NGHIÊN cứu NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO kèn

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI TRONG NUÔI CẤY IN VITRO CÁC LOÀI LAN...19 1.6.1.. Thuật ngữ nhân giống in vitro in vitro propagation hay còn gọi là vi nhân giố

HUỲNH PHƯỚC LỄ

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HOÀNG THẢO KÈN

(Dendrobium lituiflorum)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPNGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HOÀNG THẢO KÈN

(Dendrobium lituiflorum)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆPNGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PGS TS TRƯƠNG THỊ BÍCH PHƯỢNG HUỲNH PHƯỚC LỄ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kếtquả nghiên cứu nêu trong đồ án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưatừng được công bố trong bất kỳ công trình khác Những tài liệu tham khảo cónguồn gốc rõ ràng

Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn

Huế, tháng 5 năm 2016

Tác giảHuỳnh Phước Lễ

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày

tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Đào tạođại học, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Bộ môn Sinh học Ứngdụng trường Đại học Khoa học Huế, Viện Công nghệ Sinhhọc – Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôitrong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS TrươngThị Bích Phượng đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và chu đáotrong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Đức Tuấn cùng cácanh chị em ở phòng Sinh lý – Di truyền, bộ môn Sinh họcỨng dụng đã quan tâm giúp đỡ

Tôi cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bêncạnh động viên ủng hộ giúp đỡ tôi trong suốt quá trìnhthực hiện luận văn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 5 năm 2016

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.1.3 Vai trò các chất KTST trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.3.1 Auxin 6

1.1.3.2 Cytokinin 6

1.1.5 Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật 7

1.1.5.1 Sự tạp nhiễm 7

1.1.5.2 Tính bất định về mặt di truyền 8

1.1.5.3 Hiện tượng thủy tinh thể 9

1.2 GIỚI THIỆU VỀ LAN DENDROBIUM 9

1.2.1 Nguồn gốc và phân loại của lan Dendrobium 9

1.2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 9

1.2.1.2 Phân loại 10

1.2.2.1 Rễ 10

1.2.2.2 Thân 11

1.2.2.3 Giả hành 11

1.2.2.4 Lá 12

1.2.2.5 Hoa 12

1.2.2.6 Trái 12

1.2.2.7 Hạt 12

1.2.3 Giá thể trồng lan (compost) 13

1.2.3.1 Than gỗ 13

1.2.3.2 Xơ dừa 13

1.2.3.3 Gạch 13

1.2.3.4 Dớn 14

1.3 GIỚI THIỆU LAN HOÀNG THẢO KÈN 14

1.4 CÁC KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG TRÊN CÂY LAN 15

1.4.1 Kỹ thuật nhân giống hữu tính 15

1.4.2 Phương pháp nhân giống vô tính 15

1.4.2.1 Phương pháp tách chiết cây con 15

1.4.2.2 Phương pháp giâm cây 16

1.4.2.3 Các kỹ thuật nhân giống in vitro 16

1.4.2.3.2 Nhân giống bằng đỉnh chồi 16

1.4.2.3.3 Nhân giống bằng chồi bất định 17

1.5 LỊCH SỬ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY LAN 17

1.6 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG VÀ PHÁT SINH HÌNH THÁI TRONG NUÔI CẤY IN VITRO CÁC LOÀI LAN 19

1.6.1 Trên thế giới 19

1.6.2 Trong nước 20

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Chuẩn bị và khử trùng mẫu 23

2.2.2 Nuôi cấy ban đầu 23

2.2.3 Nhân nhanh protocorm 24

2.2.4 Nhân nhanh chồi 25

2.2.5 Tạo rễ 25

2.2.6 Đưa cây ra vườn ươm 25

2.2.7 Điều kiện thí nghiệm và xử lý số liệu 25

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU KHỞI ĐẦU 27

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng 27

3.2 KHẢ NĂNG NHÂN NHANH PROTOCORM 30

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh protocorm 31

3.2.2 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân nhanh protocorm 33

3.2.3 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh protocorm 36

3.2.4 Ảnh hưởng kết hợp của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh protocorm 38

3.2.5 Ảnh hưởng của saccharose đến khả năng nhân nhanh protocorm 41

3.2.6 Ảnh hưởng của nuôi cấy lắc lên khả năng nhân nhanh protocorm 44

3.3 NHÂN CHỒI IN VITRO 48

3.3.1 Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro 48

3.3.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro 51

3.4 TẠO RỄ 53

3.4.1 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro 54

3.4.2 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro 57

3.5 ĐƯA CÂY RA VƯỜN ƯƠM 59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

BAP : Benzyl amino purine

DNA : Deoxyribonucleic acidKIN : 6-furfurryl-aminopurineIBA : Indole-3-butyric acidIAA : β-indoleacetic acid

