Nghiên cứu co dinh dưỡng enzyme amylase

Nghiên cứu co dinh dưỡng enzyme amylase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOAKHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2011

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2011

Trong suốt khoảng thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Bách Khoa, nhờ

sự tận tình dạy bảo, giúp đỡ và dìu dắt của quý thầy cô, em đã trưởng thành hơn rất nhiều trong học tập, trong công việc và trong cuộc sống Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa và đặc biệt là các thầy cô trong

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, những người đã dạy em những kiến thức nền tảng vững vàng nhất để trở thành một kỹ sư trẻ trong tương lai

Em cũng xin gửi lời chân thành và sâu sắc đến cô TS Trần Bích Lam, người cô đáng kính có ảnh hưởng sâu sắc đến em trong quá trình học tập, vì sự tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt khoảng thời gian học tập và làm luận văn, giúp em hoàn thành tốt nhất luận văn của mình

Con xin cảm ơn nội và ba luôn ở bên cạnh con, hết lòng yêu thương, chăm sóc và cổ

vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua được những giai đoạn khó khăn nhất trong công việc cũng như trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè tôi và các bạn lớp HC06TP, những người đã ở bên cạnh động viên giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hiểu được giá trị tình bạn chân thành, đẹp đẽ

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 1 năm 2011

Nguyễn Thị Vân Linh

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1.CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME) [3, 13, 15]2 1.1.1.Endo-enzyme 4

1.1.2.Exoamylase 5

3.1.1.α-1,6 enzymes 6

5.1.1.Isomerases 7

5.1.2.Cyclodextrin Glycosyltransferase 8

5.2.ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 9, 16, 31, 32] 9

5.2.1.Lịch sử nghiên cứu và phát triển 9

5.2.2.Định nghĩa 10

5.2.3.Đặc điểm của enzyme cố định 10

5.2.4.Ưu và nhược điểm của enzyme cố định 11

5.2.5.Một số phương pháp cố định enzyme 11

11.1.1.Những yếu tố ảnh hưởng 15

14.1.NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AMYLASE CỐ ĐỊNH [8, 14, 30, 31] 16

14.1.1.α-amylase cố định 16

14.1.2.β-amylase cố định 17

14.1.4.Pullulanase cố định 21

14.1.5.Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase 21

14.2.CHITOSAN [5, 18, 25] 22

14.2.1.Giới thiệu về chitosan 22

14.2.2.Tính chất của chitosan: 23

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

15.1.NGUYÊN LIỆU 24

15.1.1.Enzyme α-amylase 24

15.1.2.Chitosan 24

15.2.HÓA CHẤT SỬ DỤNG 24

15.3.DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 25

15.4.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

15.4.1.Sơ đồ nghiên cứu 25

15.4.2.Phương pháp cố định enzyme 26

17.1.1.Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme 30

22.1.1.Tối ưu hóa quá trình cố định 31

22.1.2.Xác định tính chất enzyme cố định: 33

24.1.1.Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme 33

24.1.2.Xác định hiệu suất cố định enzyme 34

26.1.1.Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của enzyme α-amylase tự do và cố định 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

29.2.CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME 40

29.3.KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH 42

29.3.1.Khảo sát thể tích enzyme sử dụng 42

29.3.2.Khảo sát thời gian cố định 45

29.3.3.Khảo sát vận tốc lắc đảo 47

29.3.4.Khảo sát kích thước chitosan 49

29.3.5.Khảo sát nồng độ glutaradehyde 51

29.4.TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH 53

29.5.KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA α-AMYLASE CỐ ĐỊNH 58

29.5.1.Ảnh hưởng của pH 58

29.5.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ 60

29.6.NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH 63

29.6.1.Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 63

29.6.2.Xác định hệ số phương trình động học Michaelis – Menten 64

29.7.KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH 65

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

30.1.KẾT LUẬN 67

30.2.KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và

cyclodextrins[15] 3

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase 20

Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố 32

Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do 40

Bảng 3.2: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thể tích enzyme sử dụng khác nhau 44

Bảng 3.3: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thời gian cố định khác nhau 45

Bảng 3.4: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những vận tốc lắc đảo khác nhau 47

Bảng 3.5: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những kích thước chitosan khác nhau 50

Bảng 3.6: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những nồng độ glutaraldehyde khác nhau 51

Bảng 3.7: Bảng mã hóa các thông số ảnh hưởng cần khảo sát 55

Bảng 3.8: Kết quả thực nghiệm với ma trận trực giao cấp 2 55

Bảng 3.9: Các hệ số phương trình hồi quy Y và kết quả kiểm định Student 56

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định 59

Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập 59

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định 60

61 Bảng 3.12: Các phương pháp cố định và chất mang dùng để cố định α-amylase 62

Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột 2

Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột 4

Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan 7

Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose 8

Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin glycosyltransferases 8

Hình 2.1: Đường chuẩn albumin 36

A 38 Hình 2.2: Đường chuẩn glucose 38

Hình 3.1: So sánh hiệu quả các phương pháp cố định 40

Hình 3.2: Cố định enzyme bằng phương pháp liên kết hóa trị 41

Hình 3.3: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme 41

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định 43

Hình 3.5: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên lượng enzyme gắn vào chitosan 44

Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian cố định lên hiệu suất cố định enzyme 45

Hình 3.7: Ảnh hưởng của vận tốc lắc đảo lên hiệu suất cố định enzyme 47

Hình 3.8: Ảnh hưởng của kích thước chitosan lên hiệu suất cố định enzyme 50

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ Glutaraldehyde lên hiệu suất cố định enzyme 52

Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích enzyme và thời gian cố định lên hiệu suất cố định 57

Hình 3.11: Đồ thị vòng dự đoán kết quả quy hoạch thực nghiệm 57

Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của α-amylase tự do và cố định 60 Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc thủy phân 64 Hình 3.15: Mối liên hệ giữa và 64 Hình 3.16: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định 66

MỞ ĐẦU

Amylase rất quan trọng trong quá trình đường hóa tinh bột, đồng thời amylase cũng

có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm như: sản xuất syrup glucose, syrup giàu fructose, syrup maltose, giảm độ nhớt của sugar syrup, hòa tan và đường hóa tinh bột để lên men cồn trong công nghiệp rượu bia…Trong hầu hết các trường hợp, quá trình sử dụng enzyme bị ức chế khi nồng độ cơ chất, sản phẩm cao và khi sử dụng enzyme nhiều lần hoặc lâu cũng làm enzyme mất ổn định Chính vì thế quá trình cố định enzyme rất quan trọng để

sử dụng enzyme liên tục và tái sử dụng nhiều lần trong công nghiệp, và dễ dàng tách enzyme ra khỏi sản phẩm Điều này rất quan trọng trong việc phát triển thiết bị phản ứng sinh học có tính khả thi về kinh tế dùng trong công nghiệp thủy phân tinh bột

Trong thời gian qua, trên thế giới và Việt Nam đã thực hiện nhiều công trình nghiên cứu cố định α-amylase trên các chất mang khác nhau Tuy nhiên quá trình thực hiện khá phức tạp, hạn chế khi ứng dụng trong công nghiệp Để đáp ứng cho mục tiêu ứng dụng thuận tiện trong công nghiệp, chúng tôi quyết định tiến hành nghiên cứu cố định α-amylase trên chitosan Từ trước đến nay, chitosan chỉ được hoạt hóa xử lý ở dạng dung dịch, do đó cần thêm quá trình tạo hạt hoặc tạo màng, nhưng ở đây chúng tôi tiến hành sử dụng chitosan ở dạng rắn để thuận tiện tạo cột thủy phân tinh bột Chitosan là chất mang được ưu tiên chọn lựa vì chitosan là một polymer có cấu trúc siêu lỗ dễ dàng hấp phụ enzyme đồng thời trong phân tử chitosan có các nhóm amino hoạt động dễ dàng liên kết cộng hóa trị với một nhóm aldehyde của glutaraldehyde, tạo cầu nối để liên kết cộng hóa trị với nhóm amino của enzyme

Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ xác định điều kiện để cố định α-amylase và khảo sát tính chất của α-amylase cố định Nội dung nghiên cứu gồm có:

Khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định

Tối ưu hóa 2 yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến quá trình cố định

Khảo sát tính chất của enzyme cố địnhvà xác định hiệu quả sử dụng enzyme cố

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 CÁC ENZYME THỦY PHÂN TINH BỘT (AMYLOLYTIC ENZYME) [3,

13, 15]

Có 5 nhóm enzyme cơ bản tham gia thủy phân tinh bột:

Nhóm endoamylase và exoamylase thủy phân chủ yếu ở liên kết α–1,4 glycoside.Nhóm enzyme cắt mạch nhánh (debranching enzyme) thủy phân liên kết α–1,6 glycoside

Nhóm isomerase xúc tác phản ứng chuyển đồng phân hóa từ glucose thành fructose, được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất syrup fructose từ syrup glucose.Nhóm cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân tinh bột đồng thời xúc tác quá trình tạo vòng cyclodextrin

Hình 1.1: Các enzyme thủy phân tinh bột

–glucosidase

PullulanaseIsoamylase

Exopullulanase

Bảng 1.1: Phân loại enzyme dùng trong sản xuất syrup tinh bột, maltodextrins và

cyclodextrins[15]

Hình 1.2: Vị trí hoạt động của enzyme thủy phân tinh bột

Chú thích:

D: Enzyme cắt mạch nhánh O-O: liên kết α-1,4

1.1.1 Endo-enzyme

Cơ chế tác dụng: Endo-enzyme thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong amylose, amylopectin, và các polysaccharide tương tự nhưng không thủy phân liên kết α-1,6 glycoside trong amylopectin Sản phẩm thủy phân là các oligosaccharide có độ dài chuỗi khác nhau và có cấu tạo α trên carbon C1 của nhóm khử trong phân tử glucose

Có hai endoamylase khác nhau (EC 3.2.1.1): bền nhiệt và không bền nhiệt

α-Amylase bền nhiệt có nguồn gốc vi khuẩn và thu nhận từ chủng Bacillus Hiện nay, hai

loại α-amylase thương mại quan trọng là:

Amylase từ B.subtilis nếu có mặt ion Ca2+ thì enzyme này sẽ có nhiệt độ tối ưu trong khoảng từ 65 đến 70oC

Amylase từ B.licheniformis hoạt động và ổn định trong dung dịch tinh bột ở nhiệt độ

trên 90oC, sự ổn định tương đối độc lập với ion Ca2+, và enzyme này hoạt động tốt hơn với khoảng pH rộng

1.1.2 Exoamylase

Cơ chế tác dụng: Một số có thể cắt liên kết α-1,6 glycoside (hình 1.2), nhưng tốc độ phản ứng chậm hơn so với khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside Exoamylase hoạt động trên các liên kết bên ngoài từ đầu tận cùng không khử và tạo ra các sản phẩm khối lượng phân tử thấp

