Nghiên cứu chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) giống nhật và giống hàn quốc và bước đầu ứng dụng sản xuất kẹo linh chi

SẢN XUẤT KẸO LINH CHI Lê Lý Thùy Trâm, Hồ Trương Quỳnh Châu đã lựa chọn Linh chi giống Hàn và Linh chi giống Nhật để nghiên cứu chiết tách hàm lượng polysaccharide tổng từ quả thể nấm

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒ TRƯƠNG QUỲNH CHÂU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ SO SÁNH

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT

NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

GIỐNG NHẬT VÀ GIỐNG HÀN QUỐC VÀ

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT KẸO LINH CHI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng - Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HỒ TRƯƠNG QUỲNH CHÂU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ SO SÁNH

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT

NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

GIỐNG NHẬT VÀ GIỐNG HÀN QUỐC VÀ

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT KẸO LINH CHI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM

Đà Nẵng - Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kì công trình nào khác

Người cam đoan

Hồ Trương Quỳnh Châu

SẢN XUẤT KẸO LINH CHI

Lê Lý Thùy Trâm, Hồ Trương Quỳnh Châu

đã lựa chọn Linh chi giống Hàn và Linh chi giống Nhật để nghiên cứu chiết tách hàm lượng polysaccharide tổng

từ quả thể nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) sử dụng dung môi rượu 400 theo phương pháp ngâm chiết kết hợp rung siêu âm, đồng thời đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng oxi hóa của cao chiết thu được từ hai mẫu nấm Linh chi này Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện chiết tách polysaccharide tổng từ quả thể nấm Linh chi đạt hiệu suất tối ưu khi chiết với tỉ lệ rắn/lỏng 1/15, thời gian chiết là 90 phút Bên cạnh đó, khả năng kháng khuẩn

của cao chiết nấm Linh chi giống Hàn và giống Nhật được xác định với 4 chủng vi khuẩn (Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) Kết quả cho thấy, cả hai cao chiết Linh chi giống Hàn và

giống Nhật đều có khả năng kháng khuẩn với tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu Ngoài ra, tác động của cả hai cao chiết lên vi khuẩn gram dương đều mạnh hơn lên vi khuẩn gram âm

EXTRACTION AND COMPARISON OF BIOLOGICAL ACTIVITY IN JAPANESE GANODERMA

LUCIDUM AND KOREAN GANODERMA LUCIDUM SPECIES AND THE FIRST APPLICATION FOR

CONTAINER PRODUCTION

ABSTRACT

Ganoderma lucidum (Lingzhi mushroom) is a valued medicinal fungus, used as a medication for prevention

and treatment of various diseases Currently, because of biodiversity for the choice in consumer, the commercially available lingzhi mushrooms have been derived from many different sources; for example, Japanese species, Korean species, DT species, etc However, it is possible for these differences to lead to the

varies in quality of Ganoderma According to this, our research group carried out the total polysaccharides isolation from fruiting bodies in Korean Ganoderma lucidum and Japanese Ganoderma lucidum species by using

40o alcoholic solvent based on ultrasonic- associated leaching method, and this evaluated anti-microbial ability

of the resulted extracts from both sources More particularly, in order to achieve the extractively optimized efficiency, the process was ongoing within about 90 minutes, the extraction ratio of solid:liquid = 1:15 Besides,

anti-microbial ability was identified by four main bacterial strains (Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, and Staphylococcus aureus) The results of study showed that both Ganoderma lucidum species from Korea and

Japan have had anti-microbial properties against all given bacterium Furthermore, there have been more effective of both extracts on Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria

Keywords: Ganoderma lucidum, polysaccharide, kháng khuẩn, kháng oxi hóa, Linh chi giống Nhật, Linh chi

giống Hàn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Cấu trúc luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst) 4

1.1.1 Vị trí phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 4

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 5

1.1.4 Phân bố 5

1.1.5 Thành phần hóa học và tác dụng trị liệu của nấm Linh chi 6

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NẤM LINH CHI 6

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 6

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước 10

1.3 CÁC SẢN PHẨM ỨNG DỤNG TỪ NẤM LINH CHI 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Thiết bị 15

2.1.3 Hóa chất 15

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu 15

2.2.2 Xác định thành phần một số kim loại nặng 16

2.2.3 Phương pháp Kjeldahl 17

2.2.4 Xác định hàm lượng cacbon tổng số 17

2.2.5 Xác định hàm lượng polysaccharide toàn phần 19

2.2.6 Lựa chọn phương pháp xử lý nguyên liệu 21

2.2.7 Phương pháp chiết 21

2.2.8 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 22

2.2.9 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 23

2.2.10 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa 24

2.2.11 Phương pháp cảm quan 24

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.2.13 Quy trình sản xuất kẹo Linh chi 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 27

3.2 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU 28

3.3 LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 30

3.4 LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT 31

3.5 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN CHIẾT 34

3.6 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỈ LỆ NGUYÊN LIỆU VÀ DUNG MÔI 36

3.7 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CƯỜNG ĐỘ SIÊU ÂM 38

3.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TỔNG SỐ CỦA HAI GIỐNG NẤM LINH CHI 39

3.9 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 40

3.10 HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HÓA 42

3.11 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẢM KẸO LINH CHI 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (bản sao)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