MS : Murashige và Skoog (1962)NAA : α-Naphthaleneacetic acidKTST

PLBVW

: Kích thích sinh trưởng: Protocorm like body: Vacin và Went (1949)

BẢNG TÊN BẢNG TRANG

protocorm

39

của cây in vitro

59

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanhprotocorm 32

Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanhprotocorm 37

Hình 3.12 Biểu đồ ảnh hưởng của lượng mẫu tối ưu đến khả năng nhânnhanh protocorm 45

Hình 3.18 Ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau đến khả năng sống sótcủa cây in vitro 60

Hoàng thảo Kèn có tên khoa học là Dendrobium lituiflorum Lindl., là một

trong những loài lan tuyệt đẹp và quý hiếm do loài hoa này rất sai hoa, nở nhiềuhoa to 6 - 7 cm, mọc từng chùm 2 - 3 chiếc trên một mắt ở các đốt giữa thân đếnngọn, phát sinh từ thân cây trụi lá cũ Cây nở hoa từ cuối mùa đông đến mùaxuân, rất thơm, lâu tàn và có giá trị kinh tế rất cao

Hiện nay, ngoài tự nhiên rất khó tìm thấy do loài hoa này bị săn lùng quánhiều vì vẻ đẹp của chúng Ở một số nơi trên thế giới loài hoa này được đưa vàodiện được bảo vệ nghiêm ngặt Nước ta may mắn là một trong những vùng đấtđược tạo hóa ban cho loài Hoàng thảo Kèn Chúng phân bố chủ yếu ở khu vựcLai Châu, Sơn La và nếu không có biện pháp bảo vệ kịp thời có thể lâm vàonguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên

Ngoài ra, việc nhân giống Hoàng thảo Kèn bằng phương pháp truyền thốngcho hiệu quả không cao, chất lượng cây giống không đảm bảo Vì vậy, khôngđáp ứng đủ nhu cầu cho người tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu

Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào quá trình nhân giống cây lan

là vấn đề đang được quan tâm và nghiên cứu Kỹ thuật này không những giải

giống lan Hoàng thảo Kèn mà còn giúp chủ động sản xuất một số lượng lớn câygiống có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh.

Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có công trình nào tiến hành

nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Hoàng thảo Kèn Các nghiên cứu chủ yếu

tập trung vào việc phân loại và xác định khu vực phân bố của Hoàng thảo Kèn

Xuất phát từ những vấn đề trên, tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu nhân giống in

vitro lan Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum)”, góp phần bảo tồn loài

hoa quý hiếm này củng như làm tiền đề cho việc cung cấp cây giống cho sảnxuất

Phần 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1 Khái niệm

Một trong những thành công sớm nhất và được ứng dụng rộng rãi nhất củacông nghệ sinh học đó là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật (plant tissue culture) là thuật ngữ dùng để chỉ quá

trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời nhau của thực vật Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống

(micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kĩ thuật nuôicấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thựcvật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong ống nghiệm hoặctrong các loại bình nuôi cấy khác [12]

1.1.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật

Quy trình nhân giống vô tính in vitro được thực hiện theo 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Cấy gây

Là giai đoạn đưa mẫu vật từ bên ngoài vào môi trường nuôi cấy, phải đảmbảo những yêu cầu sau:

- Tỷ lệ nhiễm thấp

- Tỷ lệ sống cao

- Tốc độ sinh trưởng nhanh [12]

Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọngnhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân,mảnh lá, rễ,… Cách lấy mẫu sử dụng nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố như:kiểu nuôi cấy được thực hiện, mục đích của việc nuôi cấy, loài thực vật nuôi cấy.

Sự lựa chọn đúng vật liệu nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng đến thành công củanuôi cấy mô [12]

Cây phát triển ở môi trường bên ngoài lúc nào cũng bị nhiễm vi sinh vật vàsâu bệnh, nên trước khi cấy lên môi trường dinh dưỡng mẫu cấy cần phải đượckhử trùng Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môitrường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh [7, 12]

Giai đoạn 2: Nhân nhanh

Ở giai đoạn này người ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác

từ đó cây có thể hoàn chỉnh phát sinh

Những khả năng tạo cây là:

- Phát triển chồi nách

- Tạo phôi vô tính

- Tạo đỉnh sinh trưởng mới

Trong giai đoạn này, cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơquan, đặc biệt là chồi như:

Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng nồng độ cytokinin giảm nồng độauxin), tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại

sẽ kích thích phát sinh chồi [7] Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy

khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độchiếu sáng khi nuôi cấy [12].

