Qua trinh chuyen hoa

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt.. Fenikxova và Eromsina 1991 cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo

Nhom: MSSV:

Mục lục:

Phần I: Tổng quan về enzym amylase

I.Amylase là gì?

II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase

II.1.Đặc tính của enzym α-amylase

II.2 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase

III Lịch sử phát hiện eznym

Phần II: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase

I.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt

I.1 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

I.1.1 Môi trường lỏng

I.1.2 Môi trường đặc

I.2 Qui trình sản xuất nấm mốc giống

I.2.1 Nguyên liệu

I.2.2.Chuẩn bị mốc giống

I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác

I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay

I.2.3 Qui trình sản xuất

II Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase - chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae

II.1 Nguyên liệu

II.2 Qui trình công nghệ

II.3 Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae

II.3.1 Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm

II.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzym

II.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

III.Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

Phần III : Ứng dụng và kết luận

I.Ứng dụng

I.1.Ứng dụng amylase trong sản xuất bia

I.2 Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn

I.3.Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc

I.4.Ứng dụng enzym amylase trong công nghiệp dệt

II.Kết luận

Phần IV: Phụ lục và tài liệu tham khảo

Lời giới thiệu:

Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong

kỹ thuật và trong đời sống con người Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…

Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzym Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô

cơ như HCl và H2SO4 Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym

để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển

Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài

ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,

… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,…

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

 Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:

• Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại

củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt

và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều

có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ) Các loại tinh bột đều

có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng

-Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh

-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-850C ) thì

tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose.

-Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột

• Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase

có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu-3 triệu Da Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan

II.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylase

II.1.Đặc tính của enzym α-amylase

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase

là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme:

- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 )

- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

-Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 )

-α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme ( Modolova, 1965 ) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó

sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt

độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+,

Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase

Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ) Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ) Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau:

G5 G4+G1; G6 G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít )α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose

và maltose có thể lên tới 84-87%

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ) Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm

amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2 Còn theo số liệu của Fenixova thì

pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-amylase của

Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn

Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở

70OC( Kozmina, 1991 )

Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với

tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85% Ở 500C trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự )

II.2 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase

α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ) α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn

+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất

bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh )

+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1 )

+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharideAmylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

III.Lịch sử phát hiện eznym

Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên men

Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường

Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm ở dạng dung dịch và lịch

sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây

Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen

và Pessoz đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa

α-amylase

Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme lúc bấy giờ

Phần III: Công nghệ lên men tạo enzym α-amylase

I Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt

Thiết kế công nghệ:

Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy VSV thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống

I.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triển trên bề mặt môi trường Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy

- Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.

- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những ưu điểm cần quan tâm để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường ( môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích

I.1.1.Môi trường lỏng

Ở môi trườn lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV

Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay:

Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác

Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao môi trường nhỏ,

sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao

Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý.

I.1.2.Môi trường đặc

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường

Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV

VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có

độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở

nấm mốc Asp.oryzae.

I.2.Qui trình sản xuất nấm mốc giống

I.2.1Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống

Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó

Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin

Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một

số vitamin như B1,B2,B6,PP và E

Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%;

cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%

Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và

muối khoáng 1,2%

Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose

0,4% và muối khoáng 0,4%

I.2.2.Chuẩn bị mốc giống

Nuôi cấy giồng bao gồm:

-Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm

-Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ)

-Trên sàng, khay (nhân giống lớn)

I.2.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng

I.2.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác

Cách làm môi trường trong bình tam giác:

Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút.

Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục

Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh

Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân

bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ Trường hợp nào thấy bình

bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay

I.2.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay

Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng

lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước đều rồi hấp chín Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa.

Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi

và dùng quạt thổi Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn

Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m) Đặt

ở nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100% Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-

14 giờ sau khi trộn giống Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc

Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn

I.2.3.Qui trình sản xuất

II Qui trình lên men công nghiệp tạo enzym α-amylase

II.1 Nguyên liệu

Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô

cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô

Cấy chuyển Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng

Nuôi cấy 30-32 o C trong 5-6 ngày

Giống trong ống thạch nghiêng

Mốc giống trong bình tam giác

Trộn giống 0,5 – 10%

Ngô mảnh hấp thanh trùng Làm tơi

Sấy khô Nuôi mốc 60 h

Bao gói Mốc giống cho

sàn xuất

(bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng

để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm:

+Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo:

(Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999)

- Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản

- Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid

Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường

Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp oryzae không chỉ phát triển trên bề

mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường Hay

nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai

pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt

+Thành phần dinh dưỡng của sắn(khoai mì):

Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm

ứng cho quá trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae Củ sắn

gồm ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi Ngoài ra còn có cuống và rễ củ

-Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường chiếm khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng trong vỏ cùi còn có mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol của củ sắn

-Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở đây có khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi