Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI

-oOo -

NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN

TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC – HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ NGUYỆT THU

TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH AFLATOXIN

TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

BẰNG CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc

Mã số: 62.73.15.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Trịnh Văn Quỳ

2 PGS.TSKH Nguyễn Lê Trang

HÀ NỘI - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nguyễn Thị Nguyệt Thu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Trịnh Văn Quỳ, nguyên Viện Trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

và PGS.TSKH Nguyễn Lê Trang, nguyên Trưởng phòng Hóa Miễn dịch Viện

Pasteur TP.HCM, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi nhiều kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án

Ban Giám đốc Viện Pasteur TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành

luận án đúng thời gian quy định

PGS.TS Trương Thị Xuân Liên, nguyên Viện phó Viện Pasteur TP.HCM đã đóng

góp ý kiến, chỉ dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án

Các anh chị Viện Vệ sinh Y tế Công cộng, Khoa Y học cổ truyền trường Đại học Y

Dược, và Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm TP.HCM đã cung cấp các mẫu thực phẩm, dược liệu và thuốc đông dược để tôi thực hiện đề tài

Các thầy, và các anh chị Bộ môn Hóa phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội đã

giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Hóa lý và phòng Hóa

Miễn Dịch - Viện Pasteur TP.HCM đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong công việc

Nguyễn Thị Nguyệt Thu

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt viii

Danh mục hình x

Danh mục bảng xiv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 4

1.1.1 Phát hiện aflatoxin 4

1.1.2 Aspergillus flavus và aflatoxin 4

1.1.3 Tính chất hóa, lý của aflatoxin 5

1.1.4 Độc tính của aflatoxin 8

1.1.5 Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm 10

1.1.6 Giới hạn aflatoxin trong dược liệu 12

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN 12

1.2.1 Lấy mẫu 12

1.2.2 Chuẩn bị mẫu 12

1.2.3 Phân tích mẫu 16

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH

CHO AFLATOXIN 23

1.3.1 Kháng thể 23

1.3.2 Cộng hợp kháng nguyên aflatoxin – BSA 24

1.3.3 Tạo kháng thể kháng aflatoxin 26

1.3.4 Tinh chế kháng thể 30

1.3.5 Cố định kháng thể vào pha rắn 31

1.3.6 Các đặc tính chiết xuất pha rắn của chất hấp thụ ái lực miễn dịch 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1 VẬT LIỆU 38

2.1.1 Thiết bị 38

2.1.2 Hóa chất 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP 40

2.2.1 Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể kháng aflatoxin 40

2.2.2 Phương pháp khuếch tán kép trên thạch 41

2.2.3 Phương pháp tinh chế kháng thể dùng muối amoni sulfat 42

2.2.4 Phương pháp thẩm tích (đưa protein ở dạng tủa trở lại dạng dung dịch)42 2.2.5 Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có natri dodecyl sulfat 43

2.2.6 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford 45

2.2.7 Cộng hợp protein vào gel sepharose CL-4B hoạt hóa với CNBr 45

2.2.8 Phương pháp nén cột 45

2.2.10 Pha dung dịch aflatoxin chuẩn 46

2.2.11 Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột IAC 47

2.2.12 Phương pháp chiết aflatoxin từ mẫu cần phân tích bằng cột SPE C 18 47 2.2.13 Phương pháp làm giả mẫu nhiễm aflatoxin 48

2.2.14 Phương pháp tạo dẫn xuất các aflatoxin 48

2.2.15 Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phân tích aflatoxin 48

2.2.16 Phương pháp khảo sát các thông số kỹ thuật của cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 48

2.2.16.1 Độ lặp lại của các cột 48

2.2.16.2 Dung lượng cột 49

2.2.16.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 49

2.2.16.4 Xác định độ tuyến tính 50

2.2.16.5 Xác định hiệu suất thu hồi 50

2.2.16.6 Theo dõi độ ổn định của cột 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 52

3.1 CHẾ TẠO CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN 52

3.1.1 Sản xuất kháng thể kháng aflatoxin 52

3.1.1.1 Gây miễn dịch trên thỏ 53

3.1.2 Chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 58

3.1.2 Chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin……… 59

3.1.1.2 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch ……… 54

2.2.9 Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch……… 46

3.1.2.1 Chọn nồng độ kháng thể liên kết với gel ái lực 59

3.1.2.2 Khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur 63

3.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 68

3.2.1 Khảo sát trên mẫu thực phẩm 68

3.2.1.1 Khảo sát trên mẫu ngô 68

3.2.1.2 Khảo sát trên mẫu lạc 76

3.2.2 Khảo sát trên mẫu dược liệu 81

3.2.2.1 Khảo sát trên mẫu cam thảo 81

3.2.2.2 Khảo sát trên mẫu gừng 87

3.3 SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC 92

3.3.1 So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C 18 92

3.3.1.1 Trên nền mẫu thực phẩm 92

3.3.1.2 Trên nền mẫu dược liệu 96

3.3.2 So sánh với phương pháp xử lý mẫu bằng cột sắc ký ái lực của hãng Vicam 99

3.3.2.1 So sánh trên mẫu cộng chuẩn 99

3.3.2.2 So sánh trên mẫu thực 103

3.4 ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR LÀM SẠCH MẪU ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN TRÊN MỘT SỐ NỀN MẪU THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 105

3.4.1 Trên một số nền mẫu thực phẩm 105

3.4.2 Trên một số nền mẫu dược liệu 106

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 107

4.1 BÀN LUẬN VỀ CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC CHO AFLATOXIN 107

4.1.1 Về sản xuất kháng thể kháng aflatoxin 107

4.1.1.1 Về gây miễn dịch trên thỏ……….107

4.1.1.2 Về kiểm tra đáp ứng miễn dịch 109

4.1.2 Về chế tạo cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin 111

4.1.2.1 Về chọn nồng độ kháng thể liên kết vào gel ái lực 111

4.1.2.2 Về khảo sát các thông số kỹ thuật của cột IAC Pasteur ………… 112

4.2 BÀN LUẬN VỀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỘT IAC-PASTEUR CHO PHÂN TÍCH AFLATOXIN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 114

4.3 BÀN LUẬN VỀ SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU KHÁC 118 4.3.1 Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột SPE C 18 118

4.3.2 Với phương pháp xử lý mẫu bằng cột IAC của hãng Vicam 121

4.4 BÀN LUẬN VỀ ÁP DỤNG CỘT IAC-PASTEUR ĐỂ XÁC ĐỊNH AFLATOXIN TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 122

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 125

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AOAC Association of Official Analytical Chemists

BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)

EU European Union (Liên minh châu Âu)

FDA US Food andDrug Administration (Cơ quan quản lý thuốc và

thực phẩm Hoa Kỳ)

Fab Antigen binding fragment (Mảnh gắn kháng nguyên)

Fc Crystalizable fragment

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

HPLC High-performance liquid chromatography

HCC Hepatocellular carcinoma

HBV Hepatitis B virus

HCV Hepatitis C virus

HBsAg Hepatitis B surface Antigen

IAC Immuno Affinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch) IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan

nghiên cứu ung thư quốc tế) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Liên

đoàn quốc tế về hoá học thuần túy và ứng dụng)

LC-MS Liquid chromatography with mass spectrometry

NP-HPLC Normal-phase high-performance liquid chromatography ppb parts per billion

RP-HPLC Reversed phase high-performance liquid chromatography SPE Solid Phase Extraction

TFA Trifluoro acetic acid

TLC Thin layer chromatography

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus 4

Hình 1.2 Ngô và lạc nhiễm vi nấm Aspergillus flavus 5

Hình 1.3 Bào thai thỏ (0,1mg AFB1/kg) có hốc mắt bị rộng so với nhóm chứng 8

Hình 1.4 Mối liên hệ giữa nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin và ung thư tế bào gan 9

Hình 1.5 Cấu trúc điển hình của cột chiết xuất pha rắn 13

Hình 1.6 Làm sạch mẫu bằng cột mycosep đa chức năng 14

Hình 1.7 Làm sạch mẫu bằng cột IAC 15

Hình 1.8 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều Thí nghiệm được thực hiện trên hai hệ thống dung môi khác nhau, được trình bày trên hai hướng vuông góc với nhau 17

Hình 1.9 Quá trình tạo dẫn xuất biến AFB1 và AFG1 thành AFB2a và AFG2a 19

Hình 1.10 Phản ứng tạo dẫn xuất của aflatoxin với Brom 21

Hình 1.11 So sánh sắc ký đồ của quá trình phân tích aflatoxin khi có và không có tạo dẫn xuất với cyclodextrin: (A) không tạo dẫn xuất; (B) tạo dẫn xuất với 10-2M -CD; (C) tạo dẫn xuất với 10-2M DM--CD 21

Hình 1.12 Điện di đồ của quá trình phân tích aflatoxin bằng kỹ thuật điện di mao quản MEKC pha ngược 22

Hình 1.13 Cấu tạo của phân tử kháng thể 23

Hình 1.14 Các dạng liên kết hóa học giữa hai phân tử kháng nguyên và kháng thể 23

Hình 1.15 Tạo kháng thể đa dòng 24

Hình 1.16 Phản ứng cộng hợp AFB1 với BSA 25

Hình 1.17 Các hướng sử dụng để cộng hợp aflatoxin vào protein 26

Hình 1.18 Các giai đoạn tạo kháng thể đơn dòng 28

Hình 1.19 Cấu trúc kháng thể và các phân mảnh của nó 29

Hình 1.20 Vị trí liên kết của kháng thể vào protein A, G, L và lectin 31

Hình 1.21 Cố định kháng thể qua nhóm amin bậc 1 trên gel hoạt hóa có nhóm

carbonyldiimidazol (CDI) 33

Hình 1.22 Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào pha rắn 34

Hình 2.1 Nguyên tắc thẩm tích 42

Hình 2.2 Nguyên tắc điện di 44

Hình 3.1 Sơ đồ các bước tạo kháng thể kháng aflatoxin 52

Hình 3.2 Gây miễn dịch trên thỏ với cộng hợp AFB1-BSA và các giai đoạn lấy máu 53

Hình 3.3 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch giữa BSA và huyết thanh thỏ 54

Hình 3.4 Kiểm tra kháng thể sau tinh chế 55

Hình 3.5 Loại kháng thể kháng BSA 56

Hình 3.6 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch 56

Hình 3.7 (a) AFB1 chuẩn, tR=4,32 phút (b) AFB1 sau khi qua cột IAC, tR=4,31 phút 57

Hình 3.8 (A ) Mô hình kháng thể liên kết vào hạt gel Sepharose, (B) Nguyên tắc cộng hợp protein vào gel Sepharose được hoạt hóa với –CNBr 59

Hình 3.9 Cột sắc ký ái lực bắt aflatoxin tự chế tạo 63

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin từ 0,625 ng đến 10 ng cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ 65

Hình 3.11 Theo dõi độ ổn định của cột IAC trong 2 năm 66

Hình 3.12 (a) Sắc ký đồ của mẫu ngô không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của mẫu ngô không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin 68

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu ngô 69

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu ngô 72

Hình 3.15 (a) Sắc ký đồ của mẫu lạc không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của

mẫu lạc không nhiễm aflatoxin được thêm chuẩn aflatoxin 76 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu lạc 77 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu lạc 79 Hình 3.18 (a) Sắc ký đồ của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ

của mẫu cam thảo không nhiễm aflatoxin thêm 10 ng chuẩn aflatoxin 81 Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ nền mẫu cam thảo 82 Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu cam thảo 84 Hình 3.21 (a) Sắc ký đồ của mẫu gừng không nhiễm aflatoxin, (b) Sắc ký đồ của

mẫu gừng không nhiễm aflatoxin được thêm 10 ng chuẩn aflatoxin 87 Hình 3.22 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột từ 0,625 ng đến 10 ng và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu gừng 88 Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng aflatoxin cho

qua cột và diện tích pic thu được trên sắc ký đồ trên nền mẫu gừng 90 Hình 3.24 Sắc ký đồ của mẫu cà phê làm sạch bằng cột IAC và cột SPE C18 93 Hình 3.25 Sắc ký đồ so sánh độ chọn lọc giữa hai phương pháp làm sạch mẫu

bằng cột SPE C18 và cột IAC trên một số nền mẫu thực phẩm 94 Hình 3.26 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm

sạch bằng phương pháp IAC 96 Hình 3.27 Sắc ký đồ của một số mẫu dược liệu và thuốc đông dược được làm

sạch bằng phương pháp SPE C18 97

Hình 3.28 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB1 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur 100 Hình 3.29 So sánh hiệu suất thu hồi AFB1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur 100

Hình 3.30 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFB2 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur 101 Hình 3.31 So sánh hiệu suất thu hồi AFB2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur 101

Hình 3.32 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur 102 Hình 3.33 So sánh hiệu suất thu hồi AFG1 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur 102