DĐVN Dược điển Việt Nam

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi 6

3.1 Kết quả xác định một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu 27 3.2 Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi chọn

phương pháp xử lý nguyên liệu

3.5 Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát

thời gian chiết

35

3.6 Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát tỉ

lệ nguyên liệu/dung môi

37

3.7 Hàm lượng polysaccharide toàn phần thu được khi khảo sát

cường độ siêu âm

1.5 Chiết xuất nấm Linh chi kết hợp đông trùng hạ thảo 12

2.2 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS 17

3.1 Hàm lượng polysaccharide trong 2 giống nấm Linh chi

thu được theo 2 phương pháp xử lý nguyên liệu

29

3.2 Hàm lượng polysaccharide trong 2 giống nấm Linh chi

thu được theo 2 phương pháp chiết

31

3.3 Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

thu được theo 2 dung môi chiết

33

3.4 Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

thu được khi khảo sát thời gian chiết

35

3.5 Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

thu được khi khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

38

3.6 Hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi giống Hàn

thu được khi khảo sát cường độ siêu âm

40

3.7 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết 42

Số hiệu Tên hình Trang

3.10 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của vitamin C 45

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nấm Linh chi (hay còn gọi là nấm trường thọ, nấm gỗ, nấm Lim…[4]) tên khoa

học Ganoderma lucidum P.Karst, được phân bố ở khắp nơi trên thế giới – đặc biệt tìm

thấy nhiều ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam

Trong những năm gần đây, nhu cầu người tiêu dùng đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm dược phẩm cũng như mỹ phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên Nấm Linh chi có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng làm thuốc hỗ trợ và điều trị bệnh Ở Trung Quốc, nấm Linh chi được coi là “thần dược” giúp kéo dài tuổi thọ, ngăn ngừa lão hóa, tăng sức dẻo dai cho cơ thể [20] Các nghiên cứu khoa học cũng đã chứng minh các chế phẩm từ Linh chi có tác dụng làm tăng hệ thống miễn dịch, chống các tế bào lão hóa, khử các gốc oxy tự do, sửa chữa cấu trúc ADN bị hỏng [20]; ngoài ra còn có khả năng đào thải chất phóng xạ, hạn chế và loại trừ những tổn thương phóng xạ ở mô và tế bào [19] Chính vì những tính năng và công dụng phong phú của Linh chi đối với sức khỏe mà nó ngày càng được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, nguồn nấm thu hái trong tự nhiên còn rất hạn chế, không thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng cao

Hiện nay, nhờ sự phát triển của khoa học kĩ thuật kết hợp với các biện pháp nông nghiệp kĩ thuật cao, Việt Nam đã nghiên cứu trồng thành công nhiều giống nấm Linh chi khác nhau, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng của người dân Sự đa dạng về chủng loại nấm như Linh chi giống Nhật, Linh chi giống Hàn, Linh chi giống DT tạo sự phong phú về lựa chọn nhưng cũng đặt ra câu hỏi về so sánh chất lượng giữa các giống nấm Đặc biệt hơn, những thông tin khoa học liên quan đến so sánh hoạt tính sinh học của các giống nấm Linh chi trên thị trường Việt Nam cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách các chất trong nấm Linh chi còn rất hạn chế Xuất phát từ thực tế

đó, chúng tôi quyết định chọn hai giống nấm Linh chi phổ biến và được ưa chuộng nhất trên thị trường hiện nay là Linh chi giống Nhật và Linh chi giống Hàn để tiến

hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) giống Nhật và giống Hàn Quốc và bước đầu ứng dụng sản xuất kẹo Linh chi”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với hai mục tiêu chính sau:

- So sánh hoạt tính sinh học của Linh chi giống Nhật và Linh chi giống Hàn

- Ứng dụng sản xuất kẹo Linh chi

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Quả thể nấm Linh chi giống Hàn được thu hái tại xã Vĩnh Ngọc, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Quả thể nấm Linh chi giống Nhật được thu hái tại Lấp Vò, Đồng Tháp

- Nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm

4 Phương pháp nghiên cứu

+ Phương pháp chiết soxhlet

+ Phương pháp ngâm chiết kết hợp rung siêu âm

- Phương pháp hóa sinh

+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số: phương pháp Kjeldahl

+ Xác định hàm lượng cacbon tổng số

- Phương pháp thử hoạt tính sinh học của dịch chiết

+ Hoạt tính kháng khuẩn: phương pháp khoanh giấy lọc

+ Hoạt tính chống oxy hóa: phương pháp DPPH

- Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

- Phương pháp đánh giá cảm quan

Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 3 lần, các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học của đề tài

+ Cung cấp thông tin khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2 giống nấm Linh chi (Linh chi giống Nhật và giống Hàn)

+ Cung cấp các thông số công nghệ của quá trình chiết để thu nhận cao chiết nấm Linh chi có hoạt tính sinh học

- Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

+ Là cơ sở để tạo nên sản phẩm mới có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, tăng tác dụng phòng và điều trị bệnh của nấm Linh chi

6 Cấu trúc luận văn

Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, trong luận văn gồm có các chương với nội dung như sau:

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum P.Karst)

Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 loài Trong đó, loài được sử dụng nhiều nhất cho đến thời điểm hiện tại để chăm sóc sức khỏe là nấm Linh chi Ganoderma

lucidum P.Karst [1]

Nấm Linh chi gọi theo tiếng Trung Quốc là Lingzhi, theo tiếng Nhật Bản là Reishi, ở Việt Nam gọi là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trường Thọ…[1], [2] Trong số rất nhiều tên gọi đó thì theo sách “Thần nông bản thảo” tên Linh chi đã được chính thức sử dụng [1]

1.1.1 Vị trí phân loại

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum P.Karst

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) nấm Linh chi thuộc:

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Nấm Linh chi là dạng thể quả, có đặc điểm chung là tai nấm hóa gỗ gồm 2 phần: cuống nấm và mũ nấm [4]

Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đính lệch, đôi khi đính tâm Cuống nấm thường hình trụ, dáng thanh mảnh hoặc mập khỏe, ít khi phân nhánh Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen bóng, không có lông, phủ suốt trên mặt tán nấm Mũ nấm khi non có hình trứng lớn dần có hình quạt Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ nấm có vân gợn hình đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng chanh, vàng nghệ, vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, nâu tím, nâu đen, nhẵn bóng Thường sẫm màu dần khi già, lớp vỏ nhẵn bóng phủ tràn

Hình 1.1 Nấm Linh chi

kín mặt trên mũ, đôi khi có lớp phấn ánh xanh tím Kích thước tán biến động lớn

từ (2-36) cm, dày (0,8-3,3) cm Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li

ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài Phần đính cuống hoặc

gồ lên hoặc lõm Phần thịt nấm dày từ (0,4-2,2 cm), màu vàng kem, nâu nhợt hoặc trắng kem, phân chia theo kiểu lớp trên và lớp dưới, khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm [4]

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Linh chi thuộc lớp nấm đảm, do đó có các đặc điểm như: sợi nấm có dạng ống,

có vách ngăn; các vách ngăn chưa hoàn chỉnh, cho phép nguyên sinh chất di chuyển từ

tế bào này sang tế bào khác; sợi nấm phát triển chia thành nhiều nhánh cái và con [5]

Có 2 dạng hệ sợi nấm: Sợi sơ cấp sinh ra từ bào tử, tế bào có 1 nhân; và sợi thứ cấp là phối hợp giữa 2 sợi sơ cấp, tế bào có 2 nhân

Chu trình sống của nấm Linh chi giống như hầu hết các loài nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử Bào tử nảy mầm tạo thành ống mầm Ống mầm phát triển thành hệ sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp phối hợp với nhau tạo thành sợi thứ cấp Sợi sơ cấp

và sợi thứ cấp mọc xen lẫn nhau tạo thành hệ sợi, hệ sợi phát triển thành mạng sợi nấm Khi gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ hạ, độ ẩm tăng) mạng sợi sẽ kết thành hạch nấm Ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp hạch nấm sẽ kết thành nụ nấm, sau đó nụ phát triển chồi, tán và thành quả thể nấm trưởng thành Mặt dưới mũ sinh ra các bào tử, bào

tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục [6]

1.1.4 Phân bố

Nấm Linh chi là một loài phân bố khắp nơi trên thế giới Nấm mọc trên gốc, rễ cây sống và cây đã chết, trên rất nhiều cây gỗ mọc trong rừng, đặc biệt là trên các cây thuộc bộ Đậu như Lim xanh, Lim vàng…Ở nước ta, có thể tìm thấy nấm Linh chi ở hầu khắp các tỉnh vùng núi từ Lào Cai đến Lâm Đồng [5]

Nấm Linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dưới thể quả Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất Ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam và một số quốc gia khác người ta đã chủ động nghiên cứu trồng thành công nấm Linh chi trên giá thể nhân tạo nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu khoa học cũng như ứng dụng trong cuộc sống

1.1.5 Thành phần hóa học và tác dụng trị liệu của nấm Linh chi

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của nấm Linh chi đầu tiên được tiến hành vào đầu thế kỷ 20, khi các nhà khoa học quan tâm đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất như esgosterol, các enzyme là phenoloxidase và peroxidase Cho đến gần đây, bằng phương pháp kích hoạt phóng xạ, đã xác định được trên 90 nguyên tố hóa học trong nấm Linh chi, trong đó hai nhóm được quan tâm nhất là polysaccharide và triterpenoide Trong các hợp chất trên thì polysaccharide chứa hàm lượng cao nhất, là hợp chất quyết định chất lượng của nấm Linh chi Các hoạt chất chính và tác dụng trị liệu của nó được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hoạt chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi

Tên hoạt chất/nhóm chất Hoạt tính dược lý

Lanosporeric axit A Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Lonosterol Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Compounds I, II, III, IV, V Ức chế sinh tổng hợp cholesteron

Ganoderans A, B, C Hạ đường huyết

β– D –glucan Chống ung thư, tăng cường miễn dịch

Ganoderic axit R, S Ức chế giải phóng histamine

Ganoderic axit B, D, F, H Giảm huyết áp

Lingzhi – 8 Chống dị ứng phổ rộng, điều hòa miễn dịch

Adenosine và dẫn xuất Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãn cơ, giảm đau

Ganosporelacton A, B Chống khối u

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NẤM LINH CHI

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 1994, Sang Yeon Yoon cùng các cộng sự đã công bố kết quả thử nghiệm của cao chiết nước nấm Linh chi có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, hoạt tính kháng khuẩn được biểu hiện bằng nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Trong số mười lăm loài vi khuẩn được thử nghiệm, hoạt tính kháng khuẩn của

Ganoderma lucidum thể hiện mạnh nhất khi thử nghiệm với vi khuẩn Salmonella

typhimurium ATCC 14028 (MIC = 0,75 mg/ml) Sau đó, nhóm tác giả còn tiến hành

nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Ganoderma lucidum khi kết hợp với bốn loại

kháng sinh (ampicillin, cefazolin, oxytetracycline, chloramphenicol) và đánh giá sự tác động qua chỉ số nồng độ ức chế phân đoạn (FICI) Sự kết hợp kháng sinh với cao chiết

Ganoderma lucidum trong cả bốn trường hợp đều dẫn đến tác dụng phụ Sự tương tác,

hỗ trợ lẫn nhau đã được quan sát thấy khi cao chiết Ganoderma lucidum kết hợp với cefazolin trong thử nghiệm chống lại vi khuẩn Bacillus subtilis và Klebsiella oxytoca.

