NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst. THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI

Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst

THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC

Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ KIỀU Niên khóa : 2009 – 2013

Tháng 06/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ HÌNH THÁI QUẢ THỂ CỦA CÁC CHỦNG NẤM LINH CHI

Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst

THU THẬP Ở MỘT SỐ TỈNH TRONG NƯỚC

ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 06/2013

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, trau dồi kiến thức tại trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ

Chí Minh, với bao sự cố gắng, tôi có cơ hội thực hiện khóa luận tốt nghiệp này dưới sự

hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè để có thể hoàn thành trọn vẹn việc

học, tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ

nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả thầy cô đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi

trong thời gian tôi theo học tại trường

Cảm ơn thầy Lê Đình Đôn, cô Tô Thị Nhã Trầm đã hết lòng vì học trò, tận

tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình thực

hiện khóa luận

Chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Minh Quang và cô Võ Thị Thúy Huệ đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo và động viên, truyền đạt bao kiến thức quý báu để tôi hoàn thành

khóa luận này và là hành trang để tôi bước vào đời

Xin cảm ơn anh Phan Hữu Tín, anh Huỳnh Đăng Sang cùng các bạn sinh viên

nhóm nấm, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường đại học Nông Lâm Tp

Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Cảm ơn các bạn sinh viên lớp DH09SH, những người đã giúp đỡ, góp ý và chia sẻ

cùng tôi những khó khăn trong thời gian học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã quan tâm, hướng dẫn và hỗ trợ

tôi Chúc nhà trường, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trại thực nghiệm ngày càng phát

triển lớn mạnh

Sau cùng con chân thành gửi lời cảm ơn đến ba mẹ đã nuôi dưỡng, ủng hộ, tạo cho

con điều kiện tốt nhất và là chỗ dựa vững chắc để con có được hôm nay

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013

TÓM TẮT

Từ xưa đến nay, nấm Linh Chi đã được biết đến như một loại siêu thảo dược, một loại thần dược có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại bệnh, điều chỉnh cân bằng sinh lý, làm chậm quá trình lão hóa Nấm Linh Chi chứa nhiều dược chất quan trọng đặc biệt là polysaccharide (β – D – glucans) có khả năng ức chế tế bào ung thư Hiện nay, trên thế giới nấm Linh Chi đã được đưa vào quy mô sản xuất công nghiệp và mang lại lợi ích kinh tế vô cùng to lớn Ở Việt Nam, trong những năm gần đây nấm Linh Chi cũng được chú trọng trong sản xuất cũng như nghiên cứu, tuy nhiên việc sản xuất vẫn còn nhỏ lẻ, chủ yếu là tự phát Những nghiên cứu về giá trị kinh tế

và dược liệu của các chủng nấm Linh Chi ở Việt Nam vẫn còn nhiều hạn chế Do đó,

đề tài “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và hình thái quả thể nấm Linh Chi (Ganoderma

lucidum) ở một số tỉnh trong nước” được tiến hành nhằm đánh giá các chủng nấm về

mặt ý nghĩa kinh tế để đưa các chủng nấm vào sản xuất đại trà

Nội dung nghiên cứu: Khảo sát hoạt tính enzyme amylase và cellulase của các chủng nấm Linh Chi, đánh giá tốc độ lan tơ, hình thái quả thể và hiệu suất sinh học của từng chủng nấm Cải tiến quy trình ly trích DNA các chủng nấm Linh Chi thu thập được

Kết quả: Đánh giá được hoạt tính sinh học của enzyme amylase và cellulase giữa các chủng nấm Linh Chi Ghi nhận sự khác nhau về tốc độ lan tơ, đường kính và độ dày quả thể của từng chủng nấm, chọn ra các chủng có hiệu suất sinh học cao hơn so với các chủng nấm còn lại Ly trích DNA theo quy trình cải tiến mang lại kết quả tốt hơn, DNA sạch hơn và hàm lượng cao hơn so với quy trình cũ

Kết luận: Hai chủng nấm Linh Chi thu thập tại trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh và tỉnh Đồng Nai vượt trội hơn so với các chủng nấm còn lại về tốc độ lan

tơ, hình thái quả thể và hiệu suất sinh học Do đó, có thể đưa vào sản xuất, mang lại hiệu quả kinh tế cao Quy trình ly trích DNA sau khi cải tiến đảm bảo DNA ly trích được có chất lượng và hàm lượng cao hơn có thể sử dụng cho các phản ứng RAPD – PCR trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các chủng nấm Linh Chi

SUMMARY

The thesis title: Surveying biological and morphological fruiting body traits of

Ganoderma lucidum in provinces in Vietnam

Ancient times until nows, Ganoderma lucidum is well-known a super herbal,

which is a panacea with capacity of strengthen the immune system, prevention of

the diseases, adjustment of physiological balance, delay aging process Ganoderma

lucidum contain important phamaceutical substances, especially, β-D-glucans is

ability to inhibit process of cancel cells Nowadays, Ganoderma lucidum is used

into industrial production and bring a large of economical profit in the world In

Vietnam, in recent years, Ganoderma lucidum is also significantly notible for

production and study, but which happened in small scale and household There is a

few of studies about economical value and medicinal herbs of Ganoderma lucidum

species in Vietnam Therefore, the thesis “Survey biological and morphological

fruiting body traits of Ganoderma lucidumin some provinces in Vietnam” was conducted with purpose to evaluate Ganoderma lucidum species for economical

value to apply for production

Our research includes: Survey biological activity of amylase and cellulase enzyme

of Ganoderma lucidum species, evaluating of growth rate, morphological fruiting body

and biological performance of each strain Improving the protocol for DNA extraction

of collected Ganoderma lucidum species

These results are evaluated biological activity of amylase and cellulase enzyme of

