Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen rDNA

Nhằm bổ sung cho đề tài thực tập tốt nghiệp “Kiểm tra tính thuần chay ở một số mẫu thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA” được hoàn thiện hơn chúng tôi đã tìm hiểu và thực hiện chuyên đề

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN

GEN 16S rDNA

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS Lao Đức Thuận SVTH: Phan Thị Trâm MSSV: 1153010895 Khóa: 2011 – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

XÂY DỰNG CHỨNG NỘI (INTERNAL AMPLIFICATION CONTROL) CHO QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THÀNH PHẦN CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY DỰA TRÊN

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS Lao Đức Thuận SVTH: Phan Thị Trâm MSSV: 1153010895 Khóa: 2011 - 2015

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy em nghĩ bài báo cáo này của em rất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy

Con cảm ơn gia đình đã tiếp thêm nguồn động lực, luôn bên cạnh chăm sóc, an

ủi, động viên lúc con gục ngã, yếu lòng và cảm ơn những người bạn tốt luôn ở bên tôi chia sẻ những vui buồn, bên tôi những lúc khó khăn nhất

Bài báo cáo được thực hiện trong khoảng thời gian 5 tháng Kiến thức của em còn hạn chế và nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điều chắc chắn,

em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô để kiến thức của em hoàn thiện hơn

Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

Trân trọng

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Sinh viên thực hiện

DANH MỤC VIẾT TẮT

16S rRNA – gen 16S ribosome RNA

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool

NCBI – National Center for Biotechnology Information

PCR – Polymerase Chain Reaction

S (16S) – đơn vị Svedberg (kí hiệu cho tốc độ lắng của các vật thể)

Tm – nhiệt độ nóng chảy của mồi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của người Việt Nam

Hình 1.2 Bản đồ bộ gen ty thể của con người

Hình 1.3 Cấu trúc của lục lạp

Hình 3.1 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP1

Hình 3.2 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi TP2

Hình 3.3 Cặp mồi TP1-TP2 được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần mềm Annhyb

Hình 3.4 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi xuôi CLO-1-F

Hình 3.5 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của mồi ngược CLO-1-R

Hình 3.6 Cặp mồi chứng nội được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng phần mềm Annhyb

Hình 3.7 Kết quả điện di 6 mẫu thực phẩm chay trên thị trường

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP1

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự mẫu thực phẩm chay (mẫu 1) của mồi TP2

Hình 3.10 Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (H1-F) bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1

Hình 3.11 Kết quả BLAST giải trình tự mẫu 1 thực phẩm chay của mồi xuôi TP1Hình 3.12 Trình tự DNA của mẫu 1 trên giao diện BLAST với kết quả loài tương

đồng (Gallus gallus)

Hình 3.13 Kết quả điện di với 1 mẫu thực vật, 1 mẫu động vật và 1 mẫu hỗn hợp thực vật : động vật

Hình 3.14 Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-F

Hình 3.15 Kết quả giải trình tự mẫu cải bắp của mồi CLO-1-R

Hình 3.16 Một số nucleotide đã hiệu chỉnh trên mạch xuôi (M1-F) bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1

Hình 3.17 Kết quả BLAST giải trình tự mẫu cải bắp của mồi xuôi CLO-1-F

Hình 3.18 Trình tự DNA của mẫu cải bắp trên giao diện BLAST với kết quả loài

tương đồng (Brassica oleracea)

Hình 3.19 Kết quả điện di với 5 mẫu thực phẩm chay trên thị trường

Bảng 3.3 Bảng cơ sở dữ liệu trình tự gen cpDNA

Bảng 3.4 Các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch đại gen lục lạp

Bảng 3.5 Kết quả đo OD của 6 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu thực vật

Bảng 3.6 Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (H1-F)

Bảng 3.7 Bảng hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí trên mạch xuôi (M1-F)

Bảng 3.8 Kết quả đo OD của 5 mẫu thực phẩm chay, 1 mẫu động vật, 1 mẫu thực vật

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vii

MỤC LỤC viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 THỰC PHẨM CHAY 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Lợi ích của việc ăn chay 3

1.1.3 Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới 4

1.2 THÔNG TIN VỀ GEN 16S rDNA 6

1.2.1 Ty thể 6

1.2.2 Gen 16S rDNA 8

1.3 CHỨNG NỘI - IAC (Internal Amplification Control) 8

1.4 HƯỚNG NGHIÊN CỨU, PHÁT HIỆN DNA ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM CHAY 11

1.4.1 Trên thế giới 11

1.4.2 Việt Nam 12

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 KHẢO SÁT IN SILICO 14

2.1.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu 14

2.1.2 Kế thừa cặp mồi, kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng 14

2.1.3 Danh mục các phần mềm sử dụng 14

2.2 THỰC NGHIỆM: KIỂM TRA TÍNH THUẦN CHAY CỦA 6 MẪU THỰC PHẨM CHAY 15

2.2.1 Vật liệu 15

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO TRÊN GEN TY THỂ 16S rRNA 24 3.1.1 Thu thập trình tự đích 16S rRNA 24