Hình 3.34 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa lượng AFG2 thu được

sau khi qua cột Vicam và cột Pasteur 103 Hình 3.35 So sánh hiệu suất thu hồi AFG2 thu được sau cột Vicam và cột Pasteur 103 Hình 4.1 Các u hạt gây ra do tá chất Freund 108 Hình 4.2 Vị trí cộng hợp BSA vào phân tử AFB1 110

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các nhóm chức hóa học của các aflatoxin 6

Bảng 1.2 Giá trị TD50 gây ung thư của AFB1 9

Bảng 1.3 Mối liên hệ giữa tiếp xúc với aflatoxin, nhiễm HBV và HCC 10

Bảng 3.1 Phản ứng giữa kháng thể đa dòng kháng AFB1 và AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 58

Bảng 3.2 Số liệu thu được khi cho AFB1 qua cột Vicam và cột Pasteur 61

Bảng 3.3 a Hiệu suất thu hồi đối với AFB1 61

Bảng 3.3 b Hiệu suất thu hồi đối với AFB2 61

Bảng 3.3 c Hiệu suất thu hồi đối với AFG1 62

Bảng 3.3 d Hiệu suất thu hồi đối với AFG2 62

Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin ở lượng 20 ng/cột 62

Bảng 3.5 Độ lặp lại của các cột 63

Bảng 3.6 Dung lượng cột 64

Bảng 3.7 Kết quả xét nghiệm tìm LOD và LOQ trên cột IAC 64

Bảng 3.8 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các loại aflatoxin 66

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra độ ổn định của cột IAC 67

Bảng 3.10 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền mẫu ngô 70

Bảng 3.11 Kết quả xét nghiệm độ tuyến tính trên nền mẫu ngô 71

Bảng 3.12 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu ngô 71

Bảng 3.13 a Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFB1 đơn trên nền mẫu bột ngô 73

Bảng 3.13 b Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFB2 đơn trên nền mẫu bột ngô 73

Bảng 3.13 c Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFG1 đơn trên nền mẫu bột ngô 74

Bảng 3.13 d Hiệu suất thu hồi (H%) đối với các AFG2 đơn trên nền mẫu bột ngô 74

Bảng 3.14 Phân bố của từng lượng aflatoxin đơn trong aflatoxin tổng số 75

Bảng 3.15 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu bột ngô 76

Bảng 3.16 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền lạc 78

Bảng 3.17 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin 78

Bảng 3.18 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu lạc 80

Bảng 3.19 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu lạc 80

Bảng 3.20 LOD và LOQ của các loại aflatoxin trên nền mẫu cam thảo 83

Bảng 3.21 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu cam thảo 83

Bảng 3.22 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu cam thảo 85

Bảng 3.23 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng trên nền mẫu cam thảo 85

Bảng 3.24 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng trên nền mẫu cam thảo (làm sạch bằng cột Vicam) 86

Bảng 3.25 Hiệu suất thu hồi của aflatoxin tổng số khi cho lượng mẫu là 0,5 gam 86

Bảng 3.26 LOD và LOQ của aflatoxin trên nền mẫu gừng 89

Bảng 3.27 Mối tương quan tuyến tính của phương pháp định lượng aflatoxin trên nền mẫu gừng 89

Bảng 3.28 Hiệu suất thu hồi đối với các aflatoxin đơn trên nền mẫu gừng 91

Bảng 3.29 Hiệu suất thu hồi đối với aflatoxin tổng số trên nền mẫu gừng 91

Bảng 3.30 So sánh hiệu suất thu hồi aflatoxin của hai phương pháp làm sạch mẫu: SPE C18 và IAC trên nền mẫu ngô 92

Bảng 3.31 Hiệu suất thu hồi AF khi làm sạch bằng cột IAC trên nền mẫu cà phê 93

Bảng 3.32 Các mẫu dương tính với cả hai phương pháp làm sạch 95

Bảng 3.33 Hàm lượng aflatoxin thu được trên các mẫu làm sạch bằng cột SPE C18 98 Bảng 3.34 Hiệu suất thu hồi của aflatoxin trên mẫu dược liệu có thêm chuẩn 99

Bảng 3.35 Kết quả định lượng 11 mẫu dược liệu và thuốc đông dược bằng 2 phương pháp làm sạch: qua cột IAC Vicam và cột IAC Pasteur 102

Bảng 4.1 Qui định về hàm lượng aflatoxin trong thức ăn gia súc 114

ĐẶT VẤN ĐỀ

Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vi

nấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa

nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám …

Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 10-15 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này [79] Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính Nhiễm độc cấp có thể gây chết người Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến [26][93] Ảnh hưởng quan trọng nhất dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm là khả năng gây ung thư tế bào gan nguyên phát Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) đã xếp aflatoxin vào nhóm I: các chất gây ung thư cho người [56]

Do độc tính của aflatoxin, đã có ít nhất 99 quốc gia trên thế giới (trong đó có Việt Nam) đưa ra các tiêu chuẩn về giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm [28] đồng thời quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng

Tất cả các kỹ thuật dùng định lượng aflatoxin, trừ kỹ thuật miễn dịch men (ELISA), đều cần phải có giai đoạn làm sạch mẫu Để tránh bất lợi của phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng, xu thế hiện nay là thay thế nó bằng phương pháp chiết xuất pha rắn (SPE) Các pha rắn khác nhau đã được sử dụng cho mục đích này như: Florisil,

silicagel-C18 và gần đây nhất là cột Mycosep đa chức năng Chiết xuất pha rắn có ưu điểm hơn chiết xuất lỏng-lỏng là dễ thao tác hơn và cho kết quả có độ lặp lại cũng như

độ thu hồi tốt hơn Bất lợi chủ yếu của phương pháp này là độ chọn lọc thấp Gần đây, cột sắc ký ái lực miễn dịch dựa trên kháng thể (Immuno affinity column-IAC) đã được phát triển để thay thế cho các phương pháp làm sạch pha rắn cổ điển Ngoài các ưu điểm như dễ thao tác, độ thu hồi và độ lặp lại cao, cột IAC có ưu điểm vượt trội so với cột SPE là có độ chọn lọc cao, giúp phân tách dễ dàng aflatoxin trên các nền mẫu phức tạp từ mẫu thức ăn, mẫu sinh học đến mẫu mô động vật Phương pháp làm sạch này ngày càng được sử dụng nhiều trong phân tích aflatoxin và là phương pháp bắt buộc sử dụng đối với các sản phẩm xuất khẩu Sau giai đoạn làm sạch mẫu, người ta phát hiện aflatoxin dựa trên đặc tính phát huỳnh quang của nó AFB1 và AFG1 cần biến đổi thành dẫn xuất AFB2a và AFG2a có khả năng phát huỳnh quang mạnh hơn Phương pháp tạo dẫn xuất đơn giản nhất là sử dụng acid trifluoroacetic (TFA) để xúc tác phản ứng [123] Phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang là phương pháp phát hiện aflatoxin chính xác và hiệu quả