Ganoderma lucidum species It is recorded the differences about growth rate, diameter

and thickness of fruiting body of each strain Choosing species, which is high biological performance compare with the others Extracted DNA followed advance protocol bring better results, DNA is clearner and higher concentration than old protocol

These conclusion are two Ganoderma lucidum strains were collected in Nong Lam

University, Ho Chi Minh City and Dong Nai province are superior than the others strains about growth rate, morphological fruiting body and biological performance Therefore, its can apply into production, bring high economic efficiency DNA extraction process after improving to ensure the extracted DNA were higher in quality and concentration, which’s able to use in RAPD – PCR reaction in the study of genetic diversity assessment of lingzhi mushroom

Key words: Ganoderma lucidum, morphological fruiting body Ganoderma lucidum.

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) 3

2.2 Vị trí phân loại của nấm Linh Chi 3

2.3 Nguồn gốc và sự phân bố của nấm Linh Chi 3

2.4 Đặc điểm hình thái của nấm Linh Chi 4

2.5 Đặc điểm sinh học của nấm Linh Chi 5

2.5.1 Đặc điểm sinh dưỡng của nấm Linh Chi 5

2.5.2 Điều kiện ngoại cảnh 6

2.6 Công dụng của nấm Linh Chi 6

2.6.1 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của Linh Chi 6

2.6.2 Công dụng của nấm Linh Chi 8

2.7 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Linh Chi trên thế giới và ở Việt Nam 10

2.7.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh Chi trên thế giới 10

2.7.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh Chi ở Việt Nam 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 13

3.2.1 Chủng nấm Linh Chi 13

3.2.2 Môi trường nuôi cấy nấm Linh Chi 13

3.2.3 Thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp phân lập và tăng sinh các chủng nấm Linh Chi 16

3.3.2 Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme amylase và cenllulase 16

3.3.3 Khảo sát tốc độ lan tơ và hình thái quả thể các chủng nấm Linh Chi 17

3.3.4 Tách chiết DNA 18

3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA các chủng nấm Linh Chi 18

3.3.4.2 Định tính DNA mẫu bằng phương pháp điện di trên gel agarose 19

3.3.4.3 Định lượng DNA mẫu bằng phương pháp đo mật độ quang 19

3.3.5 Phản ứng RAPD - PCR 20

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Khả năng tổng hợp enzyme amylase và cellulase của các chủng nấm Linh Chi 21

4.1.1 Khả năng tổng hợp enzyme amylase của các chủng nấm Linh Chi 21

4.1.2 Khả năng tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm Linh Chi 22

4.2 Sự phát triển của nấm Linh Chi trên bịch phôi 23

4.2.1 Thời gian tăng trưởng tơ nấm 23

4.2.2 Tốc độ tăng trưởng trung bình của tơ nấm 24

4.2.3 Tỷ lệ nhiễm nấm hại của các bịch phôi nấm Linh Chi 25

4.2.4 Thời gian xuất hiện quả thể của các chủng nấm Linh Chi 27

4.3 Độ lớn quả thể các chủng nấm Linh Chi 28

4.4 Trọng lượng quả thể và hiệu suất sinh học các chủng nấm Linh Chi 31

4.5 Kết quả ly trích DNA các chủng nấm Linh Chi 33

4.5.1 Kết quả định tính DNA các chủng nấm Linh Chi 33

4.5.2 Kết quả định lượng DNA các chủng nấm Linh Chi 35

4.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền nấm Linh Chi 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis of Variance

CMC Carboxyl Methyl Cellulase

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

PGA Potato Glucose Agar

PGAY Potato Glucose Agar Yeast

TBE Tris – borate – EDTA

UV Ultraviolet Radiation

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Linh Chi 6

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của G lucidum 6

Bảng 2.3 Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh Chi 7

Bảng 2.4 Phân loại Linh chi và tác dụng trị liệu 8

Bảng 3.1 Nguồn gốc các chủng nấm Linh Chi 13

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng RAPD – PCR 19

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD – PCR 19

Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải amylase của các chủng nấm Linh Chi 20

Bảng 4.2 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Linh Chi 21

Bảng 4.3 Tốc độ lan tơ trung bình của các chủng nấm Linh Chi 24

Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện quả thể của các chủng nấm Linh Chi 26

Bảng 4.5 Đường kính quả thể của các chủng nấm Linh Chi 27

Bảng 4.6 Độ dày quả thể của các chủng nấm Linh Chi 29

Bảng 4.7 Trọng lượng quả thể tươi của các chủng nấm Linh Chi 30

Bảng 4.8 Trọng lượng quả thể khô của các chủng nấm Linh Chi 30

Bảng 4.9 Hiệu suất sinh học của các chủng nấm Linh chi 31

Bảng 4.10 Kết quả đo OD của các chủng nấm Linh Chi ở quy trình chưa cải tiến 34

Bảng 4.11 Kết quả đo OD của các chủng nấm Linh Chi ở quy trình cải tiến 35

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Quả thể nấm Linh Chi 3

Hình 4.1 Vòng phân giải amylase của các chủng nấm Linh Chi 21

Hình 4.2 Vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Linh Chi 22

Hình 4.3 Tốc độ tăng trưởng của tơ nấm theo thời gian 23

Hình 4.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh của các chủng nấm Linh Chi 25

