KIỄM TRA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS

Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP +, thủy ph

Trang 1

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Trang 2

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ ỨNG

DỤNG

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ ỨNG

DỤNG

ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH

ĐỘC TỐ ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH

ĐỘC TỐ

Trang 3

I-Giới tiệu về Bacillus cereus:

• Trực khuẩn Gram dương

• Thuộc giới bacteria

• Ngành (phylum) firmicutes

• Lớp (class) bacilli

• Bộ (order) Bacillales

• Họ (family) Bacillaceaem

• Chi (genius) Bacillus

• Loài (species) Cereus

Bacillus cereus trên kính hiển vi

Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết 9  10

Trang 4

Trong chi bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như:

Trang 5

• Được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc

thực phẩm vào năm 1955

• Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí

tùy ý, di động.

• Bào tử dạng hình ovan

• có khả năng sinh nha bào

Trang 6

Khuẩn lạc Bacillus cereus trên môi trường BA

Bacillus cereus Infections Bacillus

cereus subsp mycoides Gram stain

Trang 7

• Tạo nội bào tử

• Lên men glucose sinh

hơi

• Phản ứng VP( +).

Mô hình cấu tạo B.cereus

Trang 8

2) Đặc điểm nuôi cấy

Nhiệt độ 5 o C-50 o C, tối ưu 35 o C-40 o C . Nhiệt độ 5 o C-50 o C, tối ưu 35 o C-40 o C .

pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ

tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ

tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.

Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng . Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng .

Trên môi trường MYP : khóm hồng

Trang 9

Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng

sáng.

Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng

Trang 10

Khử nitrat thành nitrit.

Phản ứng VP (+)

Phân giải Tyroxin

Catalase (+), Citrate (+)

Mọc trên

NB + 0,001% lyzozym

Mọc trên

NB + 0,001% lyzozym

Trang 11

+ Độc tố gây tiêu chảy

II TÍNH CHẤT GÂY BỆNH – ĐỘC TỐ - TRIỆU CHỨNG

Trang 12

SƯ HIỆN DIÊN CỦA VI KHUẨN NÀY:

Trang 13

Triệu chứng trúng độc:

Thức ăn chứa mật độ

vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ

gây độc.

Thức ăn chứa mật độ

vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ

gây độc.

Biểu hiện đau bụng,

buồn nôn và nôn sau

1-5 giờ ăn phải thực

phẩm nhiễm vi khuẩn

Bệnh có thể kéo dài 24

giờ .

Biểu hiện đau bụng,

buồn nôn và nôn sau

1-5 giờ ăn phải thực

Trang 14

2) Cơ chế gây bệnh

a) Triệu chứng nôn mửa

Tính chất / Hoạt động Liều nhiễm độc

Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 10Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg5 - 108 tb/g thực phẩm

Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 o C - 30 o C)

Thời kỳ ủ bệnh 30 phút - 5 giờ

Khoảng thời gian mang bệnh 6 giờ - 24 giờ

Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa

Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu hoặc chiên, mì ống, phở…

Tên của độc tố Cereulide

Sinh kháng thể Không

Hoạt động sinh học trên người Gây nôn

Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121oC

Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không

Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B

Cereus

Trang 15

b) Triệu chứng tiêu chảy

Đặc tính

Liều gây nhiễm Thông thưởng là 106/g hoặc 106/ml

Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non

Thời kỳ ủ bênh 8 giờ - 16 giờ

Khoảng thời gian mang

Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn

Đặc điểm của bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B

Cereus

Trang 16

Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào thời gian cho kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống và phương pháp phân tích nhanh.

Trang 17

III- Các phương pháp truyền thống

1) Đặc điểm và nguyên tắc

Ưu điểm

+ Thao tác đơn giản, dễ làm, + Không phải đầu tư dụng cụ,thiết bị đắt tiềnHạn chế

+Độ nhạy không cao+ Tốn nhiều nhân công +Thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa

Trang 18

Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus

nhóm I như B.anthracis gây bệnh than cho người,

B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng,

B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa

Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001% lysozyme,

Được trình bày trong bảng sau:

Trang 19

Đặc tính

Loài B.cereus B.thuringiens

Trang 20

•Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như: Mannitol-Egg Yolk-polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi trường này Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN.

Trang 21

2) Định lượng B.cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

a) Qui trình phân tích

Mẫu

Đồng nhất mẫu Phân lập

Khẳng định Đếm số khuẩn lạc điển hình

Trang 22

b) Các bước tiến hành:

Bước 1: Pha loãng mẫu

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường thạch (MPY hoặc Mossel)

Bước 3: Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hoá

Trang 23

•Bước 1: Pha loãng mẫu

•10g mẫu + 90ml môi trường pepton đệm (BPW)  đồng nhất bằng Stomacher/1phút để có

độ pha loãng 10-1  tiếp tục pha loãng thành dãy thập phân đến 10-2 10-3 10-4… để có các độ pha loãng thích hợp.

Trang 24

Bước 2: Cấy mẫu lên môi trường thạch (MPY hoặc Mossel)

•Chọn hai nồng độ pha loãng thích hợp, hút 0.1ml dịch pha loãng trải đều lên mỗi đĩa thạch (mỗi nồng độ 2 đĩa) Dúng que gạt trải chất nuôi càng nhanh càng tốt Ủ trong vòng 24 giờ - 48 giờ ở 30oC.

• Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường phục hồi TSA, ủ ở 30oC qua đêm trước khi thử nghiệm sinh hóa.

Các thử nghiệm sinh hóa:

+ Thử nghiệm khả năng lên men glucose

+ Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit

+ Thử nghiệm Voges – proskauer

+ Thử nghiệm Tyrosin

+ Thử nghiệm Lysozyme

Trang 25

•Bước 3: Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hoá

Chọn và đếm các đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc đaặc trưng của Bacillus cereus

Chọn ra 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi TSA, ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hàng các thử nghiệm sinh hóa

Bacillus cereus trên môi trường Mossel và MYP

Trang 26

•Các phản ứng sinh hóa khẳng định:

+Nhuộm Gram:

Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh dưỡng  ủ ở

30oC/24h  nhuộm Gram  quan sát dưới kính hiển

vi tế bào nhuộm bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.

Trang 27

+Thử nghiệm khả năng lên men glucose:

Khuẩn lạc B.cereus làm đỗi màu môi trường canh glucose

từ đỏ sang vàng

Trang 28

+ Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrate thành nitrite:

Quá trình thử nghiệm khả năng khử nitrat của B.cereus

Trang 29

+Thử nghiệm Voges-proskauer (VP):

Thử nghiệm VP trên các chủng đối chứng E.coli và Enterobacter cloacae

Trang 30

•Các bước tiến hành:

Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môitrường MR-VP), có pH 6.9 Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI Ủ yên các ống môi trường này ở 370C trong 24-48h hoặc đến 10 ngày Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường Có 3 loại thuốc thử VP là:

Trang 31

Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH.

Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH

Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 2 giọt dung dịch B để kiềm hóa môi trường nuôi cấy trước, sau đó nhỏ 6 giọt dung dịch A, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetoin Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h

Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -) bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt môi trường

Trang 32

+Thử nghiệm khả năng thủy phân Tyrosine:

•Cấy vi khuẩn ừ môi trường TSA sang ống thạch nghiêng Tyrosine, ủ ở 350C trong 48 giờ Khuẩn lạc Bacillus phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc.

Trang 33

•Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I:

+ Thử nghiệm tính di động

Thử nghiệm tính di động của các loài trong Bacillus nhóm I

Trang 34

+Sự hình thành rễ giả:

Bacillus cereus (không có

cấu trúc rễ giả) Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)

Trang 35

+Thử nghiệm làm tan máu

Bacillus cereus tạo vùng tan máu 2-4mm xung quanh

vùng phát triển

Trang 36

+Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể:

•Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang 2.5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme  ủ ở 350C trong 24 giờ  kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa lysozyme Bacillus phát triển làm môi trường đục đều, còn những ống có kết quả âm tính ủ thêm 24 giờ để kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không

Trang 37

c) Cách tính kết quả:

•Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha loãng và hiệu chỉnh bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus)

Trong đó:

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

n: số lượng đĩa đếm

f: độ pha loãng tương ứng

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử

nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ

Trang 38

II-Các phương pháp phân tích nhanh:

1) Phương pháp miễn dịch

2) Phương pháp Elisa:

3) Kĩ thuật latex agglutination (LA):

4) Kĩ thuật lai phân tử ( DNA- hybridization)

5)Kỹ thuật PCR:

6) Kỹ thuật Microarray:

7) Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR

Trang 39

TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH VI KHUẨN BACILLUS CEREUS TRÊN MẪU THỊT

Bước 1 : Pha loãng mẫu :

Máy dập mẫu

•Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra

cho vào khay vô trùng Dùng kéo và

kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu thịt

cho vào bao PE vô trùng trong điều

kiện vô trùng Mẫu thịt được đồng nhất

với 90ml dung dịch pepton đệm (BPW)

bằng máy Stomacher/1phút để có độ

pha loãng dung dịch 10-1

•Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch

pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml

dung dịch pepton đệm (BPW) để được

dung dịch pha loãng 10-2 Ta làm tới dung

dịch pha loãng 10-6

Trang 40

Bước 2: Cấy mẫu trên môi trường MYP

Bacillus cereus trên MYP.

Trang 41

Bước 3: Khẳng định Bacillus cereus Bằng phản ứng sinh hóa

•Chọn và đếm các đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc đặc

trưng của bacillus cereus (dẹt, đường kính 2-3mm,

bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục) chuyễn 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi TSA, ủ ở 300C qua đem trước khi tiến hành thử sinh hóa.

Trang 42

Thử nghiệm lên men glucose:

Sự chuyển màu môi trường từ

đỏ sang vàng

Cấy vi khuẩn vào 3ml

canh Phenol Red Glucose

(chứng tỏ có sự sinh acid

glucose trong điều kiện kị

khí).

Trang 43

Thử nghiệm khả năng khử nitrate

Cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth -> ủ 350C/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu đỏ cam xuất hiện trong 10 phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)

Trang 44

• Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa

bổ sung thuốc thử

• Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid Ống B cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính với nitrite

Trang 45

Cách tính kết

quả:

Ví dụ: Thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa là

0.1ml, số khuẩn lạc đếm được trong 1 đĩa ở độ pha

loãng 10-4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B.cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa).

Trang 46

Kết Luận

Trang 47

Bài thuyết trình của

nhóm mình đến đây là

kết thúc !!!!

Cám ơn Cô và các Bạn đã theo dõi!!!

Định dạng
Số trang	47
Dung lượng	4,06 MB