Phân lập, phát hiện vi khuẩn bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THANH HOA PHÂN LẬP, PHÁT HIỆN VI KHUẨN Bacillus cereus SINH ĐỘC TỐ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Ở VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: TS.. TRÍCH YẾU LU

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THANH HOA

PHÂN LẬP, PHÁT HIỆN VI KHUẨN Bacillus cereus SINH ĐỘC TỐ GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM Ở VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Hoa

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Thương phẩm, Khoa Quân nhu – Học viện Hậu cần đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Hoa

MỤC LỤC

Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục từ viết tắt VI Danh mục bảng VII Danh mục hình VIII Trích yếu luận văn IX Thesis abstract X

Phần 1 Mở đầu 1

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

2.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm 3

2.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

2.2 Đặc điểm chung về Bacillus cereus 3

2.2.1 Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus 3

2.2.2 Đặc điểm hình thái Bacillus cereus 4

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 5

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 6

2.2.5 Đặc điểm huyết thanh học 7

2.3 Đặc điểm gen Bacillus cereus 7

2.3.1 Hệ gen của Bacillus cereus 7

2.3.2 Sự phân bố các gen mã hoá độc tố ở vi khuẩn B cereus 8

2.4 Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus 9

2.4.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus 9

2.4.2 Nguồn gốc lây nhiễm 11

2.4.3 Triệu chứng lâm sàng 11

2.4.4 Các yếu tố gây độc của Bacilus cereus 12

2.4.5 Cơ chế gây ngộ độc và liều lượng 14

2.5 Phương pháp phát hiện Bacillus cereus 16

2.5.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa 16

2.5.2 Phương pháp miễn dịch 17

2.5.3 Phương pháp dựa trên đặc điểm gen 18

2.6 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về Bacillus cereus 19

2.6.1 Kỹ thuật PCR 19

2.6.2 Giải mã trình tự gen (Sequencing) 21

2.6.3 Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD) 21

2.6.4 Kỹ thuật RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) 21

Phần 3 Vật liệu và phương pháp 22

3.1 Vật liệu 22

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.1.2 Hóa chất và môi trường 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 26

3.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus cereus 26

3.2.2 Phương pháp kiểm tra các chủng phân lập bằng đặc điểm hình thái và một số phản ứng sinh hóa 26

3.2.3 Định danh chủng vi khuẩn 27

3.2.4 Xác định một số gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR 29

3.2.5 Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR 29

3.2.6 Phát hiện B cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 PHÂN LẬP Bacillus cereus 32

4.2 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn được chọn lọc 34

4.2.1 Khả năng sinh Catalase 34

4.2.2 Khả năng sinh axetoin (Phản ứng V-P) 35

4.2.3 Khả năng sinh gelatinase 35

4.2.4 Khả năng phân giải thạch huyết 36

4.3 Định danh chủng D1.7 bằng phân tích trình tự 16S rDNA 37

4.4 Phát hiện gen mã hóa độc tố của chủng B cereus D1.7 39

4.5 Xác định độ nhạy của phản ứng PCR 43

4.6 Phát hiện Bacillus cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm

giả định 45

Phần 5 Kết luận và đề nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

Tài liệu tham khảo 48

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

bp : base pair

CTAB : Cethyltrim ethylammonium bromide

DNA : Deoxyribonucleotide acid

dNTP : Deoxynucleotide triphosphate

ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay

EtBr : Ethidium bromide

LB : Luria – Bertani

MPA : Meat – Pepton – Agar

MPB : Meat – Peptone – Broth

MYP : Manitol – Yolk – Polimyxin

PCR : Polymerase chain reaction

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rDNA : ribosome deoxyribonuclease

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse : Ribonuclease

rRNA : ribosome ribonuclease

SDS : Sodium dodecyl sulfate

TAE : Tris Acetate Ethylendiamin Tetraacetic Acid

TE : Tris Ethylendiamin Tetraacetic Acid

UV : Ultra violet

VP : Voges – Prokauer

VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài trong nhóm Bacillus cereus

[27] 7

Bảng 2.2 Các loại độc tố của B cereus [21] 14

Bảng 2.3 Đặc trưng của hai loại bệnh do vi khuẩn B cereus gây ra 15

Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen 16S rDNA 28

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 29

Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng phân lập 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 5

Hình 2.2 Khuẩn lạc vi khuẩn B cereus trên môi trường MYP, trên môi trường thạch máu 6

Hình 2.3 Cấu trúc hoá học của độc tố gây nôn 13

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng D1.7 khi phân lập trên môi trường MYP và trên môi trường MPA sau 24h nuôi cấy ở 37oC 32

Hình 4.2 Hình thái tế bào của chủng D1.7 sau 24h nuôi cấy ở 37 o C quan sát trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần và trên kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 13000 lần 33

Hình 4.3 Hình thái bào tử chủng phân lập C1.1 sau 3 ngày nuôi cấy ở 37oC trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần 34

Hình 4.4 Khả năng sinh Catalase của 11 chủng phân lập Lần lượt từ 1 đến 5 là C1.1, B1.5, D1.7, C1.3 và CV1.6 34

Hình 4.5 Khả năng sinh axetoin của 11 chủng nghiên cứu Lần lượt từ 1 đến 5 là CV1.6, D1.7, C1.3, C1.1 và B1.5 35

