Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng (tóm tắt + toàn văn)

Bộ khoa học và công nghệ chương trình KH&CN Biển phục vụ phát triển bền vững kinh tế-xã hội, mã số kc.09/06-10 Báo cáo tóm tắt đề tài “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh họ

Bộ khoa học và công nghệ chương trình KH&CN Biển phục vụ phát triển bền vững

kinh tế-xã hội, mã số kc.09/06-10

Báo cáo tóm tắt đề tài “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh

học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào

và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các

sản phẩm có giá trị dược dụng”

Mã số: KC.09.09/06-10

Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Châu Văn Minh

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội, 5 năm 2009

Bộ khoa học và công nghệ chương trình KH&CN Biển phục vụ phát triển bền vững

kinh tế-xã hội, mã số kc.09/06-10

Báo cáo tóm tắt đề tài “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh

học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào

và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các

sản phẩm có giá trị dược dụng”

Mã số: KC.09.09/06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Châu Văn Minh - Chủ nhiệm đề tài

Phan Văn Kiệm - Thư ký đề tài, Lê Mai Hương, Phạm Quốc Long, Hoàng Thanh Hương, Nguyễn Minh Hà, Đỗ Công Thung, Tống Kim Thuần, Nguyễn Huy Nam, Trương Hương Lan, Đặng Diễm Hồng, Đoàn Thái Hưng

Thông tin tóm tắt về đề tài 1.Tên và mã số đề tài:

“Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng”

Thuộc chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC09/06-10: Khoa học và Công nghệ Biển phục vụ phát triển bền vững kinh tế xã hội

Mã số: KC09.09/06-10

Thời gian thực hiện: 1/2006-12/2008

2 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

18 Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà Nội

Điện thoại: 04-8360830; Fax: 04-7564390

Cơ quan phối hợp chính: Viện Tài nguyên và Môi trường biển Hải Phòng, Viện Y

học cổ truyền Quân đội, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghiệp Thực phẩm, Công ty Dược phẩm Đông Dương

3 Chủ nhiệm Đề tài: GS TS Châu Văn Minh

Địa chỉ: Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Điện thoại: 04-8363375; Fax: 04- 7564390 Email: cvminh@vast.ac.vn

Thư kí khoa học: TS Phan Văn Kiệm

Địa chỉ: Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Điện thoại: 04-7562378; Fax: 04- 7564390 Email: phankiem@vast.ac.vn

4 Mục tiêu của đề tài:

4.1 Xây dựng được danh mục sinh vật biển có chất kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hoá

4.2 Xây dựng được qui trình công nghệ tách chiết các chất có hoạt tính sinh học

và tạo ra một số sản phẩm có giá trị dược dụng

4.3 Đào tạo cán bộ trong lĩnh vực Hợp chất thiên nhiên biển, một lĩnh vực còn rất mới mẻ ở Việt nam

4.4 Phối hợp với các cơ quan liên quan để đưa vào ứng dụng thực tế

5 Những nội dung chính của đề tài:

5.1 Thu thập mẫu, phân loại sinh vật biển, xác định tên phân loại, tạo tiêu bản, xây dựng cơ sở dữ liệu về nguồn dược liệu biển Việt Nam

5.2 Sàng lọc hoạt tính sinh học các mẫu sinh vật biển theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống ôxy hoá

5.3 Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của một số loài sinh vật biển được lựa chọn thông qua quá trình sàng lọc

5.4 Nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ rong - tảo và khả năng sinh các chất

có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển

5.5 Xây dựng quy trình công nghệ tạo chế phẩm, xây dựng và thẩm định tiêu chuẩn cơ sở, tiến hành các nghiên cứu về dược lý và đăng ký tiêu chuẩn sản phẩm và giấy phép lưu hành của Bộ Y tế cho 04 chế phẩm: CEFISH, BIONAMINE, HALIOTIS và HASAMIN

Danh sách những người thực hiện

A Tác giả chính

1 GS TS Châu Văn Minh Chủ nhiệm đề tài

2 TS Phan Văn Kiệm Thư ký đề tài

3 PGS TS Lê Mai Hương Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

4 PGS TS Phạm Quốc Long Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

5 PGS TS Hoàng Thanh Hương Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

6 TS Nguyễn Minh Hà Viện Y học Cổ truyền quân đội

7 TS Đỗ Công Thung Viện Tài nguyên và Môi trường Biển

8 PGS TS Tống Kim Thuần Viện Công nghệ Sinh học

9 ThS Nguyễn Huy Nam Viện Công nghệ Sinh học

10 TS Trương Hương Lan Viện Công nghiệp thực phẩm

11 TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ Sinh học

12 ThS Đoàn Thái Hưng Công ty Dược Đông Dương

B Những người tham gia

1 TS Lưu Văn Chính Viện HCTN 27 BS Phạm Thị Dung BVĐK Hà Tây

2 TS Nguyễn Tiến Đạt Viện HCTN 28 TS Lê Văn Ty Viện CNSH

3 NCS Nguyễn Hoài Nam Viện HCTN 29 CN Võ Thị Ninh Viện CNSH

4 NCS Đoàn Lan Phương Viện HCTN 30 PGS TS Vũ Mạnh Hùng Học viện QY

5 NCS Trần Thị Như Hằng Viện HCTN 31 GS TS Lê Quý Phượng Viện KHTDTT

6 ThS Trần Hồng Quang Viện HCTN 32 CN Đặng Trần Hoàn Viện KHTDTT

7 ThS Trịnh Thu Hương Viện HCTN 33 BS Ngô Đức Nhuận Viện KHTDTT

8 TS Lê Minh Hà Viện HCTN 34 DS Nguyễn Văn Chung Công ty

INTECPHARM

9 ThS Nguyễn Xuân Cường Viện HCTN 35 TS Nguyễn Văn Xá TT GD&PT Sắc ký

10 CN Nguyễn Phương Thảo Viện HCTN 36 ThS Hoàng T Minh Hiền Viện CNSH

11 CN Trần Hồng Hạnh Viện HCTN 37 ThS Hoàng Thị Lan Anh Viện CNSH

12 NCS Nguyễn Hồng Vân Viện HCTN 38 CN Hoàng Sỹ Nam Viện CNSH

13 ThS Nguyễn Hải Đăng Viện HCTN 39 CN Nguyễn T Minh

16 ThS Mai Ngọc Toàn Viện HCTN 42 ThS Nguyễn Thị Vân Anh Đại học Y HN

17 NCS Phạm Hải Yến Viện HCTN 43 TS Nguyễn Công Thực Viện YHCT

18 CN Phan T Thanh Hương Viện HCTN 44 ThS Nguyễn Văn Lĩnh Viện YHCT

19 CN Trần Anh Tuấn Viện HCTN 45 NCS Nguyễn Đăng Ngải Viện TN&MT Biển

20 NCS Trần Thu Hà Viện HCTN 46 NCS Trần Mạnh Hà Viện TN&MT Biển

21 ThS Nguyễn T Kim Thúy Viện HCTN 47 CN Nguyễn Thế Hoàng Viện TN&MT Biển

22 Ths Lại Quốc Phong Viện CNTP 48 CN Lê Thị Thúy Viện TN&MT Biển

23 KS Dương Văn Đồng Viện CNTP 49 NCS Nguyễn Văn Quân Viện TN&MT Biển

24 ThS Trần T Minh Hà Viện CNTP 50 CN Vũ Thị Lựu Viện TN&MT Biển

25 CN Phạm Linh Khoa Viện CNTP 51 TS Đàm Đức Tiến Viện TN&MT Biển

26 KS Nguyễn Thị Làn Viện CNTP 52 ThS Chu Thế Cường Viện TN&MT Biển

Tóm tắt báo cáo

Bố cục của báo cáo được trình bày như sau:

Mở đầu

Phần I Tổng quan, mô hình và phương pháp nghiên cứu

I Tổng quan về dược liệu biển

II Mô hình nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

Phần II Kết quả nghiên cứu

A Thu thập mẫu và sàng lọc hoạt tính sinh học

Chương I Thu thập, định loại mẫu SVB và xây dựng cơ sở dữ liệu

Chương II Xử lý mẫu, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học

B Nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học Chương III Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học của một số

loài san hô mềm Chương IV Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học của một số

loài da gai Chương V Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học của một số

loài hải miên Chương VI Tổng hợp các chất phân lập được trong khuôn khổ đề tài

C Các nghiên cứu về rong, tảo và vi sinh vật biển

Chương VII Nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ rong và tảo biển Việt

Nam Chương VIII Nghiên cứu thăm dò khả năng sinh các chất có HTSH từ vi sinh vật

biển

D Các nghiên cứu ứng dụng sản xuất các sản phẩm

Chương IX Nghiên cứu công nghệ sản xuất thức ăn chức năng bổ sung Omega 3

phòng và hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch

Chương X Nghiên cứu quy trình sản xuất thực phẩm chức năng tăng cường thể lực

cho vận động viên từ sao biển Chương XI Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng bồi bổ cơ thể của viên nang

HALIOTIS từ bào ngư

Chương XII Nghiên cứu công nghệ sản xuất viên nang mềm hải sâm HASAMIN

Phần III Kết luận và kiến nghị chung

Nội dung chính của toàn bộ báo cáo được tóm tắt như sau:

Phần I Tổng quan, mô hình và phương pháp nghiên cứu

I Tổng quan về dược liệu biển

Phần tổng quan được trình bày trong báo cáo gồm các mục sau:

I.1 Tổng quan chung tình hình nghiên cứu trên thế giới

1 Lược sử hình thành, phát triển và các hướng nghiên cứu hoạt chất sinh học biển hiện nay

Mục này trình bày một cách tóm tắt sự hình thành và phát triển của nghiên cứu dược liệu biển, đồng thời nêu ra một số hướng nghiên cứu hoạt chất sinh học biển hiện nay trên thế giới Trong đó, hướng sàng lọc theo định hướng hoạt tính sinh học được

đánh giá là một bước tiến trong việc nghiên cứu, phát triển các dược phẩm mới đã và

đang được nhiều trung tâm trên thế giới sử dụng như là một trong những công cụ hàng

