Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây lan một lá nervilia aragoana

Anandan đã nghiên cứu tất cả các chất chiết xuất được tập trung và phân tích bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký khí quang phổ kế để xác định các thành phần hoá học có trong thân rễ của

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT

NERVILIA ARAGOANA

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Thị Ngọc Mai

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em Các số liệu và kết quả nêu trong đồ án là đúng sự thật và chƣa có ai công bố ở các công trình khác

TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Trịnh Kim Thảo

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Trần Thị Ngọc Mai – Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TPHCM, người đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Mai Đình Trị - Trưởng phòng Hợp chất thiên nhiên hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ Hóa học, người trực tiếp quản lí, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp tại đây và em cũng xin cảm ơn đến những anh chị đang công tác tại đơn vị đã nhiệt tình và chỉ bảo để em

có thể hoàn thành tốt đồ án nghiên cứu của mình

Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TPHCM cũng như nhà trường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em được học tập nghiên cứu để hoàn thành đồ án này Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Đỗ Phương Vy, người đã hỗ trợ

và cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đồ án Xin gửi lời cảm ơn đến những bạn bè, anh chị đang nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ cùng nhau vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt

đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng xin cảm ơn những người thân yêu trong gia đình dành cho tôi sự quan tâm, chia sẻ, động viên, khích lệ trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để tôi hoàn thành đồ án này

Do thời gian thực hiện có hạn, kiến thức còn nhiều hạn chế nên đồ án thực hiện chắc chắn không tránh khỏi những sai sót nhất định Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để em có thêm kinh nghiệm và tiếp tục hoàn thiện đồ án tốt nghiệp của mình

TP.HCM, ngày 6 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện Trịnh Kim Thảo

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 3

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5.1 Đối tượng nghiên cứu 3

5.2 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana) 5

1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố 5

1.1.1.1 Phân loại khoa học 5

1.1.1.2 Phân bố 6

1.1.2 Đặc điểm thực vật 6

1.1.3 Thành phần hóa học 7

1.1.4 Giá trị dược liệu 9

1.1.5 Các nghiên cứu trên thế giới về Lan một lá (Nervilia aragoana) 11

1.2 Tổng quan về các phương pháp chiết xuất 12

1.2.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 12

1.2.1.1 Sự hòa tan 13

1.2.1.2 Sự khuếch tán 13

1.2.1.3 Quá trình thẩm tích 14

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 15

1.2.2.1 Nguyên liệu 15

1.2.2.2 Dung môi 16

1.2.2.3 Kỹ thuật chiết 17

1.2.3 Các phương pháp chiết 18

1.2.3.1 Phương pháp ngâm 18

1.2.3.2 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt 20

1.2.3.3 Các phương pháp chiết khác 21

1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa 21

1.3.1 Giới thiệu chung 21

1.3.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa 21

1.3.1.2 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể 22

1.3.1.3 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do 24

1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa 26

1.3.2.1 Flavonoid 26

1.3.2.2 Terpenoid 28

1.1.3 Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa 29

1.1.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng MDA 29

1.1.3.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 30

1.4 Tổng quan về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 32

1.4.1 Khái niệm chung 32

1.4.2 Cơ chế đối kháng 33

1.4.3 Một số loài vi khuẩn, nấm gây bệnh thường gặp 33

1.4.3.1 Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) 33

1.4.3.2 Trực khuẩn (Escherichia coli) 34

1.4.3.2 Nấm mốc Aspergillus 36

1.4.3.3 Nấm sợi Fusarium 37

1.4.3.4 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 38

1.4.4 Các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm in vitro 40

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 42

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 42

2.2 Vật liệu nghiên cứu 42

2.2.1 Nguồn mẫu 42

2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị 42

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 42

2.3.1 Thiết bị 42

2.3.2 Dụng cụ 43

2.3.3 Hóa chất 43

2.4 Phương pháp nghiên cứu 43

2.4.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu 43

2.4.2 Phương pháp tách chiết và thu nhận cao chiết 44

2.4.2.1 Phương pháp chiết ngâm dầm 44

2.4.2.2 Phương pháp chiết bằng máy Soxhlet 45

2.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 47

2.4.4 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar method) 49

2.4.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 51

2.4.6 Phương pháp xử lí số liệu 53

2.5 Bố trí thí nghiệm 53

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi của cao chiết cây N aragoana 60

3.2 Kết quả khảo sát quá trình chiết phân đoạn từ cao chiết cây N aragoana 61

3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH của cao chiết và các cao phân đoạn từ cây N aragoana 63

3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N aragoana 68

3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết và các cao phân đoạn

cây N aragoana 68

3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn cây N aragoana 70

3.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với các chủng vi sinh vật gây bệnh 75

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78

4.1 Kết luận 78

4.2 Kiến nghị 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 80

TSA :Tryptic Soy Agar

TSB : Tryptone Soya Broth

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao chiết Ethanol 63

Bảng 3.2 Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn PE 64

Bảng 3.3 Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn EA 65

Bảng 3.4 Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của cao phân đoạn nước 66

Bảng 3.5 Giá trị I % ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C 67

Bảng 3.6 Kết quả so sánh hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vậy gây bệnh 74

Bảng 3.7 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn đối với 5 chủng vi sinh vật gây bệnh 76

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Ảnh Nervilia aragoana 7

Hình 1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 34

Hình 1.3 E.coli quan sát dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm 35

Hình 1.4 Nấm mốc Aspergillus 37

Hình 1.5 Nấm sợi Fusarium 38

Hình 1.6 Nấm Neoscytalidium dimidiatum 39

Hình 2.1 Mẫu bột N aragoana 44

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 54

Hình 2.3 Mẫu bột chiết bằng hệ thống Soxhlet 56

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi cao chiết cây N aragoana 60

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn từ cao chiết cây N aragoana 62

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao Ethanol 63

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn PE 64

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn EA 65

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn % ức chế của cao phân đoạn nước 66

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn % ức chế của mẫu Vitamin C 67

Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn Escherichia coli 69

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng kháng sinh Ampicillin đối với vi khuẩn S.aureus 70

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Aspergillus niger 71

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Fusarium solani 72

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn hoạt tính kháng nấm của cao chiết, cao phân đoạn và đối chứng thuốc Ketoconazole đối với chủng nấm Neoscytalidium dimidiatum 73

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây dược liệu từ lâu được xem là cơ sở để điều trị các bệnh truyền nhiễm khác

nhau trong y học cổ truyền, và một loạt các hợp chất được biết đến mang tính chất

điều trị Các hợp chất có nguồn gốc thực vật đang có tầm quan trọng lớn trong dược

phẩm và các ứng dụng điều trị vì thường có ít tác dụng phụ và không gây độc.Việt

Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài

nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu

gần đây được ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn có công dụng làm thuốc,

52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc ở

Việt Nam Kết quả này cũng đã cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú

Con số này sẽ còn tăng thêm, nếu đi sâu điều tra cụ thể hơn một số nhóm

động - thực vật tiềm năng

Stress oxy hóa, gây ra bởi các gốc oxy, đuợc cho là nguyên nhân chính trong

các bệnh thoái hóa khác nhau như ung thư, xơ vữa động mạch, loét dạ dày Chất

chống oxy hoá là những hợp chất giúp ức chế nhiều phản ứng oxy hóa gây ra bởi

các gốc tự do như vậy như oxy đơn, superoxide, gốc peroxy, hydroxyl các gốc tự do

và peroxy nitrate, do đó ngăn ngừa hoặc trì hoãn thiệt hại cho tế bào và các mô

Mặc dù có một số chất chống oxy hoá tổng hợp các hợp chất như butylated

hydroxyl anisole (BHA) và butyl hóa toluene hydroxyl (BHT), thường được sử

dụng trong thực phẩm chế biến, tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng các hợp

chất này có thể có tác dụng phụ [21]

Bên cạnh những loại thuốc chống nấm, kháng oxy hóa được tổng hợp bằng

con đường hóa học được bày bán tràn lan trên thị trường không rõ độc hại thì tình

trạng tiêu thụ lạm thuốc kháng sinh tại Việt Nam ngày càng gia tăng Một nghiên

cứu của Bộ Y tế trong thời gian gần đây đã chỉ ra rằng, việc tự ý sử dụng thuốc

kháng sinh của người dân Việt Nam ở thành thị là 88%, trong khi ở nông thôn lên

tới 91%, không phải bệnh viện tuyến trung ương sử dụng thuốc kháng sinh nhiều

hơn các bệnh viện địa phương Mà ngược lại, tỉ lệ sử dụng kháng sinh ở các bệnh

viện tuyến trung ương chỉ chiếm gần 30% chi phí điều trị trong khi các bệnh viện tuyến tỉnh là 35%, tuyến huyện là 45%, sự quan tâm đến y học cổ truyền đã tăng lên Theo WHO đã đưa ra cảnh báo đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh có thể là nguyên nhân gây tử vong cho 10 triệu người trên toàn cầu Đáng báo động hơn, trong số các quốc gia có tình trạng kháng thuốc kháng sinh nghiêm trọng thì Việt Nam là một trong số những nước đứng đầu.

Để tìm ra giải pháp cho vấn đề sản xuất thuốc kháng kháng sinh, thuốc chống nấm, chống oxy hóa đồng thời giảm chi phí trong sản xuất và tiêu dùng dược liệu, các nhà khoa học bắt đầu tiềm kiếm và nghiên cứu các loài cây có chứa hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc Để làm được điều đó việc đầu tiên là cần phải xác định hoạt tính trị liệu và độc tính của một số loài thực vật trước khi dùng làm thuốc là điều rất cần thiết Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên,

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết

và các cao phân đoạn từcây Lan một lá (Nervilia aragoana)” nhằm nâng cao giá

trị sử dụng và góp phần vào kho tàng cây thuốc đặc hữu của Việt Nam

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Tại Việt Nam vẫn chưa tìm thấy tài liệu về nghiên cứu hoạt tính sinh học của loài cây Lan một lá, tuy nhiên ở một số nước trên thế giới đã có những nghiên cứu

liên quan được công bố:

- Năm 2009, K Himakar Reddy, P.V.G.K Sharma, và cộng sự đã so sánh hoạt tính chống nấm và chống oxy hoá từ chiết xuất Ethyl acetate của toàn bộ cây

Nervilia aragoana Gaud (Orchidaceae) với chiết xuất Ethanol của Atlantica monophylla Linn (Rutaceae) [21]

- Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T P, và cộng sự, đã nghiên cứu xác

định thành phần hóa học có trong thân rễ của Nervilia aragoana bằng phương pháp quang phổ [16]

- Năm 2013, Elizabeth Thomas và cộng sự đã nghiên cứu về đặc điểm, tác

dụng dược lý của cây Lan một lá [18]

- Năm 2013, EK Dilipkurma và GR Janardhana công bố kết quả nghiên cứu hoạt tính tái tạo tận, tuyến tụy và bình thường hóa lượng đường trong máu từ các

chiết xuất Nervilia aragoana trên đối tượng chuột [15]

3 Mục tiêu nghiên cứu

- Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao chiết và các cao phân đoạn cây

Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50)

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân

đoạn cây Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết

và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana

4 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tách chiết đến tỷ lệ thu hồi cao chiết

cây Nervilia aragoana Xác định hiệu suất chiết giữa các phương pháp tách chiết

- Xác định tỷ lệ thu hồi các cao phân đoạn sau trích ly của cao chiết cây

Nervilia aragoana

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bắt gốc tự do từ cao chiết và các cao phân

đoạn cây Nervilia aragoana Xác định nồng độ ức chế 50% gốc tự do (IC50) từ cao

chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia aragoana

- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao chiết và các cao phân

đoạn cây Nervilia aragoana đối với các chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết và các cao phân đoạn cây Nervilia

aragoana

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

5.1 Đối tượng nghiên cứu

Thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Nervilia aragoana, tiến hành khảo

sát các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm từ cao chiết các cao phân đoạn của loài cây này

5.2 Phạm vi nghiên cứu

Mẫu cây Nervilia aragoana được tách chiết từ dung môi Ethanol sau khi thu

cao chiết tiến hành trích ly cao chiết với các loại dung môi khác nhau từ kém phân

cực đến phân mạnh: Petroleum ether, Ethyl acetate, nước Sau đó cao chiết và các cao phân đoạn thu được tiến hành khảo sát khả năng kháng oxy hóa bắt gốc tự do DPPH (1,1-dihenyl-2-picrylhydrazyl); khả năng kháng khuẩn trên các vi khuẩn gây

bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus; khả năng kháng nấm trên các chủng

nấm gây bệnh như: Fusarium solani, Aspergillus niger, Neoscytalidium dimidiatum

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Lan một lá (Nervilia aragoana)

1.1.1 Phân loại khoa học và phân bố

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Hệ thống phân loại của Nervilia aragoana [34]

Species Nervilia aragoana GAUD

Nervilia bao gồm một số loài sau: Nervilia aragoana Commons ex Gaudich (Trân châu xanh, Thanh thiên quỳ xanh), Nervilia fordii (Hance) Schltr (Trân châu, Thanh thiên quỳ, Lan một lá, Lan cờ), Nervilia plicata (Andrews) Schltr (Trân

châu xếp, Thanh thiên quỳ lá xếp) [2], [35]

Một số tên gọi khoa học khác của Nervilia aragoana: Aplostellis aragoana (Gaudichaud-Beaupré) Ridley; Aplostellis flabelliformis (Lindley) Ridley; Epipactis carinata Roxburgh; Nervilia carinata (Roxburgh) Schlechter; Nervilia flabelliformis (Lindley) Tang & Wang; Nervilia scottii (Reichenbach f.) Schlechter; Nervilia tibetensis Rolfe; Nervilia yaeyamensis Hayata; Pogonia carinata

(Roxburgh) Lindley; Pogonia gracilis Blume; Pogonia flabelliformis Lindley;

