Chương 5 phân tích protei trong thực phẩm pttp 1

 Vai trò của protein cho cơ thể Phân tích định lượng protein  Nhóm các phương pháp xác định Protein thô  Nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan  Nhóm các phương pháp xác địn

 Vai trò của protein cho cơ thể

 Phân tích định lượng protein

 Nhóm các phương pháp xác định Protein thô

 Nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan

 Nhóm các phương pháp xác định phi Protein

CHƯƠNG 5:PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG

THỰC PHẨM CHƯƠNG 5:PHÂN TÍCH PROTEIN TRONG

THỰC PHẨM

TẦM QUANG TRỌNG CỦA PROTEIN

 Vai trò sinh học của Protein

 Vai trò dinh dưỡng của Protein

VAI TRÒ SINH HỌC CỦA PROTEIN

Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống Protein là nền tản về cơ thể và chức năng của cơ thể sinh vật Dưới đây là một số chức năng quan trọng của protein:

VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID

TRONG DINH DƯỠNG

VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID

TRONG DINH DƯỠNG

+ Protein là hợp phần chủ yếu quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn Khi thiếu protein trong chế độ

ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu:

- Sức khỏe bị suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn đối với trẻ em

- Giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đở của cơ thể đối với một số bệnh

- Gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh

- Làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái của xương (lượng calci giảm, lượng magie tăng cao).

- Do đó mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa

đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong

khẩu phần ăn cho mọi lứa tuổi.

Protein là thành phần nguyên sinh chất của tế bào

Protein tham gia cân bằng năng lượng của cơ thể

Protein là chất kích thích ngon miệng

VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID

TRONG DINH DƯỠNG

VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTID

TRONG DINH DƯỠNG

ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THÔ

• Nhà hóa học người Đan mạch; X Johan G.C.T Kjeldahl

(1883).

• Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng

PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

 Phân hủy  Chưng cất  Chuẩn độ

8

Quy Trình

PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

Các yếu tố:

+ Điều kiện vô cơ hóa mẫu

+ Thứ tự cho mẫu và hóa chất vào bình Kjeldalh + Thiết lập nồng độ cho NaOH

+ Thử quá trình chưng cất là hoàn toàn

+ Làm mẫu trắng để loại bỏ ảnh hưởng của môi trường

PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL (1883)

PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN

A sample of known mass

Combustion (900 o C)

CO 2 , H 2 O and N 2

Nitrogen

Thermal conductivity detector

The nitrogen content is then measured

10

PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN

+ Đầu dò TCD chứa một dây tóc được đốt ở một nhiệt độ nhất định.

+ Trong điều kiện bình thường

có một dòng nhiệt ổn định từ dây tóc đến detector Tạo ra thế ổn định.

+ Khi có một chất được rữa giãi từ cột, thì lập tức độ dẫn nhiệt của cột bị giảm, dây tóc nóng lên làm điện trở thay đổi

PHƯƠNG PHÁP DUMAS CẢI TIẾN

Nồng độ protein được xác định, trong đó có chứa các gốc phenol như tyrosine bằng cách cho phản ứng với hợp chất màu phenol Folin-Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức

đồng Phản ứng gồm hai bước:

Cu2+ tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở

pH kiềm

Phức hợp protein-Cu2+ sẽ xúc tác cho phản ứng oxy

hóa các nhóm phenol có trong tyrosine hay trytophan

bằng thuốc thử Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WO4 +

H3PO4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương đậm hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 750nm

Nguyên Tắc:

PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

+ Các acid mạnh và muối ammonium sulphat ảnh hưởng lên phản ứng.

+ Phản ứng nhạy với các tạp chất màu khác

+ Thành phần acid amin ảnh hưởng đến sự phát triển màu trong phản ứng LOWRY (để dựng đường chuẩn nên dùng các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính xác.)+ Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi hỏi phải dựng đường chuẩn mỗi lần khi tiến hành

+ Độ nhạy cao: cho phép xác định từ 10 - 200 µg of

protein, bước sóng hấp thụ trong khoảng : 500 - 750 nm

PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

+ Sự hiện hiện của 5 acid amin có tính khử (tyrosine, tryptophan, cysteine, histidine, and asparagine) trong chuổi peptide hay trong mạch protein sẽ làm tăng

cường độ màu của sản phẩm khử, làm cho cần bằng chuyển dịch về phía phải

PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

Thuốc thử Lowry A

21,2 g natri cacbonat (2% w / v)

40 ml 1 N NaOH (hoặc 4,0 g NaOH; dung dịch 0,1N)

Thêm nước cất hoặc nước khử i-on vào 1 lít Pha ngay khi dung

Thuốc thử Lowry B

0,5 g CuSO4.5H2O (0,5% V)

1 g Natritartrate (1% V)

Pha định mức 100ml

Lowry thuốc thử C (1 N Folin thuốc thử phenol)

Pha loãng 2 N Folin phenol (Sigma, Fisher, hoặc VWR) với một lượng nước tương đương.

Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.

Lowry thuốc thử D (thuốc thử A và B kết hợp)

Trộn 1 thể tích thuốc thử B và 50 thể tích thuốc thử A Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.

Thuốc thử Lowry D ’

Thêm 2 ml dung dịch 10% sodium dodecyl sulfate vào nước khử ion định mức 100ml Chuẩn bị ngay khi dùng

PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

C mg/ml 0 0.01 0.02 0.03 0,04 ? ?

PHƯƠNG PHÁP LOWRY (1951)

* BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid or 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline.