Song song với việc cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của người dân Việt Nam, nhu cầu đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng cao Số lượng và chủng loại mẫu được yêu cầu kiểm tra aflatoxin ngày càng nhiều và đa dạng Qui trình kiểm tra aflatoxin sẽ đơn giản và chính xác hơn khi sử dụng cột IAC để làm sạch mẫu Hiện nay, cột IAC cho aflatoxin dùng tại Việt Nam đều được nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao Đây chính là nguyên nhân làm hạn chế việc thay thế cột SPE bằng cột IAC trong qui trình kiểm tra aflatoxin tại các phòng xét nghiệm trong nước Do đó, có được qui trình sản xuất cột IAC cho aflatoxin trong nước với giá thành phù hợp là rất cần thiết Xuất phát từ cơ sở khoa học và yêu cầu thực tiễn về phân tích aflatoxin nêu ở trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài luận án:

“Tách chiết, phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký

ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Mục tiêu của luận án là:

- Nghiên cứu chế tạo cột sắc ký ái lực cho aflatoxin

- Đánh giá khả năng phân tích aflatoxin trên mẫu thực phẩm và dược liệu bằng phương pháp làm sạch mẫu với cột sắc ký ái lực miễn dịch và định lượng aflatoxin bằng sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang

Đề tài bao gồm các nội dung sau:

1 Chế tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch cho aflatoxin

2 Đánh giá khả năng ứng dụng cột sắc ký ái lực cho phân tích aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu

3 So sánh việc xử lý mẫu bằng cột sắc ký ái lực tự chế tạo với một số phương pháp xử lý mẫu khác

4 Áp dụng cột sắc ký ái lực để xác định aflatoxin trong một số thực phẩm và dược liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN:

1.1.1 Phát hiện aflatoxin:

Aflatoxin thuộc nhóm các độc tố có nguồn gốc từ vi nấm Aflatoxin được phát hiện lần đầu vào khoảng 50 năm trước, khi đi tìm nguyên nhân gây dịch bệnh và gây chết cho gà tây [12] cũng như gây ung thư cho cá [99] Sau đó, nguyên nhân được xác

định là do chúng ăn thức ăn có chứa lạc và hạt bông bị nhiễm nấm Aspergillus flavus

Phân tích thức ăn, người ta tìm ra tác nhân gây chết là một số chất chuyển hóa thứ cấp

có độc tính của nấm Các chất này được gọi là Aflatoxin (Aspergillus flavus toxin)

Aflatoxin được sinh ra từ một nhóm sinh vật có quan hệ gần gũi của loài aspergilli: A

flavus, A parasiticus và A nomius Gần đây, A ochraceoroseus và A tamarii đã được

thêm vào danh sách này [39]

1.1.2 Aspergillus flavus và aflatoxin :

A flavus là loài vi nấm chủ yếu sản xuất ra aflatoxin (Hình 1.1), được phân bố

rộng khắp thế giới, đặc biệt là các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có khả năng gây nhiễm trên nhiều loại thực phẩm khác nhau Các vùng địa lý nằm giữa vĩ tuyến 40

Bắc và 40 Nam của đường xích đạo có điều kiện thuận lợi để nấm Aspergillus flavus

sản xuất aflatoxin

Hình 1.1: Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của loài Aspergillus flavus [59]

Aflatoxin có thể nhiễm vào các sản phẩm nông nghiệp ở tất cả các giai đoạn: trồng, gặt hái, dự trữ, chế biến và bảo quản Quá trình sản sinh aflatoxin phụ thuộc vào điều kiện thời tiết như nóng, ẩm

Thực phẩm thường bị nhiễm aflatoxin là gạo, các loại ngũ cốc như ngô, lúa mì, lúa mạch, các loại trái cây khô, các loại hạt có dầu, các loại hạt bông cũng như các loại gia vị như tiêu, ớt Ngô và lạc là hai loại thực phẩm thường bị nhiễm aflatoxin nhất [90]

Hình 1.2: Ngô và lạc nhiễm vi nấm Aspergillus flavus [127]

Aflatoxin cũng có thể được tìm thấy trong thịt, cá, trứng, sữa và các thực phẩm khác do vật nuôi ăn phải thức ăn bị nhiễm aflatoxin Đây cũng là đường đưa aflatoxin vào người

Các aflatoxin là những chất hóa học bền vững, chúng ít bị phân hủy trong quá trình bảo quản và chế biến, thậm chí cả khi được đưa đến nhiệt độ nấu nướng khá cao như trong quá trình làm bánh mì Aflatoxin rất khó được loại trừ ra khỏi thực phẩm một khi đã bị nhiễm Vì vậy aflatoxin được tổ chức FDA (US Food and Drug Administration) xếp vào loại các chất gây nhiễm không thể tránh được của thực phẩm

1.1.3 Tính chất hóa, lý của aflatoxin:

Đến nay có ít nhất 16 aflatoxin [22], có sự khác biệt rất ít trong cấu trúc hóa học

Bảng 1.1: Các nhóm chức hóa học của các aflatoxin

Tác động của các yếu tố nhiệt độ và hóa học lên aflatoxin:

- Nhiệt độ: Aflatoxin là các hợp chất bền với nhiệt Tuy nhiên trong điều kiện

nhiệt độ cao và độ ẩm cao có sự phân hủy aflatoxin theo thời gian Quá trình phân hủy

có thể xảy ra với aflatoxin trong thực phẩm có dầu, hay trong dung dịch nước tại pH 7

- Kiềm: Trong dung dịch kiềm, có thể xảy ra sự ly giải của vòng lacton Sự ly

giải này là thuận nghịch, nghĩa là có sự đóng vòng lại khi thêm acid vào dung dịch

kiềm chứa aflatoxin Tại nhiệt độ cao (khoảng 100C) vòng mở kéo theo quá trình khử carboxyl và phản ứng có thể tiếp tục dẫn đến sự mất nhóm methoxy của vòng thơm

