khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn bacillus cereus k13

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG

ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LÔNG GIA CẦM

CỦA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS K13

MSSV: 309 2445 LỚP: CNSH K35

Cần Thơ, Tháng 5/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trong thời gian học tập tại trường tôi đã nhận được sự quan tâm hướng dẫn của thầy cố vấn học tập Trần Vũ Phương cùng sự chỉ dạy tận tình của các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Khoa Nông Nghiệp, Khoa Khoa Học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, các anh chị và các bạn sinh viên thuộc phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn đến tất cả sự quan tâm và giúp đỡ quý báu!

TÓM LƢỢC

Lông gia cầm là phế phẩm được sinh ra với khối lượng lớn từ hoạt động chăn nuôi và giết mổ Với thành phần chính là keratin, lông gia cầm khó bị phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Sử dụng vi sinh vật để phân hủy nguồn chất thải này đang là hướng đi mới vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường lại có thể sử dụng sản phẩm tạo thành bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Kết quả thực hiện đề tài

“Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus cereus K13” cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi khuẩn này là 3 ngày Tại mức nhiệt độ 37°C và pH 7,5 vi khuẩn có mật số và khả năng phân hủy bột lông cao nhất so với các nghiệm thức còn lại Hoạt động của vi khuẩn bị

ức chế khi môi trường nuôi cấy có bổ sung glucose (1% w/v) Trong môi trường có bổ sung rỉ đường (1% w/v), mật số vi khuẩn tăng lên nhưng khả năng phân hủy bột lông

bị giảm đi Ngoài bột đậu nành giúp làm tăng mật số vi khuẩn, các nguồn nitơ khác khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bột lông là nguồn dinh dưỡng duy nhất

Từ khóa: lông gia cầm, keratin, Bacillus cereus

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về lông gia súc – gia cầm 3

2.2 Keratin 4

2.3 Enzyme keratinase 5

2.4 Sơ lược về vi sinh vật phân hủy keratin 6

2.4.1 Vi khuẩn Bacillus 6

2.4.2 Các nhóm vi sinh vật khác 7

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 8

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 8

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11

3.2 Phương tiện nghiên cứu 11

3.2.1 Giống vi khuẩn 11

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 11

3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 11

3.2.4 Hóa chất 12

3.2.5 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 12

3.3 Phương pháp nghiên cứu 13

3.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn giống 13

3.3.2 Chuẩn bị nguồn cơ chất 13

3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 14

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn 14

3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn 15

3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn 16 3.3.7 Phương pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy 16

3.3.8 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn 17

3.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 18

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn 19

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn 23

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn 26

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

Bảng 6 Kết quả thí nghiệm 1

Bảng 7 Kết quả thí nghiệm 2

Bảng 8 Kết quả thí nghiệm 3

Bảng 9 Kết quả thí nghiệm 4

PHỤ LỤC 2

Kết quả thống kê thí nghiệm 1

Kết quả thống kê thí nghiệm 2

Kết quả thống kê thí nghiệm 3

Kết quả thống kê thí nghiệm 4

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ 3

Bảng 2 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn 11

Bảng 3 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng 12

Bảng 4 Thành phần hóa chất môi trường BSM 12

Bảng 5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm 20

Bảng 6 Kết quả thí nghiệm 1

Bảng 7 Kết quả thí nghiệm 2

Bảng 8 Kết quả thí nghiệm 3

Bảng 9 Kết quả thí nghiệm 4

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 1 Cấu trúc α-keratin và β-keratin 5

Hình 2 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus cereus 7

Hình 3 Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian 18 Hình 4 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến mật số vi khuẩn 23 Hình 5 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn 24 Hình 6 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến mật số vi khuẩn 26 Hình 7 Biểu đồ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến khả năng phân

hủy bột lông của vi khuẩn 27

TỪ VIẾT TẮT

B Bacillus

BSM Basal salt medium

CFU colony-forming unit

EDTA Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride

PTN Phòng thí nghiệm

rpm Rotation per minute

rRNA Ribosomal ribonucleotide acid

w/v Weight/volume

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Theo số liệu từ Tổng cục thống kê, năm 2011, đàn gia cầm cả nước có 322,6 triệu con và đàn gia súc là khoảng 28 triệu con, trong đó đàn lợn chiếm 27,1 triệu con Sự phát triển mạnh của ngành chăn nuôi là một phần quan trọng để giải quyết vấn