Nuôi cấy phải được bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20 - 25°C.Trường hợp những loài có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vàokhoảng từ 32 - 35°C Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độnuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải < 30°C [12]

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thứcnhân nhanh bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích [12].Giai đoạn 3: Tạo rễ và đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ; huấn luyện thích nghi vớithay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡngsang tự dưỡng hoàn toàn [11]

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này câyphải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như: mất nước nhanhlàm cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy

lá do nắng [12]

Đối với Phong lan, cây trước khi ra đất cần được huấn luyện thích nghi vớimôi trường tự nhiên bằng cách để cây trong chai nuôi cấy để tăng tỉ lệ sống củacây con Bình có chứa cây được ra đất cần đặt trong điều kiện che 80% ánh sáng

và nhiệt độ dưới 30oC [3]

1.1.3 Vai trò các chất KTST trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ngoài những thành phần dinh dưỡng khoáng cơ bản, việc bổ sung một hoặc

tổ hợp các chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần

thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa cơ quan, tạo sức sốngtốt cho mô và các tổ chức tế bào Yêu cầu đối với những chất này trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật thay đổi tùy theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điềuhòa sinh trưởng nội sinh của chúng [12]

1.1.3.1 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được phát hiện đầu tiên, cóvai trò quan trọng trong điều chỉnh các hoạt động sinh trưởng và các quá trình sinhhóa, sinh lý trong cây [12]

Đặc điểm chung của các auxin là tính phân chia tế bào Các hormone thuộcnhóm này có các tính chất sinh lý như: kích thích sự giãn nở của tế bào, gây sự cửđộng sinh trưởng, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự nảy mầm của hạt, tạo

rễ và phân hóa mạch dẫn [6]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi trường nuôi cấy thường được bổsung các auxin khác nhau như: 3-Indoleacetic acid (IAA), 3-Indolebutyric acid(IBA), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), β-Naphthyloxyacetic acid và α-Naphthaleneacetic acid (NAA) [6]

1.1.3.2 Cytokinin

Cytokinin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có nhiều tác động lên sự sinhtrưởng của thực vật như: tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào nhưngcần có sự có mặt của auxin, kích thích mạnh mẽ lên sự nảy mầm hạt và chồi ngủ,ảnh hưởng đến quá trình ra hoa của cây

Các cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ callus hoặc

từ các cơ quan, tạo phôi vô tính, tăng cường sự phát sinh chồi phụ [5, 21]

Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là benzyl aminopurine (BAP), 6-furfurryl-aminopurine (KIN), zeatin, 6-(3-methyl-2-butenylamino) purine, 1-phenyl-3 (1,2,3 thiadiazol-5-yl) [5].

6-1.1.5 Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật

1.1.5.1 Sự tạp nhiễm

Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy Một số nguồn gây tạp nhiễmnhư từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ côn trùng như ve bét, môitrường, dụng cụ và các máy móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thốngthông khí trong phòng cấy [13]

Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũngđược xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống Mẫu cấy có thể là đốt thân,đỉnh sinh trưởng, mẫu lá, phát hoa hay rễ non Tuy nhiên, để mẫu sống và pháttriển trong điều kiện vô trùng thì không phải dễ Môi trường bên ngoài luôn córất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vảy, của cây

mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc đượcchúng Đặc biệt, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễmmôi trường sau 1 tuần nuôi cấy Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gâynhững vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy

bình nuôi cấy Những loài vi khuẩn thường gây nhiễm gồm: Acinebacter,

Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Erwinia, Pseudomonas,…

[13]

Nấm thường tồn tại ở dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi

có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều Nếu màng lọc

tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy Ngoài ra,bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc

những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng Các loài nấm thường gặp: Aspergillus,

Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra [12].

Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm không thua gì nấm mốc Ve bétxâm nhập vào vào bình nuôi cấy qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâmnhập cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm và ve bét cùng lúc.Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết sau khi chúng xâm nhậpkhoảng 2 tuần [6]

1.1.5.2 Tính bất định về mặt di truyền

Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồngđồng nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bàosoma qua nuôi cấy callus Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụngvào cải thiện giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo.Tần số biến dị hoàn toàn khác nhau và không lặp lại Nuôi cấy callus cho biến dịnhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấythường là biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất Đến nay việc gây ra biến

dị chưa được làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA.Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền Số lần cấy chuyềncàng nhiều càng cho độ biến dị cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôicấy kéo dài Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làmgiảm sự biến dị [13]

1.1.5.3 Hiện tượng thủy tinh thể

Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy.Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp.Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bánrắn

Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất là làm giảmảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách tăng nồng độđường và tạo điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thíchhợp [12, 13]