Hình 4.6 Khả năng sinh gelatinase của 11 chủng phân lập 36

Hình 4.7 Khả năng phân giải thạch huyết của các chủng phân lập 36

Hình 4.8 Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu trên gel agarose 1,2% 38

Hình 4.9 Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA của chủng vi khuẩn D1.7 39

Hình 4.10 Điện di đồ sản phẩm PCR với các mồi NheA, HblA, HblD, Bcet, CytK, EntFM trên gel agarose 1,5% 40

Hình 4.11 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblA, HblD, BceT, CytK, EntFM trên gel agarose 1,5% 44

Hình 4.12 Điện di đồ sản phẩm PCR với mồi HblD trên gel agarose 1,5% 45

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Đề tài nghiên cứu “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam” tiến hành tại phòng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ

vi sinh - Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 10/2016 đến tháng 6/2017

B cereus thuộc nhóm trực khuẩn Gram dương, có khả năng sinh bào tử Vi khuẩn này có thể tổng hợp một số protein độc gây ra các bệnh liên quan đến ngộ độc thực phẩm Đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích phân lập vi khuẩn B cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm và bước đầu xây dựng quy trình phát hiện một số gen mã hóa độc tố từ B cereus Từ các mẫu đất và thực phẩm có nguồn gốc khác nhau, bằng phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc và căn cứ vào đặc điểm hình thái, tôi đã thu được 11 chủng vi khuẩn giống với vi khuẩn B cereus Nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa, sinh lý của 11 chủng này đã chọn ra chủng D1.7 mang các đặc tính giống hoàn toàn với chủng B cereus chuẩn Phân tích trình tự 16S rDNA cho thấy chủng D1.7 và chủng B cereus có độ tương đồng 99% Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân tích sinh học phân tử đã xác định chủng vi khuẩn D1.7 thuộc loài B cereus Bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu đã xác định chủng B cereus D1.7 mang các gen mã hóa một phần các protein độc tố ruột Đồng thời xác định độ nhạy của phản ứng PCR trong phát hiện các gen mã hóa độc tố gây ngộ độc thực phẩm là 3,5x103 vi khuẩn/ml Đã sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gen mã hóa thành phần L 2 của độc tố HBL của B cereus D1.7 trực tiếp từ thực phẩm giả định tại nồng độ 3,5x103 vi khuẩn/ml

THESIS ABSTRACT

Study on "Detection of pathogenic Bacillus cereus bacteria isolated in Vietnam" was conducted at the laboratory of the Department of Microbial Biotechnology, Faculty

of Biotechnology, VNUA from 10/2016 to 6/2017

B cereus belong to Bacillus genus, is a Gram positive, catalase positive and spore-forming bacterium They are able to synthesize a number of pathogenic proteins that cause foodborne illness This study was designed to isolate B cereus bacteria that produce toxins caused the food poisoning and to initially develop a process for the detection of several toxin-coding genes from B cereus Different soil and food samples were collected for isolation Based on morphological characteristics of colonies, cell and spore-forming we selected 11 isolates similar to B cereus Biochemical and physiological characteristics of 11 strains were show that the D1.7 strain has the most of characteristics as the B cereus strains Analysis of 16S rDNA sequences showed that D1.7 and B cereus strains were 99% homologous A combination of morphological, biochemical and molecular biology we indicated the D1.7 isolated strain is B cereus Using PCR with specific primers suggest that the B cereus D1.7 strain carrying genes that partially encode enterotoxin proteins At the same time, the sensitivity of the PCR response to detecting genes encoding toxins causing foodborne botulism is 3,5x10 3

bacteria/ml PCR technique was used to detect the gene that encode L 2 component of enterotoxin HBL from food presumably at a concentration of 3,5x103 bacteria/ml

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]

Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh

Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29] Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm

Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B cereus là không nhỏ tại Việt Nam

Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định B cereus gây ngộ độc thực phẩm: Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn Phương pháp ELISA Phương pháp phát hiện gen dựa vào phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR) Trong

đó phương pháp phát hiện gen nhờ PCR đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm Phương pháp này cho phép xác định chính xác được

sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh Ưu điểm của kỹ thuật này là

có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện vi khuẩn B cereus có khả năng gây

ngộ độc thực phẩm là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B cereus

Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam”

Đề tài được đặt ra nhằm đạt được mục tiêu sau:

Phát hiện vi khuẩn B cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm từ các chủng phân lập tại Việt Nam

Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nội dung sau:

- Phân lập và xác định vi khuẩn B cereus từ các mẫu khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự 16s rDNA

- Phát hiện gen mã hoá độc tố của các chủng B cereus bằng kỹ thuật PCR

- Xác định độ nhạy của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện B cereus

- Phát hiện vi khuẩn B cereus sinh độc tố trong một số thực phẩm giả định bằng kỹ thuật PCR

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

2.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6]

2.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5]

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2]

2.2 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus

2.2.1 Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus

Phân loại quốc tế B cereus:

• Thuộc giới Bacteria

• Loài (species) B cereus

B cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887 Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25] Để khẳng định B cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml và uống 200ml cocktail Sau 13h ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau một triệu chứng ngộ độc thực phẩm khác do chủng B cereus gây ra lại xuất hiện ở công nhân Anh Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h) Sau đó, B cereus được công nhận là một nguyên nhân quan trọng của ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [28]