đầu để phát hiện ra các dược tố mới

2 Các hợp chất thiên nhiên biển và hoạt tính sinh học từ các loài hải miên, da gai và san hô mềm

Mục này trình bày một cách tổng quát về các hoạt chất được phân lập từ hải miên,

da gai và san hô mềm có hoạt tính đặc biệt hấp dẫn hoặc đang được tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng theo các hướng: kháng viêm, chống ung thư, kháng vi

rút, kháng sinh, kháng nấm Điển hình như: Contignasterol được phân lập từ hải miên

Petrosia congignata thể hiện hoạt tính kháng viêm rất cao hoạt động theo cơ chế kìm

hãm sự giải phóng histamine từ các bạch cầu, các dẫn xuất tổng hợp của nó đang được

tiến hành nghiên cứu lâm sàng pha II điều trị bệnh hen Các hợp chất sarcodictyin phân

lập từ loài san hô mềm Sarcodictyon roseum hiện đang là những ứng viên nặng ký cho

nghiên cứu tạo thuốc trị ung thư Hàng ngàn hợp chất khác đã và đang được nghiên cứu, phát triển ở các Viện nghiên cứu và Bệnh viện trên toàn thế giới

3 Khả năng khai thác nguồn dược liệu biển, cơ hội và thách thức

Triển vọng và thách thức trong việc nghiên cứu các hoạt chất từ sinh vật biển được trình bày vắn tắt trong mục này Với ưu thế về cấu trúc hóa học độc đáo, đa dạng và thể hiện nhiều hoạt tính quý báu, các hợp chất thiên nhiên biển có nhiều tiềm năng để nghiên cứu và phát triển các dược phẩm mới Tuy nhiên cũng có không ít trở ngại như:

sự khó khăn trong công tác lấy mẫu, khả năng thu mẫu lượng lớn Các hoạt chất từ sinh vật biển thường có hàm lượng thấp do đó để thu được lượng chất đủ để sản xuất thuốc sẽ cần một lượng nguyên liệu khổng lồ, ví dụ để thu được 1 gam ET-743 thì phải

cần tới 1 tấn E turbunata

4 Phương hướng nghiên cứu sàng lọc hoạt tính từ nguồn dược liệu biển trên thế giới

Mục này đưa ra các phương hướng nghiên cứu sàng lọc hoạt tính từ nguồn dược liệu đang được sử dụng trên thế giới

I.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước

Mục này trình bày một cách tóm tắt và hệ thống các nghiên cứu trong nước về các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu biển như: sàng lọc hoạt tính sinh học, nghiên cứu hóa học theo định hướng HTSH và nghiên cứu chế tạo sản phẩm

II Mô hình nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu

II.1 Lựa chọn mô hình nghiên cứu và thiết kế nghiên cứu

II.1.1 Lựa chọn mô hình nghiên cứu

Nghiên cứu về dược liệu biển là một lĩnh vực còn mới mẻ đối với các nhà khoa học trong nước Đề tài đã chọn cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu và các kỹ thuật hiện đại để thực hiện đề tài Cụ thể như sau:

• Cách tiếp cận nghiên cứu của đề tài:

Mô hình nghiên cứu lựa chọn trong đề tài là mô hình nghiên cứu hoá học theo

định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided chemical study) Đây là mô hình nghiên cứu khép kín, từ thực tiễn nghiên cứu đến cơ bản triển khai, tạo sản phẩm cụ thể phục vụ cho cuộc sống bằng con đường ngắn nhất, nâng cao giá trị sử dụng và góp phần bảo vệ nguồn tài nguyên thiên nhiên Sơ đồ tóm tắt các bước tiến hành của mô hình này được trình bày ở sơ đồ1:

Sơ đồ 1: Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính

tính

II.1.2 Thiết kế nghiên cứu

Đây là một đề tài nghiên cứu liên ngành, để giải quyết được các nhiệm vụ đặt ra, chúng tôi đã bàn bạc và xây dựng sơ đồ nghiên cứu như sau:

Cở sở dữ

liệu

Các QT tách chiết, phân lập các chất có HTSH

Sàng lọc hoạt tính Sinh học (Bioassay sceening)

Qui trình sản xuất nguyên liệu

Dây chuyền

thiết bị quy mô

Pilot

Thực phẩm chức năng CEFISH hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch từ Omega 3

Thực phẩm chức năng

HASAMIN tăng cường

sinh lực từ hải sâm

Đăng ký sản phẩm

Thực phẩm chức năng HALIOTIS từ bào ngư

Xây dựng các qui trình NCHH theo

định hướng HTSH

Các thử nghiệm dược lý, độc tính bán trường diễn,

hiệu lực chế phẩm (HASAMIN, BIONAMINE,

Các kết quả nghiên cứu đã

triển khai trong đề tài KC09.15

Sản phẩm thực thực tế phục vụ cuộc sống

• Tổ chức thực hiện

Đề tài KC09.09/06-10 là đề tài nghiên cứu liên ngành (Hoá, Sinh, Y, Dược và Công nghệ), các mảng nghiên cứu gắn kết với nhau và kết quả thực hiện của mỗi nhóm nghiên cứu đều đóng vai trò quan trọng đến kết quả chung của đề tài Vì vậy, ngay từ khi xây dựng đề cương cũng như khi bắt đầu thực hiện đề tài, chúng tôi đã tập trung

được lực lượng cán bộ khoa học và triển khai để xây dựng tiến độ nghiên cứu và nội dung nghiên cứu thống nhất

1) Viện Tài nguyên và Môi trường Biển Hải Phòng

Chịu trách nhiệm thu thập mẫu sinh vật biển, xác định tên, phân loại, tạo tiêu bản mẫu và các thông tin về mẫu Số lượng mẫu, địa điểm thu mẫu, số chuyến khảo sát và các kỹ thuật xử lý sơ bộ, bảo quản mẫu theo yêu cầu của đề tài

2) Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên:

Cơ quan chủ trì đề tài KC09.09/06-10, chịu trách nhiệm chung Các phòng nghiên cứu trong Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên tham gia vào các phần việc chính bao gồm:

Xử lý mẫu sinh vật biển, tạo dịch chiết phục vụ cho sàng lọc hoạt tính sinh học

và nghiên cứu hoá học Xây dựng qui trình xử lý mẫu thống nhất

Sàng lọc hoạt tính sinh học của các mẫu sinh vật biển theo các hướng sau:

• Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity assay)

• Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic activity assay)

• Hoạt tính chống ôxi hoá (Antioxidant activity assay)

Nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học: Tách chiết và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tượng chọn lọc và hướng sử dụng

- Xây dựng qui trình tách chiết tổng hợp các chế phẩm cụ thể phục vụ y tế

- Xây dựng cơ sở dữ liệu về dược liệu biển

3) Viện Y học Cổ truyền Quân đội:

Xây dựng và tiến hành qui trình sản xuất thực phẩm chức năng CEFISH phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tim mạch

II.2 Các phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý số liệu phân tích mẫu và xây dựng cơ sở dữ liệu

II.2.1.1 Phương pháp thu mẫu

Mục này trình bày các phương pháp thu mẫu được áp dụng gồm:

- Theo quy phạm thu thập mẫu sinh vật biển do UBKH KTNN ban hành năm 1981

- Phương pháp thu mẫu sinh vật trong quan trắc và phân tích môi trường biển do Bộ KHCN và

MT ban hành năm 2002

- Phương pháp thu mẫu sinh vật của Winkinson và Baker năm 1998

- Sử dụng phương pháp lặn sâu kết hợp với các thiết bị quay phim chụp ảnh

II.2.1.2 Các loại hoá chất

Mục này trình bày các loại hóa chất được sử dụng để nhuộm màu, định hình và bảo quản lâu dài mẫu tiêu bản

II.2.1.3 Xử lí số liệu và phân tích mẫu

- Tất cả mẫu thu được đều được chụp ảnh trên máy ảnh kĩ thuật số và lưu giữ trong máy

vi tính, sâu đó ngâm trong cồn 70 độ để lưu trữ làm mẫu so sánh sau này

- Mẫu dược gửi đến các chuyên gia trong nước và ngoài nước giám định theo các phương pháp chuyên dụng

- Sử dụng phần mềm visual basic và Microsoft Acess để xây dựng cơ sở dữ liệu về các loài sinh vật chứa dược liệu

- Xây dựng cơ sở dữ liệu về các loài sinh vật chứa dược liệu

II.2.2 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học

Do có những đặc trưng riêng, các mẫu sinh vật biển đòi hỏi phải được bảo quản

và xử lý rất cẩn thận để tránh hư hỏng và mất hoạt tính trong quá trình xử lý Phần này giới thiệu tóm tắt cách thức xây dựng quy trình xử lý, tạo dịch chiết và bảo quản mẫu phục vụ cho sàng lọc hoạt tính sinh học và xây dựng các protocol thống nhất trong đánh giá hoạt tính sinh học Các qui trình và protocol này được tuân thủ trong suốt quá trình thực hiện dự án Nội dung chính gồm:

II.2.2.1 Xử lý mẫu và tạo chiết phẩm phục vụ sàng lọc hoạt tính sinh học

Chi tiết các công đoạn phải được tiến hành để xử lý mẫu, tạo dịch chiết và bảo quản mẫu được trình bày trong mục này Tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình này sẽ

đảm bảo được độ chính xác cao, tránh nhầm lẫn giữa các mẫu hoặc chiết xuất không triệt để các hoạt chất giúp định hướng một cách chính xác cho các nghiên cứu tiếp theo

II.2.2.2 Các phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh học

a) Quy trình đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity assay):

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996), hiện đang được áp dụng tại trường

đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Các chủng vi sinh vật kiểm định

được sử dụng bao gồm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus

- Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.

- Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae

Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên

b) Quy trình đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxic assay):

Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự (1993) tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các HCTN Các dòng tế bào ung thư người được sử dụng là:

- Dòng KB (Human epidemoid carcinoma - Ung thư biểu mô) từ phòng thí

nghiệm Bioassay trường Đại học Dược Illinois- USA

- Dòng Fl (Fibril sarcoma of Uteus - Ung thư màng tử cung)

- Dòng Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma- Ung thư gan) từ Viện VSDT TƯ

c) Quy trình thử hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự do DPPH (DPPH radical scavenging activity)

Thử nghiệm bao vây các gốc tự do tạo ra bởi DPPH picrylhydrazyl) của các chất chiết dựa trên nguyên lý: DPPH có khả năng tạo ra các gốc

(1,1-diphenyl-2-tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá dựa trên giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên

d Đánh giá hoạt tính chống loãng xương thông qua các cơ chế kích thích sự biệt hóa của nguyên bào xương MC3T3-E1

Hoạt tính chống loãng xương được đánh giá bằng ảnh hưởng của mẫu thử đối với

sự sinh trưởng của tế bào, hoạt lực của enzim ALP (Alkaline Phosphatase), hàm lượng collagen và và sự tích tụ canxi đối với tế bào MC3T3-E1, một tiền nguyên bào xương, đã

được chấp nhận rộng rãi làm mô hình in vitro để nghiên cứu sự biệt hóa của nguyên bào

xương tại trường Đại học Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc

e Đánh giá hoạt tính kháng NF-κB

Các thử nghiệm hoạt tính kháng NF-κB được tiến hành theo phương pháp SEAP ASSAY trên dòng tế bào chuẩn RAW264 tại Phòng nghiên cứu ung thư, Viện Sinh học

và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)

II.2.3 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hoá học

Các phương pháp cứu chủ yếu gồm:

- Các phương pháp sắc ký: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC)

- Các phương pháp phổ bao gồm: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR FAB-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

II.2.4 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu thăm dò khả năng kháng viêm từ rong tảo biển Việt Nam

II.2.4.1 Nguyên liệu

a Mẫu rong

Danh sách 22 mẫu rong tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu do cán bộ Phòng Công nghệ Tảo, Viện CNSH và CN Huỳnh Quang Năng, Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang (VAST) thu thập và định tên khoa học Thời gian thu mẫu 2007-

2008 Trong đó, Undaria pinnatifida, Enteromorpha linza là hai loài có hoạt tính kháng

viêm cao do Trường Đại học Quốc gia Pukyong, Hàn Quốc cung cấp được sử dụng làm mẫu thử so sánh với rong biển Việt Nam

Danh sách 22 mẫu rong biển được dùng để tách dịch chiết có hoạt tính kháng viêm

thuỷ sản nước lợ Quý Kim, Hải Phòng

thuỷ sản nước lợ Quý Kim, Hải Phòng

compressa

Nha Trang, Khánh Hoà

II.2.4.2 Phương pháp nghiên cứu

a Quy trình tách chiết dịch có hoạt tính kháng viêm

Dịch chiết có hoạt tính kháng viêm trong các mẫu tảo nghiên cứu được tách chiết

theo phương pháp của Jin và cs, 1997 và Khan 2007

b Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm trên tai chuột

Theo phương pháp của Van Arman (1974)

c Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (pha loãng nồng độ)

- Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ: Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có nồng độ 128 àg/ml; 32 àg/ml; 8 àg/ml; 2 àg/ml; 0,5 àg/ml đối với chất sạch.,

256 àg/ml; 64 àg/ml; 16 àg/ml 1 àg/ml; 0,25 àg/ml đối với dịch chiết

d Nghiên cứu độc tính cấp

Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của dich chiết có hoạt tính kháng viêm

từ Sargassum swartzii (S) và Ulva reticulata (U) trên chuột nhắt trắng bằng phương

pháp của Litchfield và Wilcoxon (1949)

e Nghiên cứu tác dụng giảm đau

Tác dụng giảm đau được xác định bằng phương pháp Koster - quặn đau axit acetic

và phương pháp mâm nóng:

* Phương pháp gây viêm cấp

+ Gây phù chân chuột bằng carrageenin

+ Gây viêm màng bụng

* Gây viêm mạn (gây u hạt)

f Xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student và test

“trước - sau”(Avant - Après) Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05

II.2.5 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu thăm dò khả năng sinh các chất có Hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển

II.2.5.1 Nguyên liệu

- Các mẫu nước và trầm tích được lấy ở các địa điểm khác nhau của biển Việt Nam: Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên vào tháng 5/2007 Các mẫu này được Viện Địa Lý cung cấp

- Các mẫu san hô và rong lấy từ biển Nha Trang, đảo Trường Sa 6/2007 –do Phòng Sinh thái nước Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga cung cấp Các mẫu nước biển, trầm tích biển ở

độ sâu > 2m trở lên được lấy bằng các dụng cụ chuyên dụng

- Các mẫu nước bề mặt biển Hải Phòng, Cát Bà, Nha Trang, Hạ Long, Nam Định do nhóm đề tài thu thập tháng 6-7/2007

- Các mẫu cá biển, ngao, sò huyết mua tại chợ Thành Công, Hà Nội vào tháng 5/2007

- Sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Heliothis armigera) do Viện Bảo vệ Thực vật

cung cấp

- Giun nhiều tơ Derodigitata miiler (thức ăn cho cá cảnh) mua tại chợ Hà Nội

- 5 chủng VSV kiểm định nhận từ bảo tàng giống chuẩn của Trung tâm CNSH, Đại học

khoa học tự nhiên Hà Nội: vi khuẩn Gram (-): E coli; Pseudomonas aeruginose, vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis; Streptococcus aureus, Nấm men gây bệnh: Candida

albicans

II.2.5.2 Môi trường phân lập vi sinh vật (g/l)

- Môi trường MPA (phân lập vi khuẩn) Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; Thạch: 20; Nước biển 100%

- Môi trường Gause 1 (phân lập xạ khuẩn) Glucoza :10; K2HPO4: 0,5; MgSO4: 0,5; KNO3: 1; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước biển

- Môi trường Hansen (phân lập nấm men) Glucoza: 50; pepton 5; MgSO4.7H2O: 3;

K2HPO4: 3; KH2PO4: 3; Cao nấm men: 1; Thạch: 20; Nước biển

- Môi trường Czapek (phân lập nấm mốc) Glucose: 5: MgSO4: 0,5; KCl: 0,5; MgCl2: 3; FeSO4: 0,01; NaNO3: 3; KH2PO4: 1; K2HPO4 : 1; Thạch: 20; Nước biển Tất cả các môi trường trên đều được bổ sung dung dịch nguyên tố vi lượng

II.2.5.3 Phương pháp nghiên cứu

- Số lượng vi sinh vật trong các mẫu phân tích được xác định theo phương pháp

pha loãng tới hạn của Koch

- Sàng lọc sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn, kháng nấm của các chủng phân lập được trên đĩa thạch MPA chứa 2% dịch VSV kiểm định

- Nhuộm Gram: làm tiêu bản các chủng vi khuẩn có hoạt tính sinh học

- Mô tả hình thái khuẩn lạc bằng phương pháp cấy khuẩn lạc lớn trên đĩa thạch

- Hoạt hoá các chủng vi khuẩn kiểm định trên môi trường MPA ở 370C trong

vòng 24 giờ, còn chủng nấm men C albicans trên môi trường Hansen ở 300C trong 48 giờ

- Nuôi cấy VSV biển để thử khả năng sinh các chất có HTSH

- Xác định khả năng kháng các VSV kiểm định bằng phương pháp đục lỗ và đo vòng vô khuẩn

- Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào trên giun tơ Derodigitata

miiler

- Phương pháp thử khả năng diệt sâu hại

- Xác định hoạt tính amilaza trên môi trường chứa 1% tinh bột tan; hoạt tính xenluloza trên môi trường chứa 1% bột giấy và hoạt tính proteaza trên môi trường chứa 1% cazein Dung dịch hiện màu là Lugol 1%

- Xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon, nitơ, pH và độ thoáng khí lên sinh truởng và sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn, kháng nấm theo phương pháp VSV thông dụng

- Định tên khoa học các chủng vi sinh vật biển có hoạt tính sinh học theo phương pháp hình thái, sinh lý sinh hoá và sinh học phân tử

II.2.6 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu tạo thực phẩm chức năng bổ sung omega-3 phòng và hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch

II.2.6.1 Phương pháp nghiên cứu

- Xác định đạm toàn phần bằng phương pháp Kieldahn

- Xác định hàm lượng béo bằng phương pháp Sochlex

- Xác định độ nở: Độ nở của bỏng được xác định bằng tỷ số giữa diện tích của bỏng/diện tích đầu khuôn

- Xác định độ màu (L,a, b) bằng máy Hunter – Mỹ

- Xác định độ nhớt trên máy đo độ nhớt Brookfield DV-II

- Hàm lượng DHA được xác định tại Viện Dinh dưỡng

- Xác định axít béo omega 3 trên máy sắc ký khí: chất béo được methyl hoá, chạy trên máy GC PLUS HP 6890 của Viện Nghiên cứu Dược phẩm và Mỹ phẩm miền Nam

c Phương pháp vi sinh

- Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trên môi trường thạch thịt, pepton

- Phát hiện E coli trên canh thang thường, canh thang lactoza, nước pepton

- Phát hiện vi khuẩn Salmonella trên môi trường EMB (eosin methylen blue)

- Phát hiện nấm mốc, nấm men trên môi trường thạch malt

d Phương pháp thử nghiệm lâm sàng

Đối tượng thử nghiệm là các bệnh nhân có các yếu tố và nguy cơ của bệnh tim mạch như cao huyết áp, rối loạn chuyển hoá lipit máu đang được điều trị tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tây

e Phương pháp đánh giá cảm quan: theo TCVN

f Phương pháp toán học

Qui hoạch toán học thực nghiệm tối ưu hóa các điều kiện công nghệ của quá trình

ép đùn bằng ma trận toán học thực nghiệm Doehlert

II.2.6.2 Thiết bị, dụng cụ, nguyên vật liệu và hoá chất sử dụng cho nghiên cứu

Mục này trình bày các thiết bị, nguyên vật liệu và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung Omega-3 phòng và điều trị bệnh tim mạch

