Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) (LV thạc sĩ)

NGUYỄN THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM

(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016

NGUYỄN THU HƯỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO

LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM

(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hải Yến Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng có ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thu Hường

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này

Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm Sinh học của Khoa Khoa học Sự sống đã tạo điều kiện

về thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn thạc sĩ

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thu Hường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về phong lan 3

1.1.1 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 4

1.1.2 Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 7

1.1.3 Các phương pháp nhân giống trên cây lan 9

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 10

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào 10

1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính 11

1.2.3 Các giai đoạn của nhân giống in vitro 12

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 13

1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 16

Chương 2: 18

2.1 Vật liệu 18

18

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 18

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 19

2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20

2.2.3 Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 21

2.2.4 Chuẩn bị giá thể và ra cây 21

2.2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 21

2.2.6 Bố trí thí nghiệm 21

2.2.7 Các chỉ tiêu theo dõi 24

2.2.8 Xử lý số liệu 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy 25

3.1.1 Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan 25

3.2 Kết quả tái sinh chồi 26

3.2.1 Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím 26

3.2.2 Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím 28

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím 29

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) 33

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phi điệp tím 35

3.6 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của cây lan sau khi ra chai trồng trong bầu 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

1 Kết luận 40

2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APG III Angiosperm Phylogeny Group III

BAP 6 - Benzyl adenin purine

IAA Indol - 3 - acetic acid IBA Indol - 3 - butyric acid Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin

2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid

α - NAA α - Naphthalene acetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằng

HgCl2 0,1% 25 Bảng 3.2 Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím 27 Bảng 3.3 Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệp

tím sau 50 ngày cấy chuyển 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lan

Hoàng thảo phi điệp tím 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền

đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau

30 ngày 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lanHoàng

thảo phi điệp tím 36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng phát

triển của cây 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím 9 Hình 2.1 Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím 20 Hình 3.1 Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MS

chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy 26 Hình 3.2 Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từ

hạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP 27 Hình 3.3 Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồi

lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanh

cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 35 Hình 3.6 Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày 37 Hình 3.7 So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng và

phát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày 38

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cần thiết Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất khá phổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩu trên thế giới Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15]

Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho

sự phát triển của các loài phong lan Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì nước ta có 137 - 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lan đều có vẻ đẹp riêng Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giống lan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hương thơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng Thế giới lan rừng rất phong phú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàng

thảo (Dendrobium) Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trị kinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thì Dendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệp

mỹ phẩm, y học Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lại

nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này

Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạng cây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiên

vì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều Ngày nay, với công nghệ nhân

giống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn

định về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triển

nguồn gen của các loài lan Việt Nam Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào chi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả

Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân

giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)”

nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phương

pháp in vitro

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobium anosmum Lindl (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý

hiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thực vật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím

(Dendrobium anosmum Lindl.)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sự

nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm

auxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)

- Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và phát

triển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khi

ra cây trồng trong bầu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về phong lan

Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp một lá mầm (Monocotylendons), phân lớp hành (Liliidae), họ Lan (Orchidaceae) Họ phong lan đã biết khoảng 850 chi (APG III, 2009) và có trên 25000 loài chiếm khoảng 10% của các loài thực vật

có hoa (Dressler, 1993) [12] Bên cạnh đó còn có hơn 30000 loài lan lai Ngày nay, dựa vào đặc tính di truyền các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ: Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae, Vandoideae Họ Lan là một họ thực vật lớn và phân bố gần như trên toàn thế giới (ngoại trừ châu Nam Cực) Danh sách dưới đây liệt kê gần đúng sự phân

bố của họ này [18]

Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi Châu Đại Dương: 50 - 70 chi Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi Bắc Mỹ: 20 - 25 chi

Ở Việt Nam có 137-140 chi gồm trên 1000 loài lan rừng, bao gồm cả địa lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước, hầu hết đều có hoa đẹp nên được trồng làm cây cảnh [3]

Dựa theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia ra làm hai nhóm

là nhóm cây đơn thân (monopodial) và nhóm cây đa thân (sympodial) Nhóm cây đơn thân: lá mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân cây phát

triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa đến vài mét Ví dụ như chi lan Vanda, Vanilla Nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến kích thước

nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát triển thay thế Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi là “mắt” cây Các mắt cây phát triển

đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lan

Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá

1.1.1 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)

1.1.1.1 Phân loại chi lan Hoàng thảo

Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan

đứng sau lan lọng Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam

Á Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú về dạng cây, dạng hoa Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ để tiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm:

Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ở

gần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium phalaenopsis…[17]

Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mang nhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như:

Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum…

Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có

mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum…

Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc

màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile…

Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớp

lông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17]

Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan

Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính:

Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m

Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia, Indonexia…)

Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùng nóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17]

1.1.1.2 Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium

Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa

Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C Ngoài ra nếu vào mùa đông lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ

Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70% Nếu độ

ẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi Cây cũng không mọc mạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió

nụ sẽ ít đi

Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn Giá thể của lan gồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên Những chất liệu này không

phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất Những loại giá thể thường sử dụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu

Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lần một tuần Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa

đi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [19]

1.1.1.3 Sâu bệnh và các vấn đề khác

Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và

môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:

Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị là

tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào thuốc trị nấm Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]

Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có

độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18]

Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra Bệnh phát triển mạnh

vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/lần [18]

Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra

Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng của lá Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18]

Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ

nhiễm bệnh Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do thiếu ánh sáng Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun nhiều hơn (2 - 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18]

Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong

Bộ: Măng tây (Asparagales)

Họ: Phong lan (Orchidaceae)

Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae)

Chi: Hoàng thảo (Dendrobium) Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)

Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoa

học công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3]

1.1.2.2 Đặc điểm sinh học

- Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễ thật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối

khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây,

ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp

- Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh sự mất nước do mặt trời hun nóng Củ giả hành có màu xanh bóng nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4]

- Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinh dưỡng bằng quang hợp Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụng tạo thành các giả hành

- Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằm chính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt Nhị gồm hai phần bao phấn và hốc phấn Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốc phấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng

- Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh

và phía gốc Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy không khí Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5]

1.1.2.3 Phân bố

Hoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miền Nam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương,

Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừng

từ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16]

Hình 1.1 Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím

1.1.3 Các phương pháp nhân giống trên cây lan

1.1.3.1 Các phương pháp nhân giống truyền thống

Nhân giống vô tính

Tách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn

và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc

đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con [5]

Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành một

cách tự nhiên Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách ra khỏi giả hành để trồng Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất di truyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn

Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn

trùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụ

phấn ấy Có 2 phương pháp thụ phấn:

Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên núm nhụy của chính hoa ấy Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan

Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoa hác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống

Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày hôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khác

do côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to ra thành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái

Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải được nhiễm một số loại nấm cộng sinh Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như:

Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium; Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3]

Nhân giống in vitro

Ngày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạo

ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời có chất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường

1.2 Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô

- tế bào

Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệ

tế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặc các mô phân sinh trong cây[1]

Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài

tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [1]

Vì vậy, nuôi cấy mô - tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ có các ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vào sản xuất Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm

1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính

Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triển cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phân chia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh

Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô - tế bào như các đoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ

Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt

di truyền

1.2.3 Các giai đoạn của nhân giống in vitro

Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống

in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng

để đưa vào nuôi cấy in vitro [1], [11]

Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợp chất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy [1], [11]

Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ

số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp [1], [11]

Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường

ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng

l này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [1], [11]

Giai đoạn 5: Đưa cây ra giá thể

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài môi trường l

bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả

năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn

chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự

dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con đạt

tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất [1], [11]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

Mô nuôi cấy:

Mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau Việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽ không thu nhận được kết quả hoặc thu được những cây sẽ không phát triển mạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở một giai đoạn nhất định

Điều kiện vô trùng:

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có các thành phần thích hợp cho các loại nấm, vi khuẩn phát triển Vì vậy, điều kiện tiên quyết là phải đảm bảo nguyên tắc vô trùng cho mẫu cấy, môi trường cấy và các trang thiết bị liên quan trong suốt quá trình nuôi cấy, tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển… cũng phải thực hiện trong điều kiệ 1]

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng:

glucose, maltose, galactose Cung cấp năng lượng cho nuôi cấy đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [1], [10]

Thành phần khoáng: Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg, Ca… được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l và thường tồn tại dưới các dạng muối NH4