2.2.2 Đặc điểm hình thái Bacillus cereus

Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông Phần lớn tế bào B cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động B cereus có khả năng hình thành nội bào tử Nội bào tử của B cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18]

Khả năng hình thành bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B cereus nói riêng Nhờ có đặc điểm này mà B cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất Vì vậy, khả năng lây nhiễm B cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn Khi

tế bào sinh dưỡng của B cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng khô hạn…, B cereus sẽ sinh nội bào tử Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài Khi gặp môi trường thuận lợi

về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu…, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành

tế bào sinh dưỡng Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất

lợi nội bào tử lại được hình thành [4] Do bào tử của B cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng nên trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B cereus

Hình 2.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi

2.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường

 B cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tối

ưu cho sự phát triển của B cereus là 30 - 37oC

 Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2

 B cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [18, 27]

 Trên môi trường LB lỏng: đục

Khi nuôi cấy B cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzyme lecithinase) [17,19,27]

Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,32]

Hình 2.2 Khuẩn lạc vi khuẩn B cereus trên môi trường MYP (A), trên

môi trường thạch máu (B) Trên môi trường thạch máu, B cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B cereus với các vi khuẩn khác như B anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B cereus [18,27]

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Để phân biệt B cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1 (B anthracis, B mycoides, B thuringiensis,…) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L – tyrosine , được trình bày trong bảng sau:

BA

Bảng 2.1 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài trong nhóm

Chú thích: +: phản ứng dương tính

+/-: 50% phản ứng dương tính

-: phản ứng âm tính

2.2.5 Đặc điểm huyết thanh học

Hiện nay theo một số nghiên cứu, B cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên O) và giống như B thuringiensis, B cereus cũng có kháng nguyên tiên mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử dụng cho phân loại B cereus 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B cereus Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết thanh 1, 2,

6, 8, 10, 12 và 19 thường liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu chảy còn các nhóm huyết thanh 1, 4, 7, 11, 18 của B cereus lại liên quan tới những vụ ngộ độc thể nôn Trong đó, typ huyết thanh H1 thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [18]

2.3 ĐẶC ĐIỂM GEN Bacillus cereus

2.3.1 Hệ gen của Bacillus cereus

Bản đồ di truyền của chủng B cereus đã chỉ ra rằng kích thước nhiễm sắc thể có thể thay đổi từ 2,4 đến hơn 5,5 Mb Bộ gen dường như có một khu vực liên tục 2,4 Mb và một khu vực ít ổn định [21]

Plasmid đóng một vai trò quan trọng trong sinh học của các loài Bacillus Cùng với các yếu tố di động khác như bacteriophages, chúng cho phép chuyển

gen theo chiều ngang giữa các loài thuộc chi này, một lực lượng chính làm thay đổi tính đa dạng di truyền Plasmid thay đổi đáng kể về kích thước và nội dung gien của Bacillus spp và đóng góp rất lớn vào sự biến đổi gen [50] Plasmid tìm thấy trong 5 chủng B cereus với kích thước biểu kiến là 730 kb (ATCC6464),

600 kb (F2038/78), 450 kb (chủng 41), 400 kb (ATCC 33.018) và 290 kb (F4810/72) Beverley (1988) [21]

Mặc dù B anthracis, B cereus và B thuringiensis được phân biệt theo đặc tính kiểu hình và đặc tính bệnh lý, dữ liệu trình tự bộ gen đã chỉ ra rằng chúng liên quan chặt chẽ, và trình tự gen 16S rRNA của chúng có độ tương đồng hơn 99% Các nghiên cứu phát sinh loài dựa trên các chỉ thị về nhiễm sắc thể cho thấy không có cơ sở phân loại để chia B cereus và B thuringiensis thành 2 loài riêng biệt, trong khi B anthracis về cơ bản có thể được coi là một dòng của B cereus Các đặc điểm phân biệt giữa các loài được mã hoá bởi các gen nằm trên plasmid, được coi là các yếu tố di truyền di động cao, cũng nằm trong nhóm B cereus [31]

2.3.2 Sự phân bố các gen mã hoá độc tố ở vi khuẩn B cereus

Các gen mã hóa độc tố của B cereus gồm hblA, hblD, hblC nằm trên cùng một operon mã hóa độc tố HBL; nheA, nheB, nheC nằm trên cùng một operon

mã hóa độc tố NHE; Các gen bceT, cytK, entFM, ces lần lượt mã hóa độc tố D-ENT, cytK, entFM, Cereulide

bc-Tỷ lệ hiện nhiễm các chủng tiêu chảy của B cereus trong thực phẩm và tham gia vào các đợt bùng phát dường như đã thay đổi xu hướng trong thập kỷ qua Trước đây các chủng chứa gen mã hóa độc tố HBL được tìm thấy là phổ biến hơn và cũng liên quan nhiều hơn đến sự bùng phát Tuy nhiên các báo cáo mới nhất cho thấy các dòng sản xuất NHE xuất hiện thường xuyên hơn trong số các thực phẩm phân lập Trong thực tế, các gen mã hoá NHE hiện nay được cho