1.2 Giới thiệu về lan Dendrobium

1.2.1 Nguồn gốc và phân loại của lan Dendrobium

1.2.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ

Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong ngành một lá mầm Cácloài trong hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức

đa dạng và phức tạp [9] Với 1.600 loài khác nhau đòi hỏi nhiều cách chăm sóckhác nhau, nguyên do là vì chúng du nhập từ nhiều nơi khác nhau: Nhật Bản,Triều Tiên và Newzealand, đặc biệt là Guinea là nơi sản sinh ra nhiều loài

Dendrobium nhất [1] Trong đó, Việt Nam có khoảng 137 – 140 chi gồm 800

loài lan rừng [7]

Riêng chi Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông được phân biệt

bằng thân (giả hành), lá và hoa [14]

Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành 2 dạng chính:

Dạng đứng (Dendrobium phalaenopsis) thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm:

Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia [1]

Dạng thòng (Dendrobium mobile) chịu khí hậu mát mẽ: Giả hạc, Hạc vĩ,

Long tu, Phi điệp vàng

Theo Nguyễn Công Nghiệp và cs (2004) thì không có một hình dạng chungnhất về hoa và dạng cây do số lựợng quá lớn, phân bố rộng rãi Riêng giống lan

Dendrobium đều có bộ phận sinh dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan

sinh sản như hoa, trái [14]

1.2.2.1 Rễ

Rễ lan thuộc loại rễ bì sinh, chúng vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muốikhoáng vừa giúp cây bám chặt vào giá thể giúp cây khỏi bị gió cuốn đi, ngoài racòn có tác dụng chống đỡ cho cây mọc cao, vươn ra xa để lấy ánh sáng [7]

Chung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễdàng hút nước, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ cómàu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thểgiúp cây quang hợp Vì vậy, rễ hút được nước mưa chảy dọc trên giúp cây hútdinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bịgió cuốn [14].

Đối với lan, phải trồng với giá thể nhỏ hơn và nhiều hơn, để bộ rễ bám dàyđặc hút nhiều dưỡng chất [18]

1.2.2.2 Thân

Thân cây của các loài thuộc họ Phong lan rất ngắn hay kéo dài, đôi khi phânnhánh và có thể có hoặc không mang lá [7]

Lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình múi

hay hình dẹt, có nhiều đốt thân Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống Một số

Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chóng tàn, chúng vàng úa và rụng

vào mùa thu, thân phì to giống như củ, không có lá là nơi dự trữ năng lượng[13]

1.2.2.3 Giả hành

Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịchnhày làm giảm sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điềukiện khô hạn khi cây sống bám trên cao [7]

Ngoài ra, giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp được [14].Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thuôn dài hay hìnhtrụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ [9]

loài thuộc giống Dendrobium vùng nhiệt đới nói riêng và họ Orchidaceae nói

chung đôi khi trút lá vào mùa khô hạn Sau đó, cây ra hoa hay sống ẩn để khi gặpmưa thì cho chồi mới [9]

1.2.2.5 Hoa

Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ các mắt

ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây Rụng hết lá trước khi

ra hoa [14]

1.2.2.6 Trái

Họ Orchidaceae đều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang bung rachỉ còn dính lại với nhau ở đỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt ranên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [9]

1.2.2.7 Hạt

Quả chứa 10.000 - 100.000 hạt đôi khi đến 3 triệu hạt có kích thước rất nhỏnên phôi hạt chưa phân hoá Sau 3 - 5 tháng hạt chín và phát tán nhờ gió [9]

1.2.3 Giá thể trồng lan (compost)

Trồng lan phải sử dụng đến giá thể Giá thể là những chất liệu dùng để cảithiện độ ẩm là chính, còn cung cấp chất dinh dưỡng cho lan chỉ là việc phụ,không đáng kể Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm vì có sẵn chung quanhta

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004) thì có các loại giá thể trồng lan và đặctính của từng loại như sau:

1.2.3.1 Than gỗ

Trồng lan bằng những thanh than gỗ ngắn, với kích cỡ bằng ngón tay cái,ngón chân cái là vừa Đặc tính của than gỗ là hút nước và giữ ẩm được lâu Nênchọn loại than xốp, với than chắc quá như than đước không nên dùng vì khảnăng giữ ẩm kém

1.2.3.2 Xơ dừa

Xơ dừa làm giá thể để trồng lan chính là vỏ của trái dừa khô Xơ dừa rút

ẩm rất tốt, tốt hơn cả than gỗ, nhưng khuyết điểm là mau mục và là nơi đeo bám

lý tưởng của rêu và cỏ dại Trong xơ dừa có chất tanin là chất chát, vì vậy trướckhi dùng ta nên ngâm nước nhiều ngày, sau đó vớt ra phơi khô, rồi cẩn thận hơnnên phun thuốc trừ sâu bệnh,