II.2.7 Phương pháp nghiên cứu tạo thực phẩm chức năng Bionamine tăng cường sức khỏe cho vận động viên từ sao biển

II.2.7.1 Nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất sinh học hoocmôn steroit (testosteron, progesteron, cortilson, oestradoen) trong các đối tượng nghiên cứu (theo

phương pháp miễn dịch Eliza trên máy Multiskan - Phần Lan với kit của hãng Biotech–

Mỹ)

II.2.7.2 Nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất sinh học, các nguyên tố khoáng vi lượng cần thiết (Fe, Zn, Mn, Se…) trong các đối tượng nghiên cứu (bằng phương pháp phân tích huỳnh quang tia X trên máy ký hiệu XRF SEA-2110 của Nhật)

II.2.7.3 Nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất sinh học (protein, axit amin) của các đối tượng nghiên cứu (bằng phương pháp điện di trên máy axít amin tự động HP – Amino Quant Series II của Nhật)

II.2.7.4 Nghiên cứu quy trình khai thác các hoạt chất sinh học từ tạo chế phẩm thực phẩm chức năng viên tăng lực Bionamine bằng công nghệ enzim

* Phân tích hoạt chất sinh học trong một số loài sao biển bằng phương pháp sinh hóa, phương pháp miễn dịch Eliza, phương pháp vi sinh và phương pháp phân tích huỳnh quang tia X

* ứng dụng công nghệ enzyme, công nghệ hóa sinh để tạo các sản phẩm bột nguyên liệu Bionamine

* Phương pháp xác định mức độ thuỷ phân cơ chất: Phương pháp Auson cải tiến, và phương pháp chuẩn độ formol

II.2.7.5 Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của bột Bionamine

Các nghiên cứu thực nghiệm về độc tính cấp và bán trường diễn được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu độc học – Học Viện Quân Y

II.2.7.6 Phương pháp thử nghiệm tác dụng của viên tăng lực Bionamine trên động vật thực nghiệm

Tác dụng của viên tăng lực Bionamine trên động vật thực nghiệm được đánh giá thông qua các chỉ tiêu huyết học, tăng cường thể lực và sức bền của chuột trong quá trình bơi lặn

II.2.7.7 Phương pháp đánh giá tác dụng lâm sàng của viên Bionamine trên vận động viên điền kinh

Đánh giá tác dụng về sức bền, sức nhanh (phản xạ thần kinh) và sức mạnh cơ bắp trên vận động viên của các đội điền kinh Hà Nội

II.2.8 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu sản xuất viên nang mềm bào ngư HALIOTIS

II.2.8.1 Phương pháp nghiên cứu qui trình bào chế viên nang Haliotis

a Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lựa chọn dược liệu và xây dựng qui trình bào chế viên nang mềm Bào ngư HALIOTIS thành dạng bán thành phẩm và thành phẩm

- Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm viên nang mềm bào ngư HALIOTIS

- Kiểm nghiệm sản phẩm viên nang mềm HALIOTIS theo tiêu chẩn cơ sở đã xây dựng

- Tiến hành đăng ký sản phẩm dưới dạng thực phẩm chức năng với Bộ y tế xin cấp giấy phép lưu hành toàn Quốc

b Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu:

- Xây dựng qui trình bào chế viên nang mềm Haliotis:

- Bào ngư sau khi thu hoạch tách bỏ vỏ cứng loại hết tạp chất và phủ tạng, rửa sạch

xử lý bảo quản đông khô

- Thái lát mỏng, sấy cho đến khô

- Nghiền thành bột mịn

- Nhũ hoá bằng dầu đậu lành thu được dạng bán thành phẩm

- Đóng nang mềm Gelatine trên dây chuyền đóng nang mềm đạt tiêu chuẩn GMP WHO

- Sấy viên

- Đóng lọ hoặc ép vỉ, dán nhãn hoàn thiện sản phẩm

- Kiểm nghiệm thành phẩm

- Nghiên cứu

II.2.8.2 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp

Nghiên cứu độc tính cấp được thực hiện tại Khoa Nghiên cứu thực nghiệm - Viện

Y học cổ truyền Quân đội theo các phương pháp:

- Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc Nhà xuất bản Y học, 1996

- Hướng dẫn kèm theo quyết định số 371/BYT QĐ ngày 12/3/1996 về xác định độ an toàn cho thuốc cổ truyền của Bộ Y tế

- General guidelines for methodologies on research and evaluational of traditional medicine World Health Organization 2000

- Principles and Methods of Toxicology A Wallace Hayes, 1994

II.2.8.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Mẫu thử: Liều thử: 2 viên/ kg/ ngày

Cắt viên nang mềm, ép ra hết chất dịch và thêm nước, trộn đều để thu được hỗn dịch có chứa lượng thuốc tương đương 2 viên/ 5ml Khuấy trộn đều hỗn dịch mỗi khi lấy cho thỏ uống

Chuẩn bị mẫu thử hàng ngày trước khi cho thỏ uống

Bố trí thí nghiệm và tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành trên 20 thỏ, chia làm hai

nhóm chứng và thử, mỗi nhóm 10 thỏ

- Nhóm chứng: uống nước cất 5,0 ml/ kg/ ngày

- Nhóm thử : uống 5 ml dịch mẫu thử đã chuẩn bị như trên với liều 0,3 g/ kg/ ngày Cho thỏ uống hàng ngày, liên tục trong một tháng

Thỏ ở cả 2 nhóm được nuôi dưỡng trong cùng điều kiện và cùng chế độ dinh dưỡng

Theo dõi và đánh giá: Theo dõi thỏ hàng ngày về mức độ tiêu thụ thức ăn, khả năng

hoạt động, tình trạng phân, lông

Trước khi thí nghiệm, xác định chỉ số bình thường của thỏ về cân nặng, các dấu hiệu toàn thân, các chỉ số về huyết học, hoá sinh chức năng gan, thận Hết thời gian thí nghiệm, đánh giá lại thỏ trên các chỉ tiêu như trước thí nghiệm Mổ thỏ quan sát đại thể các tổ chức gan, thận, phổi, tim về hình dạng, màu sắc, thể chất, tình trạng xung huyết

So sánh kết quả trước và sau thí nghiệm của nhóm chứng, nhóm thử, giữa nhóm

chứng và nhóm thử theo phương pháp thống kê y sinh học

II.2.8.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng bồi bổ cơ thể trên lâm sàng

a Chất liệu nghiên cứu:

Viên nang mềm Haliotis bào chế từ Bào ngư được đóng gói 170 mg/ viên, do khoa dược - Viện YHCT Quân đội sản xuất

b Đối tượng nghiên cứu

Gồm 45 bệnh nhân (BN) tự nguyện≥ 40 tuổi

+ Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Bệnh nhân ≥40 tuổi, không phân biệt giới, nghề nghiệp

- Bệnh nhân được chẩn đoán là suy nhược cơ thể theo tiêu chuẩn chẩn đoán của CDC năm 1994

- Theo YHCT bệnh nhân thuộc chứng hư lao thể can thận âm hư: Đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, tai ù, mất ngủ, hay quên, thể trạng gầy; người mệt mỏi, hay cáu gắt, lòng bàn tay chân nóng; ra mồ hôi trộm; đau lưng; mỏi gối; nhức trong xương

- Bệnh nhân chấp nhận dùng thuốc, tham gia công trình nghiên cứu, thực hiện những

điều quy định trong quá trình nghiên cứu

- Bệnh nhân điều trị nội trú tại khoa lão khoa và điều trị ngoại trú tại phòng khám bệnh viện YHCT Quân đội

+ Tiêu chuẩn loại trừ

- BN đang dùng thuốc khác hoặc suy thận, suy gan, suy tim, thiếu máu nặng, bệnh thần kinh thực tổn …

- Phương pháp dùng thuốc: dùng viên nang mềm bào ngư 2 viên/lần x 2 - 3 lần/ngày x

30 ngày điều trị nội trú tại Khoa Lão khoa và điều trị ngoại trú tại phòng khám bệnh - Viện YHCT Quân đội

- Tất cả các bệnh nhân nghiên cứu đều được khám xét tỷ mỉ về nội khoa, làm bệnh án

được chẩn đoán theo YHCT và y học hiện đại, có phiếu theo dõi, thăm khám hàng ngày

để theo dõi kết quả và ghi tác dụng phụ không mong muốn của thuốc

II.2.9 Phương pháp nghiên cứu sản xuất thực phẩm chức năng viên nang mềm hải sâm HASAMIN

II.2.9.1 Phương pháp xác định các thành phần dinh dưỡng, hoocmon và khoáng chất trong Viên nang hasamin

a Nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất sinh học hoocmôn steroit (testosteron, progesteron, cortilson, oestradoen) trong các đối tượng nghiên cứu theo phương pháp miễn dịch Eliza trên máy Multiskan - Phần Lan với kit của hãng Biotech–Mỹ

b Nghiên cứu xác định hàm lượng các nguyên tố khoáng vi lượng cần thiết (Fe, Zn,

Mn, Se…) trong viên Hasamin bằng phương pháp phân tích huỳnh quang tia X trên máy

ký hiệu XRF SEA-2110 của Nhật

c Nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất sinh học (protein, axit amin) của trong viên Hasamin bằng máy axít amin tự động HP –Amino Quant Series II của Nhật

II.2.9.2 Phương pháp thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn

Độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang mềm hải sâm Hasamin

được nghiên cứu tại Viện Y học Cổ truyền Quân đội theo các phương pháp đã được trình bày ở mục II.2.7.2 và II.2.7.3

II.2.9.3 Phương pháp thử nghiệm tác dụng của viên Hasamin trên động vật

Đối tượng:

Thí nghiệm tiến hành đối với 10 thỏ đực thuộc giống Newzealand, nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây Thỏ giống có trọng lượng 3,0 - 5,0 kg, tuổi 12 - 26 tháng, khoẻ mạnh, giao phối thuần thục, nuôi ở những chuồng riêng biệt, chế độ nuôi d-

ưỡng bao gồm thức ăn tinh hỗn hợp 16% protein 80g/ngày và 600g thức ăn xanh

Phương pháp:

Lấy tinh thỏ bằng âm đạo giả, nhiệt độ âm đạo giả 45oC, lấy tinh vào buổi sáng Thể tích tinh dịch (V), hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng (A), nồng độ tinh trùng (C), sức kháng (R) đối với dung dịch NaCl 1% của tinh trùng xác định theo phương pháp của Milovanov (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng của một lần lấy tinh (V.A.C) xác định theo phương pháp của Herrick và Self (1962), tỷ lệ tinh trùng sống (LS) theo phương pháp nhuộm màu phân biệt với eosin 5% của Morozov (1938), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) theo phương pháp nhuộm màu với fuxine của Serdiuc (1970), pH tinh dịch đo bằng giấy đo pH của Trung Quốc

Thời điểm đánh giá phẩm chất tinh dịch:

Trước khi cho ăn viên HASAMIN, Placebo

Sau 10 ngày bổ sung viên HASAMIN, Placebo

Sau 20 ngày bổ sung viên HASAMIN, Placebo

Liều lượng và cách cho ăn: Liều luợng bổ sung: 01 viên/con/ngày Cách bổ sung

viên thuốc: trộn đều thuốc với một ít thức ăn tinh, cho thỏ ăn hết, sau mới cho ăn thức ăn cơ sở

Phần II kết quả nghiên cứu

A Kết quả Thu thập mẫu sinh vật biển và sàng lọc hoạt tính sinh học

Chương I Thu thập, định loại mẫu sinh vật biển và xây dựng cơ sở dữ liệu

I.1 tình hình nghiên cứu nhóm Hải miên, Da gai, San hô mềm

Phần này trình bày một cách vắn tắt các nghiên cứu thu thập, định loài, và phân bố của các loài sinh vật biển thuộc ba nhóm hải miên, da gai và san hô mềm

I.2 Địa điểm và thời gian thu mẫu

Đề tài đã tổ chức 9 chuyến thu mẫu (Cát bà tháng 11/2006; Cồn Cỏ thỏng

11/2006; Trường Sa thỏng 3-4/2007; Cụn Đảo thỏng 6/2007; Vịnh Hạ Long thỏng 7/2007 ; Cỏt Bà thỏng 8/2007; Cồn Cỏ từ 6 đến 10/6/2008; Cỏt Bà từ 27/ 6 đến

5/7/2008; Vịnh Hạ Long từ 9/9 đến 16/9/2008) Tổng số mẫu thu được trong đề tài này

là 101 mẫu sinh vật Biển Cụ thể bản đồ các đợt thu mẫu được trình bày trên hình dưới

đây:

Các địa điểm thu mẫu năm 2006 - 2008

Côn Cổ

Vịnh Hạ Long Cát Bà

Trường Sa

Côn đảo

I.3 Một số nét cơ bản về đặc điểm môi trường ở các địa

điểm nghiên cứu

Mục này trình bày một số nét cơ bản về đặc điểm môi trường tại các địa điểm lấy mẫu: Cát Bà, Côn Đảo và Trường Sa

I.4.Kết quả thu thập mẫu

Trong ba năm 2006-2008, qua 9 đợt thu mẫu đề tài đã tiến hành thu thập được 101 mẫu sinh vật Biển có khả năng chứa dược liệu tại các địa điểm như sau:

I.4.1 Thu thập mẫu đợt 1 tại Cỏt Bà thỏng 11/2006

- Thời gian thu mẫu: từ ngày 5 đến 15/11 năm 2006

- Cỏc điểm đó thu: Cỏt Dứa, Vạn Bội, Ba Trỏi Đào,

- Số mẫu thu: 6 mẫu

I.4.2 Thu mẫu đợt 2, Cồn Cỏ thỏng 11/2006

- Thời gian thu mẫu: từ ngày 5 - 20/11/2006

- Cỏc điểm đó thu: Đảo Cồn Cỏ - Quảng Trị

- Số mẫu thu: 9 mẫu

I.4.3 Thu mẫu đợt 3 Trường Sa thỏng 3-4/2007

- Thời gian thu mẫu: từ 20 thỏng 3 đến 20 thỏng 4/2007

- Cỏc điểm đó thu: Trường Sa Lớn, Nam Yết, Tốc Tan

- Số mẫu thu: 6 mẫu

I.4.4 Thu mẫu đợt 4 tại Cụn Đảo thỏng 6/2007

- Thời gian thu mẫu: từ 20 thỏng 5 đến 10 thỏng 6/2007

- Cỏc điểm đó thu: Hũn Tre, Hũn Bảy Cạnh, Hũn Trọc, Vịnh Cụn Sơn

- Số mẫu thu: 17 mẫu

I.4.5 Thu mẫu đợt 5 tại Vịnh Hạ Long thỏng 7/2007

- Thời gian thu mẫu: Từ ngày 3 - 15 thỏng 7/2007

- Cỏc điểm đó thu: Đầu Bờ, Hang Trai, Hang Dự (Ang Dự), Cống Đỏ

- Số mẫu thu: 16 mẫu

I.4.6 Thu mẫu đợt 6 tại Cỏt Bà thỏng 8/2007

- Thời gian thu mẫu: Từ ngày 1 - 10 thỏng 8/2007

- Cỏc điểm đó thu: Cỏt Dứa, Vạn Bội, Ba Trỏi Đào,

- Số mẫu thu: 17 mẫu

I.4.7 Thu mẫu đợt 7 tại Cồn Cỏ từ 6 đến 10/6/2008

- Thời gian thu mẫu: Từ ngày 6 - 10 thỏng 6/2008

- Cỏc điểm đó thu: Bắc Cồn Cỏ

- Số mẫu thu: 9 mẫu

I.4.8 Thu mẫu đợt 8 tại Cỏt Bà từ 27/ 6 đến 5/7/2008

- Thời gian thu mẫu: Từ ngày 27/6 – 5/7/2008

- Cỏc điểm đó thu: Vạn Bội, Ba Trỏi Đào, Hang Trai, Đầu Bờ,

- Số mẫu thu: 7 mẫu

I.4.9 Thu mẫu đợt 9 tại Vịnh Hạ Long từ 9/9 đến 16/9/2008

- Thời gian thu mẫu: Từ ngày 9/9 – 16/9/2008

- Cỏc điểm đó thu: Vạn Hà, Áng Dự, Cống Đỏ, Bự Xỏm, Cọc 8, Cọc 6

- Số mẫu thu: 14 mẫu

Trong số 101 mẫu thu được có 41 mẫu hải miên, chiếm 40,6 % tổng số mẫu thu

được, 31 mẫu san hô mềm (30,7 %) và 29 mẫu da gai (28,7 %) Trong số đó:

• Hải Miên

+ Số lượng: 41 mẫu

+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu hải miên tại các điểm thu mẫu:

- Các kết quả phân tích của chúng tôi đã xác định được 6 mẫu tại khu vực đông

nam đảo Cát Bà (Gellius varius, Dysidea cinerea, Haliclona sp, Mycale plumosa,

Ircinia echinata, Amorphinopsis excavans)

- 4 mẫu cũng đã tìm thấy ở đảo Trường Sa (Petrosia nigricans, Janthella sp,

Xestospongia testudinaria, Ircinia sp)

- 7 mẫu Hải miên tại vùng biển Côn Đảo (Clathria vulpina, Petrosia nigricans,

Xestospongia testudinaria, Niphates sp, Spongia sp, Stylissa flabelliformis, Gellius var fibrosa)

- Tại Vịnh Hạ Long cũng đã thu được 7 mẫu (Haliclona subarmigera, Dysidea

cinerea, Ircinia echinata, Biemna cf nudelringna, Xestospongea testudinaria, Gelliodes fibulata, Aka mucosa)

• San hô mềm

+ Số lượng: 31 mẫu

+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu san hô mềm tại các điểm thu mẫu:

- Tại Cồn Cỏ đã tìm thấy 7 mẫu: Cladiella sp, Sarcophyton trocheliophorum,

Lobophytum crassum, Lobophytum sp, Lobophytum compactum, Sinularia abrupta, Klyxum sp

- Tại đảo Nam Yết thuộc Trường Sa đã thu được 1 mẫu san hô Lobophytum

+ Ví dụ về sự phân bố các mẫu da gai tại các điểm thu mẫu:

- Tại Côn Đảo: đã thu được 3 mẫu gồm: Hải sâm đen (Holothuria atra), đuôi rắn (Macrophiothrix sp), cầu gai hình trứng (Echinocardium cordatum)

- Vịnh Hạ Long: Số lượng mẫu thu được nhiều hơn khu vực Côn Đảo, tổng số 5

mẫu gồm: Sao biển 5 cánh màu tím rêu (Asterope carinifera), sao biển cánh ngắn (Anthenea pentagonala), sao biển 5 cánh màu tím đỏ (Asterope carinifera), sao biển 5 cánh màu hồng (Protoreaster nodusus), cà gim gai dài (Diadema setosum)

- Vùng biển Cát Bà : Trong đợt thu mẫu tháng 8/2007 đã thu được 6 mẫu Chúng

bao gồm hải sâm gai (Holothuria spinifera), sao biển rãnh nông (Astropecten

polyacanthus), dưa chuột biển màu hồng không gai (Thyone bicornis), dưa chuột biển

màu hồng có gai (Stichopus sp), sao biển 5 cánh màu tím rêu (Asterope sp) và sao biển

Mục này đưa ra một số đặc điểm nhận dạng của một số đối tượng sinh vật biển

điển hình thuộc các nhóm san hô mềm, da gai và hải miên Do khuôn khổ của báo cáo

có hạn, chúng tôi chỉ trình bày dưới đây ảnh mẫu lưu và mô tả của một số loài sinh vật biển điển hình:

I.5.1 Các loài san hô mềm

1 Loài Lobophytum compactum, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có dạng phủ dày, trên polyparium có các thuỳ mọc gần nhau, dài 3-5cm hầu như không phân nhánh Polyp có ở bề mặt trên của tập đoàn và trên các thuỳ