đề lương thực cho hơn 85 triệu dân ở nước ta Tuy nhiên, việc phát triển ngành chăn nuôi lại gây ra nhiều ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống, đòi hỏi con người phải tìm ra biện pháp xử lý thích hợp Trong số các loại chất thải tạo ra trong quá trình chăn nuôi và giết mổ gia súc – gia cầm thì phế phẩm lông là khó xử lý nhất do thành phần chính của chúng là keratin, một loại protein có khả năng chống lại các tác nhân phân hủy cao, cần thời gian rất lâu để phân hủy hoàn toàn trong tự nhiên

Chất thải lông gia súc – gia cầm thường được xử lý bằng cách chôn lấp hoặc đốt cháy và thậm chí là thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường đất, nước và không khí, cho nên đòi hỏi cần phải có biện pháp xử lý mới tốt hơn cho các loại phế phẩm này; mục tiêu là vừa có khả năng phân hủy chúng và không gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Công nghệ sinh học mà cụ thể là công nghệ vi sinh vật chính là chìa khóa quan trọng để giải quyết vấn đề này Do bản chất của lông

là protein nên vi khuẩn hoàn toàn có khả năng phân hủy được chúng thông qua hoạt động của hệ enzyme keratinase Bên cạnh đó, nếu được xử lý thích hợp thì phế phẩm lông có thể trở thành một nguồn protein bổ sung hiệu quả vào thức ăn chăn nuôi thay thế cho các nguồn protein đắt tiền khác, vừa có thể giải quyết vấn đề môi trường lại có thể tận dụng nguồn phế phẩm này đem lại hiệu quả cao về kinh tế

Dòng vi khuẩn K13 được tuyển chọn ra từ 19 dòng vi khuẩn phân lập từ mẫu đất

và nước lấy từ lò giết mổ gia súc tại huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre Đây là dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy lông gia súc và gia cầm cao nhất trong số các dòng vi khuẩn phân lập được Đoạn gene 16S rRNA được xác định cho kết quả tương đồng với

dòng vi khuẩn Bacillus cereus PRM2 ở mức 99% Do môi trường nuôi cấy có ảnh

hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn, nên để có thể ứng dụng dòng vi khuẩn vào thực tiễn cần tiến hành các nghiên cứu khảo sát nhằm chọn ra điều kiện môi trường tối

ưu cho sự phát triển của vi khuẩn, nâng cao khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin và chọn ra hướng ứng dụng phù hợp cho dòng vi khuẩn này

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, nguồn nitơ, nguồn carbon đến

sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của dòng vi khuẩn Bacillus cereus K13

Qua đó, xác định các điều kiện môi trường thích hợp để ứng dụng dòng vi khuẩn này vào việc xử lý và chế biến phế phẩm lông vào thực tiễn

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về lông gia súc – gia cầm

Lông là một phế phẩm sinh ra với số lượng lớn tại các cơ sở giết mổ gia súc – gia cầm và nhà máy chế biến thực phẩm, khối lượng lên đến hàng triệu tấn mỗi năm trên toàn thế giới (Manczinger et al., 2003) Tùy thuộc vào giống vật nuôi và độ tuổi mà tỉ

lệ lông trên trọng lượng cơ thể có sự khác nhau Đối với gia súc lớn như lợn, lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng lượng cơ thể, đối với gà trưởng thành tỉ lệ này đạt từ 5 – 7%

Bảng 1 Thành phần protein và acid amin có trong lông vũ

(Nguồn: Latshaw et al., 1994)