3.1.2 Kế thừa và đánh giá mồi cho phản ứng PCR 25

3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CHỨNG NỘI 29

3.2.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu 29

3.2.2 Kế thừa và đánh giá mồi được chọn làm chứng nội 31

3.3 THỰC NGHIỆM 34

3.3.1 Kiểm tra tính thuần chay của 6 mẫu thực phẩm chay 34

3.3.2 Kết quả đo mật độ quang sản phẩm tách chiết 35

3.3.3 Kết quả khảo sát với một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường 36

3.3.4 Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi TP1-TP2 37

3.3.5 Bước đầu thiết lập quy trình multi-PCR để khảo sát mồi chứng nội 41

3.3.6 Kết quả giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự của cặp mồi CLO-1 42

3.3.7 Kết quả khảo sát multi-PCR với một số mẫu thực phẩm chay trên thị trường 46

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 50

4.2 ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Những tiến bộ trong nghiên cứu về dinh dưỡng vài thập kỷ qua đã thay đổi hiểu biết của các nhà khoa học về lợi ích của chế độ ăn chay đối với sức khỏe con người và bệnh tật [36]

Vì những lý do như tôn giáo, y tế, nền kinh tế và bảo tồn sinh thái, những người ăn chay đã trở thành một phần lớn dân số, tạo ra cơ hội kinh doanh lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm [24] Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có rất nhiều sản phẩm thực phẩm chay từ các công ty hoặc các tiểu thương ở chợ như: chả cá chay, bò lát chay, cá thu sốt cà chay,…nhưng tính “thuần chay” chưa được xác nhận và đảm bảo Một chế độ ăn chay được định nghĩa là trong đó không bao gồm thịt, hải sản, hoặc các sản phẩm có chứa những thành phần kể trên

[12] Nhiều người ăn chay hiện nay rất chú trọng đến tính “thuần chay”, nghĩa là không lẫn bất kì thành phần nào có nguồn gốc từ động vật Đây là một đặc tính quan trọng trong chế biến và sản xuất thực phẩm chay [2]

Trình tự gen 16S ribosome RNA (rRNA) là trình tự được sử dụng rộng rãi để

xác định loài vi khuẩn và thực hiện các nghiên cứu phân loại [9]

Trình tự đích chúng tôi chọn thuộc gen 16S rRNA bởi các lí do sau: (i) hiện diện ở hầu hết các loài vi khuẩn, (ii) có nhiều bản sao trong tế bào, (iii) bảo tồn cao, chức năng qua thời gian thường không có sự thay đổi, (iv) gen 16S rRNA (1,500 bp) đủ lớn cho mục đích nghiên cứu thông tin [33], (v) mtDNA di truyền theo dòng mẹ nên có tính ổn định cao [30]

Một nhược điểm chính của hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR được công bố cho thấy chúng không chứa chứng nội - điều khiển khuếch đại bên trong (IAC) [18] Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu Âu (CEN), phối hợp với tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO), đã đề xuất một hướng dẫn chung cho thử nghiệm PCR đòi hỏi phải có sự hiện diện của IAC trong hỗn hợp phản ứng Vì vậy, chỉ PCR chứa IAC mới có thể trải qua thử nghiệm hợp tác đa trung tâm và là một điều kiện tiên quyết cho việc chuẩn hóa [8]

Trong việc thiết lập chứng nội cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành chọn

trình tự gen đích là cpDNA (chloroplast DNA) Lý do lựa chọn trình tự gen đích này

do: (i) lục lạp là bào quan đặc trưng cho thực vật, (ii) trong mỗi lục lạp có chứa khoảng 50 - 100 bản sao DNA [13], (iii) nguyên liệu làm thực phẩm chay có thành phần chủ yếu từ thực vật [36], (iv) cpDNA có tình bảo tồn cao [3]

Nhằm bổ sung cho đề tài thực tập tốt nghiệp “Kiểm tra tính thuần chay ở một

số mẫu thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA” được hoàn thiện hơn chúng tôi đã

tìm hiểu và thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “Xây dựng chứng nội

(internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn

gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA”

Mục tiêu của nghiên cứu: Mục tiêu của đề tài là xây dựng chứng nội - IAC

(internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ

động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen 16S rDNA

1 TỔNG QUAN PHẦN

Những người ăn chay hình thành các nhóm không đồng nhất bao gồm [15]:

+ Nhóm semivegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng và cá) + Nhóm lacto - ovo vegetarians (thực vật, sản phẩm sữa, trứng) + Nhóm người thuần chay (chỉ ăn thực vật)

1.1.2 Lợi ích của việc ăn chay

Ngày nay, ăn chay đang phát triển toàn cầu và ngày càng được chấp nhận Nguyên nhân chính của xu hướng này là vấn đề sức khỏe, đạo đức, sinh thái học và các vấn đề xã hội Tương lai của việc ăn chay đầy hứa hẹn bởi vì dinh dưỡng đầy đủ

là rất quan trọng cho sức khỏe con người Ngày càng có nhiều người không muốn giết động vật, không muốn biến đổi khí hậu, để phòng tránh một số bệnh và đảm bảo một tương lai sống tốt hơn cho thế hệ mai sau [23]