Hình 4.5 Tỷ lệ nhiễm các loại bệnh trên nấm Linh Chi 25

Hình 4.6 Đường kính quả thể các chủng nấm Linh Chi 28

Hình 4.7 Độ dày quả thể của các chủng nấm Linh Chi 29

Hình 4.8 Kết quả điện di DNA của 7 chủng nấm Linh Chi trên gel agarose 1% 31

Hình 4.9 Kết quả điện di DNA ly trích theo quy trình cải tiến trên gel agarose 1% 34

Hình 4.10 Sản phẩm của phản ứng RAPD – PCR 36

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm Linh Chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bát Lão Thảo, Vạn Niên Thảo, Trần Tiên Thảo, Đoạn Thảo, nấm Lim v.v Mỗi tên gọi của nấm Linh Chi đều thể hiện giá trị dược liệu của nó Tên gọi của nấm Linh Chi bắt nguồn từ Trung Quốc, có phiên âm

là Lingzhi, theo tiếng Nhật là Reishi hoặc Mannentake, tên khoa học là Ganoderma

lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst

Từ lâu, nấm Linh Chi (G lucidum) được biết tới như một loại thuốc dân gian có

tác dụng tăng cường sức khoẻ và chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu

đường, bệnh tim mạch, dị ứng, v.v) G lucidum có khả năng tăng cường sự thải độc

ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động hiệu quả hơn G lucidum còn

kìm hãm sự sinh tổng hợp DNA mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát triển của các khối u và hạn chế sự di căn Các nghiên cứu y và dược học cũng cho thấy các

loài G lucidum khác nhau có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt tính

khác nhau

Nhận thấy tầm quan trọng và lợi ích nấm Linh Chi mang lại rất lớn, một số nước trên thế giới đã đưa nấm Linh Chi vào quy mô sản xuất công nghiệp Các nước có sản lượng nấm Linh Chi sản xuất hằng năm lớn trên thế giới như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hoa Kỳ, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Sri Lanka và Indonesia Nấm Linh Chi mang lại lợi ích vô cùng lớn, việc phát triển ngành nấm là rất cần thiết Tuy trong những năm gần đây Việt Nam cũng phát triển nghề trồng nấm, nhưng chủ yếu là tự phát, quy mô sản xuất nhỏ lẻ, chưa đáp ứng được nhu cầu của xã hội Vì vậy, để phát triển ngành nấm, đặc biệt là nấm Linh Chi cần tuyển chọn những giống nấm Linh Chi có phẩm chất tốt, không nhiễm bệnh, phát triển nhanh, thời gian sinh trưởng, phát triển ngắn, có giá trị dược liệu cao, nhất là các giống Linh Chi rừng đặc trưng của rừng núi Việt Nam để đưa vào sản xuất và bảo tồn Chính vì thế, đề tài

“Nghiên cứu hoạt tính sinh học và hình thái quả thể của các chủng nấm Linh Chi

(Ganoderma lucidum) thu thập tại một số tỉnh trong nước” được thực hiện không chỉ

mang ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn góp phần vào việc nghiên cứu các chủng nấm Linh Chi ở nước ta

1.2 Yêu cầu của đề tài

Khảo sát đặc điểm sinh học và hình thái quả thể của các chủng nấm Linh Chi được thu thập ở một số tỉnh trong nước, chọn ra các chủng nấm có ý nghĩa về mặt

kinh tế để bảo tồn và phát triển

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát hoạt độ enzyme amylase và cellulase của các chủng nấm Linh Chi dựa vào kích thước đường kính vòng phân giải enzyme trên môi trường Czapek Dox có bổ sung tinh bột/CMC

Khảo sát tốc độ lan tơ của các chủng nấm Linh Chi trong phòng thí nghiệm

Khảo sát đặc điểm hình thái quả thể của các chủng nấm Linh Chi thu thập được ở một số tỉnh trong nước

Đánh giá năng suất sinh học của các chủng nấm Linh Chi thu thập được ở một số tỉnh trong nước

Thiết lập quy trình ly trích DNA từ các chủng nấm Linh Chi thu thập được nhằm đánh giá đa dạng di truyền các chủng nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu sơ lược về nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum)

Nấm dược liệu có nhiều loài như nấm Linh Chi, nấm Phục Linh, nấm Vân Chi, nấm Thượng Hoàng v.v Hầu hết chúng là những loài nấm mục gỗ, trong đó có nhiều loài chúng ta chưa phát hiện được giá trị của chúng Nấm Linh Chi ngày nay được rất nhiều người tin dùng và được xếp vào loại siêu thảo dược vì giá trị mà chúng mang lại rất lớn

Ở các nước châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, v.v, việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh Chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm Đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng

Trong số các loài Linh Chi tìm thấy cho đến nay thì Xích Chi (Ganoderma

lucidum) được nghiên cứu y dược chi tiết nhất Loài chuẩn Ganoderma lucidum

có thành phần hoạt chất sinh học phong phú và chứa hàm lượng nhiều nhất (Lê

Xuân Thám, 2005)

2.2 Vị trí phân loại của nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay

Chi: Ganoderma Hình 2.1 Quả thể nấm Linh Chi

Loài: Ganoderma lucidum (Leyss, Ex Fr.) Krast

2.3 Nguồn gốc và phân bố của nấm Linh Chi

Trong tự nhiên, Linh Chi mọc ở rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm, thường mọc trên thân cây mận, cây dẻ (pasania), và guercus serrata Tuy nhiên số lượng cây mọc được nấm Linh Chi là rất nhỏ Chính vì thế Linh Chi tự nhiên rất quý hiếm Trong lịch

sử đã có rất nhiều người tìm cách gây giống và trồng loại nấm này nhưng đều thất bại Mãi tới năm 1971, hai nhà bác học người Nhật Zenzaburo Kasai và Yukio Naoi, giáo

sư khoa Nông Nghiệp Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống, từ đó nấm Linh Chi bắt đầu đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp

Ganoderma lucidum gặp nhiều ở vùng lạnh Tứ Xuyên, Quảng Đông, Trung Quốc

Ở Việt Nam, có 15 loài Linh Chi đã được biết đến, mọc hoang ở rừng Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Gia Lai, Đắk Lắk

Hàng năm, trên thế giới sản xuất được khoảng 4300 tấn, riêng Trung Quốc trồng khoảng 3000 tấn còn lại là các nước khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hoa

Kỳ, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Sri Lanka và Indonesia Nhật Bản tuy đã tìm ra cách trồng nhưng chỉ sản xuất khoảng 500 tấn mỗi năm, đứng sau Trung Quốc Cách trồng nấm Linh Chi ngày càng phát triển, ở Việt Nam nhiều nhà nông nghiệp học cũng

đã nghiên cứu và lập ra một số trại trồng và bào chế nấm Linh Chi từ năm 1987 Hiện nay, đã có nhiều trang trại trồng và phát triển nấm Linh Chi như ở thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh khác trong cả nước

2.4 Đặc điểm hình thái của nấm Linh Chi

Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đính bên, đôi khi trở thành đính tâm do quá trình liền tán mà thành, có hình trụ, đường kính 0,5 – 3,0 cm Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc Lớp vỏ cuống không có lông, bóng, màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen

Mũ nấm dạng thận hay gần tròn, đôi khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng, mặt trên bóng như đánh vecni, màu từ vàng chanh, vàng nghệ đến vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, nâu tím, có đường vân đồng tâm, lượn sóng và vân tán xạ Phần cổ cuống đính hơi gồ lên hoặc lõm xuống Mặt dưới màu nâu nhạt, mang các ống rất nhỏ chứa bào tử, Bào tử khi chín có màu nâu Khi nấm trưởng thành thì phát tán bào tử Kích thước tán biến động lớn từ 2 – 36 cm, dày khoảng 0,8 – 3,3 cm

Phần thịt nấm dày 0,4 – 2,2 cm màu vàng kem, nâu nhạt, kem trắng, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới, thấy rõ các lớp trên các tia sợi hướng lên Trên lát cắt giải phẩu dưới kính hiển vi chỉ thấy đầu các sợi phình hình chùy, máng rất dày, đan khít nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 – 0,5 mm) bởi sự tiết các

chất laccate (tan mạnh trong cồn) Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước mà nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tỉa xuống đều đặn và tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – Hymenium) là một lớp vồng dày khoảng 0,2 – 1,8 cm có màu kem, nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn màu trắng hay màu chanh nhạt, khoảng 3 – 5 ống/mm

Đảm bào tử dạng trứng cụt (truncate), cấu trúc lớp vỏ kép (bitunicate), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu Kích thước dao động 8,0 – 11,5 x 6,0 – 7,7 μm

2.5 Đặc điểm sinh học của nấm Linh Chi

2.5.1 Đặc điểm dinh dưỡng của nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi là loại nấm gỗ Trong quá trình sinh trưởng, phát triển yêu cầu cung cấp đầy đủ các hợp chất cacbon, đạm, chất khoáng và chất sinh trưởng Nguồn cacbon chủ yếu là các loại đường đa, đường đơn Đối với các chất cao phân tử như lignin, cellulose và tinh bột thì chúng không thể sử dụng trực tiếp mà phải tiết ra các enzyme ngoại bào để phân giải thành các chất đơn giản để hấp thụ (Trần Văn Mão, 2004) Theo Lê Xuân Thám (1998), các loại bột ngũ cốc, bột cám gạo, bột bánh dầu được xem là nguồn dinh dưỡng cơ bản cho nấm, hàm lượng bổ sung của chúng khá cao: từ

15 – 20% so với tổng lượng cơ chất vì nấm Linh Chi đòi hỏi tỷ lệ C/N nhỏ

Theo Nguyễn Hữu Đống (2002), nấm Linh Chi hoại sinh rộng khắp trên các loài cây lá rộng đến lá kim, thậm chí ở các tre, trúc, dừa, cau, cọ dừa và nho Nấm Linh Chi tiết ra các enzyme phân giải màng tế bào endopolygalacturonase (endo – PG) và endopectin methyl – translinase (endo – PMTE) có tác dụng làm nhũn tế bào thực vật rất mạnh làm cho các loại gỗ và rễ cây bị mùn ra

Theo Trần Văn Mão (2008), nếu bổ sung nhiều đạm, sợi nấm sẽ mọc nhiều và khó hình thành quả thể Trong quá trình sinh trưởng sợi nấm tỷ lệ C/N là 25/1 và giai đoạn hình thành quả thể tỷ lệ C/N là 30/1 hoặc 40/1

Sự sinh trưởng của nấm Linh Chi còn cần các nguyên tố vi lượng như: Ca, P, Mg,

K (Trần Văn Mão, 2008)

2.5.2 Điều kiện ngoại cảnh

Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Linh Chi

Yếu tố Giai đoạn lan tơ Giai đoạn ra quả thể

4,5 – 6 Không cần

25oC – 30oC 90% – 95%

4,5 – 6 Cần ánh sáng tán xạ (Nguyễn Lân Dũng, 2002)

Ẩm độ giữa hai giai đoạn chính của nấm Linh Chi có sự khác biệt đáng kể nên trong quá trình nuôi trồng cần chú ý việc đảm bảo độ ẩm cho nấm

