BÀI 1: KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Kỹ thuật vô trùng: Vô trùng vòng thí nghiệm và box cấy: phòng và box cấy được vệ sinh thường xuyên. • Cá nhân: Cần rửa tay xà phòng trước khi vào phòng, đeo găng tay (trường hợp tiếp xúc HgCl2 thì cần phải đeo 2 găng, bên trong là găng nilon), đeo khẩu trang, áo blue cần được khử trùng trước, thay dép khi vào phòng. • Vệ sinh box cấy trước sử dụng: Bật box cấy. Sử dụng ethanol 96% để xịt và lau (sử dụng bông, lau 1 chiều) toàn bộ bề mặt trong của box cấy. Lau ít nhất 2 lần. Sau đó lau đèn UV bằng ethanol 96% (chú ý lau sạch đáy), đặt đèn trong box cấy (bên ngoài, hướng lên), phủ vải đen, bật đèn UV khoàng 3060 phút trước khi sử dụng buồng. BÀI 2: NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CÂY LAN KIM TUYẾN IN VITRO 1. Tiến hành Khử trùng buồng cấy và các dụng cụ. Tiệt trùng găng tay với ethanol 96. Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ. Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu cây con ra ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh). Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt. Dùng kẹp và dao cắt các đoạn thân mang lá thành từng đoạn 12 đốt. Tách và để riêng 1 bên sạch. Loại các lá úa vàng khi cắt. Mở bình môi trường cây và khử trùng miệng bình cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Tiệt trùng kẹp. Dùng kẹp chuyển các đoạn thân cây đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát, khoảng 15mm thân dưới ngập dưới môi trường. Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy. Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (L)). Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ. Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BỘ MÔN THỰC VẬT
(Họ và tên) (Mã sinh viên)
BÁO CÁO THỰC TẬP
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
LỚP CAO HỌC 22
HÀ NỘI, 2018
Trang 2BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN: NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Thời gian thực tập: 19/9/2018
Lớp: Cao học 22
Nơi thực tập: Phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội.
BÀI 1: KỸ THUẬT VÔ TRÙNG VÀ PHA CHẾ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
1 Kỹ thuật vô trùng:
- Vô trùng vòng thí nghiệm và box cấy: phòng và box cấy được vệ sinh thường xuyên
Cá nhân: Cần rửa tay xà phòng trước khi vào phòng, đeo găng tay (trường hợp tiếp xúc HgCl2 thì cần phải đeo 2 găng, bên trong là găng nilon), đeo khẩu trang, áo blue cần được khử trùng trước, thay dép khi vào phòng
Vệ sinh box cấy trước sử dụng: Bật box cấy Sử dụng ethanol 96% để xịt và lau (sử dụng bông, lau 1 chiều) toàn bộ bề mặt trong của box cấy Lau ít nhất 2 lần Sau đó lau đèn UV bằng ethanol 96% (chú ý lau sạch đáy), đặt đèn trong box cấy (bên ngoài, hướng lên), phủ vải đen, bật đèn UV khoàng 30-60 phút trước khi sử dụng buồng
Sau sử dụng, vệ sinh lại box cấy tương tự
Kiểm tra cồn trong đèn cồn, đổ đầy
Bộ dụng cụ cấy: Thay dao Thêm cồn vào khay đựng dụng cụ, đốt ethanol
Đốt đèn cồn Chuẩn bị các ống cồn Sau mỗi thao tác, nhúng các dụng cụ cấy vào ống cồn, đốt trên ngọn lửa đèn cồn Các ống/lọ/thớt cắt được hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng (có thể xịt ngoài và lau với cồn trước)
Bất cứ phần nào tiếp xúc với da người/tay cầm/nền box cấy đều coi như nhiễm bẩn