Chế độ ăn chay thường có ít chất béo, đặc biệt là ít chất béo bão hòa, có nhiều chất xơ hơn Nó cũng có thể bao gồm nhiều loại ngũ cốc nguyên hạt, các loại đậu, các loại hạt, protein đậu nành, và không hiện diện thịt màu đỏ, chế độ ăn chay này

có thể cung cấp nhiều lợi ích về các vấn đề sức khỏe mãn tính, phòng ngừa và điều trị bệnh béo phì, bệnh tiểu đường và cả bệnh tim mạch Mặc dù ăn chay có thể đáp ứng tất cả các nhu cầu dinh dưỡng của một cá nhân, nhưng cần đặc biệt chú ý đến một số chất dinh dưỡng để đảm bảo khẩu phần đầy đủ, đặc biệt là nếu người đó là người chỉ ăn chay [26] Hiện nay có một số lượng đáng kể các nghiên cứu cho thấy những lợi ích sức khỏe của chế độ ăn chay và thực vật, trong đó có liên quan đến việc giảm nguy cơ béo phì, tiểu đường, bệnh tim, và một số loại ung thư cũng như

Đài Loan, cho thấy việc tiêu thụ các loại thực phẩm chay địa phương có lượng chất béo thấp có tác dụng bảo vệ chống lại ung thư tuyến tiền liệt đối với nam giới trong quần thể nghiên cứu này [10] Quan điểm cho rằng chế độ ăn uống có thể ảnh hưởng đến bệnh viêm thấp khớp (Rheumatoid Arthritis - RA) là một trong văn hóa dân gian, nhưng thông tin hỗ trợ khoa học cho quan điểm này còn ít Kết quả nghiên cứu cho thấy điều trị bằng chế độ ăn uống có thể là một loại thuốc hỗ trợ có giá trị cho việc điều trị cho RA [22] Các nghiên cứu dịch tễ học cũng cho rằng một chế độ

ăn chay cân bằng cũng có nhiều lợi ích sức khỏe, tỷ lệ mắc các bệnh về hệ tuần hoàn ở người ăn chay thấp hơn so với người ăn động vật Nghiên cứu này còn đưa

ra một lối sống thường xuyên ăn chay không có tác động tiêu cực đến tình trạng sức khỏe ở người cao tuổi [14] Nghiên cứu của Sharma S và cs (2014) cho rằng ăn chay

là một lựa chọn an toàn và hữu hiệu đối với các bệnh nhân bị bỏng [38] Và một trong những phát hiện bất ngờ nhất trong dịch tễ học dinh dưỡng cho rằng ăn các loại hạt dường như giúp bảo vệ chống lại bệnh tim do thiếu máu cục bộ (Ischaemic Heart Disease - IHD) Tần suất tiêu thụ các loại hạt được phát hiện tỷ lệ nghịch với tất cả các nguyên nhân gây tử vong ở một số nhóm dân số như người da trắng, da đen và đặc biệt đối với người già Như vậy, tiêu thụ hạt có thể không chỉ giúp bảo

vệ chống lại IHD, mà còn làm tăng tuổi thọ [35]

1.1.3 Các thống kê/khảo sát về việc sử dụng thực phẩm chay ở Việt Nam

và một số quốc gia trên thế giới

1.1.3.1 Việt Nam

Tháng 8 - 2012, công ty nghiên cứu thị trường trực tuyến W&S đã thực hiện một cuộc khảo sát nhanh trên 659 người về “Xu hướng ăn chay của người Việt Nam” nhằm tìm hiểu về nét văn hóa ẩm thực đặc biệt này Cuộc khảo sát được tiến hành điều tra trên 355 nam và 304 nữ từ 16 tuổi trở lên Trong tổng số 659 người

tham gia khảo sát thì có hơn một nửa thường xuyên ăn chay (chiếm 58,9%)

Hình 1.1 Biểu đồ thể hiện tình hình ăn chay của người Việt Nam

Đa số thường ăn chay vào các thời điểm như ngày rằm và mồng một hàng tháng, hay vào những dịp lễ lớn của Phật giáo Giữa nam giới và nữ giới không có

sự khác biệt nhiều về mức độ thường xuyên ăn chay Kết quả khảo sát còn cho thấy

có 3 lý do ăn chay được nhiều người đồng tình nhất: (i) vì ăn chay giúp tâm hồn thanh thản, nhẹ nhàng (40,7%), (ii) vì họ muốn cầu nguyện (39%) và (iii) ăn chay giúp mọi người bổ sung/ngăn ngừa một số chất, giúp tăng cường bảo vệ sức khỏe (33,1%) 46% trong tổng số 659 người tham gia trả lời khảo sát cho biết ăn chay là một việc có ý nghĩa đối với cuộc sống của họ Ăn chay ngày nay không còn đơn thuần là vì sức khỏe của mỗi cá nhân, con người riêng biệt mà còn được nâng lên một tầm cao mới Mọi người còn ăn chay để hướng tới cộng đồng nhân loại toàn cầu, bảo vệ môi trường sinh thái, hệ động thực vật trên Trái Đất

1.1.3.2 Một số quốc gia trên thế giới

Theo một cuộc thăm dò ý kiến của Hiệp hội các Nhà hàng Quốc gia thì người dân Hoa Kỳ đang quan tâm nhiều hơn đến món ăn chay trong các thực đơn Từ năm

1970 đến năm 2007, số người ăn chay gia tăng khoảng 30% Sự phổ biến các thông tin sự liên hệ mật thiết giữa chế độ ăn uống và bệnh tật là một nguyên do thúc đẩy phong trào ăn chay gia tăng ở Mỹ và những nước Tây Âu [6]