Pogonia nervilia Blume; Pogonia scottii Reichenbach f [36], [37], [38], [39]

1.1.1.2 Phân bố

N aragoana là một loài hoa phong lan sống trên mặt đất (địa lan) được tìm

thấy chủ yếu ở những khu rừng rậm rạp ẩm ướt ở Ấn Độ [40], [41] Nó chủ yếu

được tìm thấy trong các khu rừng của Darjeeling Himalaya trồng ở độ cao

400 – 1000 m [28] Nó cũng được báo cáo là có trong dãy McIlwraith ở

Queensland, Australia, từ độ cao 0 – 150 mét Vì vậy cây chủ yếu được tìm thấy ở

Ấn Độ, Malaysia, bắc Thái Lan, Lào, Miến Điện, Indonesia và New Guinea

Ở nước ta Lan một lá mọc trên kẽ đá, nơi rợp vùng núi đá vôi và ở nơi ẩm

vùng chân núi Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Hoà Bình, Ninh Bình Cây chỉ mọc ở

khe núi, nơi thấp và ẩm ướt, dưới bóng cây to Miền núi phía bắc gồm: Văn Uyên,

Cao Lộc, Đồng Mỏ, Hữu Lũng, Trùng Kháng, Quảng Uyên (Cao Bằng) Gần đây

xuất hiện tại các tỉnh: Lao Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Hoà Bình, Sơn

La, Lai Châu…

Loài cây này cho ra hoa quả vào khoảng độ tháng 3 – 6 Thu hái vào mùa thu,

rửa sạch, phơi khô, vò nhẹ rồi phơi lại Phơi và vò ngày 2 – 3 lần cho tới khô hẳn

Cũng có thể thu hái toàn cây quanh năm, dùng tươi hay phơi khô

Hiện loài cây này đang bị suy giảm nghiêm trọng do chặt phá rừng hủy hoại

nơi cư trú và nhất là đối tượng săn tìm khai thác "tuyệt diệt" Nervilia aragoana

nằm trong danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2)

của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai

thác, sử dụng vì mục đích thương mại Vì vậy cần có biện pháp xây dựng khu bảo

tồn và nhân giống Lan trong các vườn quốc gia và di chuyển một lượng cây sống có

thể của loài này về khu vực bảo tồn và chăm sóc

1.1.2 Đặc điểm thực vật [17]

Cây thân thảo cao dưới 20 cm, mọc ở đất, có củ chìm, thân rễ tròn to 15 mm,

ra hoa và lá không đồng thời (cho ra hoa trước rồi mới đến lá) Cuống lá cao

10 – 15 cm Lá màu xanh, đôi khi có chấm màu tía sẫm, không có lông, dài 12 cm,

rộng 16 cm, hình tim rất rộng, mép hơi lượn sóng, thùy gốc ít nhiều phủ lên nhau

Cụm hoa cao tới 30 cm, cán mang vài bẹ nhỏ, dài 1,5 cm, hẹp Cuống và bầu dài

8 – 10 mm Lá đài và cánh hoa hẹp, xoè, màu xanh nhợt, dài 2 – 2,5 cm Môi ngắn hơn lá đài, màu trắng có các gân màu xanh hoặc tía nhạt; thùy bên nhỏ, hình tam giác, đứng, đỉnh xòe; thùy giữa hình trứng có mép cong, có lông ở trên gân.

Cây mới tái sinh bằng chồi và hạt Mọc rải rác trong rừng thưa, ở độ cao

200 – 500 m

Hình 1.1 Ảnh Nervilia aragoana [42]

1.1.3 Thành phần hóa học

Bhogaonkar và cộng sự cho biết thành phần hóa học của N aragoana bằng

cách sử dụng các xét nghiệm nhận dạng thông thường Kết quả nghiên cứu chỉ ra

rằng cây N aragoana có chứa hợp chất alkaloids, flavonoid, triterpenoid, khoáng

chất, acid amin Lá của cây được báo cáo là chứa flavonoid, glycosid cyanogenic, terpenoid và tannin [25], [27]

Beena và Radhakrishnan cũng báo cáo các thành phần hóa học loài cây này bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) các vết chất khác nhau được phát hiện có

trong chiết xuất cao Methanolic của N aragoana bằng cách soi đèn UV và phun

thuốc thử hiện màu Các tác giả cũng đã báo cáo về phân tích thành phần hóa học các chất chiết xuất từ thân, rễ và lá bằng các phương pháp xác định thành phần hóa học khác nhau Phân tích từ chiết xuất nước của rễ đã cho thấy sự hiện diện của flavonoid, glycoside, sterol và tannin Và phân tích từ chiết xuất nước của lá cho thấy sự có mặt của flavonoids, glycosides và tannin Họ cũng ghi nhận sự hiện diện của alkaloid có trong thành phần hóa học loài cây này [14]

Tohru và cộng sự đã báo cáo các acid béo khác nhau trong các chiết xuất khác nhau của toàn bộ cây khô Các chiết xuất ether của toàn bộ cây đã được phân tích bởi GC – MS sau khi methyl hóa và báo cáo có chứa các acid béo như methyl palmitate, methyl lenolate và methyl lenolinate Phần trung tính của chiết xuất ethereal được báo cáo chứa phytol, glyceride hỗn hợp, hai chất kết tinh tạo thành hỗn hợp các rượu triterpene Hỗn hợp này đã được xác định có chứa cycloeucalenol acetate, dihydrocyclonervilol acetate, dihydrocycloeucalenol acetate (Sau khi acetyl hóa), hai triterpene cyclonervilol và cyclohomonervilol theo phân tích GC – MS [32] Loài cây này cũng báo cáo có chứa 24 – Isopropenyl cholesterol [29] Các chiết xuất methanolic được báo cáo là chứa một lượng lớn L – norelucine bằng cách

so sánh trực tiếp với mẫu thực bằng phương pháp phân tích acid amin Phần hòa tan của chiết xuất methanolic được báo cáo có chứa hợp chất giống như chiết xuất ethereal [32]

Các cấu trúc hóa học thành phần hóa học được xác định có trong chiết xuất

của N aragoana báo cáo bởi Tohru Kikuchi được đưa ra dưới đây [32]:

Cycloeucalenol acetate

Dihydroeucalenol acetate

Stigmasterol

1.1.4 Giá trị dược liệu

Loài cây N aragoana đã có nhiều sử dụng trong y học cổ truyền và cũng trong

y học dân gian Củ và lá là những phần chính đƣợc dùng làm thuốc [40] Cây có tác dụng làm mát, thuốc lợi tiểu và thuốc bổ Hữu ích trong chữa đau dạ dày, đau thắt

ngực, đau thắt cổ, bệnh hoại tử [27] Củ được sử dụng làm thuốc cho điều trị chứng

động kinh, trong bệnh tiểu tiện, tiêu chảy và hen suyễn [40, 14] Củ tươi được làm

sạch đúng cách được tin rằng có thể giúp kiểm soát đói và khát [27], [33]

N aragoana còn có tác dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh tâm thần, liệt nửa người, ho

và nôn mửa [40]