là có mặt trong hầu hết các chủng B cereus

Guinebretière et al (2002) đã phân tích kết quả của 37 chủng B cereus gây ngộ độc thực phẩm Ông chỉ ra rằng một trong những chủng này có thể mang một số gen gây bệnh Trong 37 chủng B cereus gây ngộ độc thực phẩm, 36 (97,3%) có gen mã hóa cho cả ba thành phần của độc tố NHE, 27 có gen mã hóa cho tất cả các thành phần của HBL và cytK (73%), và 21 (56,8%) cho bc-D-ENT Tất cả các chủng có gen mã hóa cho các thành phần HBL cũng có gen mã hóa các thành phần NHE Trong 27 chủng dương tính với gen cytK, 26 cũng

dương tính với gen nhe và 23 đối với gen hbl Trong số 37 chủng B cereus gây ngộ độc thực phẩm, 21 có chứa gen bceT, trong đó có 20 gen dương tính với gen nhe, 19 đối với gen hbl và 18 đối với gen cytK Trong 37 chủng này không có chủng nào chỉ chứa gen mã hóa 1 thành phần độc tố Một phát hiện quan trọng khác của Guinebretière et al (2002) là sự hiện diện hay vắng mặt của gen hblB không ảnh hưởng đến sự có mặt của gen hblA

2.4 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO Bacillus cereus

B cereus là phổ biến rộng rãi trong môi trường và xâm nhập vào chuỗi thức ăn qua thực phẩm và nước bị ô nhiễm Các sinh vật có trong hầu hết các thực phẩm sống có nguồn gốc thực vật với số lượng đặc biệt cao ở một số mẫu của các loại gia vị và ngũ cốc [23] Cách kháng khô hạn của các bào tử cho phép sinh vật tồn tại trên các sản phẩm thực phẩm khô nhất Một cuộc khảo sát gần đây của tỏi, quế, hạt tiêu, ớt, rau oregano và húng tây tìm thấy B cereus trong tất cả các mẫu ở các cấp độ của 102 - 106 cfu/g Eyles et al (1989) tìm thấy B cereus 100% (25/25) các mẫu bột được thử nghiệm [22] B cereus gây ra các hội chứng ngộ độc thực phẩm giới hạn trong 24 - 48 giờ gồm thể bệnh tiêu chảy và thể bệnh gây nôn

B cereus được ghi nhận là nguyên nhân phổ biến thứ ba gây ra dịch ngộ độc thực phẩm ở Hungary (117 vụ dịch) giữa 1960 và 1968, tiếp theo là Phần Lan (50 đợt dịch), Hà Lan (11 đợt dịch) và Canada (9 ổ dịch) Ngoài ra, có nhiều báo cáo về sự bùng phát dịch bệnh của B cereus trong nhiều loại thực phẩm ở nhiều quốc gia, trong đó có Hoa Kỳ, Anh, Scandinavia, Nhật Bản và Na

Uy Ở Na Uy, B cereus thường gặp nhất trong các hội chứng ngộ độc thực phẩm Theo Turnball (1981), đã có ít nhất 230 lần bộc phát về loại bệnh tiêu chảy của ngộ độc thực phẩm B cereus được báo cáo trên toàn thế giới từ năm

1950 đến năm 1976

Hơn 197 sự cố độc hại về ngộ độc thực phẩm liên quan đến gạo nấu chín (thường là chiên) từ các nhà hàng Trung Quốc hoặc cửa hàng "take away" được báo cáo ở Anh từ năm 1971 Ở London, hơn 40 trường hợp bị ngộ độc thực phẩm liên quan đến tiêu thụ gạo nấu chín, thường là từ các nhà hàng Trung Quốc và các cửa hàng "take away", được báo cáo trong đó tất cả các trường hợp này đều

do B cereus

Tại Nhật Bản, tổng số 5.141 vụ bùng phát ngộ độc thực phẩm diễn ra giữa năm 1982 và 1986; Trong số này, các vi khuẩn gây bệnh đã gây ra 3.740 vụ bùng phát B cereus gây ra 73 vụ Giữa năm 1986 và năm 1995, 852 vụ bùng phát các bệnh truyền qua thực phẩm liên quan đến 26.173 ca và 20 ca tử vong được báo cáo ở Đài Loan Trong số này, 555 trường hợp (65%) là do các vi khuẩn gây

ra Loại vi khuẩn gây bệnh thứ ba trong số những vụ ngộ độc này là B cereus (18% trường hợp)

Trong khi tóm tắt dữ liệu về các bệnh do tiêu dùng thực phẩm và sản phẩm thịt của Trung Quốc từ năm 1991 đến năm 1994 tại Cơ quan Thanh tra Thực phẩm khu vực Hà Lan, Simone et al (1997) báo cáo 2.621 vụ, trong đó có 7,567 người bị bệnh Trong số các tác nhân gây bệnh đã biết, 19% là do B cereus, mức cao nhất

B cereus được báo cáo không chỉ trong thực phẩm của nhà hàng, mà còn từ những nơi khác phục vụ thức ăn Hatakka, (1998) báo cáo rằng giữa năm 1991 và năm 1994, B cereus là mầm bệnh phổ biến nhất (3%) được tìm thấy trong các mẫu lấy từ các bữa ăn nóng phục vụ trên máy bay Daniels et al (2002) báo cáo B cereus là tác nhân gây bệnh trong 7% trường học dịch bệnh bùng phát ở Bắc Mỹ trong giai đoạn 1998-2000