Bởi vì thành phần chính của lông là keratin (chiếm hơn 92%), nên chất thải lông được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi Để có thể trở thành thức ăn chăn

nuôi, chất thải lông cần trãi qua nhiều giai đoạn xử lý bằng các phương pháp vật lý và hóa học khác nhau Tại các cơ sở chế biến hiện đại, lông vũ được nấu dưới áp suất cao,

sử dụng hơi nước trực tiếp thủy phân một phần protein, phá hủy các cầu nối bền trong cấu trúc keratin Sau đó, bột lông vũ đã thủy phân sẽ được xử lý bằng men pepsin tạo

ra một sản phẩm có tính ngon miệng cao và dễ tiêu hóa đối với nhiều loài vật nuôi Đặc biệt đây là nguồn dồi dào các acid amin như Leucin, Arginine, Cystein Tuy nhiên những quá trình này đòi hỏi rất nhiều năng lượng và chi phí đầu tư sản xuất cũng rất lớn Bên cạnh đó, quá trình gia nhiệt và xử lý hóa học cũng làm phá hủy một số acid amin nhạy cảm bởi nhiệt có trong thành phần lông như Methionine, Lysine, Tryptophan (Papadoulos, Ketelaars, 1986) và tạo ra một số acid amin như Lanthionine

và Lysinoalanine làm giảm sút đáng kể giá trị dinh dưỡng của sản phẩm tạo thành Công nghệ vi sinh vật phát triển đã mở ra một hướng đi mới, phân hủy chất thải lông bằng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của vi khuẩn nhằm tạo ra một nguồn protein có tỉ lệ dinh dưỡng cân bằng hơn, cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế các nguồn protein đắt tiền khác, và đồng thời còn giúp hổ trợ xử lý các nguồn rác thải có chứa nhiều cơ chất keratin để giải quyết vấn đề

ô nhiễm môi trường

2.2 Keratin

Keratin là nhóm protein có cấu trúc dạng sợi, hiện diện rất phong phú trong tế bào biểu mô của động vật có xương sống và là thành phần chủ yếu cấu tạo nên các phần phụ như móng, tóc, lông,… Keratin ở các loài động vật có xương sống khác nhau

có trình tự acid amin và cấu trúc cơ bản tương tự nhau Trình tự acid amin quyết định cấu trúc phân tử và tính chất của những cấu trúc bậc cao hơn, cũng như ảnh hưởng đến các liên kết trong phân tử keratin Các chuỗi acid amin này được cuộn chặt, ở dạng xoắn α (α-keratin) hoặc ở dạng phiến β (β-keratin) và gấp nếp tạo thành cấu trúc ba chiều Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ vào những cầu nối disulfide, liên kết hydro và tương tác kị nước làm cho keratin có khả năng kháng lại tác động của các tác nhân phân hủy vật lý, hóa học và sinh học Keratin không tan trong nước, acid loãng, kiềm

và dung môi hữu cơ, cũng như không bị phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein như pepsin, trypsin, papain (Veslava et al., 2009); tuy nhiên chúng có thể bị phân hủy bởi các chất gây biến tính như thioglycollate, dithiothreitol, mercaptoethanol do các cầu nối disulfide bền bị cắt đứt Keratin được phân thành hai nhóm chính dựa theo

hàm lượng lưu huỳnh Keratin cứng hiện diện nhiều ở tóc, móng guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao; trong khi keratin mềm với các cầu nối disulfide ít hơn tìm thấy chủ yếu ở da và mô

Hình 1 Cấu trúc α-keratin và β-keratin

(Nguồn: Trần Tố,2008)

2.3 Enzyme keratinase

Keratinase là loại enzyme có khả năng phân hủy cơ chất chứa keratin trong tự nhiên và được phân loại là protease với mã số là EC 3.4.21/24/99.11 (Gupta, Rammani, 2006) Keratinase được định nghĩa là serine protease do nó tương đồng trình tự 97% với protease kiềm và nó cũng bị ức chế bởi các chất ức chế tương tự chất

ức chế serine protein (Bressollier et al., 1999, Wang et al., 2003)

Tuy keratin là một dạng protein khó bị phân hủy, nhưng thực tế ngoài tự nhiên các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn bị phân hủy Điều này có được là do hoạt động của các vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng sinh ra keratinase Tuy nhiên, khả năng tạo ra keratinase của vi sinh vật phụ thuộc vào

nhiều yếu tố như chủng vi sinh vật, nguồn cơ chất và cả điều kiện của môi trường Đây