[18]

Năm 2004, Qing-Yi Lu và cộng sự đã tiến hành điều tra các tác dụng ức chế hóa

học của Ganoderma lucidum bằng cách sử dụng mô hình tế bào nội mô nhân tạo trong

ống nghiệm (HUC) bao gồm các tế bào HUC-PC và các tế bào MTC-11 Cao chiết

ethanol và cao chiết nước từ quả thể và bào tử của G lucidum được sử dụng để kiểm

tra sự ức chế tăng trưởng, tình trạng trùng hợp sợi actin trong hai loại tế bào khảo sát Kết quả cho thấy rằng cao chiết ethanol có tác dụng ức chế tăng trưởng mạnh hơn so với cao chiết từ nước Ở nồng độ 40-80 μg/ml, các cao chiết này tạo ra sự trùng hợp sợi actin, do đó ức chế sự di chuyển của chất gây ung thư 4-aminobiphenyl ở cả hai dòng tế bào nghiên cứu [21]

Năm 2009, Liyan Zhao và các cộng sự đã tiến hành chiết xuất, tinh chế và khảo sát hoạt tính chống ung thư của polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi Nhóm nghiên cứu đã sấy khô quả thể Linh chi ở 500C, cắt thành từng miếng nhỏ và chiết với 95% ethanol trong 24 giờ để loại bỏ tạp chất và các phân tử lipophilic Tiếp đó, dịch chiết được cô quay thành cao và chiết 10 gam cao này với 280 ml nước cất bằng sóng siêu âm của thiết bị JY98 (Công ty Công nghệ sinh học Scientz, Ningbo, Trung Quốc) trong 17 phút Dịch chiết nước được ly tâm tại 4500 vòng / phút trong 20 phút để loại kết tủa Thu dịch ly tâm và bổ sung ethanol khan, sau đó ủ ở 40C trong 24 h Sau đó ly tâm, thu kết tủa và rửa lần lượt bằng các dung dịch etanol, acetone, ether và sấy khô để thu được polysaccharides thô Các polysaccharide thô này tiếp tục được cho qua cột sắc kí Sephadex G-100 thu được hai polysaccharide chính là GL1 và GL2 Các tác giả tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của GL-1 và GL-2 khi kích hoạt tế bào macrophage (RAW 264.7) và các hoạt động chống ung thư cho tế bào ung thư vú ở người (MDA-

MB231) in vitro được đánh giá bằng xét nghiệm MTT (3 (4,5dimethylthiazol2yl)

-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) Các kết quả chỉ ra rằng GP-1 và GP-2 có thể làm tăng sự gia tăng và hoạt động tế bào của đại thực bào một cách đáng kể và có khả năng

ức chế tế bào ung thư [19]

Năm 2010, Sheng-Quan Huang và các cộng sự khi nghiên cứu xác định điều kiện tối ưu hóa quá trình chiết polysaccharide của nấm Linh chi với dung môi kiềm bằng phương pháp phản ứng bề mặt đã chỉ ra rằng các điều kiện tối ưu của quá trình chiết là nhiệt độ chiết 60,1ºC, thời gian chiết 77,3 phút, nồng độ natri hydroxit (NaOH) 5,1%

và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1: 21.4 Hàm lượng polysaccharide thu được khi chiết với các điều kiện tối ưu đã nêu trên đạt 8,21% và hàm lượng này cao hơn gấp 5 lần so với khi chiết bằng nước nóng Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét

và kết quả phân tích thành phần hóa học để chứng minh rằng sử dụng dung môi kiềm

có khả năng phá vỡ cấu trúc các sợi nấm, đẩy nhanh quá trình trích ly polysaccharide Tiếp đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm các cao chiết lần lượt ở nồng độ 50mg/kg, 100mg/kg, 200mg/kg trên cơ thể chuột để đánh giá tác dụng của cao chiết với chức năng miễn dịch của chuột Kết quả xét nghiệm miễn dịch cho thấy polysaccharides hòa tan trong kiềm không có tác dụng đáng chú ý đối với thực bào đơn bào và cơ quan miễn dịch (lá lách, tuyến ức) của chuột suy giảm miễn dịch ở liều lượng thử nghiệm Tuy nhiên, với liều thử nghiệm 200mg/kg lại có tác dụng cải thiện hoạt động tế bào killer tự nhiên [14]

Cũng trong năm 2010, nhóm tác giả đến từ Khoa Sinh học, trường đại học R.D, Jabalpur đã tiến hành chiết bột nấm Linh chi trong thiết bị soxhlet lần lượt với các dung môi ethanol, methanol, axeton và nước cất theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

là 1/10 Dịch chiết được thu hồi bằng phương pháp lọc và đảm bảo duy trì ở nhiệt

độ 400C để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo Sau đó, dịch chiết được cô đuổi dung môi trong thiết bị cô quay chân không Buchi R - 300 Rotavapor, Buchi Co Germany.Tiếp theo, các cao chiết Ganoderma lucidum của 4 loại dung môi (40Pg / ml) được thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch đối với sáu loài vi

khuẩn: Escherichia coli (MTCC-443), Staphylococcus aureus (MTCC-737),

Klebsiella pneumoniae (MTCC2405), Bacillus subtilis (MTCC-1789), Salmonella typhi (MTCC-531) và Pseudomonas aeruginosa (MTCC-779) Kết quả cho thấy cao

chiết axeton thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng

khuẩn là 31,60 ± 0,10 mm, trong khi vi khuẩn nhạy cảm nhất quan sát được là

Klebsiella pneumoniae (một loại vi khuẩn gây bệnh viêm phổi) [15]

Sau đó một năm, năm 2011, nhóm tác giả người Serbia, gồm Maja Kozarski và

cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxi hóa của cao chiết nước polysaccharide từ 4

loại nấm dược liệu Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis, Ganoderma lucidum và

Phellinus linteus Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp FT-IR và bằng các bộ kit

Megazyme β-glucan để xác định hàm lượng α và β-glucans Từ đó nhận thấy rằng có

sự tương quan giữa hàm lượng glucan với hoạt tính kháng oxi hóa Đối với cao chiết

polysaccharide của A bisporus giá trị EC50 > 20 mg/ml, với A brasiliensis

EC50 = 13,25 mg/ml và thấp nhất đối với G lucidum EC50 = 7,07 mg/ml Kết quả của

nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất polysaccharide nấm dược liệu hoạt động như

chất chống oxy hóa tự nhiên và có đặc tính điều hòa miễn dịch Chất chiết xuất từ

polysaccharide có thể là nguồn tốt cho sự phát triển của phụ gia thực phẩm chống oxy

hóa Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn thử nghiệm in vitro về khả năng điều hòa miễn

dịch của các cao chiết polysaccharide từ các giống nấm này và nhận thấy các

polysaccharide chiết xuất từ A bisporus, A brasiliensis và G lucidum thể hiện tác

dụng kích thích miễn dịch trên PBMCs hoạt hóa của con người và gây tổng hợp IFN-γ