Pirhonen et al (2005) đã điều tra sự bùng phát dịch bệnh ngộ độc thực phẩm xảy ra sau khi ăn một món mì ống và thịt băm, liên quan đến cả thể bệnh gây nôn và tiêu chảy ở hai người trưởng thành Kết quả cho thấy B cereus tạo độc tố gây bệnh đã hình thành phần lớn (68%) trong số các chủng được xác định trong thực phẩm được kiểm tra

Theo báo cáo mới nhất của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (2007)

về sự bùng phát dịch bệnh, B cereus là tác nhân gây ra 77 vụ dịch và gây ra 17,1% trường hợp do độc tố vi khuẩn

Nhìn chung, số lượng ca ngộ độc thực phẩm do B cereus gây ra ở các quốc gia khác nhau không được biết chính xác vì nó không phải là bệnh thường được báo cáo và không phải lúc nào cũng được chẩn đoán [13]

Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế

có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tỉnh thành có năng lực kiểm nghiệm Tuy nhiên, hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết

hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần, độ chính xác không cao và không

có khả năng cơ động

2.4.2 Nguồn gốc lây nhiễm

Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng hình thành bào tử mà B cereus có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều cách [37] Chúng có thể tồn tại trong thực phẩm lâu dài cho dù thực phẩm đó đã trải qua các quá trình xử lý nhiệt, sấy, thanh trùng… B cereus có mặt ở khắp mọi nơi, có thể dễ dàng phân lập được chúng từ đất, nước, bụi, không khí… đặc biệt là trong đất Đất có thể chứa từ 103 - 105 bào tử B cereus/g [22] Vì vậy, đất chính là nguồn lây nhiễm chủ yếu bào tử B cereus vào thực phẩm B cereus trong đất dễ nhiễm vào các loại cây như lúa, rau màu, cây gia vị…[16,22] Các nghiên cứu cho thấy 100% các loại gạo đều chứa bào tử B cereus Trong gạo và các thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây, các loại ngũ cốc khác… phát hiện được chủ yếu là B cereus gây nôn Trong khi đó, các chủng B cereus gây tiêu chảy lại có thể phát triển ở phổ thực phẩm rộng hơn Nó có thể tồn tại từ các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật như các loại rau cho tới những thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, sữa, cá…[37]

Ngoài khả năng lây nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ đất, nước, không khí… B cereus còn có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều con đường khác như sự lây nhiễm của bào tử B cereus trong các loại gia vị dùng để ướp, chế biến các món ăn… Đặc biệt, do bào tử B cereus có tính chất kỵ nước nên nó có khả năng bám rất chắc vào bề mặt của các dụng cụ chế biến thực phẩm như xoong, nồi, chảo… hay cả các dây truyền máy móc trong chế biến thực phẩm công nghiệp [11,12,39] Vì vậy, nếu dụng cụ chế biến không được vệ sinh sạch sẽ thì bào tử B cereus rất dễ nhiễm vào thức ăn gây ngộ độc cho người sử dụng Bào

tử B cereus còn được tìm thấy trong nhà máy sản xuất giấy hay bao bì gói thực phẩm Do vậy, thực phẩm sau chế biến có thể loại được B cereus nhưng đến tay người sử dụng vẫn có thể bị nhiễm do bao bì của chúng [39] Như vậy, tuy chỉ có khả năng gây ngộ độc thực phẩm khi trong thực phẩm có chứa một lượng nhất định tế bào nhưng B cereus vẫn là loại vi khuẩn có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cao [27]

2.4.3 Triệu chứng lâm sàng

Thực phẩm chứa vi khuẩn ở mật độ 106 tế bào/g đủ gây ngộ độc Các triệu

chứng ngộ độc do B cereus thường nhẹ và nhanh chóng hồi phục, với hai dạng ngộ độc chính:

+ Dạng thứ nhất: xảy ra rất nhanh, buồn nôn, nôn, tiêu chảy thường xuất hiện trong vòng 5h sau khi ăn phải thức ăn bị ô nhiễm độc tố của B cereus, thể nhẹ có thể bình phục trong vòng 12 – 24h [24]

+ Dạng thứ hai: tiêu chảy thường xảy ra sau 8 – 16h sau khi ăn phải thức

ăn bị nhiễm độc tố của B cereus, thể thông thường không cấp tính, 1 – 2 ngày sau khi ăn phải thức ăn ô nhiễm B cereus sẽ thấy một lượng lớn B cereus trong mẫu phân, khi bình phục các chất nhanh chóng được bài tiết ra khỏi cơ thể Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột trong thời kỳ sinh trưởng của B cereus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử của vi khuẩn [24]

2.4.4 Các yếu tố gây độc của Bacilus cereus

B cereus được biết đến có khả năng gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn Thể bệnh nôn gây ra bởi một loại độc tố có khả năng kháng nhiệt cao được gọi là cereulide hay emetic toxin có mặt trong thực phẩm trước khi con người tiêu hoá [25] Trong khi đó, thể bệnh tiêu chảy lại

là kết quả của rất nhiều loại độc tố ruột (enterotoxin) khác nhau gây nên Các nhân tố chính được cho là có khả năng gây độc của B cereus sẽ được giải thích

rõ hơn dưới đây

B cereus gây bệnh bằng sinh độc tố, B cereus gây ngộ độc thức ăn sinh ra

6 loại độc tố bao gồm [21, 24]:

• Độc tố ly giải hồng cầu (HBL), có trong khoảng 50-66% số chủng B cereus [13] Nó được xem là yếu tố gây độc cơ bản của B cereus nhưng cơ chế hoạt động nội độc tố của nó vẫn chưa được biết rõ Độc tố gây ly giải hồng cầu là protein 3 thành phần gồm B, L1, L2 Ba thành phần này lần lượt được mã hóa bởi 3 gen hblA, hblD, và hblC, 3 gen này cùng nằm trên 1 operon [31]

• Độc tố ruột không ly giải hồng cầu (NHE) là một độc tố có bản chất là protein 3 thành phần A, B, C do hầu hết các chủng B cereus sinh ra Trong đó NHEC là thành phần protein liên kết còn NHEA, NHEB là thành phần protein phân giải Giống như HBL, hoạt tính của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 thành phần này Các gen nheA, nheB, nheC lần lượt mã hóa cho 3 thành phần NHEA, NHEB, NHEC của protein này, 3 gen này cùng nằm trên 1 operon gen

mã hóa Nhe được cho là xuất hiện trong tất cả các chủng B cereus [34]

• Độc tố T (bceT): Một protein 1 thành phần (41 kDa) với hoạt động enterotoxic được xác định bởi Agata et al (1995) Là độc tố có hoạt động sinh học tương tự như NHE Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để xác định tỷ lệ enterotoxin T trong các chủng B cereus trong kết quả của Agata et al (1995) phát hiện thấy gene bceT trong 100% (10/10) các chủng thử nghiệm [21]

• Độc tố FM (EntFM) là độc tố có bản chất protein với vai trò và đặc tính chưa được biết đến [34] Bằng chứng cho sự tồn tại của một enterotoxin thứ ba của B cereus lần đầu tiên được phát hiện bởi Granum et al (1996) Các nhà nghiên cứu phát hiện ra 2 của 7 chủng ngộ độc thực phẩm đã kiểm tra không sản xuất HBL hoặc enterotoxin T, do đó, chất độc với thành phần phức tạp enterotoxin, mà bây giờ được gọi là enterotoxin FM

• Nội độc tố K (CytK) có bản chất là protein 1 thành phần, loại độc tố này giống độc tố beta của vi khuẩn Clostridium perfring CytK gần đây đã được phát hiện trong khoảng 90% số chủng B cereus Chất độc này xảy ra dưới hai dạng CytK-1 và CytK-2 [33]

• Độc tố gây nôn (Emetictoxin) Độc tố này có tên là cereulide được hình thành trước trong thực phẩm, là nguyên nhân của hội chứng nôn, bản chất là một dodecadepsipeptide có một vòng 4 acid amin với phân tử lượng 1,2 kDa và/ hoặc oxy acid [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] lặp đi lặp lại 3 lần, bền với nhiệt, pH

và sự phân giải protein: nó vẫn hoạt động ở nhiệt độ 121oC, có khả năng chịu các điều kiện của axit, độc tố gây nôn phát triển tốt trong thức ăn từ cơm, khoai tây nghiền, thực phẩm có nhiều tinh bột và rau [21]

Hình 2.3 Cấu trúc hoá học của độc tố gây nôn

Tiêu chảy là do độc tố gây ly giải hồng cầu BL, độc tố ruột không gây ly giải hồng cầu và độc tố K Độc tố liên quan đến hội chứng tiêu chảy không bền với axit của dạ dày, độc tố tiêu chảy phát triển nhiều trong thực phẩm từ rau, thịt Độc tố tế bào K (cytK) của B cereus là một yếu tố quan trọng gây ngộ độc thực phẩm vì hoạt tính ly giải hồng cầu và gây độc tế bào của nó

Bào tử của B cereus có khả năng bám vào tế bào biểu mô của người và sau

đó nhanh chóng hình thành tế bào B cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố, nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung, khoanh vùng ở vùng ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây bệnh một cách trầm trọng, thời gian ủ bệnh sẽ lâu hơn [36]

Bảng 2.2 Các loại độc tố của B cereus [21]

Độc tố Thành phần độc tố Protein Gen mã hoá

Độc tố gây tiêu

chảy

Độc tố gây ly giải hồng cầu (HBL)

Độc tố không gây ly giải hồng cầu (NHE)

2.4.5 Cơ chế gây ngộ độc và liều lượng

Hầu hết các loại thực phẩm đều có khả năng lây nhiễm bào tử của B cereus Nếu môi trường thực phẩm đó không thích hợp cho sự nảy mầm của bào

tử thì B cereus sẽ được đưa vào cơ thể ở dạng bào tử Ngược lại, nếu điều kiện thực phẩm cho phép bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng thì B cereus sẽ được đưa vào cơ thể ở dạng tế bào [33] Đặc biệt nếu trong thực phẩm xuất hiện chủng B cereus có mang gen mã hoá sản sinh độc tố cereulide thì khi con người

ăn phải thực phẩm có độc tố đó sẽ bị ngộ độc với thể bệnh nôn [16,36]

Bảng 2.3 Đặc trưng của hai loại bệnh do vi khuẩn B cereus gây ra [31]