Màu sắc: có màu nâu nhạt, xanh

2 Loài Lobophytum crassum, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có thân ngắn

và to hoặc dạng phủ Polyparium phân nhánh thành các thuỳ hoặc dạng mào, rất hiếm khi có dạng phẳng Polyp lưỡng hình Gai xương trên bề mặt có dạng dùi cui, gai xương trong dạng hình con suốt Màu sắc: có màu vàng sáng, nâu hoặc xanh lục

3 Loài Sarcophyton elegans, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có một thân lớn, phía trên dạng đĩa mang polyp gọi là polyparium ở giữa polyparium có dạng lòng chảo, phía ngoài gợn sóng hoặc gấp khúc

4 Loài Sarcophyton mililatensis, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có thân lớn, polyparium có dạng lòng chảo, phía ngoài gơn sóng hoặc gấp khúc Bề mặt tập đoàn nhẵm, polyp nhỏ ở môi trường sóng mạnh thân ngắn và mập, ở môi trường được bảo vệ thân dài và mảnh hơn Màu sắc: có màu vàng xanh, nâu hoặc nâu vàng

5 Loài Sarcophyton trocheliophorum, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn có dạng nấm, thân

lớn Bề mặt polyparium thường gấp khúc Polyp lưỡng hình Gai xương trong có hình dạng con suốt với các mấu lồi, gai xương ngoài hình dùi cui

Màu sắc: có màu vàng, nâu nhạt hoặc xanh nhạt

6 Loài Sinularia abrupta, thuộc họ Alcyoniidae

Đặc điểm: Tập đoàn dạng phủ hoặc có thân phân biệt Polyparium nhẵn, phân thuỳ dạng ngón hoặc dạng mào Polyp đơn hình Gai xương trong có dạng con suốt lớn

có mấu nhỏ, chiều dài lớn hơn 2mm Gai xương ngoài dạng dùi cui hoặc con suốt nhỏ

Màu sắc: hơi trắng, vàng nhạt, nâu sáng

I.5.2 Các loài hải miên

1 Loài Gellius varius, thuộc họ Chalinidae

Mô tả: dạng cành, màu xanh lục đậm khi còn sống, khi chết hoặc khi cố định bằng hoá chất thì chuyển màu xanh đen, chúng tạo thành khóm sống trên các khối san hô hoặc bám trên nền đáy cứng

2 Loài Dysidea cinerea, thuộc họ Dysideidae

Mô tả: mọc thành dạng khối trên rạn san hô, màu sắc thany đổi rất nhiều phụ thuộc vào môi trường sống, từ màu nâu nhạt cho tới màu xám hoặc, mềm và dai, thường lẫn cả cát hoặc sạn bên trong cơ thể

3 Loài Haliclona sp, thuộc họ Chalinidae

Mô tả: thường có dạng cành, cấu trúc thay đổi tuỳ loài có thể mềm hoặc hơi cứng, màu sắc thay đổi rất nhiều, từ màu xám nhạt, hồng, tím hoặc xanh đậm, với

lỗ mở trên bề mặt tương đối lớn

4 Loài Mycale plumosa, thuộc họ Mycalidae

Mô tả: có dạng cành đắc trưng và thường nối với nhau, màu sắc từ đỏ đậm cho tới màu tím nhạt, thường bị mất màu rất nhanh sau khi lấy ra khỏi môi trường sống, cấu trúc tương đối mềm

5 Loài Ircinia echinata, thuộc họ Irciniidae

Mô tả: thường sống dạng khối có xẻ thuỳ, bề mặt được bao phủ bởi các mấu nhỏ, thường có màu nâu đen cho tới màu

đen, cơ thể dẻo và đàn hồi giống như cao

su

6 Loài Amorphinopsis excavans, thuộc họ Halichondriidae

Mô tả: đây là loài đục lỗ vào trong các khối san hô hoặc nền đáy và chiếm cứ gần hết không gian bên trong, màu sắc thay đổi từ vàng cho tới vàng đậm, có lỗ

mở trên bề mặt khá lớn Khi để khô thường chuyển màu trắng ngà

7 Loài Clathria vulpina, thuộc họ Microcionidae

Mô tả: cơ thể dạng cành, có màu vàng cam, bề mặt xù xì được tạo nên bởi nhiều núm gai nhỏ

8 Loài Petrosia nigricans, thuộc họ Petrosiidae

Mô tả: thường có dạng khối, giống hình núi lửa, cấu trúc cứng và dễ vỡ,

dễ gãy, bề mặt tương đối nhẵn, thường có màu tím nhạt cho tới nâu

đậm

9 Loài Xestospongia testudinaria, thuộc họ Petrosiidae

Mô tả: hình dạng, màu sắc và kết cấu

bề mặt thay đôi rất nhiều tuỳ thuộc vào môi trường sống, thường chúng có dạng cốc lớn với bề mặt nhiều các gờ và các rãnh, cấu trúc cứng và dễ vỡ vụn

10 Loài Niphates sp, thuộc họ Chalinidae

Mô tả: cơ thể dạng cành phân nhánh, màu sắc thay đổi thừ màu trắng ngà cho tới màu hồng nhạt, bề mặt tường

đối nhẵn, có một

số lỗ mở nhỏ trên

bề mặt

11 Loài Stylissa flabelliformis, thuộc họ Axinellidae

Mô tả: mọc thành cụm trên rạn san hô, có màu vàng cam, bề mặt xù xù thường có nhiều mấu nhỏ hoặc có các đường gờ hoặc nếp gấp

12 Loài Ianthella sp, thuộc họ Ianthellidae

Mô tả: Cơ thể có dạng quạt, màu sắc thay đổi từ màu vàng nhạt, màu vàng cam đậm cho tới màu tím sẫm, khi tiếp xú vơi không khí thường chuyển màu tím sẫm

13 Loài Ircinia sp, thuộc họ Irciniidae

Mô tả: thường có dạng xẻ thuỳ, có màu từ nâu đậm tới màu đen, đôi khi

được bao phủ bởi các mâu thịt nhỏ, cấu trúc dẻo và dai giống cao su

.5.3 Các loài da gai

1 Hải sâm trắng Holothuria scabra, thuộc họ Holothuridae

Đặc điểm nhận dạng: Là loài có cơ thể lớn, chiều dài có thể đạt đến 30 cm Bình thường cơ thể hình quả chuối, nhưng có thể thay đổi rất nhanh nếu môi trường có biến dổi Cơ thể màu đen hoặc đen hơi chuyển màu nâu, màu hồng Trên cơ thể

có hai dạng gai hình gần tròn và thoi bao phủ

2 Sao biển cánh dày Protoreaster nodusus, thuộc họ Oreasteridae

Đặc điểm nhận dạng: Hình sao 5 cánh,

độ dài các cánh đều nhau và tương đối ngắn Trên mỗi cánh có từ 5 - 6 ụ hình tròn Màu sắc biến đổi từ màu vàng chanh sang vàng nhạt

I.6 Bước đầu xác định các khu vực có khả năng khai thác nguồn dược liệu biển

Các kết quả thu thập mẫu vật của chúng tôi dọc theo chiều dài của biển Việt Nam,

đã cho phép bước đầu xác định các sinh cảnh chính mà ở đó chúng ta có thể thu thập các loài sinh vật biển có giá trị làm dược liệu

1 Các tùng, áng thuộc quần đảo đá vôi như Hạ Long - Cát Bà: Thường có nhiều loài thuộc nhóm Hải miên và sao biển, hải sâm, phân bố ở khu vực này chúng thường tập trung phân bố thành các bãi lớn có giá trị khai thác Đây là khu vực đặc biệt cần lưu ý, trong tương lai, chúng có thể là những địa điểm quan trọng cho việc nuôi trồng

và khai thác các loài có chứa dược liệu biển Điều này chứng tỏ khu vực Hạ Long Cát Bà - Bái Tử Long là những nơi có các loài sinh vật chứa dược liệu tập trung sinh sống

-2 Rạn san hô: là sinh cảnh quan trọng, ở đây có thể thu được rất nhiều các loài sinh vật

có khả năng chứa dược liệu, đặc biệt là nhóm Da gai và san hô mềm và Hải miên Các rạn san hô thuộc Đông Nam Cát Bà, Hang Trai- Đầu Bê, Cô Tô, Hải Vân - Sơn Chà, Cù Lao Chàm, ven bờ Ninh Thuận Đặc biệt 3 khu vực là Cồn Cỏ, Côn Đảo và Trường Sa là khu vực có mật độ cao của các loài san hô mềm

3 Các bãi triều cát hoặc cát pha vỏ sinh vật, cát sỏi: Phân bố ở hầu hết các cung lõm của các đảo hoặc ven bờ Việt Nam ở đây có thể thu được hầu hết các loài da gai, hải miên có giá trị dược liệu

Hình I.6 Các bãi dược liệu biển chủ yếu khu vực Hạ Long - Cát Bà

Ghi chú: 1- Bãi Vạn Bội - Vạn Hà (Bãi sao biển); 2- Bãi Tùng Gấu - Tùng Hói (Bãi hai mảnh vỏ); 3- Bãi

Ba Trái Đào (hải miên cành); 4- Bãi Vụng Vua - Cống Lá; 5- Đông Nam Đảo Hang Trai; 6- Khu Hồ Ba Hầm

Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đã xác nhận được 6 khu vực là các bãi dược liệu lớn của Vùng biển Việt Nam (ví dụ như ở hình 1.6) đó là: Bãi dược liệu đông nam đảo Cát Bà, bãi dược liệu khu vực vịnh Hạ Long, bãi dược liệu khu vực vịnh Cô Tô

- Thanh Lân, bãi dược liệu Cồn Cỏ, bãi dược liệu Côn Đảo và bãi dược liệu Trường Sa

Đó là các khu vực có đa dạng sinh học cao, từ đó chúng ta có thể khai thác được các loài sinh vật biển có giá trị kinh tế và dược liệu cao đặc biệt là các loài thuộc nhóm hải miên, da gai (sao biển, hải sâm, cầu gai…) và san hô mềm