Hai loại exoenzyme quan trọng trong thủy phân tinh bột được ứng dụng trong công nghiệp là: glucoamylase và β-amylase

2 Glucoamylase

Glucoamylase (EC 3.2.1.3) có nguồn gốc từ nấm Enzyme này thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ đầu tận cùng không khử, giải phóng ra phân tử ᴅ-glucose cấu hình β Glucoamylase cắt phân tử ᴅ-glucose ở đầu nhánh phân tử amylopectin, bắt đầu thủy phân ở liên kết α-1,6 glycoside, nhưng chậm hơn nhiều khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside Enzyme này là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới Glucoamylase sử dụng quan trọng nhất là sản xuất syrup giàu glucose (96 – 98% glucose) và syrup giàu fructose (55% fructose)

Ở nồng độ glucose cao, glucoamylase tái tổng hợp các phân tử glucose hình thành maltose và isomaltose Hiện tượng này xảy ra rõ hơn ở nồng độ cơ chất cao và nồng độ enzyme cao Trong dung dịch glucoamylase thô thường có mặt transglucosidase (EC 2.4.1.24), enzyme này cũng có khả năng trùng hợp glucose

3 β-amylase

Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2), có nguồn gốc thực vật Lúa mạch, lúa mì, khoai tây

và đậu nành là những nguồn phổ biến để thu nhận β-amylase Tuy nhiên, β-amylase cũng

tồn tại như một enzyme ngoại bào trong Bacillus sp và Pseudomonas sp.

β-amylase hoạt động theo kiểu exo, thủy phân từ đầu tận cùng không khử của chuỗi bên ngoài phân tử tinh bột hoặc polysaccharide tương tự, và mạch ngắn dần tạo β-maltose Amylose được chuyển hoàn toàn thành maltose, ngược lại amylopectin và các polymer mạch nhánh khác được thủy phân thành nhiều sản phẩm khác nhau phụ thuộc vào mức độ phân nhánh, kết quả quá trình thủy phân này khoảng 50 – 60% chuyển thành maltose Kết quả này là do β-amylase không thể thủy phân liên kết α-1,6 glycoside Enzyme β-amylase đạt hoạt tính cao nhất ở pH 5 Nhiệt độ tối ưu trong khoảng giữa 55 và 60oC.

3.1.1 α-1,6 enzymes

Các enzyme α-1,6 (hay còn gọi là các enzyme cắt nhánh - debranching enzyme), vài thập niên qua đã được biết đến nhưng chưa phổ biến, như pullulanase (EC 3.2.1.41) và isoamylase (EC 3.2.1.68) Gần đây các enzyme này thu hút nhiều sự chú ý, do có thể cải thiện hiệu suất thủy phân khi có mặt một enzyme cắt nhánh trong hệ thống

Các enzyme cắt nhánh có 2 nhóm, có hoạt tính endo có thể thủy phân liên kết α-1,6 glycoside ở điểm nhánh của amylose, glycogen, pullulan và các oligosaccharide tương tự:

Nhóm đầu tiên là pullulanase, thủy phân đặc hiệu liên kết α-1,6 glycoside, giải phóng các oligosaccharide mạch thẳng gồm các nhóm glucose liên kết bằng liên kết α-1,4 glycoside

Nhóm thứ hai là neopullulanase và amylopullulanase, có hoạt tính nhắm vào cả liên kết α-1,6 và α-1,4 glycoside

4 Pullulanase

Pullulanse được phát hiện đầu tiên vào năm 1961 và thu hút sự chú ý vì nó hoạt động đặc hiệu trên liên kết α-1,6 glycoside của pullulan (pullulan là một polymer ᴅ-glucose mạch thẳng bản chất gồm các đơn phân maltotriosyl liên kết với nhau bằng liền kết α-1,6 glycoside), tinh bột, amylopectin, và các oligosaccharide tương tự

Pullulanase thủy phân tinh bột tạo các sản phẩm có DP trung bình thay đổi từ 115 đến 2300 Enzyme này thường dùng kết hợp với glucoamylase, α- hoặc β-amylase

Hình 1.3: Cấu trúc của pullulan

Chú thích:

→O: liên kết α-1,6

5 Isoamylase

Isoamylase được phát hiện vào năm 1949, được thu nhận ở phòng thí nghiệm từ một

số vi sinh vật như K aerogenes và Pseudomonas sp Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6

glycoside trong amylopectin và có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính trên pullulan

Trong phản ứng thủy phân tinh bột, khi sử dụng isoamylase trước glucoamylase, phần amylopectin được tách khỏi polymer nhanh chóng và vì thế rất dễ bị hồ hóa Thời điểm cho isoamylase vào hệ thống thủy phân rất quan trọng

5.1.1 Isomerases

Glucose isomerase (EC 5.3.1.5) được ứng dụng quan trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm là dùng để chuyển glucose thành fructose (hình 1.4)

Cobalt được biết đến là chất hoạt hóa glucose isomerase, nhưng glucose isomerase

từ một số nguồn lại không cần ion cobalt Magnesium là một chất hoạt hóa khác của những enzyme này Ngược lại, calcium và oxygen có tác động ức chế, tác động ức chế của calcium có thể khắc phục bằng cách cho magnesium vào, ngược lại tác động của oxygen được khắc phục nhờ quá trình nhiệt Vì thế, việc tinh sạch cơ chất (glucose syrup) rất quan trọng để enzyme ổn định

Hình 1.4: Quá trình chuyển đồng phân glucose thành fructose

5.1.2 Cyclodextrin Glycosyltransferase

Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) thủy phân một loạt đầu không khử cyclomaltooligosaccharides chuyển thành cyclodextrin, gồm 6, 7 hoặc 8 nhóm ᴅ-glucopyranol Các enzyme cyclodextrin glycosyltransferase thủy phân cắt mạch nhánh của tinh bột và xúc tác tạo vòng

Hình 1.5: Cơ chế phản ứng thủy phân – liên kết của cyclodextrin glycosyltransferases.