Loài cây này đang được sử dụng như một loại thuốc được nhiều bộ lạc của Ấn

Độ sử dụng Các bộ lạc đã phát triển dược phẩm riêng của họ bằng những kiến thức

truyền thống của họ về việc sử dụng thuốc của thực vật từ các thử nghiệm và

phương pháp xưa N aragoana đang được sử dụng bởi bộ lạc Bhilla của

Maharashtra Bột củ được đắp trên trán cho chữa trị bệnh đau đầu [31] Có một vài

thông báo rằng các củ của cây này đang được sử dụng để điều trị bệnh kiết lỵ máu

do bộ tộc cư dân của cao nguyên Amarkantak, Madhya Pradesh, Ấn Độ Trong

phương pháp điều trị bệnh này, người dân tộc đã sử dụng củ của cây N aragoana

và được báo cáo là dùng làm hỗn hợp với mật ong 5 (ml), liều dùng là uống hai lần

một ngày trong năm ngày [13] Các lá của cây có thể dùng làm thuốc bảo vệ cho

phụ nữ sau khi sinh [33], [14], [26] Các nước sắc của lá cây này được sử dụng làm

thuốc bổ cho phụ nữ và củ được sử dụng như là một chất kích thích tăng lượng sữa

mẹ [27]

Theo Dược học cổ truyền Tàu và Việt Nam: Toàn cây và có khi chỉ lá được

dùng làm thuốc Vị thuốc được xem là: Vị đắng, tính mát Thân củ có tác dụng tán

ứ, tiêu thụng; trấn tinh, chỉ thống Toàn cây thanh nhiệt, giải độc, nhuận phế, chỉ

khái Được dùng trị bệnh tâm thần, ho, hạ đàm Làm nước sắc, hay ngâm ruợu trị

thương tổn, đau đớn, té ngã [35]

Theo tài liệu Trung Quốc thuốc có tác dụng trị lao phổi, làm mát phổi Dùng

ngoài làm thuốc xoa bóp, đáng gió giải cảm Thường ngâm trong rượu Công dụng,

chỉ định và phối hợp: ở nước ta đồng bào sử dụng lá làm thuốc giải độc, nhất là ngộ

độc nấm Người ta dùng 2 – 3 lá phơi khô thái nhỏ, hãm với nước sôi trong ít phút

rồi chiết nước uống Ngày uống 2 lần Người ta cũng dùng nó làm thuốc bồi dưỡng

cơ thể, thuốc bổ và mát phổi, chữa lao phổi, ho Ngày dùng 10 – 20 lá dưới dạng

thuốc sắc, thuốc hãm, hấp đường hoặc chế biến thành cao lỏng để uống Dùng ngoài lấy lá tươi giã nát, đắp lên các chỗ đau nhức hoặc đắp mụn nhọt các vết lở

Ở Trung Quốc, toàn cây được dùng trị: Ho lao phổi, viêm phế quản, viêm miệng, viêm họng cấp tính, tạng lao, trẻ em hấp thụ kém và nuôi dưỡng kém, rối loạn kinh nguyệt, đòn ngã tổn thương, viêm mủ da Liều dùng 10 – 15 g dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu Dùng ngoài giã củ tươi vừa đủ đắp vào chỗ đau [43]

1.1.5 Các nghiên cứu trên thế giới về Lan một lá (Nervilia aragoana)

Năm 2009, K Himakar Reddy, P.V.G.K Sharma, và O.V.S Reddy đã nghiên

cứu chiết xuất Ethyl acetate của toàn bộ cây Nervilia aragoana Gaud (Orchidaceae) và chiết xuất Ethanol từ bộ phận lá của Atlantica monophylla Linn

(Rutaceae) được đánh giá cho các hoạt động kháng nấm và kháng oxy hoá Kết quả nghiên cứu cho thấy chất này có hoạt tính ức chế hơn so với kháng nấm Thứ tự

của các giá trị MIC cho Nervilia aragoana là: Saccharomyces cerevisiae >

Aspergillus niger > Aspergillus fumigatus > Cryptococcus neoformans Đối với loài Atlantica monophylla là Cryptococcus neoformans > Candida albicans > Aspergillus niger

Thử nghiệm phương pháp DPPH được tiến hành để đánh giá khả năng chống

oxy hoá Chiết xuất N aragoana (85%) có hoạt tính bắt gốc tự do nhiều hơn

A monophylla (66%) [21]

Năm 2013, Elizabeth Thomas, Aneesh T P, Della Grace Thomas, R Anandan

đã nghiên cứu tất cả các chất chiết xuất được tập trung và phân tích bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký khí quang phổ kế để xác định các thành phần hoá học có

trong thân rễ của N aragoana Kết quả phân tích được trong chiết xuất Ethanol tập

trung chứa một loạt các acid béo Hợp chất 5 – hydroxyl – 2 - (hydroxyl methyl) – 4H – pyran – 4 – one có đặc tính chống nấm kháng khuẩn và ức chế sản sinh melanin Các chất chống viêm như acid hexadecanoic, hương thơm và hương liệu như 2 – octenoic acid, Acid pentadecanoic cũng được tiềm thấy trong chiết xuất này Chiết xuất Ether chứa acid hexadecanoic có hoạt động chống viêm, các chất hương liệu như acid pentadecanoic, 2 – chloroethyl linoleate, Isoamyl laureate là

chất làm sạch da, acid phthalic được sử dụng trong rối loạn thoái hoá cơ tim Các chiết xuất Methanol chứa vitamin C có hoạt tính chống oxy hoá Các lớp nước tách

ra khỏi chiết xuất Ethanol chứa 2 – propyl thiophene là một chất tạo hương vị

Nghiên cứu này tìm thấy sự tiềm năng của bộ phân rễ thân cây Nervilia aragoana

động kinh… [18]

Năm 2013, EK Dilipkurma, GR Janardhana đã nghiên cứu hoạt tính tái tạo

tận, tuyến tụy và bình thường hóa lượng đường trong máu từ các chiết xuất Nervilia

aragoana trên đối tượng chuột Mục đích của nghiên cứu này là khảo sát tiềm năng

hồi phục và tái tạo từ chiết xuất cồn của Nervilia aragoana Gaud Trên các mô hình

bệnh tiểu đường loại 2 gây ra streptozotocin – nicotinamide Ở nồng độ 5 mg/ml chiết xuất thực vật, nồng độ glucose máu trong chuột NIDDM cho thấy 65,91% và 76,58% giảm mức đường huyết vào ngày 0 và ngày 30 ngày Thiệt hại gây ra cho

mô thận là không đáng kể hoặc không nhìn thấy Urea và creatinine huyết thanh giảm 65,00% và 71,00% vào ngày 30 Mức độ thận và tụy giảm xuống tương ứng là 76,47% và 74,19% Những kết quả này chứng tỏ tiềm năng chống lại bệnh đái tháo

đường và tái phát của Nervilia aragoana Gaud [15]