- Acid: Các muối vô cơ có thể xúc tác biến đổi AFB1 và AFG1 thành AFB2a và AFG2a bằng cách thêm nước vào nối đôi trong vòng furan Sự có mặt của anhydrit acetic và acid hydrocloric sẽ giúp phản ứng tiếp diễn để tạo các dẫn xuất aceton Những dẫn xuất tương tự của AFB1 và AFG1 được tạo thành với acid formic-thionyl clorid, acid acetic-thionyl clorid và acid trifluoroacetic

- Các tác nhân oxy hóa: Nhiều tác nhân oxy hóa như natri hypoclorit, kali permanganat, clor, hydrogen peroxyd, ozon và natri perborat phản ứng với aflatoxin làm thay đổi cấu trúc phân tử aflatoxin, dẫn đến sự mất huỳnh quang Cơ chế và sản phẩm của các phản ứng này chưa được xác định

- Các tác nhân khử: Quá trình hydrogen hoá AFB1 và AFG1 tạo ra AFB2 và AFG2 tương ứng Khử hơn nữa AFB1 bằng 3 mole của hydrogen tạo tetrahydroxy aflatoxin Khử AFB1 và AFB2 với natri borohydrid tạo aflatoxin RB1 và RB2 tương

ứng

Aflatoxin có khả năng phát quang dưới đèn UV và được phân thành 2 nhóm theo màu huỳnh quang: nhóm B phát huỳnh quang màu xanh (Blue) và nhóm G phát huỳnh quang màu lục (Green)

Aflatoxin là các difurano coumarin Cấu trúc furano coumarin có trong rất nhiều các hợp chất tự nhiên với các hoạt tính dược học khác nhau [106] Tuy nhiên cấu trúc bifuran chỉ gặp trong một hợp chất tự nhiên là sterigmatocystin, một chất chuyển hóa

của nấm Aspergillus versicolor [14]

Các aflatoxin thường được quan tâm phân tích xác định là: AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 và dẫn xuất được tiết qua sữa của chúng: AFM1, AFM2 AFB2 và AFG2 là các dẫn xuất được hydro hoá của AFB1 và AFG1 Cấu trúc hóa học của nhóm B khác nhóm

G ở vòng cyclopentenon (B) và vòng 3-lacton (G) Trong cấu trúc của AFB1 và AFG1

có nối đôi tại vị trí 8,9 của vòng furan cuối Nối đôi này được bão hòa trong cấu trúc

của AFB2 và AFG2 [13] Sự khác biệt này đã dẫn đến độc tính của các aflatoxin thay đổi rất nhiều: AFB1 và AFG1 có khả năng gây ung thư cao hơn rất nhiều so với AFB2

do ăn thức ăn làm từ ngô bị nhiễm aflatoxin [69]

Độc tính mạn do aflatoxin thường là ức chế đáp ứng miễn dịch và gây xơ gan Nghiên cứu trên một số trẻ em ở Gambia cho thấy AFB1 có thể đi qua nhau thai và đi vào bào thai Nghiên cứu trên động vật cho thấy nhiễm aflatoxin trong giai đoạn bào thai có thể gây ra dị tật thai (Hình 1.3) AFB1 gây ra các bất thường như làm rộng xương, nội tạng

Hình 1.3: Bào thai thỏ (0,1mg AFB 1 /kg) có hốc mắt bị rộng (hình mũi tên)

so với nhóm chứng [93]

Một số nghiên cứu cho thấy tiếp xúc với aflatoxin sau một thời gian dài có thể gây ung thư trên một số động vật như chuột cống, chuột lang, khỉ … (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 : Giá trị TD 50 gây ung thư của AFB 1 [80]

bị bệnh HCC cho thấy khi tăng lượng aflatoxin vào cơ thể từ 3-222 ng/kg/ngày sẽ tăng nguy cơ bị HCC từ 2- 35 trường hợp/ 100.000 người/ năm (Hình 1.4)

Hình 1.4: Mối liên hệ giữa nguy cơ tiếp xúc với aflatoxin và ung thư tế bào gan [128]

- Trong một số nghiên cứu đoàn hệ tiền cứu đã cho thấy sự đồng nhiễm HBV sẽ làm tăng rất nhiều nguy cơ bị HCC trong dân số tiếp xúc cao với aflatoxin (Bảng 1.3)

Bảng 1.3: Mối liên hệ giữa tiếp xúc với aflatoxin, nhiễm HBV và HCC

Nguy cơ bị HCC (RR-Relative risk) Nhiễm HBV

và aflatoxin Qian [92] Ross [96] Wang [121] Lunn [71]

1.1.5 Giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm: [28]

Vào năm 2003, ít nhất 99 quốc gia trên thế giới đã có tiêu chuẩn giới hạn về aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, tăng 30% so với năm 1995 Số người sống tại các quốc gia có tiêu chuẩn này chiếm 87% dân số trên thế giới vào năm 2003

so với 77% vào năm 1995

Trong thực phẩm, giới hạn này áp dụng đối với AFB1 hay aflatoxin tổng số (gồm AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) hay AFM1 (trong sữa và các sản phẩm có nguồn gốc từ sữa)

- Giới hạn của AFB 1 :

Năm 2003, giới hạn qui định đối với AFB1 là 1-20 g/kg

Có 29 quốc gia, phần lớn thuộc khối liên hiệp Châu Âu có giới hạn là 2 g/kg Một giới hạn thường gặp khác là 5 g/kg, có 21 quốc gia, thuộc về Châu Phi, Châu Á (Việt Nam [2]), Châu Mỹ Latin và Châu Âu Mỹ và Canada không có giới hạn riêng cho AFB1

- Giới hạn của aflatoxin tổng số:

Giới hạn thường gặp nhất là 4 g/kg, được gặp ở các quốc gia khối EU và các quốc gia chuẩn bị gia nhập vào khối EU (29 quốc gia) Một giới hạn thường gặp khác

là 20 g/kg (17 quốc gia), một nửa là các quốc gia thuộc Châu Mỹ Latin và một số quốc gia ở Châu Phi Mỹ là nước đầu tiên thiết lập giới hạn 20 g/kg Tại Việt Nam giới hạn này là 15 g/kg [2]

Xác định giới hạn của aflatoxin tổng số thường đòi hỏi nhiều công sức phân tích hơn so với chỉ xác định AFB1 Việc này có đem lại lợi ích vượt trội đến việc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng so với xác định chỉ một AFB1 hay không vẫn còn là vấn đề gây nhiều tranh luận AFB1 là chất quan trọng nhất trong các aflatoxin, xét cả về hai khía cạnh: độc tính và sự lưu hành Chưa thấy có trường hợp thực phẩm chỉ nhiễm AFB2, AFG1

và AFG2 mà không nhiễm AFB1, và nồng độ của tổng các AFB2, AFG1 và AFG2

thường ít hơn nồng độ của AFB1

- Giới hạn của AFM 1 :