+

, NaH2PO4, KNO3, KCl… Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Bo,

Zn, Cu, Ni… được cung cấp với hàm lượng nhỏ hơn 30 mg/l [1], [10]

Vitamin: Để cây phát triển được tối ưu ta cần bổ sung từ bên ngoài các vitamin như: Vitamin B1, B2; myo-inositol; biotin; pantothenic acid…

chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng

Agar: Hàm lượng agar thường dùng cho môi trường nuôi cấy dao động

từ 0,6 - 1,0% theo khối lượng

Than hoạt tính: Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 - 3% Than hoạ

hấp thụ độc tố nâu/đen và các độc tố không màu khác; hấp thụ các hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin…); thúc đẩy sự tạo phôi soma, ổn định độ pH [1], [10]

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:

Là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò

quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu quả tác

động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy

Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chất

có tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng và nhóm chất ức chế sinh trưởng Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồm

có 3 nhóm chính đó là: auxin, gibberellin và cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy Còn các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng gồm có ABA, etilen, các hợp chất phenol, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các chất diệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh trưởng, người ta còn bổ sung thêm các dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và không xác định như: dịch chiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa, cazein thuỷ phân… nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy [10]

Nhiệt độ thông thường trong phòng thí nghiệm nhiệt độ được duy trì bằng máy điều hoà ở 25 ± 2 C phù hợp với đa số mô cấy; ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao gồm cường

độ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991) Cường độ ánh sáng trắng từ 1000 - 2500 lux, với chu kỳ 16/24 giờ chiếu sáng được dùng phổ biến cho nhiều mô nuôi cấy; pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 - 6 thì tốt trong nuôi cấy mô [10]

1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium

Phong lan là một trong những loại cây trồng có nhiều thành công nhất

trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Trên thế giới cũng như tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình về nhân nhanh các giống lan nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất Với việc sử dụng kĩ thuật nhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc nghề trồng lan ở quy mô lớn

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tháng 8/2010, Maridass M và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ Nghiên

cứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010) Vật liệu thân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử trùng với hyponatri 3% (bổ sung 2 - 3 giọt Tween80 EAC) trong 20 phút

và sau đó rửa sạch cho 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng Thân rễ được chẻ ra cắt miếng nhỏ (5 mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của

MS bổ sung các chất KTST như NAA, BAP và kinetin Các mẫu hình thành protocorm tốt trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM Sau đó protocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + BAP 0.5μM [14]

Năm 2011, Sana A và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh

chồi giống lan Dendrobium nobile var Emma từ chồi nách, sử dụng môi

trường có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l và kinetin Qua nghiên cứu các tác giả nhận thấy ở môi trường có chứa BAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất Tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa IBA 2 mg/l với tỷ lệ phần trăm tạo

rễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [15]

Bijaya P và Deepa T (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống

Dendrobium primulinum Lindl đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy các

đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môi trường MS bổ sung kết hợp các chất NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau,

các protocorm hình thành đã tạo chồi và rễ Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng chồi tăng nhanh nhất trên môi trường MS + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi trường MS + IAA 0,5 mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất Khi ra cây trên giá thể đất sạch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [13]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Phong lan Việt Nam có số lượng chi và loài phong phú, dần trở thành một họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế bậc nhất trong các họ cây rừng Việt Nam trong những năm gần đây đã có rất nhiều đề tài nhân giống phong lan đặc biệt là các cây lan có giá trị như các nghiên cứu:

Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra

một số kết quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi

non, được cắt thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + saccharose 20 g/l + nước dừa 100 ml/l + peptone 1 g/l + BA 1 mg/l + NAA 0,3 mg/l + AC 1 g/l Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệ tạo soma là 100% trên các mẫu nuôi cấy Tế bào soma màu trắng sáng, được tiến hành nhân sinh khối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu được

tế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môi trường VW + BA 1 mg/l + NAA 0,3 mg/l + nước dừa 100 ml/l [8]

Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi

cấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệu khởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang Kết quả cho

thấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS + BA 0,5 mg/l và tái sinh tốt trên môi trường MS + kinetin 3 mg/l + NAA 0,3 mg/l Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [9]

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo phi điệp tím