Chú thích:

→, vị trí thủy phân O-O, liên kết α-1,4

CGTase được sản xuất chủ yếu bởi giống Bacillus CGTase từ B macerans khi thủy

Glucose isomerase

α-cyclodextrin

β-cyclodextrin

γ-cyclodextrinPhân tử tinh bột

stearothermophilus khi thủy phân tinh bột sản xuất cả α- và β-cyclodextrin và B subtilis

CGTase thì tạo ra chủ yếu là γ-cyclodextrin

5.2 ENZYME CỐ ĐỊNH [3, 9, 16, 31, 32]

5.2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển

Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và thấy rằng enzyme invertase của nấm men khi hấp phụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose

Năm 1949, Micheal và Iuers đã sử dụng phương pháp azide hóa carboxymethyl cellulose để cố định những chuỗi protein có hoạt tính

Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzyme như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị

và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot

Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme để chống lại dị ứng khi đưa enzyme vào cơ thể

Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công khi nhốt các enzyme như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide

Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde Cũng trong năm này, Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzyme carbonic anhydrase

Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định Cũng trong năm này, Chibata và các cộng sự đã thực hiện thành công áp dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp

Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzyme: β-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex

Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng

gel acrylamide Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartase rất cao.

Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzyme glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất syrup frutose từ glucose theo quy mô công nghiệp

Ngoài những sản phẩm kể trên, enzyme cố định còn có được những ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học

5.2.2 Định nghĩa

Enzyme cố định có thể được hiểu theo 2 nghĩa:

Nghĩa hẹp: Enzyme cố định là enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với dung dịch tự do Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại Như vậy, theo nghĩa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm

cả enzyme được cố định vào một chất mang, cả enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các thiết bị phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép sử dụng nhiều lần

5.2.3 Đặc điểm của enzyme cố định

Hoạt tính riêng của enzyme cố định nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme tự do cùng loại

Enzyme cố định hòa toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có một số sai khác nhất định

Enzyme cố định thường bền nhiệt hơn enzyme tự do

Enzyme cố định có pHopt có thể khác với pHopt của enzyme tự do cùng loại

Khả năng bảo quản của enzyme cố định tốt hơn

Enzyme cố định dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm và có sự ổn định cao hơn enzyme tự

Sản phẩm không chứa enzyme

Mô hình tốt để nghiên cứu động học của enzyme

Nhược điểm:

Hoạt tính enzyme bị giảm do chất mang

Enzyme bị giảm hoặc mất hoạt tính sau quá trình cố định

5.2.5 Một số phương pháp cố định enzyme

6 Phương pháp hấp phụ (Adsorption)

Nguyên tắc: Enzyme được hấp phụ vào các nguyên liệu, như là than, polymer hữu

cơ, thủy tinh, muối vô cơ, oxide kim loại, hoặc silicagel

Ưu điểm: Rẻ tiền, quá trình thực hiện đơn giản, enzyme ít bị biến tính trong suốt quá trình cố định so với quá trình cố định enzyme bằng phương pháp hóa học

Nhược điểm: Các lực liên kết yếu nên enzyme dễ bị giải hấp phụ khi thay đổi nhiệt

độ, pH, lực ion hoặc sự có mặt của cơ chất Ngoài ra những chất lạ cũng có khả năng hấp

CHẤT MANG

Enzyme

phụ vào chất mang, có thể gây ra những vấn đề khác nhau bao gồm cả việc làm biến tính enzyme.

Kích thước lỗ gel nhiều chỗ làm thất thoát enzyme do chúng bị khuếch tán ra ngoài

8 Phương pháp vi bao (Microencapsulation)

Phương pháp này được mô tả bởi Chang tương tự phương pháp nhốt, nhưng bản chất là quá trình hình thành của các hạt rất nhỏ hoặc các màng bao Cơ chất trong trường hợp này, cũng như trong phương pháp trên, phải có khối lượng phân tử thấp Bao phổ biến dày 200 Ao, và bán kính lỗ là 18 Ao

Phương pháp vi bao khắc phục vấn đề enzyme thoát ra ngoài vì kích thước lỗ đồng nhất, kích thước lỗ có thể thay đổi

9 Phương pháp trao đổi ion (Ion-exchange)

Nguyên tắc: Chất trao đổi ion là nguyên liệu không tan chứa các nhóm điện tích tạo liên kết hóa học và di chuyển đến các ion trái dấu Các ion trái dấu có thể trao đổi với các ion khác cùng điện tích mà không có bất kỳ sự thay đổi nào trong chất mang không tan Protein và enzyme có thể mang điện tích phụ thuộc vào pH và loại protein Tính chất này được Tose và các cộng sự sử dụng để kết nối enzyme với chất trao đổi ion bằng tương tác điện tích

Các vật liệu cố định thường sử dụng là: các dẫn xuất trao đổi ion như CM-, AE-, DEAE-, cellulose, sepadex, chitosan…