được xem như một nguồn enzyme quan trọng có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thuộc da, phân bón, thức ăn chăn nuôi, y dược,… Phần lớn keratin bị phân hủy do tác động của keratinase tiết ra từ tế bào vi khuẩn, tuy nhiên theo nhiều báo cáo nghiên cứu, các tế bào vi khuẩn cũng giữ một vai trò

quan trọng trong quá trình phân hủy cơ chất chứa keratin Những thành phần disulfide reductases, sulfite, thiosulfate và keratinase có trong tế bào giúp bẻ gãy các cầu nối disulfide hỗ trợ cho quá trình phân hủy của enzyme ngoại bào được tốt hơn Như vậy,

có thể nói rằng, quá trình phân hủy keratin bao gồm hai bước là phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy dây protein (Gupta, Rammani, 2006)

Keratinase từ vi sinh vật có pH tối ưu nằm trong khoảng từ trung tính đến kiềm (6 đến 9), và nhiệt độ tối ưu từ 30°C đến 80°C, có khi đạt tới 100°C như ở chủng vi

khuẩn Fervidobacterium islandicum AW-1 (Nam et al 2002)

Keratinase được kích thích khi môi trường có chứa các ion hóa trị hai như Ca2+

,

Mg2+ và Mn2+ Trong khi đó, hoạt tính keratinase bị ức chế bởi các ion kim loại Cu2+

,

Zn2+, Ag+, Pb+,… và các hợp chất như phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF),

ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1,10-o-phenanthroline

2.4 Sơ lƣợc về vi sinh vật phân hủy keratin

2.4.1 Vi khuẩn Bacillus

Theo kết luận của Ghosh et al (2007) thì phần lớn các vi sinh vật có khả năng

phân hủy cơ chất chứa keratin cao thường là vi khuẩn, đa số thuộc chi Bacillus

Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia

tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc

kỵ khí không bắt buộc và hình thành nội bào tử Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn

thuộc chi Bacillus rất đa dạng Khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám

Trong số các chủng Bacillus sp., Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis được

mô tả có khả năng phân hủy keratin tốt (Manczinger et al., 2003) Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương, được tìm thấy nhiều trong đất, nhiệt độ tăng

trưởng tối ưu khoảng 30°C, sinh enzyme tối đa ở 37°C và có khả năng sinh bào tử ở môi trường khắc nghiệt

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí tùy tiện, sinh nội bào tử, kích thước 0,5 – 0,8µm x 1,8 – 3µm Khi gặp điều kiện bất lợi B subtilis có khả năng

hình thành bào tử, bào tử tồn tại rất lâu trong tự nhiên và có thể phát triển lại thành tế

bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi B subtilis là một trong những

vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm sản xuất amylase,

protease, inosine ribosides, pullulanase, chitinase, và các acid amin

Bacillus cereus là trực khuẩn, Gram dương, tạo nội bào tử Kích thước 0,5 – 1,5µm x 2 – 4µm Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động B cereus

là vi khuẩn hiếu khí và kị khí không bắt buộc, có thể tồn tại ở nhiệt độ 5 – 50°C , tối

ưu là 35 – 40°C; pH tồn tại trong khoảng 4,5 – 9,3, thích hợp nhất ở 7 – 7,2

Hình 2 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus cereus

2.4.2 Các nhóm vi sinh vật khác

Nhóm vi khuẩn : nhóm vi khuẩn Gram dương có khả năng phân hủy keratin bao

gồm Lysobacter, Nesternokia, Kocurica và Microbacterium và một vài dòng Gram âm như Vibrio, Xanthomonas, Stenotrophomonas, Chryseobacterium (Sangali, Brandelli,

2000; De Toni et al., 2002)

Nhóm xạ khuẩn : chủ yếu là nhóm Streptomyces bao gồm S fradiae (Novel and Nickerson, 1959), S sp A11 (Mukhopadhyay, Chandra, 1990), S pactum (Bockle et al., 1995), S albidoflavus (Letourneau et al., 1998), S thermoviolaceus SD8 (Chitte et

al., 1999)