2.6 Công dụng của nấm Linh Chi

2.6.1 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của Linh Chi

Nấm Linh Chi được các nước trên thế giới nghiên cứu từ hơn 30 năm nay, chủ yếu

là nghiên cứu thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Các phương pháp cổ

điển trước đây đã phân tích thành phần hóa học tổng hợp của nấm Linh Chi như sau:

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của G.lucidum

phổ kế plasma (ICP), đã xác định chính thức gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong

nấm Linh Chi

Bảng 2.3 Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh Chi

Hoạt chất Nhóm chất Hoạt tính dược lý Loại mô nấm

RNA Nucleic acid Kích thích hệ miễn dịch

**(không xác

Bổ tim

Quả thể

Ganoderic acids Triterpenoid

Chống dị ứng Bảo vệ gan

Ức chế tổng hợp cholesterol

Quả thể

Ganodermadiol Triterpenoid Giảm huyết áp

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giãn cơ, giảm đau Hệ sợi nấm

β-D-glucans Polysaccharide

Chống khối u Kích thích hệ miễn dịch Tăng sản xuất kháng thể

2.6.2 Công dụng của nấm Linh Chi

Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh Chi đã được dùng để làm thuốc Các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh Chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời Sách “Thần nông bản thảo” có nói: “Linh Chi là thuốc kết tinh được cái quý của mây mưa trên núi cao, cái tinh của ngũ hành trong ngày đêm mà khoe năm sắc nên có thể giữ sức khoẻ cho các bậc đế vương” Đến đời Minh (năm 1590) trong sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân đã mô tả 6 loại Linh Chi và khái quát tác dụng trị liệu của Linh Chi

Bảng 2.4 Phân loại Linh Chi và tác dụng trị liệu

Tên gọi Màu Đặc tính dược lý

Thanh Chi

Vị chua, tính bình, không độc, chủ trị sáng mắt,

bổ gan khí an thần, tăng trí nhớ Hồng Chi

(Xích Chi, Đơn Chi) Đỏ

Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ trung, trị tức ngực

Tử Chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức khớp

xương, gân cốt

(Nguyễn Duy Đại, 2009)

Các nghiên cứu được thực hiện ở Trung Quốc và các nước phương Tây qua hàng ngàn năm đã khẳng định lợi ích của nấm Linh Chi, nó không phải là phép thuật chữa tất cả các loại bệnh nhưng Linh Chi cung cấp lợi ích to lớn đối với việc duy trì sức khỏe tốt và ngăn ngừa rối loạn Theo như nền y học cổ truyền Trung Quốc, Linh Chi là một trong những loại thuốc thảo dược mạnh và quý nhất, được coi là một loại thuốc có hiệu quả “thần thánh”, thuốc được sử dụng để bảo vệ sức khỏe Linh Chi hoàn toàn không có tác dụng phụ ngay cả khi dùng nhiều lần với số lượng lớn trong thời gian

dài, có thể dùng để điều tiết và ổn định thể chất sinh lý của con người, và đáng ngạc nhiên trong hiệu quả chống lại các bệnh hiểm nghèo (Lingzhi experts, 1987)

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông các tác dụng cụ thể của nấm Linh Chi được tập hợp vào những mặt lớn sau:

 Kiện não: làm sáng suốt, minh mẫn

 Bảo can: bảo vệ gan

 Cường tâm, cường phế: thêm sức cho tim, phổi

 Kiện vị: củng cố dạ dày và hệ tiêu hóa

 Giải độc: giải tỏa trạng thái nhiễm độc

 Giải cảm: giải tỏa trạng thái bị cảm

 Trường sinh: sống lâu, tăng tuổi thọ

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược tính, dược lý và sử dụng nấm Linh Chi, người ta thấy nấm Linh Chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như:

 Bệnh về tim mạch: tác dụng điều hòa, ổn định huyết áp

 Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh Chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn

 Khả năng miễn dịch: nấm Linh Chi có chứa một lượng lớn germanium hữu cơ, polysaccharide và triterpenes Những thành phần này đã được chứng minh là tốt cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta

 Chữa gan: điều trị 2 – 15 tuần thì tỷ lệ chữa bệnh hiệu quả khoảng 70,7 – 98%

 An thần: các kết quả nghiên cứu dược lý đã chứng minh Linh Chi có tác dụng

an thần, làm giảm hưng phấn của thần kinh trung ương, giảm đau

 Chế phẩm polysaccharide của Linh Chi dùng chữa chứng giảm bạch cầu (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

 Hiệu quả chống ung thư: nấm Linh Chi có thể ngăn chặn sự bám dính và di căn của những tế bào ung thư tuyến vú và tuyến tiền liệt Polysaccharide trong Linh Chi có tác dụng ức chế các tế bào ung thư, tăng miễn dịch cơ thể Bác sĩ Fukumi Morishige, chuyên gia giải phẫu tim đang nghiên cứu công dụng của Linh Chi trong việc trị bệnh ung thư tại viện Linus Paulong Institate of Science and

Medicine (Hoa Kỳ) cho biết dùng Linh Chi chung với Vitamine C liều lượng lớn

có tác dụng mạnh hơn vì Vitamine C tăng tính hấp thụ dược tính của Linh Chi (Nguyễn Thị Hương, 2008)

 Ngoài ra, Linh Chi còn được dùng để chữa bệnh mất ngủ, lở dạ dày, tê thấp, suyễn sưng cổ họng Người Trung Quốc hiện nay còn dùng Linh Chi để làm mịn

da mặt Nhiều y gia Nhật Bản đã dùng loại nấm này trong các loại thuốc trị rụng tóc Vì tác dụng bổ khí và làm tăng hệ thống miễn dịch của cơ thể mà Linh Chi đã được sử dụng trong phòng chống ung thư