1.2.3.3 Gạch

Gạch là chất hút nước tốt, giữ ẩm cao Gạch được nung chín xốp vừanhẹ vừa hút nước nhiều Khi dùng làm giá thể, gạch được đập vụn ra từngthanh nhỏ bằng ngón tay cái Khuyết điểm của gạch là dễ mọc rêu và nặng

1.2.3.4 Dớn

Dớn là chất trồng được lấy từ thân và rễ của cây Dương xỉ Dớn là chấtliệu làm giá thể trồng lan mới được sử dụng gần đây Ưu điểm của dớn là giữ

ẩm tốt [14]

1.3 Giới thiệu lan Hoàng thảo Kèn

Theo Nguyễn Tiến Bân (2005), Hoàng thảo Kèn còn có tên khác là Hoàngthảo Loa kèn là một loài lan trong chi lan Hoàng thảo, phân bố từ Nam Á đếnĐông Nam Á Ở Việt Nam, Hoàng thảo Kèn phân bố chủ yếu ở Lai Châu, Sơn

Thân cây dài 50 - 80 cm, mềm, dạng thòng, hình trụ, căng tròn, nhẳn bóng,thon nhọn dần về phía đầu ngọn, đôi khi đốt thân thắt hình thoi rất nhẹ Lá hẹp,thuôn dài, dẻo dai rụng vào mùa thu Hoa có màu tím biến thiên từ nhạt đến sậm,môi loa hình chiếc kèn, vành môi trắng

Hoàng thảo Kèn cần nhiều ẩm và phân bón trong lúc phát triển thân non,chỉ để khô khi cây đã ngừng phát triển.

1.4 Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan

Để tạo cây giống lan phục vụ cho việc nhân giống có hai cách: nhân giốnghữu tính và nhân giống vô tính

1.4.1 Kỹ thuật nhân giống hữu tính

Trong tự nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc của hoalan hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính,cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sựgiao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc

Ở vườn nuôi trồng lan, để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ranhiều giống lan lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn Sự thụ phấncủa lan có thể cùng cây hoặc có thể khác cây [8]

1.4.2 Phương pháp nhân giống vô tính

1.4.2.1 Phương pháp tách chiết cây con

Khi rễ cây con được 6 - 10 cm có thể tách để trồng riêng Đây là cách nhângiống đơn giản và dễ làm nhất Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quáđầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới Các giả hành già được tách ra khi hoa

đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm Giả hành già được ươm lại trêngiá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúctạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai Từ một giả hành có thể chomỗi đợt 1 - 2 cây con [19]

Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹnhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấpmột số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn [19].

1.4.2.2 Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành, cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi một đoạn có nhiều mấu Đặtcác đoạn này vào một nơi nóng ẩm, chỉ cần lát rêu Sau vài tuần, sẽ xuất hiệnnhững cây con có thể đem trồng vào các chậu mới [19]

1.4.2.3 Các kỹ thuật nhân giống in vitro

1.4.2.3.1 Nhân giống bằng chồi nách

Chồi nách nhô ra từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởngphụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính Khi các mẫu cấy là chồiđược giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cảnách lá Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấpcytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậcba,… Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyềntrong môi trường mới [19]

1.4.2.3.2 Nhân giống bằng đỉnh chồi

Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng

và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0,1 - 0,5 mm)thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việc pháttriển nguyên liệu gốc sạch bệnh Đỉnh chồi từ 0,5 - 2,0 mm thì thông dụng hơn

và thích hợp trong việc nhân giống Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường

có chứa auxin kết hợp với cytokinin, nồng độ cytokinin được tăng lên trongnhững lần cấy chuyền

1.4.2.3.3 Nhân giống bằng chồi bất định

Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên môcây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường Một số các nguyên liệu nuôi cấygồm: lá, vẩy, cuống lá… Mặt khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từcallus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus

và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy Tuy nhiên chồi bất định cóthể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị [19]

1.5 Lịch sử nhân giống in vitro cây lan

Có thể thấy lịch sử nhân giống cây lan là một hình ảnh trung thực của lịch

sử phát triển của ngành công nghệ sinh học [27] Các mốc chính trong lịch sửnghiên cứu cây lan được khát quát ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Tóm tắt các giai đoạn phát triển trong lịch sử nhân giống cây lan [27]

hạt lan khi ông khảo sát các hạt lan Noettia nidus nảy mầm tự nhiên trong rừng

vùng Fontainebleu ở Pháp.

nầm ấy cho nhiễm vào các hạt lan Bằng cách đó Noel Bernard là người đầu tiên làm cho 100% hạt lan nảy mầm.

trường thạch để gieo hạt không cộng sinh.

số loài lan khác.