Nhóm nấm: Chrysosporium, Aspergillus, Alternaria, Trichurus, Curvularia, Cladosporium, Fusarium, Geomyces, Gleomastis, Monodictys, Myrothecium, Paecilomyces, Stachybotrys, Urocladium, Scopulariopsis, Sepedonium, Penicillium, Doratomyces(Gradisar et al., 2000)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin ở trong nước còn rất hạn chế, chỉ có một số nghiên cứu về phân lập vi sinh vật phân hủy lông vũ ở miền Bắc và vẫn chưa có nghiên cứu ứng dụng vào thực tế

Nguyễn Huy Hoàng et al (2010) đã phân lập một số dòng vi khuẩn (Bacillus sp Đ.NĐ 1.2, Bacillus sp Đ.HY 1.1, chủng L.HY 2.6 và L.TO 2.1) có khả năng phân hủy

lông vũ tạo nguồn thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Điều kiện thích hợp cho các chủng

vi khuẩn này là ở 30°C đến 40°C và có khả năng phân hủy lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy

Nguyễn Thu Hiền et al (2010), Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, đã phân

lập được dòng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng phân hủy lông vũ

2.5.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

S Sangali và A Brandelli (2000) đã phân lập được một dòng vi khuẩn thuộc họ

Vibrionaceae từ vùng nuôi gia cầm công nghiệp ở Brazil Vi khuẩn được phân lập trên

môi trường chứa lông gia cầm được sử dụng như là nguồn năng lượng, carbon và nitơ duy nhất Trong nghiên cứu này vi khuẩn phát triển thuận lợi nhất ở 30oC và hoạt tính enzyme thu được tối đa ở nhiệt độ 55°C và pH 8,0

S Riessen và G Antranikian (2001) đã phân lập được dòng vi khuẩn

Thermoanaerobacter keratinophilus có khả năng chịu nhiệt cao, điều kiện tối ưu cho

sự phát triển của dòng vi khuẩn này là 70°C, pH 7,0 và 0,5% NaCl; chúng có khả năng phân hủy đến 60% lông cừu sau sáu ngày ủ trong điều kiện yếm khí

Riffel et al (2003) nghiên cứu thấy rằng dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp

Kr6 có khả năng phân hủy lông vũ rất cao, phát triển tốt nhất ở 30°C và pH 8 Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy tác động ức chế hoạt tính keratinase của EDTA, Hg2+,

Cu2+ và khả năng kích thích bởi Ca2+

Geun-Tae Park et al (2006) đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng phân hủy lông gà và hoạt tính keratinase của vi khuẩn

Bacillus megaterium F7-1 Dòng vi khuẩn này phân hủy hoàn toàn lông gà trong vòng

7 ngày Nhiệt độ tối ưu 25 – 40oC, và pH tối ưu từ 7 – 11 Việc bổ sung các nguồn nitơ khác nhau có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính keratinase; các nguồn nitơ hữu cơ như yeast

extract, casein, tryptone làm tăng đáng kể hoạt tính enzyme trong khi urê, các nguồn nitơ vô cơ như NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 và các nguồn carbon như glycerol

và manitol lại làm giảm khả năng phân hủy lông cũng như hoạt tính keratinase

R Gupta và P Ramnani (2006) đã thực hiện nghiên cứu về keratinase từ vi khuẩn và ứng dụng của enzyme này Trong đó, keratinase chỉ được sinh ra trong điều kiện môi trường có sự hiện diện cơ chất có chứa keratin như lông, tóc, móng,… cơ chế phản ứng phân hủy keratin bao gồm phản ứng cắt đứt cầu nối disulfide và thủy phân protein Keratinase được ứng dụng trong chế biến thức ăn cho gia súc, phân bón, làm sạch và làm giảm ô nhiễm ở các khu công nghiệp

Mohammad et al (2007) nghiên cứu sự phát triển và hoạt tính keratinase của

dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phân lập từ chất thải gia cầm Dòng vi

khuẩn này phát triển và sinh enzyme tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40°C Khả năng phân hủy keratin tăng 12% trong môi trường có bổ sung NH4Cl vởi tỉ lệ 0,1% (w/v) và tăng 30% khi bổ sung rỉ đường với tỉ lệ 1% (w/v)