Ưu điểm:

Phương pháp đơn giản

EnzymeMembrane

Enzyme

CHẤT MANG

Vật liệu có thể tái sử dụng lại (loại enzyme cũ, nạp enzyme mới)

Enzyme không bị biến đổi hóa học nên hoạt tính enzyme cố định cao

Vật liệu cố định mang điện tích làm tăng nồng độ địa phương của cơ chất, do đó làm tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme và do đó làm tăng hoạt tính enzyme cố định

Nhược điểm: Enzyme và vật liệu cố định chịu ảnh hưởng nhiều của sự thay đổi pH, nhiệt độ, lực ion, dung dịch đệm sử dụng

10 Phương pháp tạo liên giữa các phân tử enzyme (Cross-linking)

Nguyên tắc: Các phân tử enzyme được liên kết với phân tử trung gian bằng cách dùng các chất có tính năng liên kết khác nhau Các chất này hoặc có hai nhóm nhóm chức giống nhau hoặc hai nhóm chức khác nhau hoặc các nhóm phản ứng khác nhau

Ưu điểm: Liên kết giữa enzyme và chất mang bền nên hạn chế thất thoát enzyme trong quá trình phản ứng và tái sử dụng

Nhược điểm: Hoạt tính enzyme bị giảm và hóa chất đắc tiền

11 Phương pháp hấp phụ và liên kết giữa các phân tử enzyme (Adsorption and

cross-linking)

Haynes và Walsh đã kết hợp hai phương pháp, thực hiện hấp phụ enzyme vào chất mang như silica gel, tiếp theo là tạo liên kết cộng hóa trị với enzyme được hấp phụ Kết quả enzyme cố định ổn định hơn khi cố định bằng cả hai phương pháp Goldman et al đã hấp

phụ papain lên collodion, sau đó để tạo liên kết cộng hóa trị giữa các enzyme hấp phụ dùng acid bisdiazobenzidine-2,2'-disulfonic.

Ưu điểm: Tạo được liên kết rất bền trước những tác nhân pH, nhiệt độ Thường dùng phối hợp với các phương pháp cố định khác

Nhược điểm: Chi phí cao và thao tác phức tạp Hoạt tính enzyme có thể giảm

11.1.1.Những yếu tố ảnh hưởng

12 Ảnh hưởng của chất mang:

Những tính chất của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, điện tích, tính háo nước, kỵ nước… đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các chế phẩm enzyme cố định

Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzyme và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng

Sự định vị enzyme giúp cho dẫn xuất enzyme không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzyme tan

Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi, làm

đứt liên kết hydro và liên kết kỵ nước

14 Ảnh hưởng của tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào:

Kích thước lỗ chất mang

Trọng lượng phân tử của cơ chất

Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

Những giới hạn khuếch tán cùng hiệu ứng phân phối ảnh hưởng đến những đặc tính động học của quá trình khuếch tán nếu so sánh chúng với những số liệu nhận được đối với enzyme tự do Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần phải để ý tới khi thiết lập quy mô của quá trình

14.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AMYLASE CỐ ĐỊNH [8, 14, 30, 31]

14.1.1.α-amylase cố định

Năm 1968, Barker và các cộng sự đã cố định enzyme α-amylase bằng liên kết hóa trị với vi tinh thể cellulose, liên kết hóa trị này bị ảnh hưởng bởi 3-(p-aminophenoxy)-2-hydroxypropyl ethers và 2-hydroxy-3-(p-isothiocyanatophenoxy) propyl ethers của cellulose tùy mức độ thay thế Hoạt tính enzyme còn lại sau khi cố định chỉ được khoảng 2% – 6% Enzyme cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn enzyme tự do và sau 7 ngày ở nhiệt độ 45oC enzyme cố định còn lại 20% hoạt tính ban đầu Về khía cạnh tái

sử dụng, α-amylase cố định trên cellulose bị mất một lượng lớn enzyme liên kết vật lý trong những lần đầu tái sử dụng, tuy nhiên hoạt tính sau đó mất đi tương đối ít

Năm 1975, Linko và các cộng sự đã nghiên cứu khá kỹ tính chất và kiểu hoạt động

của α-amylase từ B subtilis cố định bằng cách liên kết với carboxymethyl cellulose, hoạt

hóa bởi cyanogen bromide Chất mang này được chọn vì họ thấy rằng khi α-amylase liên kết với carboxymethyl cellulose thì enzyme có tính ổn định cao nhất Linko và các cộng sự của mình đã dùng chế phẩm α-amylase cố định này thủy phân tinh bột lúa mì ở 72oC trong

thiết bị khuấy Ban đầu, tốc độ phản ứng của enzyme cố định thấp hơn enzyme hòa tan, nhưng sau 1 giờ thì enzyme cố định tạo ra được lượng đường khử cao hơn enzyme hòa tan

So với α-amylase hòa tan, α-amylase cố định tạo ra tương đối nhiều glucose và maltose hơn vào lúc ban đầu Điều này phù hợp với kết quả thu được từ Ledingham và Hornby, hai nhà nghiên cứu này đã phát hiện ra rằng trong quá trình hoạt động α-amylase cố định tấn công nhiều điểm hơn so với enzyme tự do và chính điều này làm gia tăng quá trình tạo ra glucose