I.7 Xây dựng cở sở dữ liệu sinh vật biển

Đề tài đã thiết kế, xây dựng cơ sở dữ liệu sinh vật biển chứa dược liệu Đây là một cơ sở dữ liệu đa dạng được xây dựng dựa trên các phần mềm hiện đại nhằm tạo ra một hệ thống chương trình hỗ trợ công tác quản lý, tra cứu, tìm kiếm thông tin về một số

đối tượng có chứa dược liệu sống ở vùng biển ven bờ như San hô, thân mềm, da gai, rong biển, sứa biển Cơ sở dữ liệu được thiết kế đơn giản, tiện lợi và dễ sử dụng, giúp các nhà khoa học, nhà quản lý đều có thể dễ dàng cập nhật, hiệu chỉnh, liệt kê, bổ sung thông tin về các loài sinh vật chứa dược liệu vào cơ sở dữ liệu, tìm kiếm và tra cứu thông tin, in ấn và truy xuất thông tin kết quả ra máy in

Các dữ liệu trong cơ sở dữ liệu được tổ chức dưới các hình thức sau:

- Các mẫu thu được đã được xác định có hồ sơ mẫu kèm theo, được lưu trữ trong phòng thí nghiệm để so sánh

- Hồ sơ của 101 mẫu đã thu (đợt thu mẫu, thời gian thu mẫu, địa điểm và tên loài

đã thu được)

- ảnh của tất cả 101 mẫu đã thu được lưu trữ bằng 101 file dạng jpg, có thể xử lý

ở nhiều phần mềm khác nhau

Hiện nay, chương trình cơ sở dữ liệu được trình bày qua hệ máy tính chuyên

dụng của Viện

Mô hình sử dụng của cơ sở dữ liệu được trình bày tóm tắt trên sơ đồ sau:

Tổng quát chu trình xử lý thông tin trong cơ sở dữ liệu

Bộ cơ sở dữ liệu đã được biên soạn trên bộ đĩa CD Trong đó có tích hợp phần mềm cơ sở dữ liệu sinh vật biển và các file dữ liệu mô tả các sinh vật biển có chứa dược liệu Đây là một phần trong những sản phẩm mà đề tài đã hoàn thành giao nộp cho Chương trình KC09/06-10

Chương II Xử lý mẫu, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học

Tất cả các mẫu sinh vật biển thu thập được trong đề tài đều được xử lý sơ bộ, bảo quản và tạo dịch chiết thô theo quy trình thống nhất như đã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu Các dịch chiết được tiến hành sàng lọc hoạt tính sinh học theo định hướng: kháng vi sinh vật kiểm định, chống ôxy hóa và gây độc tế bào Dưới đây là kết quả cụ thể:

Kiểm tra yêu cầu của người sử

II.1 Kết quả tạo dịch chiết

Sau khi chiết xong toàn bộ mẫu, các số liệu của quá trình chiết mẫu (Kí hiệu mẫu, l−ợng mẫu đã chiết, l−ợng cặn dịch thu đ−ợc…) đ−ợc tập hợp lại thành bảng và tính hiệu suất thu hồi cặn dịch Kết quả chi tiết đ−ợc trình bày trong bảng II.1

Bảng II.1 Kết quả tạo dịch chiết các mẫu sinh vật biển

TT Ký hiệu

L−ợng mẫu đã

chiết (g)

L−ợng cặn dịch chiết (g)

% Thu hồi cặn dịch chiết

25 KC-025 San hô mềm hình lá

gan

Sarcophyton mililatensis

1000 10,90 1,09

30 KC-030 Hải miên hình quả

đậu

Niphates sp

500 3,95 0,79

chân vịt

35 KC-035 Hải miên phiến đỏ Stylissa flabelliformis 500 1,85 0,37

36 KC-036 San hô mềm hình

chôm chôm

Dendronephthya

46 KC-046 Hải miên hình túi Xestospongea testudinaria 1000 7,70 0,77

55 KC-055 Sao biển 5 cánh màu tím rêu Asterope carinifera 1000 11,30 1,13

56 KC-056 Sao biển rãnh nông Astropecten polyacanthus 1000 9,30 0,93

94 KC-94 Hải miên hình túi Xestospongea

101 KC-101 Sao biển rãnh nông Astropecten polyacanthus 500 5,85 1,17

II.2 kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity)

+ Đã sàng lọc 101 mẫu thô hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (các vi sinh vật kiểm định là các đại diện cho các nhóm vi sinh vật gây bệnh tiêu biểu nhất thuộc các nhóm vi khuẩn Gr(-); vi khuẩn Gr(+); Nấm mốc và Nấm men) Các mẫu có biểu hiện dương tính ở bước sơ bộ này được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ 5-10 thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu (MIC) mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn Ngoài ra, các mẫu có biểu hiện dương tính còn được tiến hành chiết phân bố giữa dung môi hữu cơ và nước theo độ phân cực của dung môi tăng dần từ hexan, sang clorofooc, butanol Các dịch chiết này được tiến hành xác định giá trị MIC

để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

Bảng 1: Thống kê hoạt tính kháng VSV kiểm định của 101 mẫu sinh vật biển

Kháng 3 VSVKĐ

Kháng 4 VSVKĐ

Kháng 5 VSVKĐ

Kháng 6 VSVKĐ

Kháng 7 VSVKĐ

Kháng 8 VSVKĐ

Số mẫu có hoạt tính

101 8 10 19 10 2 1 1 0 51

Tỷ lệ % 7,92 9,90 18,81 9,90 1,98 0,99 0,99 0 50,49 Kết quả sàng lọc trên bảng 1 cho thấy tỷ lệ các mẫu có hoạt tính là khá cao: có

51 mẫu trên tổng số 101 mẫu kháng ít nhất một chủng vi sinh vật kiểm định (chiếm tỷ lệ 50,49%) Trong đó, số mẫu có hoạt tính kháng 1 vi sinh vật kiểm định là 8 mẫu (chiếm 7,92 %), kháng 2 vi sinh kiểm định là 10 mẫu, kháng 3 vi sinh kiểm định là 19 mẫu,

kháng 4 vi sinh kiểm định là 10 mẫu, kháng 5 vi sinh kiểm định là 2 mẫu, kháng 6 vi sinh kiểm định 1 mẫu và kháng 7 vi sinh kiểm định là 1 mẫu

Bảng 2: Khả năng kháng từng chủng VSVKĐ của 101 mẫu sinh vật biển

Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (-) Nấm mốc Nấm men

Khán

g 5 V SV

Khán

g 6 VSV

Khá

ng 7 V SV

Khán

g 8 V SV

Mẫu d

ương t

ính

14.85 30.69

12.87 20.79

9.90 14.85 16.83 17.82

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00

E.

li

P .a

ug in a B.

bt illis

S. au re

A sp .n er

F. oxys

po ru m

C .a lbi ns

S. cer ev ae

Biểu đồ 1: thống kê hoạt tính kháng VSV kiểm định của 101 mẫu sinh vật biển

Kết quả trên cho thấy, tỷ lệ mẫu sinh vật biển kháng các chủng P aeruginosa và

S aureus Đặc biệt là với chủng P aeruginosa, tỷ lệ mẫu biểu hiện hoạt tính lên tới

30,69 % Đây là trực khuẩn mủ xanh thuộc dạng vi khuẩn Gram (-), hiếu khí, có thể gây bệnh, đặc biệt là những người có vấn đề về hệ thống miễn dịch Nó là loài điển hình nhất

của chi Pseudomonas và cũng là loài vi khuẩn được xác định là nguyên nhân chủ yếu

(khoảng 10%) gây lên các ca bệnh nhiễm trùng cơ hội được ghi nhận trong các bệnh viện (hầu hết các ca nhiễm trùng khi bị bỏng là do vi khuẩn này) Chúng nhiễm vào những người bị suy giảm miễn dịch hay bị bỏng, bị thương và những người phải sử dụng

ống thông hay máy hô hấp nhân tạo Nhiễm khuẩn Pseudomonas có thể dẫn tới nhiễm

trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng máu, viêm phổi, viêm họng, và nhiều bệnh khác

Pseudononas phát triển thành khuẩn lạc trên phổi của bệnh nhân bị xơ nang (cystic

fibrosis - CF), và làm tăng tình trạng mãn tính hóa của bệnh về phổi và tăng tỷ lệ tử vong

khi bị xơ nang Vi khuẩn Pseudomonas thường sinh sống trong đất, vùng lầy lội và các

vùng duyên hải Nó cũng có thể sống sót dưới các điều kiện mà ít có loài vi khuẩn nào chịu đựng nổi, nó tạo ra một lớp màng mỏng có thể chống lại sự thực bào, và hiện nay,

chúng kháng hầu hết các loại kháng sinh đang được sử dụng Pseudomonas có thể sinh

sôi cả ở những điều kiện môi trường rất khác nhau như: sà phòng, bồn rửa chén, thiết bị gây mê và hồi tỉnh, các loại nhiên liệu, máy làm ẩm và thậm chí cả trong nước cất được lưu trữ Nó cũng được phát hiện trong máy chạy thận Màu xanh đặc trưng của

mủ là do sắc tố xanh (pyocyanin) và sắc tố lục (fluorescein) được sản sinh bởi vi khuẩn

Pseudomonas

Ngoài ra, tỷ lệ mẫu có biểu hiện hoạt tính kháng tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

cũng đạt tỷ lệ 20,79 % Tụ cầu khuẩn có tỉ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như kháng kháng sinh rất mạnh Các nhà vi khuẩn học lừng danh như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu

khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có men coagulase (gồm S aureus và S

intermedius) và tụ cầu không có men coagulase Tụ cầu có men coagulase gâylên nhiều

bệnh lý khác nhau như: các bệnh nhiễm trùng khu trú tại da và niêm mạc, nhiễm trùng các nội cơ quan, hội chứng nhiễm độc, hội chứng Thukydides, ngộ độc thực phẩm Như vậy, với tỷ lệ mẫu thể hiện hoạt tính kháng các chủng VSV kiểm định (đặc biệt

là kháng kháng 2 chủng vi khuẩn: S aureus và P aeruginosa) khá cao của các mẫu sinh

vật biển là một tiền đề quan trọng phục vụ cho việc tìm kiếm và nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên biển theo định hướng hoạt tính kháng sinh, nhằm phát triển các chế phẩm thuốc kháng sinh thế hệ mới, khắc phục tình trạng kháng thuốc kháng sinh nghiêm trọng hiện nay