Radhika Tatineni et al (2007) nghiên cứu hoạt tính keratinase thu được từ

Streptomyces sp cao nhất ở nhiệt độ 45°C và pH 11 Đồng thời nhận thấy môi trường

bổ sung ion Ca2+, Mg2+ có hoạt tính keratinase cao hơn, trong khi ion Zn2+ làm ức chế hoạt động của keratinase

A Ghosh et al (2008) nghiên cứu khả năng phân hủy lông vũ của dòng vi khuẩn

Bacillus cereus DCUW cho khả năng phân hủy cao nhất ở 50oC và pH 8,5 Đồng thời nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của enzyme trên nhiều loại cơ chất khác nhau gồm keratin, casein, collagen, fibrin, gelatin và khả năng ức chế hoàn toàn hoạt tính keratinase bởi PMSF

Bo Xu et al (2009) đã phân lập được một dòng vi khuẩn mới được định danh là

Bacillus licheniformis K-19 chịu được nhiệt độ cao (30 – 90oC) và pH rộng (6 – 10) Nhiệt độ tối ưu là 60oC và pH tối ưu từ 7,5 – 8

Veslava et al (2009) đã chọn ra các dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis 511, B subtilis 11, B subtilis 717, B subtilis 103 phân lập từ nước thải tại khu chế biến gia

cầm để khảo sát khả năng phân hủy lông gia cầm Các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường có bổ sung bột lông vũ : (NaCl 0,5 g/L, KH2PO4 0,4 g/L, K2HPO4 0,3

g/L, bột lông vũ 10 g/L và agar 15 g/L) Đối với dòng B subtilis 103 thì hàm lượng

keratinase tối đa là 153 U/ml sau 24 giờ nuôi cấy, trong khi các dòng khác từ 148 –

292 U/ml sau 48 giờ nuôi cấy

Onuoha et al (2011) đã chọn ra dòng vi khuẩn Bacillus sp D4 có khả năng phân

hủy lông vũ cao, pH tối ưu của dòng vi khuẩn này là 10,0 và phát triển tốt nhất ở nồng

độ bột lông từ 6 – 7% (w/v)

Sabrina et al (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả

năng phân hủy lông gà và hoạt tính enzyme của dòng vi khuẩn Bacillus subtilis SLC

Lượng keratinase sinh ra cao nhất trong môi trường có bổ sung 1% (w/v) lông gà ở nhiệt độ 60oC và pH 10,0

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện tại PTN Sinh học phân tử thực vật và PTN Sinh hóa, thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ

 Thời gian: Từ tháng 12/2012 đến tháng 5/2013

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn Bacillus cereus K13 được Đinh Thị Bé Hiền (2012) phân lập từ

mẫu đất và nước thu tại lò giết mổ gia súc ở huyện Mỏ Cày Nam, tỉnh Bến Tre Giống

vi khuẩn ròng được giữ lạnh trong ống nghiệm trữ tại PTN Sinh học phân tử thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Cần Thơ

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm

- Bột lông gia cầm

- Rỉ đường mía

- Bột đậu nành

3.2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 2 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ rắn

Bảng 3 Thành phần hóa chất môi trường bột lông vũ lỏng

0,3 0,5

3.2.4 Hóa chất

 Hoá chất dùng để nuôi cấy các dòng vi khuẩn:

K2PO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4.7H2O, Glucose, Sucrose, NH4Cl, Yeast extract

- Tủ lạnh trữ mẫu Akira - Việt Nam

- Que cấy, que trãi tam giác, đèn cồn, ống nhỏ giọt

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn giống

Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường bột lông vũ rắn, ủ ở 37oC trong hai ngày Sau đó cấy vào bình chứa 100ml môi trường bột lông vũ lỏng đã được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút, nuôi tăng sinh khối trên máy lắc (120 rpm) ở 37o

C trong 48 giờ Rút 1ml dịch nuôi cấy tiến hành đếm mật số vi khuẩn Mật số cần đạt khoảng 107

CFU/ml Trữ lạnh bình nuôi tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4o

C

3.3.2 Chuẩn bị nguồn cơ chất

- Bột lông vũ được sấy khô ở 80oC trong hai đến năm ngày, bảo quản trong bình hút ẩm cho đến khi sử dụng

- Dịch rỉ đường được lọc qua vải lọc, loại bỏ các phần xác bã mía, bảo quản trong bình thủy tinh ở nơi khô mát

- Bột đậu nành được nghiền mịn, sấy khô ở 80°C từ hai đến năm ngày, bảo quản trong ống nghiệm

3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

 Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời

gian nuôi cấy tối ưu của dòng vi khuẩn B.cereus K13.