Một nghiên cứu gần đây bởi Boundy và các cộng sự đã quan sát rằng quá trình cố định α-amylase trên phenolformaldehyde nhân tạo bằng phương pháp hấp phụ đã làm thay đổi kiểu hoạt động của enzyme đối với cơ chất tinh bột, từ dạng endo thành dạng exo Ở trạng thái tự do, α-amylase dễ dàng tiếp xúc vùng bên trong của phân tử tinh bột lớn, khi đó hoạt tính xảy ra hoạt tính endo Tuy nhiên, quá trình cố định enzyme làm hạn chế hoạt tính ban đầu của nó tác dụng lên vùng bên ngoài của polysaccharide

Cuối cùng, lưu ý liên kết của α-amylase tạo phức chất với các polymer đồng trùng hợp ái nước nhân tạo đã được mô tả bởi Manecke và các cộng sự Enzyme được kết hợp với một chất đồng trùng hợp nitrate hóa của methacrylic acid, methacrylic acid m-fluoroanilide và divinylbenzene cũng như với chất đồng trùng hợp nitrate hóa của methacrylic acid 4- hoặc 3-fluorostyrene và divinylbenzene Hoạt tính của enzyme cố định không quá 3% của enzyme tự do

14.1.2.β-amylase cố định

β-amylase có giá trị thương mại lớn trong công nghiệp rượu bia, chưng cất và bánh Agarose là một trong những chất mang phổ biết nhất dùng trong cố định β-amylase Một trong những ưu điểm đáng chú ý là lỗ xốp lớn và ổn định cơ học cao Agarose có thể được chuẩn bị ở dạng hạt, khá phù hợp với quá trình dùng cột, phản ứng xúc tác enzyme trong cột như vậy có thể tạo ra tốc độ dòng tốt vì enzyme – hạt cứng

Nhiều phương pháp để gắn kết β-amylase vào agarose đã được mô tả Vretblawd và Axen đã cố định β-amylase nguồn lúa mạch bằng liên kết hóa trị với Sepharose, trung gian

bởi cyclohexyl isocyanide và acetaldehyde Enzyme cố định còn đến 40% hoạt tính so với β-amylase tự do Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng đã thử nghiệm một số phương pháp liên kết khác nhằm tìm ra phương pháp phù hợp nhất để gắn β-amylase vào agarose Họ đã

sử dụng cyanogen bromide, bis-oxiranes hoặc divinylsulfon dưới những điều kiện pH và nhiệt độ, sản phẩm enzyme cố định thu được có hoạt tính không ổn định Enzyme β-amylase cố định trên sepharose có pH và độ mạnh ion tương tự như những enzyme tự nhiên khác, tuy nhiên trong lúc bảo quản thì β-amylase – sepharose có khả năng chống sự vô hoạt

và trong lúc sử dụng thì hoạt tính tăng rõ rệt

Enzyme β-amylase cố định rất ổn định khi thủy phân tinh bột liên tục trong khoảng thời gian lâu Ở 45oC, sau 7 tuần β-amylase duy trì được 50% hoạt tính và phần trăm tương ứng ở 23oC là 85% Từ kết quả thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu của β-amylase cố định

là 45oC Ngoài ra người ta phát hiện rằng cột β-amylase bị vô hoạt có thể phục hồi lại một cách dễ dàng bằng liên kết của enzyme tự nhiên hoạt hóa trong sự có mặt của acetaldehyde

và cyclohexylisocyanide

Caldwell và các cộng sự cũng sử dụng agarose làm chất mang để cố định β-amylase bằng phương pháp hấp phụ Enzyme β-amylase được gắn thông qua tương tác kỵ nước giữa enzyme và hạt liên kết cộng hóa trị với gel sepharose, để các nhánh hexyl được liên kết với cầu ether Từ kết quả thí nghiệm cố định β-amylase thấy rằng khả năng hấp phụ tăng khi lượng hexyl tăng Khả năng hấp phụ trên lượng gel chất mang tối đa đạt ở tỷ lệ hexyl : galactose là 0,51 : 1 Hoạt tính tuyệt đối trên một thể tích tương đương 40 mg protein/ml gel cũng giống hoạt tính β-amylase liên kết hóa trị với chất mang như cellulose, acrylic polymer và agarose

Ngoài ra, một số nhà nghiên cứu đã thử cố định β-amylase qua trung gian diazo hoặc isothiocyanate liên kết với các hạt cellulose và polyacrylamide Mặc dù β-amylase đã được gắn dễ dàng vào những chất mang phù hợp, dẫn xuất acid azide được nối bị vô hoạt

và hoạt tính duy trì sau khi nối diazo và isothiocyanate vào polyacrylamide polymers thấp hơn (≈1%) của dẫn xuất cellulose tương ứng (≈3%) Theo những tác giả trên, steric có ảnh

hưởng đến hoạt tính thấp của quá trình cố định β-Amylase cố định không chỉ hoạt tính thấp mà sự ổn định cũng thấp so với β-amylase tự do.