Từ những tính năng tác dụng của Linh Chi mà người ta xếp nó vào loại dược liệu

đặc biệt mà những sinh vật khác không thể có được (Nguyễn Hữu Đống, 2003)

2.7 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh Chi trên thế giới và ở Việt Nam 2.7.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh Chi trên thế giới

Việc nuôi trồng nấm Linh Chi được ghi nhận từ năm 1621, nhưng đến hơn 300 năm sau (1936) với thành công của GS Dật Kiến Vũ Hưng (Nhật Bản) thì ngành nuôi trồng nấm mới được phổ biến.Năm 1936, Nhật Bản đưa nấm Linh Chi vào sản xuất đại trà và sản lượng tăng vọt Nếu tính đến công trình tổng quan của Jong và Brirmingham (1992), thì thống kê chưa đầy đủ cho con số trên 200 công trình khảo cứu hóa dược lý của các loài nấm Linh Chi

Theo Wang (dẫn theo Chang, 1993), từ đầu thế kỷ XVII, Trung Quốc đã nuôi trồng đại trà nấm Linh Chi do giá trị mà nó mang lại quá lớn Ở Đài Loan, Peng (1990) và Hseu (1992) đã sưu tầm, nuôi trồng với hơn 10 loài nấm Linh Chi khác nhau

Hàn quốc cũng chiếm một thị phần đáng kể và được đặc biệt chú trọng là loài Linh

Chi cổ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u cao (Lê Xuân Thám, 1998),

song Trung Quốc vẫn là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng và sản xuất nấm Linh Chi trên thế giới

Gần đây, ở các nước Đông Nam Á cũng bắt đầu nuôi trồng nấm Linh Chi Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình ngắn ngày Thái Lan đã có một số trang trại nuôi trồng nấm Linh Chi cỡ vừa, góp phần vào sản lượng chung cho thế giới

Do giá trị dược liệu cao của các chủng nấm Linh Chi, nên Mỹ đã bắt đầu nghiên cứu và nuôi trồng ở quy mô công nghiệp Vào tháng 7/1994, hội nghị Nấm học thế

giới tại Vancouver (Canada) đã quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh Chi quốc

tế, trụ sở đặt tại New York (Mỹ) Tháng 10/1994, hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh Chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc Tháng 7/1996, Hội nghị quốc tế nấm học châu Á lại dành một năm hội thảo cho các báo cáo về nấm Linh Chi tại Đại học Chiba (Nhật Bản) Tháng 8/1996, Hội nghị Quốc tế nghiên cứu nấm Linh Chi được tổ chức tại trung tâm hội nghị quốc tế Đài Bắc (Đài Loan) Tại mỗi hội nghị số lượng báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú kì thú của nấm Linh Chi

Hiện nay, nghề trồng nấm đã phát triển trở thành ngành công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt phải kể đến là Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ và một số nước khác

Ở châu Âu và Bắc Mỹ, ngành công nghiệp trồng nấm đã được cơ giới hóa toàn bộ nên năng suất và sản lượng rất cao Ở nhiều nước châu Á, trồng nấm còn mang tính chất thủ công, chủ yếu là trên quy mô gia đình và trang trại, sản lượng chiếm 70% tổng sản lượng nấm ăn của toàn thế giới Hàn Quốc nổi tiếng với nấm Linh Chi, mỗi năm xuất khẩu nấm thu về hàng trăm triệu USD Đến nay công nghệ nuôi trồng nấm ở các quốc gia này đã phát triển ở quy mô công nghiệp hiện đại và đem lại nguồn lợi nhuận khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu

2.7.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm Linh Chi ở Việt Nam

Ngành nuôi trồng nấm dược liệu ở nước ta trong những năm gần đây phát triển mạnh mẽ, tổng sản lượng ước tính đạt khoảng 100.000 tấn/năm Với công nghệ ngày càng hiện đại, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu thành công các nguồn nguyên liệu nuôi trồng nấm Linh Chi thay cho mùn cưa cao su trước đây Kết quả này đã góp phần tránh lãng phí và hạn chế sự ô nhiễm môi trường bởi nguyên liệu được sử dụng là phế thải từ các nhà máy đường, công nghiệp dệt như: bã mía, bông thải (Nguyễn Hữu Đống, 2002)

Vào năm 1978, Viện Dược liệu Hà Nội đã trồng thành công nấm Linh Chi (giống nấm của Trung Quốc) Năm 1987, các nhà khoa học thuộc đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội đã chọn được giống nấm Linh Chi tự nhiên, mọc ở vùng rừng núi Lâm Đồng để nhân giống và đưa vào sản xuất đại trà tại trại trồng nấm Linh Chi của xí nghiệp dược phẩm TW 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988 Trong

20 năm trở lại đây việc trồng nấm Linh Chi ở thành phố Hồ Chí Minh thực sự phát triển (Lê Duy Thắng, 2006)

Hiện nay, các chế phẩm từ Linh Chi đã được con người ưa chuộng và sử dụng ngày càng rộng rãi với nhiều hình thức đa dạng về chủng loại như: thuốc tiêm, cồn thuốc, cao dán, thuốc xông và cao thuốc dùng ngoài Việc nghiên cứu phân lập nhóm hoạt chất làm thuốc còn rất hạn chế, cần được quan tâm nhiều hơn Trong công nghiệp điều chế thuốc, nhóm polysaccharide rất được chú ý Ngoài ra các acid amin và các nguyên

tố vi lượng cũng được quan tâm

Đặc biệt trong một vài năm gần đây, con người đã tìm kiếm và phát triển một lượng khá lớn nấm cổ Linh Chi tại một số vùng núi cao ở nước ta Đây là một kho tàng sản phẩm quý giá của y dược Việt Nam, cần được nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng đưa vào sản xuất, khai thác và phát triển các chủng nấm Linh Chi ở nước ta (Nguyễn Thượng Dong, 2007)

Tóm lại, phát triển ngành trồng nấm ở nước ta hiện nay là điều tất yếu Nó không chỉ giải quyết về vấn đề môi trường, lao động mà còn mang lại lợi ích kinh

tế cho người nuôi trồng Tuy nhiên để nghề trồng nấm nhanh chóng phát triển ở nước ta, bên cạnh sự vận động theo nhu cầu xã hội, cần có sự đầu tư về mặt khoa học như giống nấm, kỹ thuật nuôi trồng, vấn đề phòng bệnh, chế biến sản phẩm, cung cấp thông tin cũng như huấn luyện kỹ thuật trồng nấm và nhất là có chính sách ưu đãi cho người trồng nấm như cho vay vốn ưu đãi, miễn giảm thuế (Nguyễn Phương Hà, 2009)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường,

trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh từ ngày 15/12/2012 đến ngày 15/6/2013

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Chủng nấm Linh Chi

Bảng 3.1 Nguồn gốc các chủng nấm Linh Chi

Nấm Linh Chi thu thập tại Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Nấm Linh Chi thu thập tại Củ Chi Tp Hồ Chí Minh

Nấm Linh Chi thu thập tại Quảng Nam

Nấm Linh Chi thu thập tại Đà Lạt

Nấm Linh Chi thu thập tại Bình Dương

Nấm Linh Chi thu thập tại Đồng Nai

Nấm Linh Chi thu thập tại Hà Nội

LC-NL LC-CC LC-QN LC-DL LC-BD LC-DN LC-HN

3.2.2 Môi trường nuôi cấy nấm Linh Chi

 Môi trường phân lập PGA (Potato Glucose Agar)

Chuẩn bị môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng cho vào 600 ml

nước cất, nấu cho tới khi chín nhừ khoảng 30 phút Chiết lấy nước, thêm agar vào nấu

cho tan Bổ sung nước cất cho đủ 1000ml Đun sôi trở lại, thêm glucose chiết nhanh

vào ống nghiệm, mỗi ống 3 – 5 ml, làm nút bông và khử trùng Đặt các ống nghiệm

nằm nghiêng khoảng 15o (so với mặt bàn)

 Môi trường tăng sinh PGAY (Potato Glucose Agar Yeast)

Chuẩn bị môi trường: Tương tự môi trường PGA nhưng có bổ sung cao nấm men

 Môi trường Czapek dox bổ sung tinh bột

 Môi trường meo lúa

Nguyên liệu gồm hạt thóc và cám gạo hoặc bột ngô Môi trường thóc hạt chủ yếu

để làm và nhân giống cấp 2

Thóc hạt tốt (đã được thu hoạch từ năm trước) được ngâm qua đêm rồi đãi sạch Cho thóc vào nồi cùng với nước ngập thóc và đun sôi cho nứt vỏ thóc (thời gian sôi khoảng 20 – 30 phút)

Vớt thóc cho vào rổ, rá hoặc thúng tre để ráo nước (độ ẩm đạt 70 – 75%), sau đó trộn cám gạo và bột ngô theo tỉ lệ quy định (5 – 10%)

Đóng nguyên liệu vào túi polyetylen chịu nhiệt hoặc chai thủy tinh chịu nhiệt, đậy nút bông và khử trùng bằng nồi hấp, 1 atm (1210C) trong thời gian 90 phút

Sau khi khử trùng, cho nhiệt độ hạ xuống bình thường thì có thể sử dụng để cấp giống hoặc cất giữ ở nhiệt độ thấp (100C) để sử dụng dần

 Môi trường bịch phôi nấm Linh Chi

Nguyên liệu chính là mùn cưa (tươi hoặc khô của các loại cây mềm không có tinh dầu và không độc hoặc một số cây thân thảo: rơm rạ…) Ở nước ta mùn cưa cao su đáp ứng tốt yêu cầu và rất phong phú Mùn cưa vừa mới được mua về, ủ đống tự nhiên nơi khô ráo, thoáng mát

Tiến hành tạo ẩm và bổ sung thêm dinh dưỡng vào mùn cưa Đảo đều sao cho độ

ẩm cuối cùng đạt khoảng 60% độ ẩm của cơ chất trồng nấm Cơ chất đã được trộn đều, loại bỏ những mảnh dăm bào và gỗ còn sót lại Sau đó tiến hành cho cơ chất được sàng vào bịch nylon chịu nhiệt và nện nhẹ, đồng thời xoay tròn bịch để cơ chất được nén đều vừa đủ chặt

Mỗi bịch cơ chất có trọng lượng 1,2 – 1,5 kg/bịch Buộc cổ bịch, dùng bông không thấm bịt miệng bịch và đậy nắp nhựa chuyển vào nhà hấp khử trùng

3.2.3 Thiết bị và hóa chất dùng trong thí nghiệm

Hóa chất ly trích DNA: Dung dịch TE (10 mM Tris HCl, pH = 8, 1 mM EDTA); Extraction buffer (200 mM Tris HCl, pH = 8, 25mM EDTA, 250 mM NaCl, 0,5% SDS); Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25 : 24 : 1); Isopropanal; Natri acetate; Ethanol 70o; Chloroform : Isoamyl alcohol (24 : 1)