Cuối năm 2003, giới hạn của AFM1 được qui định ở 60 quốc gia trên thế giới, nhiều hơn 3 lần so với năm 1995 Giới hạn thường gặp nhất là 0,05 g/kg qui định tại các quốc gia thuộc EU và các nước chuẩn bị gia nhập EU Một số quốc gia tại Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ Latin cũng áp dụng giới hạn này Tại Mỹ và một số nước ở Châu Á, Châu Âu giới hạn thường gặp là 0,5 g/kg

1.1.6 Giới hạn aflatoxin trong dược liệu:

Nhu cầu sử dụng các loại thuốc điều trị và thực phẩm chức năng có nguồn gốc

từ dược liệu ngày càng tăng Chất lượng của các loại sản phẩm này ngày càng được qui định chặt chẽ hơn Gần đây đã có các chuyên luận về xác định aflatoxin trong thảo dược trên dược điển Châu Âu, dược điển Anh Giới hạn aflatoxin cho phép trong dược liệu và các sản phẩm thuốc đông dược tại Châu Âu cũng giống như trong thực phẩm: 2g/kg cho AFB1 và 4g/kg cho aflatoxin tổng số [70] Tại Việt Nam đến năm 2010 chưa thấy có tiêu chuẩn này

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AFLATOXIN:

1.2.1 Lấy mẫu:

Mẫu được lấy từ sản phẩm cần phân tích phải đại diện cho lô sản phẩm này Do lượng độc tố cần phát hiện ở hàm lượng thấp và sự phân bố có thể không đồng đều trong sản phẩm, nên việc lấy mẫu cần phải có phương pháp thích hợp Cần phải thực hiện đúng theo các qui trình lấy mẫu đã được chuẩn thức hóa

Thông thường, tùy theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau Các lượng này sẽ được gộp lại thành một mẫu duy nhất

Lượng dùng để phân tích thường khoảng 20-100 gam, tùy vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu

những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dicloromethan, benzen, acetonitril, aceton, cloroform hay methanol Nước có thể đồng tan ít nhiều trong các dung môi này Với các mẫu khô, một lượng nhỏ nước kết hợp với các dung môi trên để làm ẩm mẫu, tăng khả năng thấm của dung môi hữu cơ vào mẫu để tăng khả năng chiết aflatoxin [57] Hệ thống dung môi thông thường nhất được sử dụng để chiết aflatoxin là hỗn hợp của cloroform-nước [9][84][116], methanol-nước [34][84][88] hay acetonitril - nước [83][86][113] Sự thêm các dung

môi không phân cực như n-hexan để tách chất béo cũng được sử dụng [81]

Quá trình chiết có thể được thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong khoảng 30 phút hay dùng máy khuấy tốc độ cao trong 1-3 phút

Bất cứ dùng phương pháp chiết mẫu nào, ngoài aflatoxin trong dịch chiết cũng

có các thành phần khác như chất béo, chất màu … Điều này đặc biệt quan trọng khi aflatoxin chiếm tỷ lệ thấp so với các tạp chất khác Các tạp chất có thể gây nhiễu vào kết quả phân tích nên cần phải loại trừ

- Tinh sạch và làm giàu mẫu:

 Quá trình tinh sạch và làm giàu mẫu thường sử dụng kỹ thuật chiết xuất pha rắn (Solid Phase Extraction-SPE) (Hình 1.5)

Hình 1.5: Cấu trúc điển hình của cột chiết xuất pha rắn [81]

Các pha tĩnh được sử dụng thông dụng nhất trong cột SPE là silica gel [64], silicagel có liên kết với nhóm C18 [116][117], và magnesium silicat (được thương mại

hóa dưới tên Florisil [62] Các pha rắn này liên kết với aflatoxin theo cơ chế kỵ nước,

do đó có tính chọn lọc tương đối, phân giải kém trong nhiều trường hợp và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm một tỷ lệ nhỏ so với các tạp chất đồng chiết

 Một dạng khác của cột chiết xuất pha rắn là cột Mycosep đa chức năng [4][123] Cột này cho phép aflatoxin đi qua cột và giữ lại các tạp chất khác Trong cột chứa các chất hấp thụ phân cực và không phân cực, có khả năng lưu lại các tạp chất trong thức ăn như protein, carbohydrat, acid béo, chất màu Hỗn hợp các chất hấp thụ được thiết kế sao cho chỉ có aflatoxin đi qua cột Đây là một thiết kế khá đơn giản, cho phép làm sạch mẫu trong vòng 10-30 giây

Để tinh chế aflatoxin chúng ta tiến hành như sau: Đẩy cột mycosep vào ống nghiệm có chứa dịch chiết aflatoxin Dịch chiết sẽ đi qua màng lọc và vào cột Các tạp chất sẽ liên kết vào pha rắn trên cột và bị giữ lại, dịch chiết được tinh chế (có aflatoxin)

sẽ đi qua màng lọc, lên trên bề mặt của cột (Hình 1.6)

Nhược điểm của phương pháp này là thể tích mẫu bị giới hạn

Hình 1.6: Làm sạch mẫu bằng cột mycosep đa chức năng [129]

 Cột chiết xuất pha rắn dựa trên tương tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể (cột ái lực miễn dịch - IAC) đã được áp dụng làm sạch mẫu phân tích aflatoxin[21][88][104][107][108]

Trên cột IAC, kháng thể đặc hiệu với aflatoxin được gắn lên pha rắn Cho dịch chiết chứa aflatoxin đi qua cột sắc ký, aflatoxin sẽ liên kết đặc hiệu với kháng thể đã gắn trên pha rắn và bị giữ lại Các tạp chất theo dòng dung dịch ra khỏi cột Rửa các tạp chất còn lại trên cột Rửa giải aflatoxin bằng một thể tích nhỏ dung môi (Hình 1.7) Dịch rửa giải thường rất sạch, có rất ít các tạp chất gây nhiễu Cột IAC vừa có tác dụng tinh chế vừa có tác dụng làm giàu aflatoxin Trong phương pháp xử lý mẫu này, chúng

ta dùng các dung môi không có hợp chất clor, nên tránh được vấn đề ô nhiễm môi trường