[19]

Năm 2014, Min Shi đã chiết xuất polysaccharide từ nấm Linh chi trồng trên bã

đậu nành bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm Các điều kiện chiết tối ưu được

công bố là thời gian chiết 30 phút ở 800C với cường độ siêu âm là 80W và tỷ lệ

nguyên liệu/dung môi là 1/10 cho năng suất thu polysaccharide là 115,47 ± 2,95 mg

Các kết quả được công bố còn cho thấy polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi có

khả năng điều hòa miễn dịch bao gồm hiệu ứng kích thích sự gia tăng của đại thực

bào, sản xuất NO, thực bào và bảo vệ chống lại sự can thiệp DNA của DOX [16]

Mới đây nhất, vào năm 2017, nhóm nghiên cứu người Malaysia, đứng đầu là

Ibrahim Alzorqi đã tối ưu hóa hiệu suất chiết polysaccharides từ Ganoderma lucidum

bằng dung môi nước sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt (RSM) Nhóm nghiên cứu

đã sử dụng mô hình Box – Behnken (BBD) để đánh giá ảnh hưởng của các biến khảo

sát lên hiệu quả chiết polysaccharides Các thông số được xem xét để tối ưu hóa điều

kiện chiết là cường độ siêu âm (500–700 W), thời gian siêu âm (45–65 phút) và nhiệt

độ (70–90°C) Nhóm nghiên cứu đã đưa ra điều kiện tối ưu để chiết tách polysaccharide về cường độ siêu âm 590 W, thời gian siêu âm là 58 phút và nhiệt độ

81 ° C Dựa theo các điều kiện tối ưu này, lượng polysaccharide thu được từ nấm Linh chi là 52,28mg Nhóm tác giả còn kết luận rằng các kết quả thu được cho thấy sự phù hợp của mô hình bậc hai trong việc tối ưu hóa các điều kiện chiết polysaccharides từ

Ganoderma lucidum [13]

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Trong nước, hướng nghiên cứu chiết tách cũng như xác định hoạt tính sinh học của nấm Linh chi cũng có những công trình nổi bật

Năm 2009, Nguyễn Thị Minh Tú và cộng sự đã tối ưu hóa quá trình chiết các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi bằng mô hình quy hoạch trực giao cấp một thu được phương trình hồi quy: y = 6,59 + 0,65x1 + 0,07x2 – 0,16x3 Hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại tại nhiệt độ chiết 800C, thời gian chiết 7h, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

là 1/20 và hàm lượng cao chiết thu hồi là 6,91  0,03% Tiếp đó, nhóm nghiên cứu còn đưa ra kết quả xác định một số thành phần hóa học của nấm Linh chi như hàm lượng protein (13,5 %), hàm lượng carbohydrate (22,6%) [9]

Năm 2012, Trần Thị Văn Thi và cộng sự đã chiết xuất cao polysaccharide toàn

phần từ mẫu dược liệu nấm Linh chi Ganoderma lucidum trồng tại Phú Lương, tỉnh

Thừa Thiên Huế Định lượng polysaccharide toàn phần bằng phương pháp Dubois –

đo mật độ quang dựa trên phản ứng tạo màu với phenol – acid sulfuric dùng Glucose làm chất chuẩn Nhóm nghiên cứu đã xác định được hàm lượng cao polysaccharid toàn phần là 4,57 ± 0,18 % (P = 0,95; n =3) so với dược liệu khô tuyệt đối. Ở liều thử nghiệm tương đương 94,45 gam cao/kg thể trọng chuột, cao polysaccharide không thể hiện độc tính cấp Cao chiết này có tác dụng bảo vệ gan tốt với khả năng ức chế lần lượt 55,78%, 51,72% và 7,07% sự tăng hoạt độ men ALT, AST và bilirubin toàn phần trong huyết thanh [11]

D-Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà cùng các cộng sự, năm 2013, cho thấy cao chiết methanol và các phân đoạn n – hexan, dicloromethan, cũng các hợp chất phân lập từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxide và ganodermanontriol) có tác dụng bảo

vệ gan in vivo và in vitro liên quan đến sự kích hoạt enzyme HO – 1 và hợp chất

ganodermanontriol thể hiện tác dụng kích hoạt protein HO – 1 thông qua sự kích hoạt

yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào NRF – 2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và p38, làm tăng cường mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại t – BHP.s

Từ việc tổng quan tài liệu cho thấy, nấm Linh chi có nhiều tác dụng dược lí tuyệt vời Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, tình hình nghiên cứu về nấm Linh chi chủ yếu chỉ tập trung vào hướng khảo sát các điều kiện nuôi trồng tạo quả thể nấm, các nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi còn ít được công bố Đặc biệt hơn cả là chưa có nghiên cứu nào so sánh về hoạt tính sinh học của hai loại nấm Linh chi giống Nhật và giống Hàn, là hai chủng nấm đang được ưa chuộng trên thị trường Việt Nam hiện nay Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục đích khảo sát các điều kiện chiết tách và so sánh hoạt tính sinh học của hai loại nấm Linh chi giống Nhật và giống Hàn Từ đó, cung cấp thêm thông tin cho người sử dụng các thông tin khoa học hữu ích để lựa chọn sản phẩm phù hợp