1.2 Tổng quan về các phương pháp chiết xuất [6]

1.2.1 Các quá trình xảy ra trong chiết xuất

Trong chiết xuất, nguyên liệu thực vật thường được chia nhỏ thành các tiểu phần có đường kính thích hợp, thường từ 0,1 – 2 mm, các tế bào ngoài cùng thường

bị “vỡ” có thể tiếp xúc trực tiếp với dung môi, trong khi các tế bào phía bên trong vẫn còn nguyên vẹn dung môi và chất tan phải đi qua vách tế bào Vì thế, trong chiết xuất có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là:

độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi Nồng độ dung dịch phụ thuộc vào bản chất của dung môi, chất tan, số lượng của dung môi và chất tan

Sự hòa tan chủ yếu là một quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hóa và kéo vào dung môi Tuy nhiên quá trình hóa học đôi khi cũng xảy ra như khi hòa tan các chất kiềm trong dung môi có tính acid hay ngược lại

Sự hòa tan chất tan từ các tế bào vỡ sẽ đưa chất tan vào thẳng dịch chiết Quá trình tạo thành dịch chiết xảy ra nhanh vì dung môi không mất thời gian đi tới chỗ chất tan và dung dịch ngay khi đươc tạo thành đã là một bộ phận của dịch chiết Tuy nhiên, sự hòa tan này không có tính chọn lọc, tất cả những chất tan được trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết Sự hòa tan xảy ra trong các tế bào nguyên vẹn chỉ tạo nên dung dịch chất tan bên trong tế bào Sự hòa tan đơn thuần không đưa chất tan trong tế bào vào dịch chiết

1.2.1.2 Sự khuếch tán

Khi cho dung môi tiếp xúc với các tiểu phân dược liệu, ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan (các tế bào, còn nguyên hay bị vỡ) dung dịch có nồng độ cao hơn với những nơi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan tạo nên sự chênh lệch nồng

độ Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm làm triệt tiêu sự chênh lệch nồng độ này Các phân tử chất tan sẽ di chuyển từ nơi có nồng độ cao tới nơi có nồng độ thấp hơn làm cho chất tan có mặt đồng đều trong dung dịch

Sự khuếch tán trong dung dịch xảy ra được là do chuyển động nhiệt của phân

tử (chuyển động Brown) của chất tan cũng như của dung môi

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán gồm:

- Sự chênh lệch nồng độ

- Nhiệt độ

- Độ nhớt của dung môi

Sự khuếch tán giúp thúc đẩy quá trình hòa tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ

ra khỏi tế bào đi vào dịch chiết

1.2.1.3 Quá trình thẩm tích

Vách tế bào thực vật cấu tạo bằng cellulose và hemicellulose với những kênh bào tương (plasmodesmata, còn được gọi đơn giản là các ống trao đổi) thông thường giữa các tế bào

Các phân tử nhỏ như dung môi, các chất có phân tử lượng nhỏ có thể qua lại vách tế bào dễ dàng thông qua các kênh bào tương, các phân tử lớn hơn đi qua khó khăn hơn và đôi khi cần những cơ chế vận chuyển chủ động Việc di chuyển chất tan phân tử nhỏ qua các kênh bào tương trong quá trình chiết xuất được thực hiện bởi sự khuếch tán thụ động theo gradient nồng độ

Trong khuếch tán qua các kênh bào tương, đường kính của các kênh bào tương

sẽ quyết định kích thước và vận tốc của những chất có thể qua màng Các chất có kích thước nhỏ hơn các kênh bào tương (đa số các chất chuyển hóa bậc 2) sẽ đi qua

dễ dàng trong khi các phân tử lượng lớn (protein, polysaccharide…) sẽ khó đi qua hơn và sẽ nằm lại trong tế bào Như thế, sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hòa tan thẩm tích bao gồm:

- Sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào

- Cấu trúc của vách tế bào và các tiểu phân dược liệu

- Kích thước chất tan

- Nhiệt độ

- Độ nhớt của dung môi

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

1.2.2.1 Nguyên liệu

Bản chất của nguyên liệu

Bản chất của nguyên liệu đóng vai trò rất lớn trong quá trình chiết xuất Bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất

Độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tương càng lớn thì quá trình hòa tan chiết xuất xảy ra càng chậm Các nguyên liệu là gỗ quá trình chiết sẽ chậm hơn các nguyên liệu là lá hay cánh hoa

Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất qua lại vách tế bào càng dễ dàng Quá trình chiết xảy ra càng nhanh

Mức độ chia nhỏ của nguyên liệu

Nguyên liệu càng được chia nhỏ, tỉ lệ của số tế bào nguyên vẹn so với số tế bào bị “vỡ” giảm, quá trình hòa tan đơn giản tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết giảm, thời gian thẩm thấu qua vách tế bào giảm làm cho quá trình chiết nhanh hơn

Tuy nhiên càng chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm, dịch chiết càng có nhiều “tạp chất” làm cho lượng cao chiết nhiều lên, thành phần phức tạp và khó tách các chất hơn

Chất tan

Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết tách xảy ra càng nhanh Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng giảm

Quá trình hòa tan một chất vào dung môi là quá trình solvat hóa chất đó tạo nên một lớp solvat bên ngoài phân tử chất tan và giúp cho chất tan “phân tán” vào dung dịch Năng lượng solvat hóa có ảnh hưởng nhiều đến khả năng và tốc độ hòa tan

Năng lượng solvat hóa là năng lượng cần thiết để phá vỡ các liên kết giữa các phân tử chất tan trong pha rắn và tạo nên lớp vỏ dung môi Cấu tạo của dung môi,sự gia nhiệt là những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này

Dạng thù hình của chất tan có ảnh hưởng nhiều đến tốc độ hòa tan Các chất tồn tại dưới dạng vô định hình sẽ hòa tan nhanh hơn do bề mặt tiếp xúc với dung môi lớn, lực liên kết giữa các phân tử trong pha rắn nhỏ, dễ bị phá vỡ Đối với các dạng tinh thể, tốc độ hòa tan phụ thuộc nhiều vào cấu trúc tinh thể Các chất có nhiều nhóm có thể tạo các liên kết hydro liên phân tử như hydroxyl, carboxyl, amin, amid v.v… sẽ khó tan trở lại trong dung dịch khi được kết tinh Đặc biệt có những chất, liên kết hydro tạo nên giữa các phân tử quá lớn sẽ rất khó tan Ví dụ như các flavonoid có nhiều nhóm hydroxyl Dưới dạng tinh thể, các chất này tạo nên các

“polymer” rắn khá bền vững nên rất khó tan Muốn hoà tan cần có sự gia nhiệt trong một thời gian dài

Đa số các chất tan trong tế bào dược liệu đã phơi khô tồn tại dưới dạng vô định hình trong một hỗn hợp gồm nhiều chất nên sự hòa tan xảy ra nhanh hơn so với dạng tinh thể hay đơn chất Tuy nhiên cũng có trường hợp các chất khác làm cản trở sự hòa tan này do tạo các phức hợp khó tan với chất tan (ví dụ các tannat alkaloid) hay ngăn cản sự tiếp xúc của dung môi với chất tan (chất béo khi chiết dược liệu nhiều chất béo với dung môi phân cực, chất nhầy, protein khi chiết dược liệu với dung môi phân cực)

