh hưởng của sự trưởng thành hạt giống đến sự nảy mầm phụ thuộc vào loài

Các kết quả nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy đến sự nảy mầm của hạt lan Hài của Long và cs (2010) đã cho thấy có mối quan hệ giữalượng muối khoáng tương đối thấp và nồng độ N vô cơ trong môi trường KnudsonC (KC) và

Vacin and Went (VW) đã kích thích sự nảy mầm của P villosumvar densissimum

(nồng độ muối khoáng sản: KC, 13,42 mM, WV, 16,3 mM; nồng độ N vô cơ: KC, 12,25 mM, VW, 3,78 mM;) Sự nảy mầm đạt cao nhất trên môi trường KC Hiệu quả kích thích sự nảy mầm của hạt lan trên môi trường KC có thể liên quan đến một thực

tế là trong môi trường KC có một lượng canxi tương đối cao nồng độ (4,23 mM) so với VW (1,94 mM), và 1/4MS, ½MS (0.75 và 1.5 mM) Phản ứng này là tương tự

như quan sát khác trên cây lan Bletia purpurea (Lam.) DC (Dutra et al., 2008)

Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau đến sự nảy mầm

của hạt lan Hài loàiP.villosum var densissimum, Long và cs(2010) đã nhận thấy sự

nảy mầm của hạt đạt cao nhất trên môi trường có bổ xung glucose và cao gấp 2 lần

so với môi trường có saccarose, kết quả này cũng phù hợp nghiên cứu của Cao và Jia (2003), Xie (2003), Abdoulaye và Mark (2006) Maltose đã được báo cáo như là

một nguồn đường hiệu quả cho sự tăng trưởng của cây lan vũ nữ Oncidium, Gower

Ramsey Tuy nhiên maltose là ít hiệu quả trong việc thúc đẩy sự nảy mầm của hạt lan Hài (Huang et al., 2001; Shen and Xu, 1997; Oldach et al., 2001; Cao and Jia, 2003; Abdoulaye and Mark, 2006; Long et al., 2010)

Theo Huang et al (2001) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA Trong khi đó TDZ ức chế sự dài ra của chồi cũng như rễ Kết quả của Martin (2003), Chen et al (2004), Thomas và Michael (2007), Hong et al (2008) cho thấy rằng, trong nhiều trường hợp, lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại hoa lan khác Nồng độ chất điều tiết sinh trưởng ngoại sinh (PGRs) cần thiết cho vi nhân giống của lan Hài phụ thuộc vào loài Nồng độ BA tương đối cao làm tăng số lượng chồi của

P.villosumvar densissimum và P.armeniacum nhưng lại giảm ở P.insigne

1.4.2 Những nghiên cứu về nhân giống cây Lan Hài ở Việt Nam

Về nhân giống lan Hài ở Việt Nam còn rất hạn chế, chỉ có một vài tác giả thành công trên đối tượng lan Hài Chẳng hạn như:

Tại Phân Viện Sinh Học Đà Lạt, lan Hài Đỏ (Hồng Hài) – Một giống lan quý hiếm được nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà Lạt đã áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan Hài đỏ Các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung 2,0mg/l BA, còn trên môi trường có bổ sung 1,5mg Zeatin hoặc 1,5mg/l TDZ thì cho chất lượng chồi tốt nhất.Khi dùng phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh, mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho lan Hài nở hoa Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng lan Hài Đỏ cũng có thể sản xuất vô tính

Năm 2006, tác giả Đặng Xuyến Như và cộng sự đã thành công trong việc tạo

ra các cây con của hai loài lan Hài Hài Hằng (P.hangianum) và Hài Tam Đảo

(P.gratrixianum ) bằng cách gieo hạt của các loài lan này trong nuôi cấy in vitro

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitrogiống lan Hài Hằng (Paphiopedilum hangganumperner gurss) từ nguồn nguyên liệu ban

đầu là hạt lấy từ quả 6 – 10 tháng tuổi Môi trường nuôi cấy là RE cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao nhất (58 – 67%) Môi trường nhân nhanh là môi trường RE có bổ sung

150 ml/l nước dừa và 100 g/l chuối cho hệ số nhân cao nhất đạt 4,3 lần và cùng trên nền môi trường RE có bổ sung 0,4-0,6mg/l α-NAA cho khả năng ra rễ tốt nhất Thành công nói trên mở ra triển vọng nhân giống, tiến tới ươm cây con của lan Hài Hằng và Hài Tam Đảo tại các khu bảo tồn rồi đưa chúng trở lại tự nhiên

Tóm lại, qua quá trình nghiên cứu và thu thập tài liệu chúng tôi nhận thấy

rằng việc nhân giống lan Hài nói chung và loài P.dianthum nói riêng còn nhiều hạn

chế (nguồn nguyên liệu ít, quý hiếm; khả năng nảy mầm của hạt trên các nền môi trường rất khác nhau tùy thuộc vào từng loài, hệ số nhân thấp…) Do đó chúng tôi

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu:

2.1.1 Thời gian tiến hành

Tháng 6/2013 – Tháng 8/2014

2.1.2 Địa điểm:

Viện Sinh học nông nghiệp-Học viện nông nghiệp Hà Nội

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu

- Quả loài lan Hài P.dianthum (Hài xoắn) ở các độ tuổi khác nhau được sử

dụng để làm nguồn vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm

Các quả lan sau khi thu thập về được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng (cồn 700, dung dịch Johnson 1%, nước cất) Sau đó quả lan được bổ dọc, thu lấy hạt lan và đem gieo trên môi trường nuôi cấy

- Nguồn callus được tạo ra sau khi gieo hạt lan Hài P.dianthum

- Các thể protocorm và các chồi thu được sau quá trình phát sinh hình thái

của callus và nhân giống lan Hài P.dianthum

- Các nền môi trường cơ bản : MS, VW, RE

- Dịch chiết hữu cơ :

+ Dịch chiết chuối: Chuối chín được bóc vỏ, xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố + Dịch chiết khoai tây: Khoai tây được rửa sạch, gọt vỏ Sau đó đem luộc chín và được xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố

- Các chất điều tiết sinh trưởng

2.1.4 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài chỉ tập trung vào loài Lan Hài Paphiopedilum dianthum

2.2 Nội dung nghiên cứu:

2.2.1 Nội dung

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu:

+ Xác định tuổi quả thích hợp để làm vật liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống in vitro + Xác định nền môi trường thích hợp cho quá trình nhân giống in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D, TDZ đến khả năng phát sinh hình thái của hạt sau nảy mầm

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng (ĐTST) BA, Kinetin, TDZ đến sự phát sinh hình thái callus

- Các thí nghiệm nhân nhanh:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng các chất ĐTST BA, α-NAA, TDZ đến

khả năng nhân chồi và PLB của loài lan HàiP.dianthum

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung các loại dịch chiết hữu cơ(dịch chiết chuối, khoai tây) đến khả năng nhân nhanh chồi, thể Protocorm

- Các thí nghiệm tạo cây hoàn chỉnh:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nền môi trường khác nhau đến khả năng sinh

trưởng chồi của loài lan HàiPaphiopedilum dianthum

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng chất ĐTST α-NAA đến khả năng hình

thành rễ của loài lan HàiPaphiopedilum dianthum

2.3 Các phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức được cấy trên

6 bình, 5 mẫu/ bình và chia làm 3 lần nhắc lại

- Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ1-3 tuần/lần

- Điều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện điều kiện 2500lux, 12h chiếu sáng trong ngày, nhiệt độ 25±2oC, pH= 6-7

2.3.1.1 Nội dung 1: Các thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu

Thí nghiệm 1: Xác định tuổi quả thích hợp đến khả năng nảy mầm của hạt lan HàiP

Quả lan Hài được thu thập về ở các độ tuổi từ 6-10 tháng tuổi tính từ sau khi thụ phấn được đem vào nuôi cấy trên nền môi trường cơ bản là VW

Sau 12 tuần theo dõi hạt lan Hài có tuổi quả thích hợp sẽ được sử dụng làm nguồn vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 2: Xác định nền môi trường thích hợp sự nảy mầm của hạt lan Hài

P.dianthum.

Quả lan Hài 9 tháng tuổi sẽ được dùng làm vật liệu gieo trên các nền môi trường khác nhau (MS, 1/2MS, VW, 1/2VW, RE, 1/2RE)

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4-D tới sự phát sinh hình thái của hạt lan

HàiP.diathum sau nảy mầm (sau 12 tuần)

Môi trường 1/2VW + 10 g/l đường + 0,5 g/l than hoạt tính + 5,3 g/l agar+

100 ml nước dừa môi trường này sẽ được dùng làm môi trường nền (ĐC) cho các

thí nghiệm tiếp theo từ 4- 13

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D kết hợp với BA tới sự phát sinh

hình thái của hạt lan HàiP.diathum sau nảy mầm

2 ĐC+5mg/l 2,4D+0,5 mg/l BA

3 ĐC+5 mg/l 2,4D+1,0mg/l BA

4 ĐC+5mg/l 2,4D +1,5mg/l BA

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA sự phát sinh hình thái callus loài lan

Hài Paphiopedilum dianthum

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ sự phát sinh hình thái callus loài lan

Hài Paphiopedilum dianthum

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ kết hợp với Kinetin tới sự phát sinh

hình thái của callus loài lan HàiP.diathum

2 ĐC + 2,0 mg/l TDZ + 1,0 mg/l K

3 ĐC + 2,0 mg/l TDZ + 2,0 mg/l K

4 ĐC + 2,0 mg/l TDZ + 3,0 mg/l K

2.3.1.2 Nội dung 2: Các thí nghiệm nhân nhanh

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh

chồi, protocorm của loài lan Hài Paphiopedilum dianthum

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng TDZ đến khả năng nhân

nhanh chồi, protocorm của loài lan Hài Paphiopedilum dianthum

Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp BA và α-NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi, protocorm của loài lan Hài P.dianthum

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp TDZ và α-NAA đến khả

năng nhân nhanh chồi, protocorm của loài lan Hài P.dianthum