1961 Ito I nuôi cấy in vitro bầu nhụy và hạt lan.

sinh đỉnh chồi.

số dịch chiết khác.

1971 Mitra G.C nuôi cấy vô trùng hạt, đỉnh sinh trưởng và lát cắt thân cây lan.

cấy đỉnh rễ Phalaenopis.

1976 Tanaka M., Senda Y và Hasegawa tái sinh cây con từ nuôi cấy đỉnh rễ

Phalaenopis.

1977 Arditti J tạo dòng và nhân giống lan bằng nuôi cấy lá.

1.6 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG VÀ PHÁT SINH

HÌNH THÁI TRONG NUÔI CẤY IN VITRO CÁC LOÀI LAN

1.6.1 Trên thế giới

Hiện nay, nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng

nên việc nghiên cứu nhân giống lan Dendrobium rất được quan tâm và phát triển

mạnh mẽ

Chang J và cs (2004) đã nghiên cứu nhân giống in vitro ở Dendrobium

lituiflorum thu được kết quả: Môi trường ½ MS bổ sung 0,5 mg/l NAA là tối ưu

cho việc nhân nhanh protocorm với hệ số nhân là 4,368 lần, môi trường N6 bổ

sung 0,5 mg/l NAA, 10% dịch ép chuối là thích hợp cho tạo rễ in vitro với chiều dài rễ từ 2,0 đến 4,0 cm và số rễ từ 6 – 8 rễ [23].

Kong Q và cs (2007) đã nghiên cứu cảm ứng protocorm từ hạt trên môitrường ½ MS bổ sung 0,2 mg/l NAA Một số lượng lớn protocorm có thể đượcnhân nhanh trên môi trường ½ MS chứa 0,5 mg/l BAP [24]

Lo S.F và cs (2004) tiến hành nuôi cấy hạt lan D tosaense trên môi trường

MS với 15% saccharose và 8% dịch nghiền chuối hay nước ép khoai tây haynước dừa Hạt lan nảy mầm, sau 20 tuần nuôi cấy đã phát triển thành cây khỏemạnh [25]

Yang J.F và cs (2010) đã tiến hành thử nghiệm nuôi cấy lắc protocorm ởtốc độ lắc 100 vòng/phút cho kết quả tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường rắn

và đạt hệ số nhân đạt 4,4 lần sau 50 ngày nuôi cấy [28]

Asghar S và cs (2011) đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh chồi giống lan

Dendrobium nobile var Emma từ chồi nách sử dụng môi trường bổ sung BAP,

KIN ở các nồng độ 0,5 - 3,0 mg/l và CW với các thể tích khác nhau (50 - 300ml) Qua nghiên cứu cho thấy, ở môi trường có chứa 1,5 mg/l BAP kết hợp vớiKIN cho kết quả nhân chồi cao nhất Cây hoàn chỉnh hình thành tốt nhất trênmôi trường chứa 2,0 mg/l IBA với tỷ lệ tạo rễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) vàchiều cao cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với môi trường bổ sung NAA Nồng độcao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [22]

Luo L.P và cs (2008) đã nghiên cứu vi nhân giống cho Dendrobium

densiflorum Lindl Ex Wall, sự hình thành và tăng trưởng PLB nhanh trên môi

trường MS đầy đủ và tạo thành chồi trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP[26]

1.6.2 Trong nước

Nguyễn Thị Sơn và cs (2014) đã nghiên cứu nhân giống Lan Dendrobium

officinale Kimura et Migo (Thạch hộc Thiết bì), trên môi trường Vacin và Wen

bổ sung 10 g/l saccharose, 6 g/l agar, 10% CW cho kết quả tốt nhất giai đoạn

nuôi cấy khởi đầu cho hạt lan D officinale Kimura et Migo với tỷ lệ hạt nảy mầm là 100% Môi trường nuôi cấy tối ưu để nhân nhanh cụm chồi lan D.

officinale Kimura et Migo là MS bổ sung 10% CW, 20 g/l sucrose, 6 g/l agar, 60

g/l chuối chín cho hệ số nhân chồi đạt 2,8 lần sau 4 tuần nuôi cấy Trên môitrường MS bổ sung 20 g/l sucrose, 10% CW, 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA tốtnhất cho nuôi cấy đoạn thân mang mắt ngủ đạt chiều cao chồi 6,26 cm và số chồiđạt 8 chồi/mẫu Trên môi trường Robert Ernst bổ sung 10 g/l saccharose, 6 g/lagar, 0,3 g/l than hoạt tính, 0,5 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất tạo rễ với tỷ lệcây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình là 4,51 rễ/chồi; chiều dài rễ trung bình đạt3,19 cm sau 30 ngày nuôi cấy [15]

Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013) nghiên cứu nhân giống in

vitro Lan Dendrobium nobile Lindl (Thạch hộc) đã khẳng định môi trường gieo

hạt thích hợp với MS bổ sung 10% CW, 10 g/l saccharose, 6 g/l agar Môitrường thích hợp cho nhân nhanh protocorm là môi trường Knudson C bổ sung10% CW, 10 g/l saccharose, 6 g/l agar với hệ số nhân nhanh đạt 4,2 lần sau 8tuần nuôi cấy Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS bổsung 10% CW, 10 g/l saccharose, 6 g/l agar đạt hệ số nhân chồi tốt nhất 3,08 lầnsau 8 tuần nuôi cấy [10]

Theo Vũ Ngọc Lan và cs (2013) trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng

lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng hệ số nhân protocorm đạt 1,9

và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển Nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm

25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lêngấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển [10].

Các công thức bổ sung saccharose đều có hiệu quả trong nuôi cấy mô làmtăng hệ số nhân và tăng khối lượng protocorm [10]

Nguyễn Văn Song và cs (2014) nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum), đã tìm ra được môi trường thích hợp cho

nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/lagar, 15% CW và 2,0 mg/l BAP Trên môi trường MS bổ sung 20 g/l saccharose,15% CW, 8 g/l agar và 2,0 mg/l BAP cho nhân nhanh protocorm tốt nhất Môitrường MS bổ sung 30 g/l saccharose, 8 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính, 15% CW,2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm

và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 15% CW và 1,0 mg/l NAA là thích hợp cho tạo rễ in vitro [16].

Nguyễn Thị Sơn và cs (2011) đã khẳng định môi trường thích hợp cho nảy

mầm và phát sinh protocorm trong nhân giống in vitro lan

Dendrobium fimbriatum (Hoàng thảo Long nhãn) là môi trường MS bổ sung

10% CW, 10 g/l saccharose, 6 g/l agar; môi trường nhân nhanh protocorm tốtnhất trên môi trường Knudson bổ sung 10% CW, 10 g/l saccharose, 60 g/l khoaitây, 6 g/l agar cho hệ số nhân protocorm đạt cao nhất 4,63 lần sau 8 tuần nuôicấy Môi trường MS bổ sung 10% CW, 10 g/l saccharose, 60 g/l chuối chín, 6 g/l

agar là thích hợp nhất cho nhân nhanh cụm chồi in vitro đạt hệ số nhân trung

bình 3,44 lần sau 8 tuần nuôi cấy Trên môi trường Robert Ernst bổ sung 10 g/lsaccharose, 1 g/l than hoạt tính, 6 g/l agar thích hợp nhất cho tái sinh tạo câyhoàn chỉnh [15]

Nguyễn Thị Tâm và cs (2007) đã tiến hành nghiên cứu trên cây

Dendrobium hybrid và đưa ra kết luận: môi trường VW bổ sung 20 g/l

saccharose, 100 ml/l nước dừa, 2 mg/l BAP là thích hợp nhất cho việc nhân chồi

là 2,0 sau 6 tuần; môi trường VW bổ sung 0,3 mg/l NAA cho số rễ 15,83 rễ/chồi

và chiều dài rễ 2,3 cm; cây con in vitro trồng trên giá thể rêu cho hiệu quả cao

Phần 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là loài lan Hoàng thảo Kèn (Dendrobium lituiflorum)

-một loài lan rừng quý của Việt Nam, được thu từ tự nhiên

Vật liệu nuôi cấy khởi đầu là hạt nằm trong vỏ quả lan từ 3 - 4 tháng sau khithụ phấn

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chuẩn bị và khử trùng mẫu

Phương pháp khử trùng bằng HgCl2: quả lan được khử trùng bằng dung dịchHgCl2 0,1% trong khoảng 5 - 8 phút Tiếp theo, quả được rửa lại bằng nước cất vôtrùng 5 lần Sau đó, dùng dao bổ quả để lấy hạt lan bên trong, cấy lên môi trườngthích hợp

Tiến hành theo dõi tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết của mẫu thí nghiệm sau 1 tuầnnuôi cấy

2.2.2 Nuôi cấy ban đầu

Mẫu đã được khử trùng được cấy lên môi trường MS có 8 g/l agar, 30 g/lsaccharose và bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP ở các nồng độ từ0,5 mg/l đến 2,0 mg/l