1.2.2.2 Dung môi

Khả năng hòa tan của dung môi

Khả năng hòa tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hòa tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn

Khả năng hòa tan của các chất trong các dung môi khác nhau thì khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và của dung môi Có những chất hòa tan tốt trong dung môi này nhưng lại hòa tan kém trong dung môi khác có đặc tính tương tự Có những chất hòa tan vừa phải trong 2 dung môi khác nhau nhưng lại tan tốt trong hỗn hợp của hai dung môi này…

Khả năng hòa tan chất tan của dung môi có thể dự đoán vào độ phân cực của

dung môi theo nguyên tắc “similia similibus solvuntur” dung môi phân cực hòa tan

các chất phân cực, dung môi kém phân cực hòa tan các chất kém phân cực Độ phân cực của dung môi thường được đánh giá bằng hằng số điện môi Hằng số điện môi càng lớn, dung môi càng phân cực

Độ nhớt của dung môi

Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra càng dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh

Sự thấm của dung môi qua vách tế bào

Vách tế bào thực vật là một màng thân nước Ở trạng thái tươi, nước trên vách cũng như trong tế bào ngăn cản không cho dung môi kém phân cực, ít tan trong nước thấm vào tế bào hay tiếp xúc với chất tan làm quá trình chiết với các dung môi này khó khăn hơn Ở các tế bào khô, lớp nước ngăn cách này đã mất đi nên quá trình chiết sẽ dễ dàng hơn

Trong chiết xuất bằng phương pháp ngâm, các chất tan từ trong tế bào khuếch tán ra làm cho nồng độ lớp dịch chiết ở ngay sát tiểu phân dược liệu là cao nhất, càng xa tiểu phân dược liệu nồng độ càng giảm dần Việc “giải tỏa” nồng độ của lớp dịch chiết ngay sát tiểu phân dược liệu chỉ do sự khuếch tán nên sẽ rất chậm Sự khuấy trộn sẽ làm cân bằng nồng độ của dịch chiết bên ngoài các tiểu phân trở nên

nhanh chóng hơn, giảm nồng độ của lớp dịch chiết ngay sát tiểu phân dược liệu làm cho quá trình chiết xuất xảy ra nhanh hơn

Nhiệt độ

Tăng nhiệt độ làm khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi và đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử và giảm độ nhớt của dung môi dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hòa tan, tăng quá trình khuếch tán làm cân bằng nồng độ

Áp suất

Tăng áp suất làm tăng tốc độ độ thấm dung môi vào nguyên liệu Thông thường sự tăng áp suất này thường đi kèm với việc tăng nồng độ dung dịch

Các yếu tố khác

Chất trợ tan: Các chất diện hoạt, một khi được sử dụng trong chiết xuất có tác

dụng làm tăng tính thấm của chất tan, làm quá trình phân tán chất tan vào dung môi

dễ dàng hơn do đó làm đẩy nhanh quá trình chiết xuất

Siêu âm và vi sóng: Siêu âm và vi sóng có tác dụng làm tăng chuyển động

nhiệt của các phân tử chất tan dung môi, làm tăng nhiệt độ, tăng sự hòa tan và đẩy nhanh quá trình khuếch tán

1.2.3 Các phương pháp chiết

1.2.3.1 Phương pháp ngâm

Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu

- Phương pháp ngâm lạnh:

Trong phương pháp ngâm lạnh, dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng Thời gian ngâm bình thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất Trong thời gian này cân bằng về nồng độ giữa hoạt chất bên trong và bên ngoài

thành tế bào được thiết lập và quá trình thẩm thấu sẽ kết thúc Thời gian ngâm có thể kéo dài hơn, từ một đến vài ngày, tùy theo dược liệu, loại dung môi và yêu cầu chiết xuất

- Phương pháp ngâm nóng:

Phương pháp ngâm nóng là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi

Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được

có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn

Quá trình hãm (hãm thuốc, hãm trà) trong y học cổ truyền và trong cuộc sống hằng ngày chính là quá trình ngâm nóng với dung môi là nước Chưng cũng có thể được coi là một biến thể của phương pháp này Các dụng cụ chiết đặc biệt cho phương pháp này ở quy mô vừa và nhỏ là Soxhlet và Kumagawa

- Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa

Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần với một lượng nhỏ dung môi Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet nhưng thực ra gần với phương pháp ngâm lạnh hơn

Ưu điểm: lượng dung môi sử dụng ít mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất Nhược điểm:

Khó thực hiện cho một lượng lớn dược liệu Thông thường, chỉ dùng để chiết trong phòng thí nghiệm hoặc quy mô pilot

Không khuấy trộn được trong quá trình chiết xuất

- Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi

Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi

Do được chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi nên khả năng hòa tan của chất tan vào dung môi thường là cao nhất và quá trình hòa tan xảy ra nhanh

Nhược điểm của phương pháp này là quá trình chiết phải được thực hiện trong các thiết bị thích hợp, trong nhiều trường hợp phải có bộ phận ngưng tụ dung môi

và phải gia nhiệt

Các phương pháp sắc, hầm hay nấu cao trong y học cổ truyền là phương pháp chiết với dung môi ở nhiệt độ sôi với dung môi là nước

Với các dung môi khác, dụng cụ chiết cần có bộ phận ngưng tụ dung môi nên cũng được gọi là phương pháp chiết hồi lưu

1.2.3.2 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt

Ngấm kiệt (Percolation) là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua dược liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định Quá trình hòa tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối dược liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi/dịch chiết đi từ nơi dược liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn

Do quá trình chiết xảy ra theo gradient nồng độ nên quá trình chiết xảy ra triệt

để hơn, lượng dung môi sử dụng ít hơn phương pháp ngâm và dược liệu được chiết kiệt hơn

Các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất điện hoạt… có thể được sử dụng để gia tăng quá trình chiết

Quá trình ngấm kiệt được thực hiện trong bình chiết được gọi là bình ngấm kiệt (percolator) Hình dạng, cấu tạo và kích thước của bình ngấm kiệt có thể thay đổi thùy theo mục đích sử dụng nhưng thông thường phần ngâm chính của bình ngấm kiệt có dạng hình nón cụt có thể kín và có van điều chỉnh lưu lượng ở một đầu hay có nắp kín với van điều chỉnh ở cả hai đầu

Quá trình ngấm kiệt có thể được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi (ngấm kiệt nóng) Bình được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao

Có thể thực hiện ngấm kiệt và rút kiệt dịch chiết trên từng bình ngấm kiệt riêng lẻ hay kết hợp nhiều bình ngấm kiệt nối tiếp với nhau (ngấm kiệt ngược dòng) Trong ngấm kiệt ngược dòng, hệ thống được bố trí sao cho dịch chiết loãng của bình chiết trước sẽ là dung môi đầu cho bình chiết sau và mỗi bình chỉ lấy ra một lượng dịch chiết đậm đặc nhất định Với ngấm kiệt ngược dòng, lượng dịch

chiết thu được từ mỗi bình luôn nhỏ hơn nhiều và có nồng độ cao nhất so với ngấm kiệt từng bình riêng lẻ mà vẫn đảm bảo chiết kiệt dược liệu