Bên cạnh đó, một số sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mĩ phẩm… từ nấm Linh chi đang rất được ưa chuộng và chiếm ưu thế trên thị trường do có nhiều tính ưu việt về hoạt tính sinh học, dễ bảo quản, tính an toàn thực phẩm cao, tiện lợi cho người sử dụng Một số sản phẩm tiêu biểu phải kể đến như chiết xuất nấm Linh chi kết Hình 1.2 Quả thể nấm Linh chi Hình 1.3 Bột nấm Linh chi

hợp với Đông trùng hạ thảo, trà Linh chi gạo lứt với tác dụng làm đẹp da, giảm cân; nước uống Linh chi mật ong, viên uống có thành phần chính là các hoạt chất chiết xuất

từ nấm Linh chi hay các mĩ phẩm làm đẹp da, sáng da, trị mụn có bổ sung thành phần hoạt chất từ nấm Linh chi…

Hình 1.7 Trà Linh chi gạo lứt

Hình 1.4 Nước uống Linh chi

Ngoài ra, trên thị trường hiện nay còn có một số sản phẩm mới lạ như café Linh chi, được quảng cáo với công dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý mạch vành và ung thư; làm giảm nguy cơ đông máu và tắc nghẽn mạch máu Hay một số sản phẩm gia vị có bổ sung hoạt chất từ Linh chi như sản phẩm hạt nêm Linh chi của công ty Cổ phần sản xuất thương mại Dona

Hình 1.10 Cafe Linh chi Hình 1.11 Hạt nêm Linh chi

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Với các mục tiêu của đề tài đề ra, chúng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Để thực hiện đề tài theo các bước của sơ đồ ở hình 2.1, cần sử dụng các vật liệu

và phương pháp nghiên cứu sau:

Quả thể nấm Linh chi

- Chọn phương pháp chiết

- Chọn dung môi chiết

- Thời gian

- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

- Cường độ siêu âm

Cao chiết

Ứng dụng

làm kẹo Linh chi

Khảo sát hoạt tính sinh học

Quả thể nấm Linh chi

Khảo sát đặc điểm nguyên liệu

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu

a Quả thể nấm Linh chi

Nguyên liệu sử dụng là quả thể nấm Linh chi giống Hàn và giống Nhật Quả thể nấm Linh chi giống Hàn được thu hái tại xã Vĩnh Ngọc, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Quả thể nấm Linh chi giống Nhật được thu hái tại Lấp Vò, Đồng Tháp

Cả hai loại quả thể nấm đều được thu hái vào đầu tháng 4 trong điều kiện khô ráo, không bị sâu bệnh

Sau thu hái, quả thể nấm Linh chi được sấy khô ở 500C, nghiền thành bột mịn và cho vào lọ có túi hút ẩm, bảo quản ở nhiệt độ phòng Nguyên liệu được sử dụng cho toàn bộ các thí nghiệm trong đề tài này

b Chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật sử dụng gồm 4 chủng vi khuẩn đã được định danh, cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học, khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, Khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Đà Nẵng và Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo

lường Chất lượng 2 gồm: Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus,

Rượu 400 được lấy tại lò nấu rượu đường Lê Trọng Tấn, Đà Nẵng

Sử dụng các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm được mua từ công ty Merck – Đức

và một số từ Trung Quốc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu

Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo Phụ lục 9.6, Dược điển Việt Nam V [3]

Nguyên tắc: Sấy mẫu ở áp suất không khí, nhiệt độ sấy theo quy định và cân đến

khối lượng không đổi

Cách tiến hành:

- Sấy khô cốc cân trong 30 phút trong tủ sấy ở 1030C

- Để cốc cân trong bình hút ẩm nguội đến nhiệt độ phòng và cân chính xác đến 0,001 gam

- Lặp lại các quá trình trên cho đến khi chênh lệch giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001 gam

- Cân m gam (chính xác đến 0,001 gam) mẫu thử đã được chuẩn bị vào cốc cân

đã biết trước khối lượng

- Dùng đũa thủy tinh trộn đều mẫu thử và dàn thành lớp mỏng (nếu cần) Đặt tất

cả vào tủ sấy và sấy ở nhiệt độ 1050C

- Sau thời gian sấy, đậy nắp cốc cân lại, lấy ra khỏi tủ sấy, để nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,001 gam

- Lặp lại quá trình như trên (nhưng với thời gian sấy theo quy định) cho đến khi chênh lệch kết quả giữa 2 lần cân liên tiếp không quá 0,001 gam

m0: Khối lượng của cốc cân (g)

m1: Khối lượng của cốc cân và mẫu thử trước khi sấy (g)

m2: Khối lượng của cốc cân và mẫu thử sau khi sấy (g)

Kết quả được làm tròn và lấy chính xác đến 0,01

Chênh lệch kết quả giữa hai lần xác định đồng thời không quá 0,2%

2.2.2 Xác định thành phần một số kim loại nặng

Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử theo AOAC 999.11

Nguyên tắc: Mẫu được sấy và tro hóa ở 4500C với tốc độ gia nhiệt là 500C/giờ Thêm HCl 1-1 vào tro và làm bay hơi đến khô Cặn được hòa tan trong HNO3 0,1M Sau đó xác định hàm lượng kim loại bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử

Cách tiến hành:

Hóa hơi mẫu phân tích đưa về trạng thái khí Mục đích của quá trình này là tạo ra được đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phân tích Có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọn lửa hoặc kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan

trọng nhất và có ảnh hưởng đến phép đo AAS

Chọn nguồn tia sáng đơn sắc có bước sóng phù hợp với nguyên tố cần phân tích, chiếu chùm tia sáng đơn sắc đó vào đám hơi của nguyên tố cần phân tích

Thu toàn bộ chùm tia sáng sau khi qua môi trường hấp thụ, phân li chúng thành phổ và chọn vạch phổ cần đo của nguyên tố cần phân tích vào khe đó để đo cường độ của chúng

Ghi nhận tín hiệu và đo kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị thích hợp

Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

2.2.3 Phương pháp Kjeldahl

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số - phương pháp Kjeldahl [8]

Nguyên tắc: Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là

nitơ tổng số Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid

tự do, các peptide, urê và các dẫn xuất của urê, các alkaloid, các purin và pyrimidin…là các nitơ phi protein

Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein

2.2.4 Xác định hàm lượng cacbon tổng số

Phương pháp Walkley-Black [8]

Đầu dò (PMT)

Hệ thống xử

lý tín hiệu

Bộ đơn sắc

Hệ thống quang học

Nguồn

sáng đơn

sắc

Hệ thống nguyên tử hóa

Nguyên tắc: Oxy hoá cacbon hữu cơ bằng dung dịch kali đicromat dư trong môi

trường axit sunfuric, sử dụng nhiệt do quá trình hoà tan axit sunfuric đậm đặc vào dung dịch đicromat, sau đó chuẩn độ lượng dư bicromat bằng dung dịch sắt (II), từ đó suy ra hàm lượng cacbonhữu cơ

Cách tiến hành:

- Cân khoảng 0,1 g đến 0,2 g mẫu (chính xác đến 0,0001 g) cho vào bình tam

giác chịu nhiệt dung tích 250 ml

- Thêm 20,0 ml dung dịch tiêu chuẩn K2Cr2O7 M/6

- Thêm nhanh 40 ml H2SO4 đậm đặc từ ống đong, lắc nhẹ, trộn đều

- Đặt lên tấm cách nhiệt, để yên trong thời gian 30 min

- Thêm 100 ml nước cất và 10 ml H3PO4 85%, để nguội đến nhiệt độ trong phòng

- Tiến hành đồng thời 2 mẫu trắng, cùng cách chuẩn bị như mẫu thử

- Trường hợp mẫu sau oxy hóa có màu xanh cần phải làm lại, cân lượng ít hơn hoặc tăng thêm lượng K2Cr2O7

- Thêm 0,5 ml chỉ thị màu và chuẩn độ lượng dư K2Cr2O7 M/6 bằng dung dịch muối Mohr 0,5 M tới màu của dung dịch thay đổi Chú ý, tại gần điểm kết thúc chuyển màu, phải nhỏ từ từ từng giọt dung dịch chuẩn và lắc đều cho đến khi chuyển màu đột ngột, nếu chuẩn độ quá dư, cho thêm 0,5 ml dung dịch K2Cr2O7 M/6 và tiếp tục chuẩn

độ một cách thận trọng, cộng thêm thể tích dung dịch K2Cr2O7 M/6 thêm vào thể tích dung dịch K2Cr2O7 M/6 đã sử dụng

a Thể tích dung dịch muối Mohr chuẩn độ mẫu trắng tính bằng mililit (ml);

b Thể tích dung dịch muối Mohr chuẩn độ mẫu thử tính bằng mililit (ml);

m Khối lượng mẫu cân để xác định tính bằng gam (g);

3 Đương lượng gam của cacbon tính bằng gam (g);

100/75 Hệ số quy đổi (do phương pháp này có khả năng oxy hóa 75% tổng

lượng cacbon hữu cơ)

2.2.5 Xác định hàm lượng polysaccharide toàn phần

Hàm lượng polysaccharide tổng được xác định bằng phương pháp

phenol-sunfuric[12]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành monosaccharide

Trong môi trường axit nóng, glucozơ bị dehydrat hóa thành hydroxymethyl furfural

Hợp chất này tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước

sóng  = 490nm [12]

Cách tiến hành:

- Xây dựng đường chuẩn glucozơ:

+ Pha phenol 5%: Cân 5 gam phenol hòa tan bằng nước cất trong bình định

mức 100ml

+ Cân 1 gam D-glucose hòa tan trong bình định mức 1 lít bằng nước cất Ta có

dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000 ppm)

+ Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,1 mg/ml,

0,15 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,3 mg/ml

+ Lấy 5ml nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10 ml

+ Thêm 1 ml phenol 5% vào tất cả các lọ chuẩn, sau đó thêm 5ml dung dịch

H2SO4 đậm đặc và đun nóng ở 900C

+ Để yên hỗn hợp trong 30 phút và tiến hành đo màu tại bước sóng

 = 490nm

- Chuẩn bị các mẫu phân tích:

+ Lấy 1ml dịch chiết pha loãng 10 lần

+ Trộn đều dịch mẫu với 1 ml phenol 5%

+ Hỗn hợp được bổ sung 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và đun nóng ở 900C

+ Thực hiện tương tự như phần chuẩn bị mẫu phân tích nhưng thay 1ml dịch chiết bằng 1ml dung dịch rượu

X: Hàm lượng polysaccharide tính theo đường chuẩn glucozơ (mg/ml)

m: Khối lượng mẫu ban đầu (gam)

Hệ số pha loãng là 10 Bảng 2.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn D-Glucose

Nồng độ dung dịch D-Glucose Mật độ quang

Như vậy, từ kết quả ở bảng 2.1 xây dựng được đường chuẩn của dung dịch Glucose là y = 3,619x – 0,001 Kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

D-2.2.6 Lựa chọn phương pháp xử lý nguyên liệu

Quả thể cả hai giống nấm Linh chi được xử lý theo hai phương thức:

- Phương thức 1: cắt thành lát với độ dày lát cắt dao động từ 5 – 10mm

a Phương pháp chiết Soxhlet

Nguyên tắc: Dược liệu được cho vào túi vải rồi đặt vào ngăn chiết Dung môi

được cho vào bình cầu và đun hồi lưu Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông xuống bình cầu bên dưới mang theo các chất hòa tan từ dược liệu Ở bình cầu, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên

Hình 2.3 Đường chuẩn dung dịch D-Glucose

được ngưng tụ xuống ngăn chiết và đi qua túi bột dược liệu để hòa tan các chất còn lại

Cứ như vậy đến khi dược liệu được chiết kiệt

Cách tiến hành:

- Cân 10 gam bột linh chi

- Gói trong túi vải và cho vào hệ thống chiết Soxhlet

- Thêm vào bình cầu 200 ml rượu 400, chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 6 giờ (màu dịch chiết nhạt đi)