Hầu hết quá trình cố định β-amylase đã mô tả trước kia chỉ ra rằng β-amylase có thể

dễ dàng được cố định và một số quá trình cố định có được sản phẩm cố định ổn định tương đối cao Trong sử dụng công nghiệp, β-amylase có tiềm năng sử dụng cao dùng để sản xuất liên tục maltose từ tinh bột

14.1.3.Glucosamylase cố định

Glucosamylase là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng nhất Enzyme này được dùng ở quy mô lớn để đường hóa tinh bột thành glucose hoặc syrup trong công nghiệp thực phẩm

Có hơn 40 bài báo đã được xuất bản trong thập kỷ qua, với ý tưởng cố định glucoamylase bằng liên kết hóa trị hoặc hấp phụ vào những chất mang khác nhau Từ những yêu cầu cần thiết trong công nghiệp như thực hiện quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao (≈60oC) và sử dụng quá trình có tính kinh tế hơn, đã thúc đẩy nghiên cứu quá trình cố định glucoamylase

Để cố định glucoamylase, các nhà nghiên cứu đã thực hiện nhiều phương pháp cố định như: phương pháp liên kết hóa trị, phương pháp nhốt và phương pháp hấp phụ

Đối với phương pháp liên kết hóa trị, cellulose và dẫn xuất của cellulose được xác nhận là chất mang tốt để cố định enzyme trong nhiều trường hợp vì bản chất ưu nước của chúng, cấu trúc tương đối không hạn chế và các nhóm hydroxyl có tiềm năng để phản ứng Mặc dù liên kết của glucoamylase và cellulose tương đối ổn định, nhưng thực tế khi tái sử dụng hoặc dùng liên tục thì glucoamylase cố định bị mất một phần lớn khả năng xúc tác

Trong phương pháp nhốt, enzyme cố định ổn định nhiệt cao hơn so với enzyme tự

do Nhưng gel lại gây cản trở các phân tử cơ chất phân tử lượng lớn tiếp xúc với chất xúc tác

Đối với phương pháp hấp phụ, quá trình cố định vừa đơn giản lại có tính kinh tế

phương pháp hấp phụ vật lý, hấp phụ một phần ion DEAE-cellulose là một chất mang rắn chắc và enzyme bị hấp phụ chủ yếu bởi lực tĩnh điện, vì thế liên kết không chặt và khó để ứng dụng thực tế Chính vì thế một số tác giả người Trung Quốc đã đề nghị DEAE-Saphadex là chất mang phù hợp nhất để hấp phụ glucoamylase Gần đây, Caldwell và các cộng sự đã cố định glucoamylase bằng cách hấp phụ lên hexyl-Sepharose; hoạt tính còn lại sau khi cố định cao Sự ổn định nhiệt của enzyme cố định thấp hơn của enzyme hòa tan, nhưng có một sự lưu ý là sự ổn định nhiệt tăng trong sự có mặt của cơ chất

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase

Phương pháp

Hoạt tính

Liên kết hóa trị Cellulose, nylon hoặc

thủy tinh 16 – 25% Baker và các cộng sự

Nhốt

N-polyvinylpyrolidone 45% Waton và các cộng sự

Hấp phụ

DEAE-cellulose 16 – 55% Smiley và các cộng sựDEAE-Saphadex 35 – 45% Nhóm người Trung QuốcHexyl-Sepharose 68% Caldwell và các cộng sựNgoài ra cũng có nhiều phương pháp khác để cố định glucoamylase được thực hiện, nhưng những phương pháp này vẫn chưa cho kết quả tin cậy Mặc dù có một số nghiên cứu

cố định glucoamylase có ý tưởng tốt, nhưng vẫn còn nhiều điều cần phải nghiên cứu thêm

về quá trình thực hiện, các yếu tố mô tả sự ổn định của enzyme và sử dụng enzyme cố định Dưới những điều kiện của quá trình thực tế rất khó khăn để thu được dextrose như glucoamylase hòa tan Khi nồng độ enzyme cao, có sự tác động lẫn nhau của phản ứng thủy phân và transferase tạo thành isomlatose trong hệ thống cố định, điều này rất quan trọng và khá khác với kết quả của quá trình gián đoạn sử dụng glucoamylase hòa tan, ở đó nồng độ

Nghiên cứu trong tương lai về những khía cạnh cơ bản của cơ chất phản ứng xúc tác bởi enzyme glucoamylase cố định có lẽ tạo ra những khái niệm mới, những khái niệm này cuối cùng sẽ cung cấp thông tin cơ bản cần cho công nghiệp sản xuất tinh thể dextrose.

14.1.4.Pullulanase cố định

Pullulanase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp Ví dụ, trong công nghiệp tinh bột bao gồm sản xuất amylose khối lượng phân tử thấp và maltose tinh khiết cao, sử dụng pullulanase như những chất hỗ trợ hiệu quả trong quá trình ổn định dung dịch tinh bột độ nhớt thấp cũng như sản xuất maltotriose hiệu suất cao từ pullulan Pullulanase cũng xuất hiện như là một carbohydrase sử dụng trong rượu bia từ ngũ cốc không phải malt

Quan tâm về tiềm năng của enzyme này và những ích lợi của enzyme cố định, Martensson and Mosbach liên kết hóa trị pullulanase vào bên trong polymer đồng trùng hợp của acrylamide và acrylic acid bằng cách sử dụng carbodiimide tan trong nước Hiệu suất

cố định đạt được 34% Quá trình cố định trong sự có mặt của pullulan làm tăng gấp 5 lần hoạt tính khi cơ chất không có mặt Tuy nhiên, điều này không làm tăng sự ổn định của enzyme Pullulanase cố định được dùng trong cột để tách nhánh amylopectin tạo ra amylose có khối lượng phân tử thấp Sử dụng pullulanase không tan ở quy mô lớn sẽ yêu cầu những nghiên cứu trong tương lai nhắm vào sự ổn định của enzyme pullulanase dạng

cố định

Một ứng dụng của pullulanase cố định trong công nghiệp tinh bột là tách nhánh amylopectin thành amylose có khối lượng phân tử thấp, rồi sau đó có thể sử dụng β-amylase cố định để thủy phân thành maltose

14.1.5.Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase.

