Tìm hiểu về: phân tích clostridium perfrigens trong thực phẩm

Đặc điểm nuôi cấy:  Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi... Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM

Khoa Công Nghệ Thực Phẩm

Đề tài:

Tìm hiểu về: phân tích clostridium perfrigens trong

thực phẩmGVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ

Nhóm: 8

Mục Lục

I Giới thiệu về

clostridium perfrigensII.Quy trình phân tíchIII Ví dụ

I Giới thiệu về clostridium perfrigens

phân giải Sodium sulfil hoặc phân giải protein tạo

H2S

kị khí không bắt buộc

kị khí không bắt buộc

 Hình thái vi khuẩn Clostridium perfrigens.

Hình thái vi khuẩn Clostridium perfrigens

là thực phẩm đồ hộp).

Trong thực phẩm nhất

là thực phẩm đồ hộp)

bùn đất,

3 Đặc điểm nuôi cấy:

 Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi

Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn màu đen, do vi khuẩn sinh H2S

tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thành FeS có màu đen

Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanh chóng làm đục môi trường

II.Quy trình phân tích:

10g mẫu + 90ml dd đệm 10-1

Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-2 10-3 10-4…

10g mẫu + 90ml dd đệm 10-1

Tiếp tục pha loãng mẫu đến 10-2 10-3 10-4…

Lấy 1ml mẫu vào trong ống nghiệm vô trùng, đỗ

10-15 ml môi trường ISA ở 450C lắc đều

Lấy 1ml mẫu vào trong ống nghiệm vô trùng, đỗ

10-15 ml môi trường ISA ở 450C lắc đều

Đỗ lớp ISA thứ hai cao 1-2 cm sau khi phần dưới

đông đăc, ủ 370C , 24-48 giờ

Đỗ lớp ISA thứ hai cao 1-2 cm sau khi phần dưới

đông đăc, ủ 370C , 24-48 giờ

Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen xuất hiện trong ống

Tính kết quả số clostridium trong 1ml/1g mẫu phân

tích

Tính kết quả số clostridium trong 1ml/1g mẫu phân

tích

1 Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng

mẫu để ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…

Bước 2: Dùng pipet lấy ở mỗi nồng độ pha loãng

1ml dung dịch huyền phù ban đầu hoặc 1ml mẫu thử cho vào giữa đĩa pipet, mỗi nồng độ 02 đĩa

Bước 3: rót 15-20ml môi trường TSC vào đĩa petri và trộn đều

Bước 4: Khi môi trường đã đong chặt, rót thêm một lớp 10ml môi trường TSC phủ lên trên.

Bước 5: để đông và xếp các hộp Petri nắp ở phía trên vào bình kị khí

Bước 6: đếm và ghi lại số lượng khuẩn lạc điển hình

ở các đĩa Khuẩn lạc Clostridium perfrigens co màu đen

2 Xác nhận:

Chon tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các

đĩa đã đếm

Chon tổng số 10 khuẩn lạc điển hình từ các

đĩa đã đếm

Cấy ria các khuẩn lạc này trên môi trường

thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10ml môi trường TSC cơ bản Để đông và nuôi yếm khí ủ

37oC ± 1oC, 18-24 giờ

Cấy ria các khuẩn lạc này trên môi trường

thạch cơ bản TSC, phủ thêm một lớp 10ml môi trường TSC cơ bản Để đông và nuôi yếm khí ủ

3 Xác định tính sinh hóa

3.1 Thử nghiệm tính di động:

Cấy sâu khuẩn lạc đã phân lập vào môi trường Nuôi

trưởng dọc theo đường cấy sâu Sự sinh

trưởng khuyếch tán vào môi trường từ vết

cấy thể hiện rõ tính di động của vi sinh vật nuôi cấy.

3.2 Thử nghiệm sự có mặt của nitric:

thêm 0,2-0,5ml thuốc thử phát hiện nitrit vào mỗi

ống môi trường nitrat di động (tiến hành trong tủ

HOP) Sự hình thành màu đỏ xác nhận phản ứng khử nitrat thành nitrit Nếu trong 15 phút mà màu đỏ

không hình thành thì thêm thì thêm một lượng nhỏ bột kẽm Để yên 10 phút, nếu màu đỏ được hình

thành sau khi thêm bột kẽm thì không có phản ứng nitrat thành nitrit

vàng không (tạo acide ) cho biết sự lên men của

lactose Làm lạnh 1giờ ở 5oC và kiểm tra sự hóa lỏng của gelentine Nếu môi trường vẫn rắn, nuôi cấy

thêm 24 giờ và kiểm tra sự hóa lỏng của geletine

III.Ví dụ:

Nghiên cứu và phát

hiện vi khuẩn Clostridium perfrigens trên thịt

gà tươi tại một số chợ ở TP.nha Trang.

Áp dụng quy trình phân lập vi khuẩn C perfringens

theo quy trình phân lập của Bộ môn nghiên cứu Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung:

Sơ đồ phân lập:

1 Các bước thực hiện

a Chuẩn bị mẫu:

 Cân chính xác 25 gam mẫu thịt gà, cắt nhỏ hoặc

nghiền nát trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất Sau đó bổ sung 225 ml nước muối

sinh lý lắc đều từ 2 - 3 phút thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ 10-1

 Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử

10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý Lắc đều trong 2-3 phút thu được dung dịch nồng độ 10-2 Làm tương

tự ta thu được các dung dịch mẫu thử nồng

độ 10-3, 10-4,…

b.Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch:

 Đổ khoảng 15ml môi trường TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ pha loãng Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 1ml canh khuẩn nhỏ lên mặt thạch sau đó dùng pipet dàn đều mẫu trên bề mặt thạch, mỗi nồng độ cấy

trên 2 đĩa tương ứng Đợi bề mặt thạch khô, đổ tiếp 15ml môi trường TSC rồi láng đều để môi trường phủ kín bề mặt đĩa

 Khi môi trường đông lại, lật ngược đĩa, cho đĩa vào túi yếm khí, đặt vào tủ ấm 370, 10% Sau 18 – 24

giờ nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả sơ bộ Đếm toàn

bộ những khuẩn lạc có các đặc tính tròn, lồi, bờ đều nhẵn, màu đen Số lượng vi khuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng

  

c Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được làm tiêu bản nhuộm Gram

để kiểm tra hình thái và tính chất bắt màu trên kính hiển vi Kết quả cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn

C perfringens đều là dạng trực khuẩn bắt màu thuốc nhuộm Gram+ chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc song song, một số kết thành dạng chuỗi ngắn

 Hình thái vi khuẩn C perfringens

Hình thái vi khuẩn C perfringens

d.Kết quả kiểm tra khả năng di động bằng phương

pháp soi tươi:

Lấy một giọt canh khuẩn nhỏ lên 1 lamen sạch, cố định lamen bằng dầu parafilm dưới lam kính lõm rồi lật ngược lam kính lại Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu cho thấy, tất cả 17 chủng

kiểm tra đều có dạng hình que ngắn, không di động

Vi khuẩn C perfringens khi soi tươi

e thử nghiệm đặc tính của vi khuẩn trên một số môi trường

Trên môi trường Fluid Thyoglycolate: vi khuẩn

mọc rất tốt 37, 10% sau 24 giờ nuôi cấy vi

khuẩn làm đục đều môi trường Trên môi

trường TSC agar: sau 24 giờ nuôi cấy trong túi

yếm khí, ở 37, 10% vi khuẩn phát triển tạo

thành khuẩn lạc tròn, đen

  

Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường TSC agar

Khuẩn lạc C perfringens trên môi trường thạch máu.

 Trên môi trường thạch máu: khuẩn lạc vi khuẩn

màu trắng đục, tròn ướt, có hai vòng dung huyết xung quanh

Trên môi trường Limus milk: Sau 24 – 28 giờ nuôi

cấy trong tủ ấm 37, 10% Vi khuẩn phát triển, lên men lactose, làm đông vón casein, môi trường

chuyển từ màu tím sang nâu sang trắng với chỉ thị

pH litmus

  

Nuôi cấy trên môi trường Litmus milk

Trên môi trường Egg yorlk: sau 24 – 28

giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí ở tủ

ấm 37, 10% Vi khuẩn phát triển sinh men lecithinase phân giải lecithin tạo thành

vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc

  

Trên môi trường Egg yorlk

Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ nhiễm C perfringens trên

thịt gà ở 4 chợ

Cảm ơn cô và các bạn

đã lắng nghe