Vào năm 2009, cuộc thăm dò của Vegetarian Resource Group cho biết ở Hoa

Kỳ có 8% số người trưởng thành nói họ không bao giờ ăn thịt và các loại hải sản

12% trẻ em nam tuổi từ 10 - 12 không bao giờ ăn thịt Ngoài ra, qua sách sử từ xưa còn ghi nhận, việc ăn chay đã được sự ủng hộ bởi các danh nhân thế giới như: nhà toán học Pythagoras, nhà thi họa điêu khắc Leonard da Vinci, triết gia Pháp Jean Jacques Rousseau, nhà kinh tế Adam Smith, nhà tiểu thuyết Nga Leo Tolstoy, Tổng thống Mỹ Thomas Jefferson, Benjamin Franklin, và Mahatma Gandhi,…[6]

Ở Ấn Độ, đất nước đông dân thứ hai trên thế giới, với dân số hơn 1,2 tỷ người

có khoảng 500 triệu người ăn chay [55] Tính đến năm 2007, tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hiệp quốc (FAO) đã thống kê và chỉ ra rằng người Ấn Độ có

tỷ lệ tiêu thụ thịt thấp nhất trên thế giới [46]

Theo tổ chức Almanac of Food Consumption Survey in Taiwan (AFCST) thuộc Hội đồng Nông nghiệp năm 2007 số người ăn chay chiếm 14% dân số của Đài Loan, tăng 2% so với hai năm trước đây [16]

1.2 THÔNG TIN VỀ GEN 16S rDNA

1.2.1 Ty thể

Ty thể có trong tất cả các tế bào sinh vật nhân chuẩn Ty thể được xem là trung tâm năng lượng của tế bào [5]

Ty thể khác với hầu hết các bào quan khác vì nó

có DNA dạng vòng và sao chép một cách độc lập trong tế bào Nó còn là một ví dụ

rõ ràng của thuyết nội cộng sinh [51] MtDNA (mitochondrial DNA – gen ty thể) có đặc điểm là đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ [30]

Ngoài ra, một ty thể chứa 2 - 10 bản sao mtDNA và có 100 – 10.000 bản sao của mtDNA trong một

tế bào [30]

Chiều dài của mtDNA là 16.569 bp [52], mtDNA có chứa thông tin về protein ribosome thuộc ty thể như tRNAs, rRNAs và protein Ty thể chứa ribosome, chịu trách nhiệm cho tất cả các hoạt động tổng hợp protein xảy ra trong ty thể mRNA được tổng hợp tại ty thể vẫn có trong các cơ quan khác và được dịch mã bởi ribosome ty thể Các phân tử mtDNA đã được nghiên cứu trong một loạt các sinh vật, và vì nó tương đối nhỏ nên rất nhiều tiến bộ đạt được trong việc xác định các tổ chức gen chính xác của nó [21] Không giống như DNA trong nhân, mtDNA không

bị xáo trộn ở mọi thế hệ, do đó nó được cho là thay đổi với một tốc độ chậm hơn,

rất hữu ích cho việc nghiên cứu về tiến hóa mtDNA còn được sử dụng trong khoa học pháp y như một công cụ để xác định xác chết hoặc các bộ phận cơ thể, và chúng cũng liên quan đến một số bệnh di truyền, chẳng hạn như bệnh Alzheimer và bệnh tiểu đường [51] mtDNA mã hóa cho 37 gen: 13 tiểu đơn vị peptide của ty thể, 2 rRNAs, 22 tRNA Chuỗi nặng (H) - vòng ngoài: giàu guanines, có 28 gen còn chuỗi nhẹ (L) - vòng trong: giàu cytosines, có 9 gen: gồm ND6 và 8 tRNA [52]

Hình 1.2 Bản đồ bộ gen ty thể của con người [44]

(Các gen mã hóa cho các tiểu đơn vị của phức hợp I (ND1-ND6 và ND4L) được thể hiện bằng màu xanh; cytochrome c oxidase (COI-COIII) màu đỏ; cytochrome b của phức III màu xanh lá cây; và các tiểu đơn vị tổng hợp ATP (ATPase 6 và 8) màu vàng Hai RNA ribosome (12S và 16S được thể hiện bằng màu tím) và 22 tRNA được đánh dấu bởi các đường màu đen và được ký hiệu bằng chữ cái, nó cần thiết cho sự tổng hợp protein của ty thể Các vòng lặp (D-loop), khu vực kiểm soát không

mã hóa, bao gồm các trình tự quan trọng cho sự khởi đầu của sao chép và phiên mã

của mtDNA, trong đó có vùng khởi đầu sao chép cho chuỗi nặng (OH), chuỗi nhẹ (OL) [44])

1.2.2 Gen 16S rDNA

Các rRNA có mặt trong tất cả các loài [31] Trong hệ gen của tất cả các sinh vật

có trình tự DNA mã hóa cho các RNA ribosome (rRNA), thành phần cần thiết cho

sự tổng hợp protein của tế bào Ở thực vật DNA ribosome (rDNA) được tìm thấy trong gen hạt nhân, ty thể, lục lạp Sự tồn tại khắp nơi của rDNA trong tự nhiên và

sự phát triển của các kỹ thuật để xác định nhanh các trình tự nucleotide chủ yếu của các phân tử rRNA trong rDNA phát triển ở mức tương tự, vì vậy một số khu vực thuộc gen này rất có ích cho việc so sánh bằng hoặc thấp hơn mức chi, các khu vực khác chỉ có ích ở cấp độ họ hoặc mức cao hơn [17]

Gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1,500 bp [39] Trình tự gen 16S rRNA bảo tồn mức độ cao trong giới vi khuẩn >60% ngay cả các vi khuẩn có khoảng cách tiến hóa xa nhất Tỉ lệ đột biến trên gen 16S rRNA cũng giống các gen khác trên nhiễm sắc thể vi khuẩn Tuy nhiên, chúng thay đổi chậm và phần nào coi như là hằng số [39]

Gen 16S rDNA có một số vùng bảo tồn mạnh mẽ trên khắp các loài, thích hợp

cho việc thiết kế mồi khuếch đại đoạn gen của nhiều loài khác nhau, xen kẽ với các vùng ngắn khác ít được bảo tồn hơn thể hiện đặc trưng cho các loài khác nhau và đây là giá trị về phát sinh loài của gen ty thể [20]

Trình tự gen 16S rRNA là trình tự được sử dụng rộng rãi để xác định loài vi khuẩn và thực hiện các nghiên cứu phân loại [9] Trình tự đích chúng tôi chọn thuộc gen 16S rRNA bởi các lí do sau: (i) hiện diện ở hầu hết các loài vi khuẩn, (ii) có nhiều bản sao trong tế bào, (iii) bảo tồn cao, chức năng qua thời gian thường không

có sự thay đổi, (iv) gen 16S rRNA (1,500 bp) đủ lớn cho mục đích nghiên cứu thông tin [33], (v) mtDNA di truyền theo dòng mẹ nên có tính ổn định cao

1.3 CHỨNG NỘI - IAC (Internal Amplification Control)

Một nhược điểm chính của hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR được công bố cho thấy chúng không kèm theo chứng nội - (IAC) [18]

Ủy ban Tiêu chuẩn hóa châu Âu (CEN), phối hợp với tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế (ISO), đã đề xuất một hướng dẫn chung cho thử nghiệm PCR đòi hỏi phải

có sự hiện diện của IAC trong hỗn hợp phản ứng Vì vậy, chỉ PCR chứa IAC mới có thể trải qua thử nghiệm hợp tác đa trung tâm và là một điều kiện tiên quyết cho việc chuẩn hóa [8]

Chứng nội là một chuỗi DNA (không phải chuỗi gen mục tiêu) được khuếch đại trong cùng một phản ứng PCR với DNA mục tiêu Trong một phản ứng PCR không có sự hiện diện của IAC, nếu kết quả phản ứng không như mong đợi (không

có băng hoặc tín hiệu xuất hiện) có thể do không có trình tự gen mục tiêu trong phản ứng hoặc cũng có thể những lý do sau: sự cố của chu trình nhiệt, hỗn hợp phản ứng PCR không chính xác, polymerase hoạt động yếu hoặc quá ít và sự hiện diện của chất ức chế trong phản ứng PCR Ngược lại, trong một phản ứng PCR có hiện diện của IAC, một tín hiệu điều khiển sẽ luôn luôn được tạo ra ngay cả khi không

có gen mục tiêu Khi không có tín hiệu của IAC hoặc tín hiệu của gen mục tiêu thì phản ứng PCR thất bại Vì vậy, khi phương pháp PCR được sử dụng trong phân tích thường quy với một IAC, nếu nồng độ được điều chỉnh một cách chính xác sẽ phát hiện được kết quả âm tính giả Kết quả âm tính giả gây ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu, trong khi với kết quả dương tính giả chỉ cần lặp lại thí nghiệm tái kiểm tra mẫu để kiểm tra độ tin cậy [18]

Gen lục lạp

Lục lạp là đơn vị cơ năng quang hợp nhờ đó mà cây xanh thu nhận năng lượng mặt trời tổng hợp nên chất hữu cơ từ CO2 và H2O, không cần phải lấy năng lượng ở dạng các chất hữu cơ có sẵn, nên các sinh vật quang hợp được gọi là tự dưỡng [5]

Chloroplast DNA (cpDNA) - bộ gen lục lạp của thực vật là một gen được quan

tâm của nhiều nghiên cứu về quá trình tiến hóa phân tử và hệ thống thực vật học Một số tính năng của gen này đã tạo điều kiện phân tích tiến hóa phân tử Bộ gen có

kích thước nhỏ, là một phần quan trọng của DNA tế bào, gen của lục lạp đã được

mô tả rộng rãi ở cấp độ phân tử cung cấp các thông tin cơ bản để hỗ trợ cho nghiên cứu so sánh tiến hóa Tỷ lệ thay thế nucdeotide tương đối chậm và do đó cung cấp một cái nhìn thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài thực vật ở cấp độ sâu hơn của

sự tiến hóa [11] cpDNA có tình bảo tồn cao, nên các chỉ thị gen lục lạp đang được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu tiến hóa, xuất xứ và phát sinh loài [3]

Trong bộ gen của lục lạp có khoảng 32% bộ gen của lúa là vùng không mã hoá Hầu hết các DNA không mã hoá này được tìm thấy trong các đoạn gen rất ngắn có chức năng riêng Một số nghiên cứu gần đây đã tiết lộ mô hình phức tạp của sự thay đổi đột biến trong vùng không mã hoá [11]

1.4 HƯỚNG NGHIÊN CỨU, PHÁT HIỆN DNA ĐỘNG VẬT TRONG THỰC PHẨM

1.4.1 Trên thế giới

Những năm gần đây, các nghiên cứu nhằm phát hiện DNA động vật trong thực phẩm ngày càng được chú ý và trong đó có thể kể đến các công trình nghiên cứu của các nhóm tác giả sau:

Năm 1999, nhóm tác giả Hopwood A J., Fairbrother K S., Lockley A K., Bardsley R G với bài báo “An actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures” [19] đã sử dụng PCR và DNA tách chiết từ cơ bắp, một cặp mồi oligonucleotide có thể khuếch đại các sản phẩm của một số thành viên của họ gen actin cùng một lúc Mồi này khuếch đại tại một

locus duy nhất của gen actin và cho một băng với DNA chiết xuất từ thịt gà và gà

tây, nhưng không có phản ứng với DNA vịt, gà lôi, lợn, trâu, bò, cừu hoặc ngựa Năm 1999, Matsunaga T., Chikuni K., Tanabe R., Muroya S., Shibata K., Yamada J., Shinmura Y thực hiện nghiên cứu đề tài “A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay” [27] về cách xác định sáu loại thịt (bò, lợn, gà, cừu, dê, ngựa) được làm nguyên liệu cho các sản phẩm Bằng cách pha trộn bảy mồi với tỉ lệ thích hợp, các đoạn DNA của các loài

được thiết kế dựa trên trình tự DNA được bảo tồn trong gen cytochrome b ty thể, và

mồi ngược thiết kế dựa vào trình tự DNA cụ thể cho từng loài

Năm 2006, Yang-Chih Shih, Lih-Ching Chiueh, Hsu-Yang Lin, Che-Yang Lin, Tsung-Hsi Wu, Yuan-Hsin Chang nghiên cứu đề tài “Method of test for animal-derived ingredients in foods” [49] đã được cấp bằng sáng chế, sáng chế này liên quan đến phương pháp kiểm tra sự hiện diện hay vắng mặt của một thành phần

có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm bằng cách phát hiện một đoạn DNA bảo tồn cao hiện diện trong các loài động vật

Năm 2009, Lih-Ching Chiueh, Shiou-Wei Tsuei, Pei-Chun Hsieh, Tsung-Hsi

Wu, Yang-Chih Shih, Shu-Kong Chen đã được Hoa Kì cấp bằng sáng chế cho nghiên cứu “Detection method for differentiating between chicken-derived ingredients and egg-derived ingredients in products” [24], sáng chế này liên quan đến một phương pháp phát hiện để phân biệt giữa các thành phần nguồn gốc từ trứng gà

và các thành phần có nguồn gốc từ thịt gà (phần thịt/mô, trừ trứng) trong thực phẩm hoặc các sản phẩm khác và các cặp mồi và đầu dò được sử dụng để phát hiện đặc hiệu thịt gà trong thực phẩm hoặc sản phẩm

Năm 2009, Mane B G., Mendiratta S K., Tiwari A K nghiên cứu đề tài

“Polymerase chain reaction assay for identification of chicken in meat and meat products” [25] mục đích của nghiên cứu này là sử dụng phương pháp PCR để phát

hiện cụ thể thịt gà bằng cách sử dụng thiết kế cặp mồi dựa trên gen D-loop của ty

thể để khuếch đại đoạn DNA dài 442 bp từ thịt và sản phẩm thịt tươi sống, chế biến

và hấp

1.4.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về vấn đề này còn ít và theo tìm hiểu chỉ có một công trình duy nhất đã báo cáo của nhóm tác giả Lao Đức Thuận (2014) đã tiến hành xây dựng thành công quy trình phát hiện sự hiện diện của thành phần động vật

dựa trên kĩ thuật PCR khuếch đại gen 16S rDNA ty thể bằng cặp mồi TP1-TP2 có tính phổ quát và đặc hiệu với gen 16S rDNA ở hầu hết các loài động vật Nhóm còn

cho biết thêm tại Việt Nam chưa có một cơ quan thẩm quyền nào đảm bảo trong

thực phẩm chay không lẫn bất kì một thành phần có nguồn gốc động vật Do đó, một số công ty thực phẩm chay với mục đích để đảm bảo “thương hiệu” phải gửi mẫu thực phẩm (sản phẩm và/hoặc nguyên liệu sản xuất) sang nước ngoài để kiểm định

2 VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU PHẦN

2.1 KHẢO SÁT IN SILICO

2.1.1 Thu thập trình tự gen mục tiêu

Thu thập, khai thác thông tin từ các bài báo trên PubMed và NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) về gen 16S rRNA ty thể và lục lạp bằng một số từ

khóa “mitochondrial 16S rDNA”, “ribosome gene”, “vegetarian”, “chloroplast

gene”, “cpDNA”…

Thu thập một số trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật (cụ thể là: heo,

bò, gà,…) và thực vật (cụ thể là gạo, cải) Thu thập một số trình tự gen lục lạp của các loài thực vật (cụ thể là cải, xà lách,…) trong cơ sỡ dữ liệu Gene trên NCBI

2.1.2 Kế thừa cặp mồi, kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng

Mồi là chỉ tiêu quan trọng trong việc khuếch đại trình tự DNA mục tiêu trong phản ứng PCR Mồi phải có tính chuyên biệt nghĩa là chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp trên khuôn DNA Kế thừa cặp mồi từ bài báo của tác giả Lao Đức Thuận và cs

[2]

, mồi được thiết kế dựa trên gen 16S rRNA ty thể động vật Và cặp mồi sử dụng làm chứng nội được thiết kế dựa trên gen không mã hóa của lục lạp được kế thừa từ bài báo của tác giả Taberlet P và cs [43]