1.2.3.3 Các phương pháp chiết khác

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các

kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng tới hạn

1.3 Tổng quan về hoạt tính kháng oxy hóa

1.3.1 Giới thiệu chung

1.3.1.1 Khái niệm về stress oxy hóa [3], [10], [30]

Oxy hóa không thể thiếu với vi sinh vật ái khí Con người có thể nhịn ăn khá lâu song không thể nhịn thở quá 5 – 10 phút Khoảng vài thập niên gần đây, các thành tựu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa học Trong các quá trình đó, oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do

Từ đầu những năm 70 I.W.Fridovich đã nhận thấy rằng khi nhận một điện tử đầu tiên, oxy tạo ra gốc superoxyde Đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào

Từ gốc superoxyde (O2‾) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao được tạo ra như: HO (gốc hydroxyl), H2O2, 1O2 (oxy đơn bội), LO (gốc lipoxyde), LOO (gốc lipoperoxyde), RO (gốc alkoxyde), LOOH Tên chung của các gốc là các dạng oxy hoạt động

Các nhà khoa học cũng đã phát hiện rằng sự sản sinh ra nhiều dạng oxy hoạt động cũng có thể được loại bỏ bằng các chống oxy hóa (antioxidant), tự nhiên trong

cơ thể Tiêu biểu là enzyme superoxyd dismutase (SOD), glutathione (GSH), ezyme glutathione peroxidase (GSH – Px), enzyme catalase và phân tử nhỏ như: tocopherol, ascorbat

Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội môi (homeostasis) Do ảnh hưởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong

cơ thể, làm cho cân bằng này di chuyển theo hướng gia tăng các dạng oxy hoạt động Trạng thái sinh lý này được gọi là stress oxy hóa Hay nói một cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và oxy hóa theo các hướng tạo ra nhiều các oxy hóa

1.3.1.2 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể [11]

Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzyme hoặc không enzyme, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp

Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường

Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy Trong ty lạp thể có một hệ thống enzyme và các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyển nối tiếp nhau gọi là chuỗi hô hấp tế bào

Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai đoạn Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận được một điện tử Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo ra gốc superoxyde (O2‾) Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể Khoảng 80% lượng O2‾ hình thành chuyển vào ty lạp thể, còn 20% thoát ra bào tương O2‾

có các chức năng như sau: là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO và các chất phóng thải từ tế bào trong tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch

Các gốc O2‾ hình thành nhanh chóng được enzyme SOD chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử:

Ở cơ thể bình thường, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2‾, H2O2

để thực hiện các chức năng sinh lý Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô cùng thấp,

dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể

Sự hình gốc tự do ngẫu nhiên

- Sự hình thành gốc tự do không có enzyme SOD xúc tác

Các gốc O2‾ có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện không có enzyme

SOD xúc tác theo phản ứng sau:

O2‾ + O2‾ + 2H+ → H2O2 + 1O2 Oxy đơn bội (1O2) có tính oxy rất mạnh Nó có thể phản ứng với bất kỳ một chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd

- Phản ứng Harber – Weiss

Các gốc O2‾ va đập với H2O2:

O2‾ + H2O2 → 1O2 + OH + OH ‾ Phản ứng này xảy ra chậm, nhưng có mặt Fe2+, Cu2+ xúc tác thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh (phản ứng Fenton) Hai tiểu phân O2‾ và H2O2 không độc, có thể tạo ra 1O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào

- Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp

Ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2 thànhgốc OH

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH + OH ‾ Bình thường phản ứng này trong sinh học ít xảy ra, vì H2O2 ở nồng độ thấp còn Fe2+, Cu2+ thường bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do

Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2‾ Phản ứng này đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do xảy ra

Fe2+ + O2 → O2‾ + Fe3+

Cu2+ + O2 → O2‾ + Cu3+

Như vậy, từ các tiểu phân O2‾, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp biến sinh ra gốc OH và 1O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh Gốc OH phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn thương lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra

1.3.1.3 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do [11]

Hệ thống phòng vệ các gốc tự do trong cơ thể

Do việc sinh ra các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc bảo vệ chống lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu Đó là sự phòng vệ của các chất chống oxy hóa nội sinh trong cơ thể với hai phương cách tác động sau:

Phòng ngừa sinh ra các gốc

Khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc bao gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy và sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein như: transferrin, lactoferin, ferritin

Phòng vệ loại bỏ các gốc đã sinh ra

Ở trong tế bào quan trọng nhất là sinh enzyme SOD và hệ thống glutathione

Ở tổ chức màng thì quan trọng nhất là các chất kiểu vitamin E, ubiquinone, β – carotene loại bỏ các gốc LOO, LO theo phản ứng mỗi phân tử vitamin E này loại bỏ hai gốc LOO Ở pha nước có vai trò của vitamin C và một số chất như acid uric Việc sửa chữa loại bỏ các phân tử sinh học đã bị tổn thương trước khi chúng tích tụ lại hoặc trước khi chúng đủ mức gây ra những biến đổi chuyển hóa và định hướng đến sự sống của tế bào

Ví dụ: các protein đã bị oxy hóa sẽ bị proteinase phân hủy; các lipid màng sẽ

bị các lipase phân hủy, acyl transferase tác động

Hệ thống enzyme chống oxy hóa gan

Gan là cơ quan có nhiều enzyme trong đó những enzyme đóng vai trò quan trọng trong nhiều việc chống oxy hóa là: các chất chống peroxyd, enzyme SOD, phân hủy các gốc tự do khác, những ion khóa kim loại chuyển tiếp…, trong đó các chất chống peroxyd chiếm thành phần chủ yếu ở gan

- Các chất chống peroxyd

Đó là các chất glutathione (GSH), enzyme glutathione peroxidase (GSH – Px) xúc tác phân hủy các peroxyd với hằng số tốc độ phản ứng k = 108 mol/giây theo phản ứng sau:

2GSH + LOOH → LOH + GSHG + H2O Như vậy, hàm lượng GSH, hoạt độ enzyme GSH – Px liên quan đến việc phân hủy các peroxyd Khẩu phần ăn đủ protein và hàm lượng selen liên quan chặt chẽ với GSH và hoạt tính GSH – Px Nếu hàm lựng selen không đủ thì GSH giảm, hoạt

độ enzyme GSH – Px thấp Ngoài ra, peroxysom còn có catalase phân hủy H2O2 nồng độ cao theo phản ứng sau:

2H2O2

→ 2H2O + O2‾

- Enzyme superoxyd dismutase (SOD)

Enzyme này có khả năng phân hủy đặc hiệu các gốc O2‾ với hằng số tốc độ rất lớn (k = 109 mol/giây)