Trang 32 Pha chế và tiệt trùng môi trường cấy:
+ Công thức pha chế môi trường thực tế đã sử dụng: Công thức MS1
STT Thành phần Thể tích/khối lượng
11 Nước cất vừa đủ 2.000 ml
Cách thức pha chế:
Cách thức pha chế:
- Đong 200ml Stock đa lượng vào ống đong 1.000ml
- Thêm 10ml Stock vi lượng và 10ml Stock Vitamin, 4ml Stock Sắt (sử dụng ống đong 25ml) vào lượng 200ml Stock đa lượng trong ống đong 1.000ml trên
- Cân Mio inositol ra cốc có mỏ, hòa tan bằng nước cất (khoảng 100ml), khuấy, thêm vào ống đong 1.000 trên Sau đó tráng lại cốc 3 lần, mỗi lần 50ml
- Cân 60g đường ra cốc có mỏ đã dùng ở trên, hòa tan bằng nước cất (khoảng 100ml), khuấy, thêm vào ống đong 1.000 trên Sau đó tráng lại cốc 3 lần, mỗi lần 50ml
- Dùng pipet hút BAP, NAA, Kinetin vào ống đong 1.000ml trên
- Thêm nước cất đến vạch 1.000ml
- Đổ toàn bộ vào nồi, đun trên bếp hồng ngoại (đặt mức nhiệt 1500W)
- Cân thạch vào cốc cỏ mỏ đã dùng trước đó Thêm 400ml nước cất vào cốc trên., khuấy đều
- Đổ toàn bộ vào bếp đun hồng ngoại, khuấy nhanh, mạnh, một chiều
- Rửa lại cốc trên 3 lần, mỗi lần với 200ml nước cất để lấy hết thạch Mỗi lần rửa làm lại thao tác khuấy nhanh, mạnh, một chiều như trên
Trang 4- Sau khi hỗn hợp đồng nhất (khoảng 60-70 độ), để ra ngoài cho nguội bớt (khoảng 50 độ), tiến hành đo pH (hiệu chỉnh bằng HCl loãng, sử dụng máy đo pH đã hiệu chỉnh lần lượt bằng các dung dịch 7pH7,0; 4,1; 10,8 trước khi đo) Chỉnh đến pH 5,7
- Đun nóng lại hỗn hợp, đổ vào các lọ (độ cao khoảng 1-2cm), đóng nắp
- Ghi nhãn: MS1, 19/9/2018
- Tiệt trùng tại nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút (cài máy)
- Cất các bình môi trường vào buồng nuôi mẫu (ngăn dưới cùng)
- Dọn, rửa dụng cụ
Trang 5BÀI 2:
NHÂN NHANH VÀ RA RỄ CÂY LAN KIM TUYẾN IN VITRO
1 Tiến hành
- Khử trùng buồng cấy và các dụng cụ.
- Tiệt trùng găng tay với ethanol 96
- Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu cây con ra ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh)
- Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt
- Dùng kẹp và dao cắt các đoạn thân mang lá thành từng đoạn 1-2 đốt Tách và để riêng
1 bên sạch Loại các lá úa vàng khi cắt
- Mở bình môi trường cây và khử trùng miệng bình cấy trên ngọn lửa đèn cồn
- Tiệt trùng kẹp
- Dùng kẹp chuyển các đoạn thân cây đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát, khoảng 1-5mm thân dưới ngập dưới môi trường
- Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy
- Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (L))
- Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ
- Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy
2 Kết quả
(ảnh) Hình 2.1 Tiến hành nuôi cấy mô vào môi trường MS1
(ảnh)
Hình 2.2 Mẫu sau cấy – Ngày 19/9
(ảnh)
Hình 2.3 Mẫu sau cấy vào ngày 21/9 Nhận xét:
Trang 6- Nguyên nhân: Có thể do khâu khử trùng chưa tốt, thao tác chưa quen tay nên chưa được chuẩn Phần tay mặc áo ngắn, đeo găng tay không che hết được, nên có thể trong quá trình thao tác, các vi khuẩn và nấm, thậm chí các các vảy sừng ở da tay (phần áo không che kín hoặc không có găng tay) đã rơi vào thới (miếng nhôm) khi thao tác qua lại, hoặc khi di chuyển tay bên trên bề mặt
=> Khắc phục:
+ Cần chuẩn lại thao tác Phải tiệt trùng cả phần cánh tay và có áo che lại khi tiến hành làm trong tủ cấy Thứ 2 là cần phải để tay khuỳnh ra, mở rộng ra, để không có vật gì di chuyển qua lại phía trên thớt cắt trong quá trình thao tác
+ Tiệt trùng áo blouse trước khi vào phong nuôi cấy, tiến hành khử trùng dụng cụ, găng tay cẩn thận, theo đúng hướng dẫn
Trang 7BÀI 3: NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
Thao tác chuẩn bị:
- Tại vườn thực vật, chọn các mẫu tươi sạch, không bị dính bùn đất, sâu bệnh trên cây mẹ, cắt bằng kéo cắt, chuyển ngay đến phòng nuôi cấy mô
- Rửa qua mẫu bằng nước sạch Sau đó dùng kéo cắt các đoạn khoảng 5cm, mỗi đoạn có 1 nách lá, cắt lá (chỉ để lại 1cm cuống)
- Rửa các đoạn trên dưới nước chảy 5 phút
- Cho các mẫu vào dung dịch xà phòng loãng, lắc tròn trong 10 phút
- Rửa sạch nước xà phòng dưới nước chảy 10 phút
- Rửa sạch bằng nước cất
- Chuyển mẫu vào cốc cỏ mỏ, đưa vào box cấy
- Vệ sinh box cấy, chuẩn bị dụng cụ, hóa chất, cốc hứng nước thải
- Ngâm ngập mẫu với ethanol 70o , đóng chặt nắp, lắc đều tay trong 2 phút
- Đổ sạch cồn (sử dụng kẹp đã tiệt trùng để giữ mẫu không trôi) Tráng lại 1 lượt bằng nước cất (lắc đều tay 50 vòng)
- Ngâm ngập mẫu với nước oxi già, thêm 1 giọt Tween (để tăng khả năng thấm, tăng hiệu quả làm sạch mẫu), đóng chặt nắp, lắc đều tay 10 phút
- Rửa với nước cất 1 lần (lắc đều tay 50 vòng) cho đỡ bọt
- Ngâm ngập mẫu lần 2 với nước oxi già, đóng chặt nắp, lắc đều tay 10 phút
- Rửa sạch với nước cất ít nhất 3 lần (lắc đều tay 50 vòng)
- Chắt hết nước trong bình chữa các mẫu trên, đóng nắp, chú ý khử trùng cổ và nắp bình trước khi đóng nắp
Thao tác cấy:
- Tiệt trùng găng tay với ethanol 96
- Lấy bình nuôi cấy, tiệt trùng nắp và cổ lọ Dùng kẹp gắp nhẹ nhàng các mẫu đoạn thân HTO ra ngoài thớt cắt (chú ý không kẹp quá mạnh)
- Tiệt trùng lại kẹp và dao trước khi cắt
- Dùng kẹp và dao cắt tỉa lại các đoạn thân (chú ý phần dưới dài khoảng 2cm, phần trên có chứa bẹ chìa chỉ khoảng 1cm, cắt ngắn phần cuống lá khoảng 5mm) Tách và để riêng 1 bên sạch Loại các đoạn cành úa vàng khi cắt Mỗi sinh viên làm 3-4 đoạn cành
Trang 8- Tiệt trùng kẹp.
- Dùng kẹp chuyển các đoạn cành đã cắt vào bình cấy nhẹ nhàng, dứt khoát, khoảng 0,5-1cm cành dưới ngập dưới môi trường
- Tiệt trùng lại nắp và miệng bình cấy
- Đóng bình cấy, ghi nhãn (tên sinh viên, ngày, môi trường, ký hiệu mẫu (HTO))
- Tiệt trùng lại dụng cụ và vệ sinh tại chỗ
- Chụp ảnh và đưa bình cấy vào buồng nuôi cấy
- Vệ sinh toàn bộ phòng thực tập
(ảnh)
Hình 3.1 Cắt thân cây Hà thủ ô thành các đoạn mang mấu thân
(ảnh)
Hình 3.2 Tiến hành rửa sạch, vô trùng sơ bộ mẫu
(ảnh)
Hình 3.3 Mẫu sau cấy – Ngày 19/9
Hằng ngày tiến hành theo dõi các mẫu Mẫu nào bị nấm phải bị loại ngay
(ảnh)
Hình 3.4 Các mẫu được bảo quản trong phòng nuôi
(ảnh)
Hình 3.5 Mẫu sau cấy vào ngày 24/9/18 Nhận xét:
- Sau cấy 5 ngày cấy, xuất hiện dấu hiệu của nấm màu vàng, bắt đầu nấm từ phần thân của mẫu, phát triển xung quanh chỗ cấy mẫu Lý do nhiễm nấm có thể do rửa mẫu bên ngoài chưa đạt, thao tác tẩy với nước oxy già chưa được (có thể do lắc tay theo vòng tròn chưa tốt, hoặc thời gian lắc chưa đủ lâu), vi khuẩn và vi nấm có trong các mô bên trong của mẫu chưa bị tiêu diệt hết Cũng có thể do dụng cụ tiếp xúc với mẫu (dao, kẹp, thớt cắt) bị dính khuẩn
=> Khắc phục: tiệt trùng mẫu lâu hơn
Trang 9Hủy lọ đã bị nấm,