- Thu dịch chiết đem cô quay chân không ta được cao chiết thô

b Phương pháp ngâm chiết kết hợp rung siêu âm

Nguyên tắc: Siêu âm là một dạng sóng điện từ cao tần (lớn hơn 20 kHz) Phần

lớn năng lượng của siêu âm chuyển thành cơ năng (làm rung) Dưới tác dụng của siêu

âm, cấu trúc tế bào bị phá vỡ, dung môi tại nơi tiếp xúc với bột dược liệu bị sủi bọt, đẩy nhanh quá trình hòa tan các chất trong dung môi

Cách tiến hành:

- Cân 10 gam bột linh chi

- Chiết trên hệ thống rung siêu âm ở mức 15 trong thời gian 2 giờ với tổng lượng dung môi sử dụng là 200 ml rượu (chia làm 2 lần, mỗi lần siêu âm với 100 ml rượu) Sau mỗi lần chiết, thu dịch chiết bằng hệ thống bơm hút chân không)

- Các dịch chiết thu được qua 2 lần chiết được gộp lại đem cô quay chân không ta được cao chiết thô

2.2.8 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng

a Khảo sát ảnh hưởng của thời gian

Tiến hành chiết khoảng 10 gam bột dược liệu trong 200 ml rượu 400 với thời gian chiết là 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút Đo giá trị mật độ quang và xác định hàm lượng polysaccharide tổng theo phương pháp phenol – sunfuric của Dubois, 1956 Phân tích, lựa chọn thời gian chiết thích hợp

b Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi

Tiến hành chiết khoảng 10 gam bột dược liệu trong thời gian chiết thích hợp (đã khảo sát) với dung môi rượu 400 có thể tích thay đổi lần lượt là 100ml, 150ml, 200ml, 250ml Đo giá trị mật độ quang và xác định hàm lượng polysaccharide tổng theo

phương pháp phenol – sunfuric của Dubois, 1956 Phân tích, lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp

c Khảo sát ảnh hưởng của cường độ siêu âm

Tiến hành chiết khoảng 10 gam bột liệu trong thời gian chiết thích hợp với dung môi rượu 400, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp, ở các cường độ siêu âm lần lượt là mức 5, mức 10, mức 15, mức 20 Đo giá trị mật độ quang và xác định hàm lượng polysaccharide tổng theo phương pháp phenol – sunfuric của Dubois, 1956 Phân tích, lựa chọn cường độ siêu âm thích hợp

2.2.9 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp khoanh giấy lọc [13] [15]

Nguyên tắc: Dịch chiết khuếch tán vào môi trường thạch có chứa vi sinh vật

kiểm định tạo vòng ức chế sự phát triển của VSV Đo độ lớn vòng ức chế của dịch chiết và dịch đối chứng để xác định khả năng kháng VSV của dịch chiết

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị đĩa thạch nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường được chuẩn bị để nuôi cấy vi khuẩn là môi trường LB có bổ sung agar Đĩa thạch được tạo sau khi môi trường được đem khử trùng và cấy trải 4 loài vi

khuẩn Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus

+ Mẫu đối chứng âm: dung dịch DMSO 2%

+ Mẫu đối chứng dương: Ampicillin 5g/ml

+ Kết quả được theo dõi ít nhất sau 24 giờ nuôi ủ tại nhiệt độ 370C bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Tính kết quả: Hoạt tính ức chế vi khuẩn được đánh giá bằng cách đo đường kính

vòng ức chế VSV bằng công thức:

ĐK (mm) = D – d Trong đó: D: đường kính vòng vô khuẩn

d: đường kính khoanh giấy thấm

2.2.10 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa

Phương pháp DPPH [15]

Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được

dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH, được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng  = 517 nm

Cách tiến hành: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 500M trong ethanol Chất thử được pha trong ethanol tuyệt đối sao cho nồng độ cuối đạt được một dãy các nồng độ mong muốn Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng ở bước sóng  = 517 nm Acid ascorbic được sử dụng làm chất đối chiếu

Tính kết quả: Phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức:

As là giá trị mật độ quang của mẫu thử

2.2.11 Phương pháp cảm quan

Sử dụng phép điều tra thị hiếu, phép thử này cho phép xác định thái độ của người

sử dụng đối với một số sản phẩm nhất định

Nguyên tắc: người thử sẽ được mời nếm thử sản phẩm nhưng thay vào việc đánh

giá cường độ một tính chất cảm quan nào đó họ sẽ “đo” mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với sản phẩm bằng thang điểm đã được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả cấp độ ưa thích, hài lòng Thông thường theo thang điểm 9 []

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu được xử lý bằng các phần mềm

có sẵn trong thiết bị UV-VIS

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn…

Sử dụng phương pháp làm tròn số

2.2.13 Quy trình sản xuất kẹo Linh chi

Kẹo cứng Linh chi được sản xuất theo quy trình như trình bày ở hình

Thuyết minh quy trình:

- Chuẩn bị nguyên liệu

+ Cân nguyên liệu

+ Nước, đường, mật hoàđều

- Nấu kẹo

+ Bắt nồi lên bếp, nấu ở 120-123oC

+ Thử kẹo bằng nước lạnh nhiều lần đến khi đạt yêu cầu

- Phối trộn

+ Cho hương và acid citric trộn đều đồng nhất

+ Cho chất màu trộn đều

- Rót khuôn, làm nguội

Nước, Mật tinh bột

Đường saccharose

Lọc, loại tạp chất

+ Rót kẹo vào khuôn và làm nguội nhanh khối kẹo

- Bao gói, đóng bao

+ Tháo kẹo khỏi khuôn

+ Loại bỏ kẹo thừa

+ Bọc kẹo trong giấy

Nhận xét:

Kết quả độ ẩm của Linh chi giống Hàn là 11,45%, của Linh chi giống Nhật độ

ẩm có giá trị thấp hơn ở vào 9,8% Như vậy, cả hai mẫu nấm Linh chi đều có độ ẩm