Một trong các bất lợi chủ yếu của cột IAC là giá thành IAC sử dụng một lượng lớn kháng thể nhiều hơn bất cứ phương pháp hóa miễn dịch nào khác, do đó giá thành của một cột sắc ký khá cao Tại Nhật giá của cột IAC thương mại cao gấp 3-10 lần cột chiết xuất pha rắn SPE C18 thông thường Để giải quyết vấn đề này người ta đưa ra giải pháp tái sử dụng lại cột IAC Tinh sạch aflatoxin bằng cột AflaTest (Vicam, Watertown, MA) theo qui trình của nhà sản xuất Rửa cột đã sử dụng với đệm phosphat (pH 7,4) và để ổn định trong tủ lạnh 48 giờ, cột AflaTest có thể sử dụng ít nhất 6 lần [75]

Hình 1.7: Làm sạch mẫu bằng cột IAC [77]

Tuy cột IAC có ưu điểm vượt trội về khả năng làm sạch chọn lọc so với các phương pháp khác nhưng nó có nhược điểm là ít bền vì dựa trên các sản phẩm sinh học

và cần điều kiện bảo quản thích hợp (4-8C)

1.2.3 Phân tích mẫu:

 Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC):

TLC là phương pháp đầu tiên được sử dụng để xác định aflatoxin Tuy nhiên vào đầu thập niên 1980, tại các nước phát triển, nó đã dần được thay thế bằng các kỹ thuật mới như HPLC và sau đó là kỹ thuật ELISA và kỹ thuật huỳnh quang Các kỹ thuật mới này tuy có nhiều ưu điểm hơn TLC nhưng đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền

TLC thường được sử dụng như một phương pháp sàng lọc do nó không thể cho kết quả định lượng chính xác trừ khi dùng dụng cụ densitometry để đo

Phương pháp TLC dựa trên tính hấp phụ khác nhau của các aflatoxin trên lớp silicagel và khả năng hòa tan khác nhau của chúng trong các hệ dung môi Hệ dung môi sử dụng thường là cloroform-aceton (9:1) Sự phát hiện và định lượng aflatoxin được thực hiện dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng  = 365 nm Có thể xác định hàm lượng aflatoxin tương đối bằng mắt hay đọc trên máy densitometry

Trong một số trường hợp khi mẫu phân tích rất bẩn, để xác định aflatoxin trong mẫu người ta sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hai chiều (Hình 1.8) Hệ dung môi chạy chiều thứ 1 thường là ether ethylic-methanol-nước (94:4,5:1,5) để tách các chất béo và chất màu ra khỏi aflatoxin; hệ dung môi chạy chiều thứ 2 là cloroform-aceton (9:1)

Mặc dù kỹ thuật làm sạch mẫu được áp dụng trước khi chạy dịch chiết aflatoxin trên bản mỏng nhưng đôi khi vẫn còn những tạp chất mà khi chạy sắc ký sẽ cho những vết huỳnh quang dưới ánh sáng UV có màu sắc và Rf gần giống như aflatoxin Để tránh nhầm lẫn, cần thực hiện thử nghiệm khẳng định Cách đơn giản nhất là thực hiện

tiến trình TLC với một chuẩn nội: một thể tích xác định dung dịch chuẩn aflatoxin được chấm chồng lên vết mẫu Sau khi triển khai sắc ký vết chuẩn cộng mẫu có cường

độ huỳnh quang đậm hơn vết mẫu và có cùng Rf Cách khác là phun dung dịch H2SO450% (v/v) lên bản sắc ký, khi đó AFB1, AFG1 sẽ tạo thành các dẫn xuất của aflatoxin

có huỳnh quang màu vàng dưới ánh sáng UV có =365 nm

Hình 1.8: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng hai chiều Thí nghiệm được thực hiện trên hai hệ

thống dung môi khác nhau, được trình bày trên hai hướng vuông góc với nhau (a) Đặt mẫu chưa biết X và 3 chuẩn a, b, c; di chuyển theo hướng đầu với hệ dung môi 1; làm khô và quay bản mỏng 90  ; di chuyển theo hướng thứ 2 với hệ dung môi 2 Kết quả cho thấy X là hỗn hợp của ít nhất 2 chất: chất a (di chuyển giống chuẩn a trong cả hai hệ dung môi) và một chất không phải b [46]

Kỹ thuật này có độ chính xác không cao, tùy thuộc vào nhiều yếu tố, chủ quan trong so sánh, cho sai số khoảng 30%

 Sắc ký lỏng hiệu năng cao:

HPLC ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích aflatoxin do có nhiều ưu điểm về kỹ thuật như khả năng phân giải và phát hiện cao, khả năng tự động hóa Những nghiên cứu đầu tiên dùng phương pháp sắc ký pha thuận (NP-HPLC) với đầu

dò UV tại bước sóng 360-365 nm [35], cho giới hạn phát hiện 10 ng, không đủ nhạy để phát hiện aflatoxin ở lượng dưới nanogram như yêu cầu đánh giá giới hạn aflatoxin trong thực phẩm

Dựa trên đặc tính phát huỳnh quang của aflatoxin, những nghiên cứu sau dùng hệ thống sắc ký với đầu dò huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 360 nm, bước sóng phát xạ >420 nm) và đầu dò này cho độ nhạy cao hơn [85][109] Đặc tính phát huỳnh quang của aflatoxin phụ thuộc vào thành phần dung môi Pha động dùng trong NP-HPLC thường có cloroform hay dicloromethan Dưới điều kiện này, phát hiện aflatoxin ở lượng dưới nanogram chỉ có thể cho AFG1 và AFG2 do huỳnh quang của AFB1 và AFB2 bị tắt đáng kể Vì vậy ta phải sử dụng đồng thời cả hai đầu dò: huỳnh quang cho AFG1 và AFG2; UV cho AFB1 và AFB2 [91] Manabe nhận thấy rằng khi thêm một acid hữu cơ vào pha động có khả năng làm tăng huỳnh quang của AFB1 và AFB2 [72] Phương pháp này với một số thay đổi nhỏ đã được áp dụng để định lượng aflatoxin trong nhiều nông sản, thực phẩm [41] và cho định lượng AFM1, AFM2 trong sữa [40]

Aflatoxin cũng được chia tách bằng phương pháp sắc ký pha đảo (RP-HPLC) với

hệ dung môi methanol-nước hay acetonitril-nước Hệ thống RP-HPLC thường được sử dụng thông dụng hơn hệ thống NP-HPLC do dễ thao tác hơn và pha động ít hoá chất độc hại hơn Tuy nhiên trong hệ dung môi này cường độ phát huỳnh quang của AFB1