Cu 2+ bị khử bởi các liên kết peptide cho ra Cu + Hai phân tử

BCA sẽ tạo phức Bicinchoninic acid với Cu+ , phức màu tím, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 562nm

* Nguyên Tắc:

PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

+ Phương pháp này có độ nhạy gấp 100 lần so với phương pháp biure, ngưỡng phát hiện tương đối lớn từ 20- 2000 µg.

+ Các hợp chất như đường khử và amoniac có ảnh hưởng đến quá trình

PHƯƠNG PHÁP BCA (1985)

Chuẩn protein 2mg/ml BSA (Bovine serum albumin)

Mẫu protein

Vật liệu và cách tiến hành

Thuốc nhuộm Coomassie

+ 100mg Coomassie Brilliant blue G-250

+ 50ml etanol 95%

+ 100ml acid phosphoiric 85%

Thuốc thử được hòa tan bằng etanol sau đó

pha loãng bằng nước khử ion

PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

Thời gian lên màu là 10 phút và đo ở λ = 595nm

PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

PHƯƠNG PHÁP BRADFORF (1976)

• Đo phổ hấp thụ (A) cực đại ở

bước sóng 275 - 280 nm (nhân

thơm)

• Nguyên tắc: Một số các acid amin hấp thụ ánh sáng tia cực tím

(UV): Tryptophan, tyrosine và phenylalanine

• Nồng độ protein tối đa có thể xác

định 20-3000µg/ml

• Không nhạy bằng các phương pháp

đo phổ hấp thụ của các hợp chất màu

PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 280nm)

PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 280nm)

+ Dung dịch 3 mg / ml dung dịch protein tiêu chuẩn BSA và protein mẫu + Quang phổ với đèn UV

1 Sử dụng 3 mg/ml dung dịch protein tiêu chuẩn để chuẩn bị

dãy chuẩn gồm các nồng độ 20 , 50, 100, 250 , 500 , 1000, 2000 , và

3000 µg / ml trong cùng dung môi Mẫu Blank chỉ chứa dung môi

2 Bật đèn tia cực tím của quang phổ kế và thiết lập ở bước sóng 280 nm Nên khởi động 30 phút trước khi đo

3 Setting mẫu blank có A = 0

4 Đo độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn và dung dịch protein mẫu cần

đo Nếu A, , của protein mẫu là > 2.0, pha loãng mẫu hơn nữa trong cùng dung môi và đo lường A, , , một lần nữa

5 Tạo một đường cong chuẩn bằng các dự liệu từ nồng độ và độ hấp thu

A của dãy chuẩn Từ phương trình đường chuẩn tình hàm lượng protein trong mẫu

Vật liệu và cách tiến hành

Nguyên tắc: dựa trên khả năng hấp thu của liên kết peptide

ở bước sóng 205nm Phương pháp có thể xác định nồng

độ protein trong khoảng từ 10- 100µg

PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 205nm)

PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV (Đo ở bước sóng 205nm)

+ Dung dịch brij 35 0,01% (Sigma):

Dung dịch dùng để hòa tan hay pha loãng dịch protein

C12H25(OCH2CH2)46OH - M: 1225

Bao gồm các chỉ tiêu

•Hàm lượng TVB (Total vapor base)

•Hàm lượng TMA (Trimetylamin)

•Hàm lượng tổng axid amin

PHÂN TÍCH PHI PROTEIN

Ý nghĩa: TVB là tổng hàm lượng base dể bay hơi bao gồm: chủ yếu TMA, DMA, NH3 và một số amin mạch ngắn khác TVB là một trong những chỉ số dùng để xác định độ tươi

của thủy hải sản

Nguyên tắc: Các nitơ bazơ bay hơi có trong mẫu được chiết bằng dung dịch axit percloric Sau khi được kiềm hóa, dịch chiết được chưng cất bằng hơi nước và các thành phần nitơ bazơ bay hơi được hấp thụ trong bình chứa axit Chuẩn độ các nitơ bazơ đã hấp thụ bằng dung dịch axit clohydric

chuẩn

Phương pháp này áp dụng cho các mẫu có tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi từ: 5 mg/100g đến 100 mg/100 g

HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012) HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)

HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012) HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

Vđm là thể tích sau khi định mức

a V

V X

HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012) HÀM LƯỢNG TVB (TCVN 9215 : 2012)

HÀM LƯỢNG TMA

+ Sự phân cắt TMAO tạo ra TMA, trimetylamin là một amin dễ bay hơi có mùi khó chịu, đặc trưng cho mùi thuỷ sản ươn hỏng

+ Nhiều công trình nghiên cứu đã quan tâm đến chỉ số

TMA và TVB trong đánh giá độ tươi của thủy sản

+ TMA được xem là một chỉ số đánh giá độ tươi của thủy sản Giới hạn cho phép là nhỏ hơn 15mg/100g

Ý nghĩa

HÀM LƯỢNG TMA

Quy trình phân tích:

  0 1 2 3 4 M 1 M­ 2 TMA 0,01 mg/ml 0 1 2 3 4

Nguyên tắc: Các axit amin tự do được chiết với dung dịch

axit clohydric loãng Các chất đồng chiết xuất có phân tử lượng lớn chứa nitơ được kết tủa với axit sulfosalicylic và được loại bằng cách lọc Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,20 Axit amin được tách bằng sắc ký trao đổi ion và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử sụng detector quang

đo ở bước sóng 570 nm

HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO

TCVN 8764:2012 HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO

TCVN 8764:2012

HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO

TCVN 8764:2012

HÀM LƯỢNG ACID AMIN TỰ DO

TCVN 8764:2012

Phản ứng xãy ra

TCVN 8764:2012