tìm hiểu về enzyme cố định

Enzyme cố đinh 5 Ứng dụng của enzyme cố định không tan • Tổng hợp các hợp chất và năng lượng bằng sự chuyển đổi sinh học • Xử lý chọn lọc các chất ô nhiễm để giảm thiểu ô nhiễm môi tr

Enzyme cố định

Vì sao sản xuất enzyme cố định (không tan)

• Enzyme hòa tan dễ bị mất hoạt tính ở điều kiện pH, nhiệt độ,

dung môi không phù hợp

• Chi phí sản xuất enzyme hòa tan cao, nhiều công đoạn

• Không thể thu hồi enzyme hòa tan sau phản ứng xúc tác

Định nghĩa

• Enzyme cố định (hay enzyme không tan) là enzyme được định

vị vật lý vào một vài vùng xác định trên chất mang mà vẫn giữ

được hoạt tính và có thể sử dụng lặp lại nhiều lần

• Hoặc có thể nói “enzyme cố định là enzyme có sự tham gia

hoạt động trong một không gian bị giới hạn” Sự giới hạn hoạt

động vốn linh hoạt của enzyme bằng cách gắn nó vào một pha

cách ly tách rời khỏi pha lỏng tự do và ở đó nó vẫn có khả năng

tiếp xúc được với các phần tử cơ chất, effector hay inhibitor

(chất ức chế) Pha gắn enzyme thường không tan trong nước

nhưng cũng có thể là các polyme ưa nước

Enzyme cố đinh 3

Ưu điểm của enzyme cố định (không tan)

 Sử dụng lặp lại nhiều lần  giảm giá thành

Chế phẩm bền hơn trong các điều kiện pH, nhiệt độ, áp xuất thẩm

thấu tối ưu, tốc độ phản ứng lớn

 Sản phẩm phản ứng không lẫn lộn với enzyme không gây ảnh

hưởng xấu đến màu sắc và mùi vị của sản phẩm

Dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hoá cao

Có thể làm ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết bằng cách

tách enzyme ra khỏi cơ chất

Chế tạo enzyme tương đối dễ, đầu tư xây dựng và sản xuất tương

đối ít

Có thể dễ dàng tổ chức sản xuất các sản phẩm lên men bằng

enzyme ngoại bào như: rượu etylic, axit hữu cơ, axit amin, vitamin

Nhược điểm của enzyme cố định (không tan)

Sự chuyển khối bị hạn chế

Có thể mất hoạt tính sau khi cố định

Không có hiệu quả cao đối với cơ chất rắn

Mất tính thích nghi hình thể

Enzyme cố đinh 5

Ứng dụng của enzyme cố định (không tan)

• Tổng hợp các hợp chất và năng lượng bằng sự chuyển đổi sinh học

• Xử lý chọn lọc các chất ô nhiễm để giảm thiểu ô nhiễm môi trường

• Phân tích liên tục các hợp chất khác nhau với tính đặc thù và chọn

lọc cao

• Ứng dụng trong y dược như là tạo ra các loại thuốc mới hay các bộ

phận, cơ quan nhân tạo

Lịch sử

1916: Nelson và Griffin - enyme invertase từ nấm men bị hấp phụ trên

than hoạt tính có khả năng xúc tác sự thủy phân đường

1953: Grubhofer và Schleith - cố định nhiều loại enzyme

(carboxypeptidase, disastase, pepsin và ribonuclease) lên nhựa

diazotized polyaminostyrene bằng liên kết cộng hóa trị

1956: Mitz - liên kết ion của calalase trên chất mang DEAE-cellulose

vào năm 1956

1964: Bernfeld và Wan - bao gói trypsin, papain với glutaraldehyde

1971: Gregoriadis - cố định enzyme amyloglucosidase trong liposome

ứng dụng trong liệu pháp trị bệnh

Enzyme cố đinh 7

Lịch sử

• Năm 1969, Chibata và các cộng sự của công ty Tanabe

dụng enzyme cố định ở quy mô công nghiệp

• Enzyme aminoacylase (E.C 3.5.1.14) được cố định trên

DEAE-Sephadex bằng liên kết ion và sử dụng để thủy phân N-acyl-D-amino

acid để thu L-amino acid và N-acyl-D-amino acid

• Ứng dụng cố định tế bào vi khuẩn khác cũng được thực hiện bởi

Chibata và cộng sự năm 1973 hướng đến tổng hợp L-aspartate từ

ammonium fumarate bằng cách cố định tế bào vi khuẩn E coli có hoạt

Sự lựa chọn chất mang

• Các nhóm chức năng đồng nhất

• Tính chất vật lý (đường kính, độ uốn dẻo, độ bền cơ, độ nén…)