Đánh giá khả năng nảy mầm và phát triển protocorm sau 6 tuần nuôi cấy

2.2.3 Nhân nhanh protocorm

Các protocorm phát sinh từ hạt thu được từ giai đoạn nuôi cấy khởi đầu,được cấy chuyển với khối lượng 3 g/bình trên môi trường MS có 8 g/l agar, 30 g/

l saccharose và bổ sung riêng lẻ các chất kích thích sinh trưởng BAP (0,5 - 4,0mg/l), KIN (0,5 - 2,0 mg/l) và NAA (0,5 - 1,5 mg/l) để thăm dò khả năng hìnhthành và phát triển của protocorm

Tiếp theo, bổ sung kết hợp vào môi trường nuôi cấy BAP nồng độ 0,5 mg/

l và NAA ở các nồng độ khác nhau từ 0,1 mg/l đến 0,4 mg/l để thăm dò khảnăng nhân nhanh protocorm

Sau đó, tiến hành thăm dò ảnh hưởng của nồng độ saccharose (27 - 36 g/l)đến khả năng nhân nhanh protocorm dựa trên kết quả tốt nhất thu được ở cáccông thức trước đó

Nuôi cấy protocorm trong môi trường lỏng lắc sử dụng bình tam giác loại

250 ml với thể tích môi trường là 50 ml để khảo sát khả năng nhân nhanh trongmôi trường nuôi cấy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút Số liệu nghiên cứu được thu sau

4 – 7 tuần nuôi cấy bằng phương pháp cân định lượng khối lượng mẫu trongbình nuôi hàng tuần

Tổng khối lượng protocorm sau 6 tuần

Hệ số nhân protocorm (lần) =

Khối lượng protocorm ban đầu

2.2.4 Nhân nhanh chồi

Các chồi thu được từ giai đoạn nuôi cấy khởi đầu Được cấy trên môitrường dinh dưỡng cơ bản MS có 8 g/l agar, 30 g/l saccharose và bổ sung riêng

lẻ các chất kích thích sinh trưởng BAP, KIN ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 2,0 mg/l để thăm dò khả năng tạo cụm chồi

-Số liệu nghiên cứu được thu sau 6 tuần nuôi cấy gồm: số chồi, chiều caochồi, số lá

2.2.5 Tạo rễ

Các chồi từ 3 – 5 cm thu được từ các thí nghiệm trên được tách riêng rẽ vàcấy trên môi trường cơ bản MS có 8 g/l agar, 30 g/l saccharose và bổ sung riêng

lẻ NAA từ 0,2 mg/l đến 0,8 mg/l, IBA được bổ sung ở các nồng độ từ 0,3 mg/l

đến 1,2 mg/l để thăm dò khả năng hình thành và phát triển của rễ từ chồi in

vitro.

Theo dõi các chỉ tiêu: số rễ, độ dài rễ sau 6 tuần nuôi cấy

2.2.6 Đưa cây ra vườn ươm

Các loại giá thể sử dụng gồm: dớn trắng, sơ dừa, rêu Tất cả các loại giá thểđược ngâm dung dịch thuốc diệt nấm và để ráo Cây con có từ 3 rễ trở lên, độ dài

rễ khoảng 2 cm được ngâm với thuốc diệt nấm trong 10 phút sau đó trồng lên cácloại giá thể khác nhau, theo dõi tỉ lệ sống của cây sau 4 tuần

2.2.7 Điều kiện thí nghiệm và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện đồng nhất về nhiệt độ (24 –

260C), cường độ chiếu sáng (2000 – 3000 lux) và thời gian chiếu sáng (16

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệmđược lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp quan sát 10 mẫu

Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích

Duncan's test bằng phần mềm SPSS 16.0 với mức xác suất có ý nghĩa p<0,05.

Phần 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu

3.1.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng

Quả lan tiếp xúc với điều kiện bên ngoài nên vỏ quả chứa vi khuẩn và nấm.Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là các hóa chất có hoạttính diệt nấm như: calcium hypochlorite, sodium hypochlorite, nước brom, H2O2,HgCl2, Trong đó, HgCl2 được đánh giá là có hiệu quả diệt khuẩn khá tốt và thườngđược sử dụng ở nồng độ 0,1% [12] Khi sử dụng HgCl2 ở nồng độ cao hơn 0,1%thường cho tác dụng diệt khuẩn cao nhưng lại gây độc cho mẫu cấy, mẫu cấy thườngchết hay không tái sinh Tuy nhiên, khi khử trùng quả lan, chúng tôi sử dụng nồng độHgCl2 cao (0,5%) vẫn có hiệu quả tốt do vật liệu cấy là hạt, được bao bọc bởi vỏ, íttiếp xúc trực tiếp với tác nhân khử trùng.Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời giankhử trùng quả lan được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng quả lan

Thời gian khử trùng

(phút)

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỉ lệ mẫu chết (%)

Tỉ lệ mẫu sống (%)