Các cặp mồi được đánh giá bằng các công cụ tin sinh sau: Cặp mồi được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng công cụ BLAST, kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi

và kích thước sản phẩm bằng phần mềm Annhyb Tiếp tục kiểm tra các thông số vật

lý (chiều dài, % GC, nhiệt độ nóng chảy, hairpin, self-dimer, năng lượng hình thành cấu trúc bậc 2,…) của cặp mồi bằng chương trình trực tuyến Oligo Analyzer 3.1 của IDT

SeaView 4.5.4: hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp gióng cột các trình

tự

Chromas Lite 2.1.1: chương trình miễn phí dùng để hiệu chỉnh trình tự

2.2 THỰC NGHIỆM: KIỂM TRA TÍNH THUẦN CHAY CỦA 6

MẪU THỰC PHẨM CHAY

2.2.1 Vật liệu

Mẫu: 10 mẫu thực phẩm chay được thu nhận từ chợ và các công ty sản xuất

thực phẩm chay thuộc khu vực Tp Thủ Dầu Một - Bình Dương

Mồi:

Kế thừa cặp mồi khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật từ bài báo của tác giả Lao Đức Thuận [2]:

Mồi xuôi (F) TP1: 5’ CCYAGGGATAACAGCGCAATC 3’

Mồi ngược (R) TP2: 5’ TCCGGTCTGAACTCAGATCAC 3’ Cặp mồi sử dụng làm chứng nội kế thừa từ bài báo của tác giả Taberlet P và

cs [43]:

Mồi xuôi (F) CLO-1-F: 5’ GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 3’

Mồi ngược (R) CLO-1-R: 5’ ATTTGAACTGGTGACACGAG 3’

Hóa chất

- Dung dịch đệm PBS-Phosphate buffer saline (NaCl (8 g), KCl (2 g),

KH2PO4 (2 g), Na2HPO4 (1,15 g), dH2O (bổ sung nước đủ 1000 mL))

- Dung dịch SDS 10% (Bio Basic Canada INC)

- Proteinase K 1 mg/mL (Fermentas)

- Dung dịch Proteinase K (SDS 10%, Proteinase K 1 mg/mL, EDTA 0,5 M)

- EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acid)

- Dung dịch NaCl bão hòa

- Phenol (Merk)

- Chloroform (Merk)

- Isopropanol (Isopropyl alcohol) (Merk)

- Amonium acetat (NH4OAc)

- Dung dịch đệm TE (Tris - HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH = 8)

- Master Mix 2X (Thermo Scientific)

- Loading dye 6X (Bio Rad)

- Thang DNA chuẩn 100 bp (Bio Rad)

- Agarose 1,5% (Bio Rad)

- Dung dịch đệm TBE (Tris - acid boric - EDTA) (Bio Rad)

- Ethidium bromide - EtBr (100 mg/mL) (Bio Rad)

Dụng cụ và thiết bị

- Găng Tay cao su, khẩu trang

- Dụng cụ tách chiết (Cối giã, ống falcon, becher, micropipet, đầu tuýp, eppendorf,…)

- Cân phân tích

- Cân kỹ thuật

- Máy khuấy từ

- Bể ổn nhiệt

- Tủ lạnh

- Máy ly tâm (Hettich - Universal 320R)

- Tủ tách chiết và tủ PCR (ESCO ADC - 4B1)

- Máy luân nhiệt PCR (Bio Rad)

- Máy đo quang phổ (SmartSpec)

- Bồn điện di (Bio Rad)

- Máy đọc gel (Geldoc XR Bio Rad)

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Về thực nghiệm, mẫu đem về được tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform, DNA tách chiết xong được bảo quản bằng dung dịch TE Tiếp theo sử dụng phương pháp đo quang phổ để định tính, định lượng DNA trong mẫu Kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu bằng cách sử dụng phương pháp PCR khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật nhờ cặp mồi đã chọn, sau khi PCR xong mẫu này được đem đi điện di để phân tách DNA mục tiêu đã khuếch đại nhờ PCR Mẫu nào nghi ngờ bị nhiễm DNA động vật tiến hành gửi mẫu giải trình tự và xác định xem mẫu bị nhiễm DNA loài nào

Bước đầu thiết lập quy trình multi-PCR để khảo sát mồi CLO-1 được dùng làm chứng nội

Sơ đồ thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu

2.2.2.1 DNA trong mẫu thực phẩm chay được tách chiết bằng phương pháp

phenol/chloroform [28][29]

Mẫu được rửa lần lượt bằng nước cất, cồn 70%, dung dịch PBS (từ 2 - 3 lần) Sau khi được làm sạch dùng kéo (đã hấp, ngâm cồn) cắt mẫu thành từng mảnh nhỏ, cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn Cân 2 g mẫu và đem đồng nhất với 4 mL dung dịch đồng nhất, vortex Chuyển 750 µL dung dịch vừa đồng nhất vào eppendorf, thêm 20 μL SDS 10% và 20 μL proteinase K (1 mg/mL) Ủ mẫu qua đêm trong bể