Hóa chất dùng cho điện di: TBE 0.5X; Gel Agarose; Loading dye; Dung dịch

nhuộm Ethidium bromide

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Nồi hấp khử trùng; Tủ cấy vô trùng; Tủ sấy; Cân điện tử; Máy vortex; Bếp điện; Máy điện di; Máy chụp ảnh gel, máy chạy PCR, máy

đo OD, buồng ủ Water bath

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập và tăng sinh các chủng nấm Linh Chi

Các chủng nấm Linh Chi được thu thập tại một số tỉnh trong nước (Hồ Chí Minh,

Hà Nội, Đồng Nai, Bình Dương, Quảng Nam, Lâm Đồng)

Cách thức lấy mẫu: Chọn những quả thể nấm (có cả cuống) to, khỏe, không bị mọt, không nhiễm bệnh Dùng dao nhỏ cắt nhẹ vào phần gốc nấm, tránh cầm mạnh làm dập phần cuống nấm Mỗi giống lấy 2 – 3 quả thể nấm cho vào bịch nhựa vô trùng, ghi tên từng giống và đưa về phòng thí nghiệm để phân lập

Cách thức phân lập: Mẫu nấm được rửa sạch, lau khô, vô trùng bằng cồn 70%, cắt ngang phần quả thể và cuống nấm, chọn phần thịt nấm bên trong để tránh hiện tượng nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài Sau đó cấy qua môi trường phân lập PGA, sau 3 – 5 ngày quan sát sự phát triển của tơ nấm, loại bỏ những ống nghiệm bị nhiễm Các giống nấm được phân lập xong sẽ cấy chuyền qua môi trường PGAY để tăng sinh khối và

giữ giống cho các thí nghiệm tiếp theo

3.3.2 Khảo sát khả năng tổng hợp enzyme amylase và cellulase

Sau 3 – 5 ngày quan sát các vòng phân giải amylase/cellulase của các mẫu nấm

Đo đường kính vòng phân giải enzyme amylase/cellulose trung bình của từng mẫu nấm Linh Chi

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (7 giống nấm Linh Chi), tiến hành 3 lần lặp lại Tổng số đĩa petri thí nghiệm là 21 đĩa petri có chứa môi trường Czapek dox có bổ sung tinh bột để khảo sát hoạt tính enzyme amylase và

21 đĩa petri có chứa môi trường Czapek dox có bổ sung CMC để khảo sát hoạt tính enzyme cellulase

 Các chỉ tiêu theo dõi

Cho thuốc thử Logul vào trong từng đĩa môi trường sau 3 – 5 ngày cấy Đo đường kính trung bình của vòng phân giải trong từng nghiệm thức bằng thước kẻ Đánh giá

hoạt tính enzyme amylase và cellulase của từng giống nấm Linh Chi

3.3.3 Khảo sát tốc độ lan tơ và hình thái quả thể các chủng nấm Linh Chi

 Tiến hành thí nghiệm

 Mỗi giống nấm Linh Chi chọn ra 1 ống nghiệm chứa môi trường PGAY có tơ nấm phát triển mạnh nhất

 Cấy chuyền ra môi trường meo lúa

 Từ meo lúa, mỗi giống nấm sẽ được cấy vào 10 bịch phôi

 Khảo sát tốc độ lan tơ của từng mẫu nấm

 Thí nghiệm lặp lại 3 lần

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (7 giống nấm Linh Chi), tiến hành 3 lần lặp lại Tổng số bịch phôi thí nghiệm là 210 bịch phôi, 10 bịch phôi cho mỗi ô nghiệm thức

 Các chỉ tiêu theo dõi

Chọn những bịch nấm phát triển đồng đều, lấy ở mỗi ô nghiệm thức 3 bịch để tiến hành theo dõi Đối với mũ nấm, chọn mỗi quả thể nấm trong mỗi bịch phôi được theo dõi để đo

 Đường kính quả thể (cm): đo đường kính dài nhất của quả thể bằng thước kẻ

 Độ dày mũ nấm (cm): cắt theo chiều từ mặt trên xuống mặt dưới của mũ nấm ở

vị trí đi qua cuống nấm và dùng thước đo

Tỷ lệ nhiễm (%): số bịch phôi bị nhiễm trong quá trình thí nghiệm của từng nghiệm thức/tổng số bịch phôi trong mỗi ô nghiệm thức*100

Thời gian xuất hiện quả thể (ngày): tính từ ngày bắt đầu cấy bịch phôi đến ngày xuất hiện quả thể đầu tiên trong các nghiệm thức

 xi: tốc độ sinh trưởng (cm/ngày)

 ni: số ngày quan sát

3.3.4 Tách chiết DNA

3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA các chủng nấm Linh Chi (Lê Hữu Phước, 2011)

Mẫu nấm được nuôi cấy trong môi trường PGAY ở điều kiện 25oC Sau 5 – 7 ngày

tơ nấm bắt đầu phát triển tiến hành các bước sau:

 Cân 0,5 g tơ nấm (có chứa môi trường thạch) cho vào các eppendorf

 Cho vào mỗi eppendorf 500μl dung dịch TE

 Ly tâm 13000 rpm (vòng/phút) trong 5 phút, đổ dung dịch lỏng ở trên, lấy phần tủa dưới tube, thêm 300μl Extraction buffer

 Dùng chày nghiền nhỏ sợi nấm thật kỹ, lắc nhẹ, đều, đặt trong tủ đông -20oC trong vòng 20 phút

 Lấy mẫu ra làm tan đá và ly tâm 13000 rpm trong 5 phút, chuyển phần dịch lỏng sang eppendort mới (loại bỏ tủa)

 Thêm vào 600μl Chloroform Isoamyl alcohol để loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein bằng cách làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid nucleic