 Chuẩn bị 3 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng

 Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 20 phút

 Chủng vào bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC

 Mỗi ngày rút 1ml trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Chọn ra điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển và khả năng

phân hủy lông gia cầm của dòng vi khuẩn B cereus K13

 Các bước thực hiện:

 Chuẩn bị 15 bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường bột lông vũ lỏng Lần lượt điều chỉnh pH như bố trí thí nghiệm, mỗi mức pH có ba bình tam giác Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 20 phút

 Chủng vào mỗi bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn

bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

 Mỗi nghiệm thức chuẩn bị một bình tam giác không chủng vi khuẩn để làm mẫu đối chứng âm

 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC

 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn

 Sau chín ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm

 Lặp lại thí nghiệm tương tự cho các mức nhiệt độ khác như bố trí thí nghiệm

 Nghiệm thức có tỉ lệ phần trăm lông gia cầm bị phân hủy cao nhất được sử dụng cho các thí nghiệm sau

3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

 Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ và pH tối ưu chọn ra từ thí nghiệm 2

- Các nghiệm thức lần lượt là bổ sung dịch rỉ đường, sucrose, glucose với nồng

độ 1% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng carbon

- Số lần lặp lại: ba lần

- Tổng số nghiệm thức: bốn nghiệm thức

- Số đơn vị thí nghiệm: 12 đơn vị thí nghiệm

 Chỉ tiêu theo dõi:

nghiệm Ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng Điều chỉnh pH tối ưu chọn ra từ thí nghiệm 2 Dùng giấy bạc đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 20 phút

 Chủng vào mỗi bình tam giác 2,5ml dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn

 Ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ như bố trí thí nghiệm

 Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu đếm mật số của vi khuẩn

 Sau 9 ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm

3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn

Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn

 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiêt độ và pH tối ưu chọn ra từ thí nghiệm 2

- Các nghiệm thức lần lượt là bổ sung bột đậu nành, yeast extract, NH4Cl với nồng độ 0,5% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng nitơ

- Số lần lặp lại: ba lần

- Tổng số nghiệm thức: bốn nghiệm thức

- Số đơn vị thí nghiệm: 12 đơn vị thí nghiệm

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Mật số của vi khuẩn

- Khả năng phân hủy lông gia cầm

 Các bước thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện tương tự như thí nghiệm 3, nguồn carbon sử dụng được thay thế bằng nguồn nitơ với nồng độ bổ sung như bố trí thí nghiệm

3.3.7 Phương pháp xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy

 Mục đích: Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau

 Các bước thực hiện

 Vải lọc được sấy khô ở 80ºC trong hai đến năm ngày và cân đến khi khối lượng không đổi (G1)

 Sau quá trình nuôi cấy, dịch môi trường được đem lọc qua vải lọc Rửa lại với nước cất hai đến ba lần cho hết sinh khối vi khuẩn Sau đó đem sấy khô ở 80ºC

và cân lại đến khi khối lượng không đổi (G2)

 Khối lượng bột lông còn lại sau khi phân hủy = G2 – G1

 Tỉ lệ phần trăm lông bị phân hủy bởi vi khuẩn được tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):

A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐTrong đó: A (%) là tỉ lệ lông bị phân hủy bởi vi khuẩn

mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu

mC là khối lượng bột lông còn lại sau khi bị phân hủy

 Hút 0,1ml trong ống nghiệm ở độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa môi trường

đã chuẩn bị trước Dùng que trãi trãi đều mẫu trên đĩa môi trường

 Ủ ở 30o

C, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường

 Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy (CFU/ml) tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức

CFU/ml = Ci x Di x10 Trong đó: Di: độ pha loãng

Ci: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di

3.3.9 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.1 và vẽ đồ thị bằng MS Excel 2007