O O

O

O O

O

HO TFA

Aflatoxin B 1

O O

O O

3

OCH

O O

O O

3

OCH HO

và những sản phẩm có nguồn gốc từ sữa [15][18][32][50][110]

Hình 1.9: Quá trình tạo dẫn xuất biến AFB 1 và AFG 1 thành AFB 2a và AFG 2a

Dẫn xuất bán acetal cũng được tạo ra sau cột bằng phương pháp chiếu xạ UV quang hóa (photo-chemical UV irradiation) in-line Dẫn xuất bán acetal có thể được phát hiện ở lượng dưới picogram trong phương pháp HPLC với laser fluorimetry [25]

Với các hệ thống sắc ký lỏng tự động, tạo dẫn xuất sau cột thường được ưa chuộng hơn do nó giúp giảm các thao tác bằng tay trên mỗi mẫu Tuy nhiên phương pháp tạo dẫn xuất sau cột với TFA gặp khó khăn do tính độc cũng như các đặc tính ăn mòn của nó có thể tác động trên các thiết bị bơm

Các phương pháp tạo dẫn xuất sau cột mới dùng các tác nhân oxy hóa đã được phát triển AFB1 và AFG1 khi tạo dẫn xuất với iod cho các chất có cường độ phát huỳnh quang cao gấp 50 lần và không ảnh hưởng đến sự phân tích các chất AFB2 và AFG2 [111] Giới hạn phát hiện của phương pháp này có thể xuống dưới 1 ppb phụ thuộc vào loại đầu dò sử dụng Phương pháp tạo dẫn xuất sau cột với iod đã được chấp nhận bởi AOAC - IUPAC như là phương pháp chuẩn thức Mặc dù cho kết quả tốt nhưng phương pháp này vẫn còn một số hạn chế như thời gian cần để ổn định pha động lâu (ít nhất 1 giờ), nhiệt độ trên 75C, phải thêm tác nhân hòa loãng, dung dịch iod phải chuẩn bị hàng ngày để bảo đảm độ ổn định, cần thêm một dụng cụ bơm, dùng dung dịch iod bão hòa làm tăng sự lão hóa hệ thống dây nối và dụng cụ bơm

Một phương pháp tạo dẫn xuất khác là dùng brom (Hình 1.10) Brom là tác nhân oxy hóa mạnh hơn iod và cũng ít bền, vì vậy phải dùng một hệ thống điện hóa (tế bào Kobra) Phản ứng này chỉ cần 4 giây tại nhiệt độ phòng, cho giới hạn phát hiện tương

tự phương pháp dùng iod Tạo dẫn xuất bằng pyridinum bromid perbromid (PBPB) có thuận lợi hơn là dung dịch này khá bền, không cần thời gian phản ứng dài cũng như không cần nhiệt độ cao, hệ thống này cũng không đòi hỏi các dụng cụ đắt tiền như phương pháp brom dùng tế bào Kobra

Để tránh bất lợi do các tác nhân oxy hóa, người ta nghiên cứu dùng cyclodextrin (CDs) CDs là các oligoholosid được tạo thành từ sự thủy phân dextran với sự xúc tác của men CD-transglycolat Phức hợp giữa -cyclodextrin và AFB1, AFG1 tăng mạnh cường độ phát huỳnh quang Dùng -cyclodextrin tạo dẫn xuất sau cột với AFB1 và AFG1 có thể cải thiện giới hạn phát hiện của chúng so với AFB2 và AFG2 (Hình 1.11)

Hình 1.10: Phản ứng tạo dẫn xuất của aflatoxin với Brom [125]

Hình 1.11: So sánh sắc ký đồ của quá trình phân tích aflatoxin khi có và không có tạo

dẫn xuất với cyclodextrin:(A) không tạo dẫn xuất;(B) tạo dẫn xuất với 10 -2 M  -CD; (C) tạo dẫn xuất với 10 -2 M DM-  -CD [17]

Giới hạn phát hiện này tương đương với phương pháp tạo dẫn xuất sau cột dùng các halogen nhưng có ưu điểm hơn là các chất phản ứng bền và không gây hại cho thiết

bị bơm [17]

 Điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE):

Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tách rất nhạy, được phát triển dựa trên các

kinh nghiệm thu được từ phương pháp sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lớp mỏng và điện di

Holland and Sepaniak [52] đã phân tách được hỗn hợp của 10 độc tố vi nấm AFB1, B2, G1, G2 và Zearalenone, citrinin, acid penicillic, orchratoxin A, roridin A và sterigmatocystin Trong công bố này, tác giả đã dùng hai hệ đệm micellar có tính chọn lọc khác nhau Các dung dịch đệm micellar được làm từ SDS hay sodium cholate 0,05

M trong đệm 0,01 M Na2HPO4 và 0,006 M Na2B4O7 Janii [60] đã dùng dung dịch đệm

10 mM phosphat, 50 mM SDS và 4% acetonitril để phân tách 4 AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

Sau đó một số tác giả đã sử dụng phương pháp tạo dẫn xuất -cyclodextrin, sulphobutylether-CD (SBE-CD) và MEKC pha ngược để phân giải một hỗn hợp tương

tự của 4 loại aflatoxin trên (Hình 1.12) [61].

Hình 1.12: Điện di đồ của quá trình phân tích aflatoxin bằng điện di mao quản

MEKC pha ngược [61]

1.3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC MIỄN DỊCH CHO AFLATOXIN:

1.3.1 Kháng thể:

Bước đầu tiên trong việc chế tạo cột IAC là tạo kháng thể kháng đặc hiệu với chất cần phân tích Kháng thể được động vật tạo ra sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên Mỗi kháng thể gồm có 4 chuỗi polypeptid: hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ, liên kết với nhau để hình thành một phân tử có hình chữ Y (Hình 1.13)

Hình 1.13: Cấu tạo của phân tử kháng thể [94]

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể dựa trên các dạng liên kết hóa học không đồng trị như liên kết kỵ nước, liên kết hydro, liên kết ion, lực Van der Waals (Hình 1.14) Quá trình liên kết này là thuận nghịch Lực liên kết phụ thuộc vào cấu hình của các protein phản ứng Lực liên kết sẽ mạnh nhất khi hình dạng của kháng nguyên và kháng thể tương đồng với nhau nhiều nhất, và ở gần nhau nhất

Hình 1.14: Các dạng liên kết hóa học

giữa hai phân tử kháng nguyên và kháng thể [24]