Từ khi β-amylase và pullulanse được cố định vào chất mang acrylic (Bio-Gel GM 100) bằng liên kết hóa trị, chất mang được hoạt hóa bởi carbodiimide, điều này đã tạo điều kiện để thiết kế ra quá trình cố định hai enzyme vào cùng một bề mặt chất mang Hệ thống hai enzyme cố định, trong đó các enzyme phối hợp thực hiện, sản phẩm của enzyme đầu

tiên là cơ chất cho enzyme thứ hai, vì thế thuận tiện cho hoạt động của enzyme sau Hơn thế nữa, sự gắn kết các enzyme vào cùng một bề mặt chất mang được ưu tiên, hơn là sử dụng hỗn hợp của hai quá trình cố định riêng lẽ, β-amylase cố định có sự ổn định cao hơn ở

vị trí nồng độ protein cao Quá trình cố định được thực hiện thành công trong hai bước bởi

vì điều kiện cố định tối ưu khác nhau của hai enzyme Hiệu suất cố định của protein amylase và protein pullulanase là 40% và 38% Hoạt tính còn lại lần lượt của β-amylase và pullulanase là 22% và 32%

β-Điều kiện hoạt động tối ưu của hệ enzyme này là: pH 6, 45oC Hệ thống vẫn hoạt động ổn định sau 50 giờ, ngược lại đối với enzyme tự do sau 20 giờ bị mất toàn bộ hoạt tính

Trong công nghiệp tinh bột, sử dụng hai enzyme này có khả năng biến đổi hoàn toàn tinh bột, tạo thành sản phẩm giàu maltose

14.2 CHITOSAN [5, 18, 25]

14.2.1.Giới thiệu về chitosan

Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử ᴅ-β(1,4) glucosamine Chitosan là thành phần quan trọng trong vỏ của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn trùng và thành tế bào của nấm, nó có tác động tạo khung vững chắc và ổn định Chitosan là dẫn xuất quan trọng của chitin, được thu bằng cách khử acetyl của chitin khi xử lý với dung dịch KOH hay NaOH đậm đặc, và vì vậy chitosan là một polymer đồng trùng hợp của N-acetyl-ᴅ-glucosamine và ᴅ-glucosamine, chứa một lượng tối đa 30% các nhóm acetyl

Công thức hóa học của chitosan (C6H11NO4)n với n trong khoảng 700 – 4500:

Có 2 chỉ số quan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình Độ deacetyl hóa là độ chuyển hóa chitin thành chitosan Thông thường các chitosan có độ deacetyl hóa 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa khoảng 45 – 55% tan tốt trong nước nên gọi là chitin tan Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê, nó được xác định thông qua độ nhớt dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ 10.000 – 500.000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau Hai chỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan.

14.2.2.Tính chất của chitosan:

Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây bệnh như E

coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15.1 NGUYÊN LIỆU

15.1.1.Enzyme α-amylase

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme α-amylase của hãng Novo (termamyl 120L), dạng lỏng Enzyme này là một α-amylase bền nhiệt, sản xuất từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis Enzyme α-amylase là một endo–amylase, thủy phân liên kết α-1,4

glycoside trong phân tử amylose, amylopectin tạo các dextrin có phân tử lượng thấp hơn, maltose và glucose

15.3 DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic

Máy khuấy từ Magnetic Stirrer HANNA, BIBBY

Máy đo pH Mettler Toledo

Bể điều nhiệt Gallenkamp No.WF250

Cân 4 số lẻ OHAUS PA214, tủ sấy, tủ lạnh…

15.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15.4.1.Sơ đồ nghiên cứu

pHopt

Topt

Vmax, Km

Thể tích enzymeThời gian cố định enzymeVận tốc lắc

Kích thước chitosanNồng độ glutaraldehyde

15.4.2.Phương pháp cố định enzyme

Để tìm ra phương pháp cố định α-amylase thích hợp, chúng tôi đã tiến hành so sánh hai phương pháp cố định α-amylase sau:

Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị

Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và kết hợp giữa các enzyme

16 Phương pháp 1 : Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị

Thuyết minh sơ đồ:

Trong tất cả các thí nghiệm, khối lượng chitosan được lấy cố định là 1g

Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme

α-amylaseGlutaraldehyde

Chitosan

Hoạt hóa

NgâmNước

Rửa

Cố định

Rửa

Chitosan đã cố định α-amylase

Hoạt hóa: Quá trình hoạt hóa nhằm tạo điều kiện để nhóm CHO của glutaraldehyde liên kết với nhóm NH2 của chitosan.

Cho vào erlen chứa 1g chitosan 10ml glutaraldehyde 2%

Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút

Rửa: Sau khi glutaraldehyde đã liên kết với chitosan, chúng tôi tiến hành rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết với chitosan

Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase liên kết với chitosan qua trung gian của cầu nối glutaraldehyde, ngoài ra vẫn xảy ra quá trình chitosan hấp phụ α-amylase

Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml rồi cho vào erlen chứa chitosan đã được rửa sạch

Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút

Rửa: sau khi đã gắn kết α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml

Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa Từ đó sẽ xác định được hiệu suất cố định enzyme

Tiếp sau đó xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của α-amylase cố định

17 Phương pháp 2 : Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và tạo liên kết

giữa các enzyme

Thuyết minh sơ đồ:

Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme

Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase được hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan

Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml bằng nước cất

Chitosan

NgâmNước