II.3 Hoạt tính gây độc tế bào:

Đề tài đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung

thư người KB, FL và Hep-G2 Kết quả thử nghiệm 101 mẫu cho thấy có 43 mẫu có biểu

hiện hoạt tính trong tổng số 101 mẫu thử, trong đó có 12 mẫu kháng một dòng tế bào (chiếm 11,88 %), 15 mẫu kháng 2 dòng tế bào (chiếm 14,85 %) và 16 mẫu kháng cả 3 dòng tế bào (chiếm 15,84 %)

42.57 11.88

Kháng dòng tế bào KB Kháng dòng tế bào FL Kháng dòng tế bào Hep-G2

Biểu đồ 2 So sánh hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu sinh vật biển

Bảng 3 Bảng tổng kết kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của 101 mẫu

Tổng số mẫu Số mẫu có hoạt

Bảng 4: Bảng tổng kết khả năng các dòng KB ,FL và Hep-G2của 101 mẫu

Có hoạt tính kháng KB

Có hoạt tính kháng FL

Có hoạt tính kháng Hep-G2

Từ kết quả trên, các mẫu có biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành xác

định giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) Đồng thời, các mẫu này cũng được tiến hành chiết phân bố trong các dung môi hữu cơ và các phân đoạn thu

được cũng được tiến hành xác định giá trị IC50 Kết quả chi tiết được trình bày trong báo cáo chính Các kết quả này góp phần định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

II.4 Hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu sinh vật biển thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH)

DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515nm

Giá trị SC biểu hiện khả năng bắt giữ các gốc tự do thông qua hệ ôxy hoá tự tạo bởi DPPH, được tính theo công thức đã được trình bày trong phần phương pháp

Bảng 5: Tổng hợp kết quả hoạt tính chống ôxy hoá của các mẫu sinh vật biển

Tổng số

mẫu

Số mẫu có hoạt tính

Mẫu dương tính

Tổng số mẫu

Biểu đồ 3 So sánh tỷ lệ % các mẫu thể hiện hoạt tính chống OXH

Kết quả xác định giá trị SC cho thấy, có 23/101 mẫu (chiếm tỷ lệ 22,72 %) có biểu hiện dương tính với giá trị SC > 50% Trong đó, có 18 mẫu có khả năng bao vây từ 50-70% các gốc tự do trong thử nghiệm DPPH và 5 mẫu có khả năng bao gây trên 70% các gốc tự do Kết quả tổng hợp được thể hiện trên bảng 5 và biểu đồ 3

Các mẫu có biểu hiện dương tính (SC% > 50 %) được tiếp tục tiến hành xác định giá trị SC50 (giá trị nồng độ mẫu thử có khả năng bao vây 50% các gốc tự do), đồng thời tiến hành chiết phân bố bằng các dung môi hữu cơ Các phân đoạn chiết này được tiếp tục tiến hành xác định giá trị SC% Các phân đoạn có biểu hiện dương tính lại tiếp tục

được xác định giá trị SC50 Kết quả thử nghiệm được trình bày chi tiết trong báo cáo chính Kết quả trên cho thấy sự phù hợp so với các tài liệu đã được công bố Chẳng hạn

với các mẫu KC-007 (Cladiella sp), KC-010 (Lobophytum sp), KC-014 (Sinularia

abrupta), KC-025 (Sarcophyton mililatensis) có biểu hiện hoạt tính có thể được giải

thích bởi thành phần chính của các chi san hô mềm này là các hợp chất đitecpen dạng cembranoit thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đáng quan tâm trong đó có cả hoạt tính chống ôxy hóa Đây là lớp chất có độ phân cực thấp nên sẽ phân bố chủ yếu ở dịch chiết hexan và cloroform, giải thích cho sự tập trung hoạt tính vào các dịch chiết này của các

mẫu san hô mềm trên Còn các mẫu KC-056 (Astropecten polyacanthus) và KC-061 (Holothuria scabra) có hoạt tính tập trung ở các phân đoạn BuOH và nước, có thể được

giải thích bởi thành phần hoạt chất chính của các chi sao biển và hải sâm trên đều là các steroit glycosit chứa nhiều đơn vị đường trong phân tử, có độ phân cực rất cao và do đó phân bố chủ yếu ở các phân đoạn BuOH và nước

B nghiên cứu hóa học theo định hướng hoạt tính sinh học một số đối tượng được lựa chọn

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu thập, giám định loài, tạo dịch chiết và sàng lọc hoạt tính sinh học, kết hợp với các tiêu chí lựa chọn là:

- Hoạt tính sinh học

- Mức độ khó khăn trong công tác lấy mẫu

- Trữ lượng thực tế của loài và khả năng có thể thu thập mẫu

- Tra cứu các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thành phần hóa học đã công bố về loài hoặc chi của đối tượng nghiên cứu

07 đối tượng phù hợp nhất đã được lựa chọn để tiến hành thu thập mẫu lượng lớn, tạo dịch chiết để phục vụ cho nghiên cứu hóa học đó là:

San hô mềm Sarcophyton mililatensis Alcyoniidae Côn Đảo, Bà Rịa -

Vũng tàu San hô mềm Cladiella sp Alcyoniidae Cồn Cỏ,

Quảng Trị Hải sâm trắng Holothuria scabra Holothuridae Cát Bà, Hải Phòng

Sao biển Archaster typicus Archasteridae Cát Bà, Hải phòng

Hải miên xốp Xestospongia testudinaria Petrosiidae Quần đảo Trường

Sa, Khánh Hòa Hải miên cành

Hạ Long, Quảng Ninh

Hải miên Ianthella sp Ianthellidae Quần đảo Trường

Sa, Khánh Hòa

Chương III Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học của một số loài san hô mềm

III.1 Kết quả nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của loài

san hô mềm sarcophyton mililatensis (ALcyoniidae)

- Tên Việt Nam: San hô mềm

- Tên khoa học: Sarcophyton mililatensis

- Thời gian thu mẫu: tháng 6 năm 2007

- Địa điểm thu mẫu: hòn Bảy Cạnh, huyện đảo Côn Đảo, tỉnh

Bà Rịa - Vũng Tàu

- Người định loài: TS Đỗ Công Thung và các cộng sự, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, VAST

Phân lập và tinh chế các hợp chất:

Sơ đồ III.1a: Chiết phân đoạn mẫu san hô mềm

C - Cặn cloroform (150 g)

San hô mềm Sarcophyton mililatensis tươi (20 kg)

- Chiết MeOH, cất loại dung môi dưới ấp suất giảm

- Loại muối bằng cách chạy qua cột Dianion với dung môi rửa giải là nước cất, sau đó thu hồi chất bằng MeOH

SM - Cặn chiết MeOH Bổ sung nước

Bổ sung cloroform cloroform: nước 1/1

B- Cặn BuOH (20 g)

BuOH: nước 1/1

N - Cặn nước (30 g)

Bổ sung BuOH Lớp nước

Lớp nước

Bổ sung MeOH

Bổ sung hexan

M - Cặn tan trong MeOH (50 g)

H - Cặn tan trong hexan (100 g) MeOH: hexan 1/1

Mẫu san hô mềm tươi (20 kg) được xay nhỏ và chiết 3 lần bằng MeOH nóng (50oC mỗi lần 3h) và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 200 g cặn dịch MeOH Cặn này được hòa vào nước cất và chiết phân đoạn lần lượt với các dung môi

cloroform và n-butanol Cặn dịch cloroform (150 g) được hòa vào metanol và chiết với

hexan thu được các cặn dịch: cặn tan trong hexan (100 g) và tan trong metanol (50 g) (sơ đồ III.1a) Cặn tan trong hexan được tiến hành chaỵ cắt thô trên sắc ký cột pha thường (Ф = 10 cm, L = 50 cm) gradient nồng độ axêtôn trong hexan từ 0 đến 100% thu

được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là H1 - H5 Phân đoạn H2 (70g) được tiến hành trên sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải là MeOH/nước 4/1 thu được các hợp chất

SM6 (50 g) và SM7 (0,5 g) (sơ đồ III.1.b)

Sơ đồ III.1.b: Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cặn hexan

Phân đoạn H4 (11 g) được tiếp tục phân tách trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải là hexan/axeton 7/1 thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn nữa ký hiệu là

H4A đến H4E Từ phân đoạn nhỏ H4B (3g) các hợp chất SM1 (40 mg), SM4 (20 mg)

và SM5 (9 mg) được làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ

dung môi rửa giải là MeOH/nước 5/1 Phân đoạn H4D (1 g) đuợc tiến hành phân lập trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải hexan/cloroform/MeOH 10/1/0.5 thu

được các hợp chất SM2 (15 mg) và SM3 (20 mg) (sơ đồ III.1.c)

H5 (5 g)

Cặn H - (100 g)

Silica gel CC Hexan/Axeton 100/0-0/100

Silica gel CC pha đảo

H4B (3 g)

H4C (2 g)

H4D (1 g)

H4E (4 g)

MeOH/H 2 O 5/1

Sơ đồ III.1.c Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cặn chiết M

Xác định cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất:

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng cách phân tích chi tiết các dữ kiện về hằng số vật lý, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng và so sánh các số liệu đó với các tài liệu đã được công bố Do khuôn khổ của báo cáo tóm tắt có hạn chúng tôi chỉ chình bày ở đây quá trình xác định cấu trúc của một hợp chất điển hình

SM1:

Hợp chất SM1 được phân lập dưới dạng chất dầu không màu Công thức phân tử

của nó được xác định là C21H34O3 bằng các dữ kiện phổ khối lượng (positive ESI-MS

Silica gel CC pha

SM10

(100 mg) Silica gel CC pha

đảo MeOH/H2O: 5/1