Đặc điểm Hội chứng tiêu chảy Hội chứng buồn nôn Liều gây nhiễm

Thời gian ủ bệnh (h) 8–16 (đôi khi>24 h) 0.5–5

Thời gian bệnh (h) 12–24 (đôi khi một vài ngày) 6–24

Các triệu chứng Đau bụng, tiêu chảy và đôi khi

buồn nôn

Buồn nôn, ói mửa và khó chịu đôi khi theo sau tiêu chảy, do sản xuất độc tố ruột

bổ sung

Thực phẩm liên

quan

Sản phẩm thịt, súp, rau quả, bánh pudding, nước sốt, sữa và sản phẩm sữa

Cơm, mì, bánh ngọt và bánh

mì

Sau khi thực phẩm có nhiễm B cereus được đưa vào cơ thể, chúng sẽ được đưa tới dạ dày Dạ dày là nơi có pH thấp và có sự hoạt động của các enzym tiêu hoá như pepsin, tripsin… Vì vậy, nếu trong thực phẩm chỉ chứa bào tử thì do tính kháng axit và các enzym tiêu hoá, chúng nhanh chóng được chuyển tới ruột non Còn nếu thực phẩm chứa cả hai loại bào tử và tế bào sinh dưỡng thì phụ thuộc vào pH của dạ dày mà chỉ có bào tử hay cả bào tử và tế bào B cereus được chuyển qua ruột non Do pH của dạ dày còn phụ thuộc vào loại thực phẩm và cơ thể của từng người nên nếu pH của dạ dày quá thấp thì chỉ có bào tử được chuyển qua, còn nếu pH thuận lợi hơn sẽ tạo cơ hội cho cả tế bào sinh dưỡng được đi qua Khi vào tới ruột non, bào tử B cereus sẽ nảy mầm, phát triển và sản sinh độc tố Nếu lượng độc tố tích luỹ đủ thì sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy [36]

Trường hợp trong thực phẩm có chứa sẵn độc tố, nếu là độc tố cereulide thì

ngộ độc thể bệnh nôn [9] Còn nếu là độc tố gây tiêu chảy enterotoxins thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị các enzym tiêu hoá phá huỷ Như vậy, ngộ độc thực phẩm thể bệnh tiêu chảy chỉ xảy ra do quá trình tạo tích luỹ độc tố ruột trong ruột non người [40]

2.5 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Bacillus cereus

Hiện nay, việc nhận biết chính xác B cereus mất khá nhiều thời gian Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các nhà khoa học đang tìm ra những phương pháp tốt nhất để có thể phát hiện nhanh, chính xác B cereus Một số phương pháp đã

và đang được sử dụng để phát hiện B cereus như:

2.5.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa

Hiện nay, phương pháp truyền thống để xét nghiệm B cereus trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Qui trình này phải trải qua nhiều bước: đồng nhất mẫu, tăng sinh, chọn lọc, xác định các tính chất hóa sinh Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái:

• Trên môi trường MPA: có thể sơ bộ phân biệt được B cereus và B mycoides do khuẩn lạc của B mycoides có dạng dễ cây còn khuẩn lạc B cereus lại có hình tròn, có tâm lồi, màu trắng sữa đến trắng đục

• Trên môi trường thạch MYP và môi trường thạch Mossel (cereus selective agar) khuẩn lạc của B cereus có đường kính 0,4 – 0,5µm, khuẩn lạc có màu hồng eosin hoặc xanh xung quanh có vùng kết tủa màu hồng hoặc xanh, có tâm lồi, bề mặt xù xì, không dính ướt, có vành ở mép [16]

Phương pháp dựa trên đặc điểm sinh lý sinh hóa

Đặc tính sinh lý sinh hoá của B cereus có rất nhiều điểm tương đồng với các loài còn lại trong nhóm B cereus đặc biệt là 3 loài B thuringiensis, B mycoides, B anthracis như khả năng sinh catalase, gelatinase, khả năng lên men glucose kỵ khí, phản ứng khử nitrat, phản ứng VP… Tuy nhiên, thông qua một

số đặc tính sinh lý, sinh hóa bước đầu có thể nhận biết được B cereus với các loài khác như khả năng chuyển động để phân biệt với B anthracis và B mycoides Do hầu hết các chủng B cereus và B thuringiensis đều có khả năng chuyển động nhờ lông roi còn B anthracis và B mycodes thì không Ngoài ra, trên môi trường thạch huyết, có thể phân biệt được với B anthracis do B.cereus

có khả năng phân giải huyết còn B anthracis thì không Trong nhóm B cereus thì việc nhận biệt B cereus và B thuringiensis là tương đối khó khăn bởi chúng

có nhiều đặc điểm sinh lý sinh hoá giống nhau Hiện nay, người ta chỉ có thể phân biệt được chúng qua khả năng sinh tinh thể độc của B thuringiensis sau 3 -

4 ngày nuôi cấy trong khi B cereus và các loài khác trong nhóm thì lại không có khả năng này Tuy nhiên, phương pháp dựa trên đặc tính sinh lý, sinh hoá vẫn chưa đủ sức thuyết phục cho việc xác định chính xác vi khuẩn B cereus [27]

- Ưu điểm của phương pháp này

 Thao tác đơn giản

 Dễ làm

 Không phải đầu tư dụng cụ và thiết bị đắt tiền

- Nhược điểm

 Độ nhạy không cao

 Thời gian để xác định tình trạng ô nhiễm thực phẩm do B cereus lâu (khoảng 5 – 7 ngày)