O2‾ + O2‾ + 2H+

→ H2O2 + O2 Bản chất của enzyme này là một protein có hai đồng phân là MnSOD (có trong ty lạp thể) còn có CuZnSOD có ở bào tương Cả hai đều xúc tác phân hủy gốc

O2‾

- Phân hủy các gốc tự do khác

Vitamin E (α – tocopherol) là chất chống oxy hóa quan trọng ở các tổ chức màng Mỗi phân tử vitamin E có khả năng loại bỏ bớt hai gốc LOO theo phản ứng sau:

2LOO + vitE(OH)2 → 2LOOH + vitE(O2) Ngoài phản ứng trực tiếp với gốc tự do vitamin E có khả năng loại bỏ oxy đơn bội theo phản ứng sau:

vitE + 1O2 → O2 + vitE* → vitamin E vitE*: dạng oxy hóa (dạng kích thích)

 Trong tế bào có nhiều chất có cấu trúc tương tự vitamin E như ubiquinone (coenzyme Q10 …) cũng có tính chất này

 Vitamin C: là những chất có khả năng loại bỏ các gốc tự do ở pha nước của

tế bào Ngoài ra vitamin C còn có khả năng tái tạo vitamin E dạng oxy hóa trở về dạng khử

 Những chất như acid uric huyết tương, GSH ở dịch tế bào cũng có tính chất loại bỏ gốc tự do

 Phân tử β - caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lượng kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thường và bản thân β

- carotene trở thành dạng kích thích, sau đó trở về trạng thái bình thường hoàn toàn bằng hiện tượng vật lý là năng lượng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng dưới dạng nhiệt

- Những protein khóa ion kim loại chuyển tiếp

Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Việc phức hóa các ion này, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc Trong cơ thể có nhiều protein có chức năng này Khóa sắt transferin, lactoferin Khóa đồng có ceruloplasmin Cơ thể khỏe mạnh chỉ cần 30% lượng các protein đã đủ khóa tất cả sắt và đồng ở dạng phức, không có ion sắt, đồng tự do trong cơ thể

1.3.2 Một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng oxy hóa

Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên được gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên

Lịch sử các hợp chất thiên nhiên có từ xa xưa Ngành y học cổ truyền của nhiều nước đã biết nhiều đến độc tính và tác dụng kháng oxy hoá của nhiều chất có nguồn gốc động thực vật Các nhóm hợp chất có trong tự nhiên bao gồm: terpennoid, steroid, flavonoid, alkaloid….Chúng là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp Các chất trao đổi thứ cấp được nghiên cứu nhiều do tác dụng dược lý và các hoạt tính sinh học của chúng

1.3.2.1 Flavonoid

Đại cương về flavonoid

Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản như sau:

O1 2

3 4 5

6 7

4'

5' 6'

O

Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen

A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6

Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân

A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc

dạng glycoside Các đường thường gặp nhất là đường D – glucose, kế đó là

D – galactose, L – rhamnose, L – arabinose, D – xylose, D – apiose và acid uronic

[39] Tại các vòng có liên kết với hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thế

một phần Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính acid Các

poliphenol có thể phản ứng với nhau qua các nhóm OH để tạo thành phân tử phức

tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các đường hoặc

protein

Hoạt tính kháng oxy hóa của flavonoid [44]

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “những người thợ sửa chữa

sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại

các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư

Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy

hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường

Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như -OH,

ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hoá…)

Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins

(còn được gọi là procyanidins) Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe

Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác

Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime,

trime…polime được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO

Năm 1986, Jacques Masquelier là người khám phá ra các đặc tính chống ôxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO Nhiều phương pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc

sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu Các phương pháp này cho thấy PCO có khả năng:

+ Bắt giữ gốc tự do hydroxyl

+ Bắt giữ lipide peroxide

+ Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide + Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt

+ Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase

+ Ức chế sự tổn thương do các enzyme (hyaluronidase, elastase,collagenase…) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết

- Các Flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ

1.3.2.2 Terpenoid

Đại cương về terpennoid [45]

Trong thiên nhiên, terpenoid chủ yếu có trong các loại thực vật Chúng có vai trò quan trọng đối với cơ chế bảo vệ cũng như trong việc sinh sản của nhiều loại cây, vì phát ra mùi hương và dẫn dụ côn trùng thụ phấn

Vào năm 1818 người ta đã tìm được một số hợp chất và xác định được rằng tỉ

lệ nguyên tử C : H ở tinh dầu là 5 : 8 Tiếp thep đó là một số hợp chất hidrocacbon không no, không vòng hoặc có vòng đã được tách ra Chúng có công thức tổng quát

là (C5H8)n , (n ≥ 2) và được đặt tên là Terpen Phân tử của các hợp chất này có các mạch nhánh là các nhóm CH3- xuất hiện một cách có chu kì trong mạch cacbon

Phân tử terpenoid có cấu tạo mạch hở hoặc mạch vòng và có chứa các liên kết đôi C=C

Cấu trúc của terpenoid được tạo thành do isoprene kết hợp với nhau theo kiểu

“ đầu nối với đuôi”, hoặc đuôi nối với đuôi Phân tử terpenoid có thể có 1 vòng hoặc nhiều vòng, có thể là vòng hở hay vòng kín và các liên kết phải tuân theo qui tắc isopren

Hoạt tính kháng oxy hóa của terpenoid

Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo Theo công bố của Mahato và công sự năm 1997 terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có tác dụng tăng cường sức khỏe

Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30 Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp

và có khả năng bị oxy hóa cao Nhiều loài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển Một số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua

đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật khác nhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay có rất ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế

1.1.3 Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa

1.1.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng MDA[4], [5], [20], [24]

Có nhiều phương pháp được dùng trong nghiên cứu quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào Các phương pháp này dựa trên:

- Sự nhận biết các gốc tự do trong chuỗi phản ứng như đo phát quang sinh học đánh giá các gốc LOO hình thành, đo lượng các dien liên hợp hình thành

- Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mô

Hai nhóm 1 và 2 đơn giản và dễ thực hiện hơn so với nhóm 3, đặc biệt là phương pháp xác định sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxyd hóa lipid: malonyl dialdehyt (MDA), là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxyd hóa lipid màng tế bào do đó được áp dụng rộng rãi trong thực tế

Phương pháp sử dụng acid thiobarbituric thường được áp dụng để xác định

hàm lượng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa in

vitro hoặc in vivo của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA Nguyên tắc

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 °C trong vòng 10 – 15 phút

Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu

1.1.3.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

Phương pháp sử dụng DPPH [12]

Marsden Blois là người đầu tiên đặt nền móng cho phương pháp DPPH cách đây gần 50 năm (1958), ở thí nghiệm đầu tiên Blois đã thử hoạt tính chống oxi hóa của amino acid cystein bằng cách dùng DPPH chuẩn độ nó rồi đo độ hấp thu theo thời gian ở bước sóng 517nm

Tên khoa học của DPPH là 1,1 diphenyl -2-picrylhydrazyl (2,2 picrylhydrazyl), là gốc tự do bền, màu tím, phân tử không bị dimer hóa như một số gốc tự do khác