ổn nhiệt ở 65°C Tiến hành bổ sung 250 μL NaCl bão hòa, lắc nhẹ, ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút Sau đó hút 500 μL dịch nổi vào eppendorf khác Bổ sung 500 μL hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1 v:v:v) đảo ống nhẹ, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới (lặp lại bước này từ 1 đến 2 lần tùy thuộc vào mẫu) Thêm 500 μL chloroform, đảo ống nhẹ, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới Thêm 0,1 lần thể tích NH4OAc và 1 lần thể tích isopropanol, đảo ống nhẹ, để lạnh ở -20°C trong 2 giờ Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C thu tủa Bổ sung 1 mL ethanol 70%, ly tâm

bổ sung 50 µL dung dịch TE để bảo quản và giữ DNA trong tủ âm (-20°C) cho đến khi cần dùng

2.2.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu bằng phương

pháp PCR khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật nhờ cặp mồi đã chọn

Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử

dụng rộng rãi nhất Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần

sự hiện diện của tế bào Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ

enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng PCR cho

phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200 – 3.000 bp Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide [1]

Mẫu đem về được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform Sau đó tiến hành phản ứng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

Mồi TP1-TP2

Mồi chứng nội

Chu trình nhiệt

95°C trong 5 phút 1 chu kì 95°C trong 30 giây

35 chu kì 67°C trong 1 phút

72°C trong 1 phút 72°C trong 5 phút 1 chu kì

Water free nuclease: 4,5 µL

Chu trình nhiệt

95°C trong 5 phút 1 chu kì 95°C trong 30 giây

35 chu kì 55°C trong 1 phút

72°C trong 1 phút 72°C trong 5 phút 1 chu kì

2.2.2.3 Sử dụng phương pháp đo quang phổ để định tính, định lượng DNA [1]

Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở

bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau:

Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là:

 50 µg/mL cho một dung dịch DNA sợi đôi

 40 µg/mL cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước sóng 280 nm (OD280 nm) 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do

đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic aid Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2

Mẫu sau khi tách chiết, pha loãng 50 lần (2 µL DNA : 98 µL H2O cất) và đem

đo OD để xác định độ tinh sạch và nồng độ nucleic acid trong mẫu

2.2.2.4 Điện di sản phẩm kiểm tra kết quả

Kỹ thuật điện di trên gel bây giờ đã được coi như một phương pháp thông thường trong phòng thí nghiệm để phân tích DNA [34] Sau khi PCR xong tiến hành điện di mẫu để kiểm tra tính “thuần chay” của các mẫu thực phẩm chay đã thu thập

và kích thước sản phẩm đã khuếch đại có đúng với kích thước khuếch đại trên lý thuyết

Thông số điện di

- Gel agarose: 1,5% (1,5 g agarose + 100 mL dd TBE)

- Vnạp mẫu: 6 µL (1 µL loading dye 6X + 5 µL DNA), chạy trong 30 phút, 90V

- Thang chuẩn 100 bp: 1 µL

2.2.2.5 Tiến hành giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự

Sau khi điện di, mẫu nào nghi ngờ bị nhiễm thành phần động vật được gửi đi giải trình tự ở công ty Nam Khoa

Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 Kiểm tra các peak ở 2 đầu của trình tự mồi xuôi và mồi ngược, nếu peak không rõ ràng phải tiến hành hiệu chỉnh Đối với mạch F giữ nguyên còn mạch R phải tiến hành reverse & complement Để bắt đầu hiệu chỉnh phải export cả 2 mạch thành file fasta rồi sử dụng phần mềm seaview 4.2.12 tiến hành sắp gióng cột kiểm tra độ tương đồng Bắt đầu hiệu chỉnh trình tự (hiệu chỉnh từ sau lên trước để tránh trường hợp khi xóa 1 vài nucleotide thì vị trí của các nucleotide khác bị thay đổi) của 2 mạch bằng cách sử dụng chức năng Dotplot trong phần mềm seaview để so sánh 2 trình tự, sắp xếp các vùng trùng nhau Nếu có những lỗi (mismatch) hay những khoảng trống (gap) trong trình tự thì tiến hành mở lại trình tự bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 để tái kiểm tra, so sánh và rút ra kết luận cuối cùng với độ chính xác cao nhất Cuối cùng dùng phần mềm Chromas lite 2.1.1 xuất ra trình tự cuối cùng chính xác nhất của đoạn DNA đã được hiệu chỉnh

Sau khi hiệu chỉnh trình tự và xuất ra trình tự chính xác nhất của đoạn DNA thì bước tiếp theo là đưa trình tự vào chương trình BLAST để đánh giá Nếu kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng phù hợp: nghĩa là tìm được một vài trình tự hoàn toàn tương đồng về chiều dài, không có sự sai khác giữa các nucleotide với trình tự đang nghiên cứu thì trình tự này được chấp nhận là đã hiệu chỉnh xong Trường hợp trình

tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên ngân hàng Genbank thì xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này dựa vào peak tương ứng thuộc trình tự đã hiệu

trình hiệu chỉnh Còn nếu peak không rõ ràng, không thể nhận ra là nucleotide nào thì phải giải quyết như sau: vào NCBI thu nhận các trình tự có mức độ tương đồng trên 50% so với trình tự hiệu chỉnh, sắp giống cột với nhau và kiểm tra tần số xuất hiện tại vị trí nucleotide sai khác là nuleotide nào rồi xác định nuleotide cần thay thế

ở vị trí đó Kết thúc việc kiểm tra và hiệu chỉnh thu nhận được trình tự có mức độ chính xác cao nhất, đạt độ tin cậy lớn nhất