 Tốn nhiều nhân công, cần có kỹ thuật viên có kinh nghiệm về vi sinh vật

 Không thể phát hiện được các chủng B cereus này có hay không có sinh độc tố do đó hạn chế trong công tác phòng ngừa

B cereus bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immumofluorescence) hoặc phương pháp ELISA

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang:

Kháng nguyên H hoặc kháng thể của B cereus được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Nếu có phản ứng kháng nguyên – kháng thể xảy ra thì dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kiểm tra bởi bức xạ hoặc bước sóng đặc hiệu chúng sẽ phát quang

Phương pháp ELISA:

Phương pháp này được sử dụng nhiều nhất trong việc nhận dạng cũng như phân loại kiểu huyết thanh H của B cereus Phương pháp này dựa trên nguyên tắc gắn kháng thể với enzym Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thuỷ phân cơ chất giải phóng một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ xảy ra phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể

Phương pháp này đơn giản và có độ nhạy gấp 10 – 500 lần so với phương pháp ngưng kết Ngoài ra, phương pháp này còn có thể xác định được nồng độ kháng nguyên thông qua cường độ màu Hiện nay, không chỉ kháng nguyên H của B cereus mà cả độc tố ruột enterotoxin của B cereus cũng được phát hiện thông qua các phương pháp này

- Ưu điểm

• Độ nhạy cao, cho phép phát hiện các sản phẩm ở mức độ khoảng 10pg

• Thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét nghiệm truyền thống

- Nhược điểm

Quy trình phức tạp, phải có những cán bộ kinh nghiệm và được đào tạo bài bản mới có thể thực hiện được

2.5.3 Phương pháp dựa trên đặc điểm gen

 Dựa trên đặc điểm gen mã hoá các loại độc tố

Hệ gen của vi sinh vật chứa toàn bộ thông tin cần thiết cho sự sống sót và sinh trưởng của chúng Mỗi gen mã hoá cho một protein liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp cho chu trình sống của chúng Hiện nay cùng với sự phát triển vượt bậc của các phương pháp sinh học phân tử đặc biệt là phương pháp PCR thì việc xác định các gen mã hóa các loại độc tố gây bệnh của vi khuẩn cũng như chính loại

vi khuẩn đó trở nên dễ dàng hơn Như đã biết B cereus gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy Thể bệnh tiêu chảy do các độc tố ruột gây ra đặc biệt là do 2 độc tố HBL và NHE Việc phát hiện gen mã hoá cho

3 protein thành phần của phức hợp HBL cũng như NHE đã được thực hiện bằng PCR [20]

 Dựa trên trình tự rARN

Chuỗi 16S rARN có tác dụng khi xác định các loại vi khuẩn chưa biết Nhưng trong nhóm B cereus, việc phân biệt B cereus với các loài còn lại gặp rất

nhiều khó khăn vì trình tự 16S rARN của nhóm này có mức tương đồng rất cao (99%) trong các nghiên cứu thông qua việc lai ADN – ADN và phép phân tích trình tự các gen trên rARN Trình tự 16S rARN của B mycodes, B thuringiensis chỉ khác biệt với B anthracis, B cereus từ 0-9 nucleotit Ngoài ra, Ash và Collins đã thông báo rằng trình tự 23S rARN của B anthracis và các chủng B cereus gây nôn là khá giống nhau [15] Như vậy, các nghiên cứu đã cho thấy việc

sử dụng trình tự 16S rARN không thích hợp để phân biệt B cereus với các loài khác trong nhóm B cereus [33]

 Dựa trên gen gyrB

Yamamoto và Harayama đã gợi ý sử dụng gen gyrB thay thế cho 16S rARN làm một marker phân loại phân tử cho các loài vi khuẩn trong nhóm Bacillus cereus Gen gyrB mã hóa tiểu phần protein B của ADN gyrase (topoisomerase type II), gen này điều khiển sự siêu xoắn của 2 sợi DNA Gen này có vai trò quan trọng trong quá trình nhân bản của DNA Do vậy, người ta đã tách dòng và giải trình tự gen gyrB có kích thước 1,2 Kb của 4 loài trong nhóm Bacillus cereus (B cereus, B antharcis, B thuringiensis, B mycoides)

Trên cơ sở đó, người ta đã thiết kế ra các cặp mồi dựa trên các đoạn đặc hiệu trong gen gyrB ở các loài trên và cặp mồi BC1 và BC2r đã được sử dụng để khuếch đại đoạn có kích thước 365bp của gen gyrB của B cereus Cặp mồi này

có thể được sử dụng để nhận dạng B cereus, nó mang tính đặc hiệu loài chứ không liên quan đến các nhân tố độc của chúng Tuy nhiên đó cũng chưa phải là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định nhanh, chính xác bởi nó chỉ có vai trò trong việc phân biệt B cereus và các loài còn lại trong nhóm mà đặc biệt là B thuringiensis [41]

Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam các nhà khoa học đã và đang

sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để tìm ra phương pháp xác định Bacillus cereus trong thực phẩm nhanh và chính xác

2.6 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU VỀ Bacillus cereus

2.6.1 Kỹ thuật PCR

Trên thế giới, các kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện các gen đặc hiệu của B cereus trong thực phẩm [8,24] Kỹ thuật PCR không chỉ giảm thời gian phát hiện B cereus trong các mẫu thực phẩm, mà còn có thể phát