• Tính ái nước hay kỵ nước của chất mang

• Hình dạng và kích cỡ

• Gồm hai loại: vô cơ và hữu cơ

Enzyme cố đinh 9

Chất mang vô cơ

• thường hay được sử dụng do đặc tính cơ học, độ bền nhiệt và

khả năng kháng vi sinh cũng như dung môi hữu cơ tốt

• Silica gel (Promaxon):

• bề mặt gắn và kích thước lỗ xác định, nhưng giá thành cao và độ bền kém trong

điều kiện kiềm

• trơ về mặt hóa học, nên cần được hoạt hóa và biến đổi bởi các hóa chất khác

• Organopolysiloxanes cấu tạo nên hợp chất vô cơ tổng hợp mang các

nhóm chức năng hữu cơ, có sẵn trên thị trường (Deoxan, Degussa

AG)

• tính kháng với các biến đổi hóa học và có sức chứa enzyme lớn

• nhóm chức năng vô cơ cho phép liên kết cộng hóa trị với glutadialdehyde

Chất mang hữu cơ

• Chất mang hữu cơ tự nhiên:

• rẻ tiền, sẵn có

• Carbohydrate (alginate, carrageenan, chitin hay chitosan) được quan

tâm đặc biệt vì an toàn sinh học và có tính ái nước cao

• Chất mang hữu cơ tổng hợp:

• đa dạng cao về đặc điểm lý hóa

• thích nghi tốt với các điều kiện trong quy trình sản xuất liên quan đến

• Tính xốp của agarose cao làm gia tăng lượng enzyme gắn

• có đặc tính ái nước, dễ dàng biến đổi, không có nhóm tích điện và có

sẵn ở thị trường thương mại

• Nhược điểm của agarose là giá thành cao

• Sepharose là tên thương mại của agarose ứng dụng trong sự cố định

bằng liên kết cộng hóa trị

• Cellulose:

• rẻ tiền và có sẵn trên thị trường

• năng lực cố định enzyme của cellulose thấp hơn agarose

Chất mang hữu cơ tổng hợp

• Polystyren:

• Sự gắn chủ yếu do lực hấp thụ

• Quá trình gắn tính ái nước của chất mang thường làm biến đổi cục bộ

enzyme, vì vậy hoạt độ enzyme bị giảm

• Polymer acrylic như là Eupergit C (Rohm, Darmstadt, Đức)

Enzyme cố đinh 13

Eupergit C

• độ bền hóa học và cơ học cao

• tạo ra liên kết cộng hóa trị vơi nhóm amino của enzyme thông qua

nhóm oxirane của nó

Nhóm chức năng của enzyme

• Phản ứng hóa học của enzyme chủ yếu xảy ra do các nhóm

chức thuộc các gốc amino acid trong phân tử enzyme

• nhóm alkyl: trơ về mặt phản ứng hóa học

• nhóm aliphatic hydroxyl của gốc serine và threonine: dẫn xuất của

nước, có phản ứng yếu trong sự đông đảo của các phân tử nước ở

môi trường xung quanh

• Chín nhóm bên góp phần quan trọng trong các phản ứng hóa học của

enzyme với các phân tử khác:

Guanidinyl (arginine), γ-carboxyl (glutamic acid), β-carboxyl (aspartic acid),

sulfhyfryl (cysteine), imidazolyl (histidine), ε- amino (lysine), thioether (methionine),

indolyl (tryptophan) và phenolic hydroxyl (tyrosine)

Enzyme cố đinh 15

Nhóm alkyl

Nhóm aliphatic hydroxyl

Enzyme cố đinh 17

Guanidinyl γ-carboxyl β-carboxyl

sulfhyfryl imidazolyl ε- amino

Enzyme cố đinh 19

thioether indolyl phenolic hydroxyl

Nhóm chức năng của enzyme

• Bản chất của phản ứng enzyme là phản ứng ái nhân:

Nhóm sulfhydryl của cysteine là nhóm ái nhân mạnh nhất (đặc biệt khi

nó ở dạng thiolate, RS-)

Nitrogen của nhóm amino (yếu hơn sulfhydryl): số lượng nhiều trong

phân tử enzymemục tiêu quan trọng trong các phản ứng

• Các nhóm phản ứng khác có thể được biến đổi bằng các phản

ứng hóa học đặc biệt để sử dụng cho mục đích cố định

amine để thu nhận nhóm phản ứng ái nhân và tích điện bề mặt

Phương pháp tổng hợp chế phẩm enzyme cố định

Về nguyên tắc có 4 phương pháp:

điện tích

phân tử enzyme với nhau bằng liên kết đồng hóa trị tạo đại phân

tử enzyme không hòa tan

- “Gói” enzyme trong khuôn gel

men)

Enzyme cố đinh 21

Phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion

• Nguyên tắc: Các enzyme có thể gắn lên chất mang bằng tương tác

vật lý (liên kết hydro, tương tác kỵ nước, lực Van der Waal) hay

bằng các liên kết ion nếu chúng mang điện tích (phương pháp ion

bền hơn phương pháp hấp phụ vật lý)

• Mô hình cố định enyme đầu tiên (Nelson và Griffin, 1916): invertase từ

nấm men trên than hoạt tính có khả năng xúc tác sự thủy phân

đường (sucrose)

• Năm 1956, Mitz đã sử dụng liên kết ion để cố định thành công

catalase trên chất mang cellulose

Phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion

• Ưu điểm:

• không làm biến đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của E

• Đơn giản, dễ thực hiện

• Chất mang có thể được tái sử dụng

• Nhược điểm: tương tác yếu, và bị tác động bởi các điều kiện

môi trường (nhiệt độ, nồng độ)

Enzyme cố đinh 23

Phương pháp hấp phụ vật lý và liên kết ion

• Ưu điểm:

• không làm biến đổi cấu trúc trung tâm hoạt động của E

• Đơn giản, dễ thực hiện

• Chất mang có thể được tái sử dụng

• Nhược điểm: tương tác yếu, và bị tác động bởi các điều kiện

môi trường (nhiệt độ, nồng độ)

Chất mang thường sử dụng để cố định enzyme bằng hấp

phụ hay liên kết ion:

collagen, CMC

- Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxit của kim loại

- Chất mang trao đổi ion: DEAE – sephadex, CM – sephadex

- Polyme tổng hợp: polyacrylamit, nilon

Enzyme cố đinh 25

Phương pháp

Cho chất mang và enzyme tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó

rửa để loại các phân tử bị gắn yếu lên chất mang

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzyme cố định và độ

bền của liên kết cố định

thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó trong một giới hạn nhất

định

- pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các

nhóm tính điện ở chất mang và enzyme Sự thay đổi pH thường

ảnh hưởng lớn đến lượng enzyme cố định bằng liên kết ion

Đồng thời sự thay đổi đột ngột của pH có thể gây ra sự nhả hấp

phụ của enzyme

Enzyme cố đinh 27

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzyme cố định và độ

bền của liên kết cố định

- Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi chuỗi mạch enzyme nên làm

tăng liên kết protein chất mang nhưng dễ làm mất hoạt tính của

enzyme

- Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzyme có

khối lượng phân tử càng nhỏ thì khả năng hấp phụ càng lớn

Những chất mang chứa thêm nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt

hơn và bền hơn

Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết đồng hóa trị

Nguyên tắc:

Các gốc amino acid nằm ngoài trung tâm hoạt động hay vị trí gắn cơ

chất của enzyme thường được lựa chọn để cố định lên chất mang

thông qua liên kết cộng hóa trị với chất mang

Đó thường là các nhóm: amino của lysine, mercapto của cysteine, beta-carboxyl

của tyrosine, gamma-carboxyl của glutamic acid, phenolic hydroxyl của tyrosine,

hay hydroxyl của serine và threonine

Trong số đó, các nhóm hydroxyl, carboxyl và amino thường được sử

dụng trong quá trình cố định enzyme vì nó chiếm phần lớn trong phân

Enzyme cố định dễ dàng tiếp xúc với cơ chất bởi vì enzyme

được gắn trên bề mặt của chất mang

Tính bền nhiệt tăng do liên kết bền giữa enzyme và chất mang

Ưu và nhược điểm của phương pháp cố định enzyme

bằng liên kết cộng hóa trị

Nhược điểm:

Cấu trúc hoạt tính của enzyme dễ bị phá hủy do sự biến đổi cục bộ

Tương tác bền giữa enzyme và chất mang có thể cản trở sự chuyển

động tự do của enzyme, làm cho hoạt động của enzyme bị giảm

Điều kiện tối ưu cho sự cố định khó được xác định

Không phù hợp cho sự cố định các loại tế bào

Chất mang không thể tái sử dụng được Vì vậy phương pháp này

phù hợp cho các loại enzyme đắt tiền cần cải thiện độ bền bằng liên

kết cộng hóa trị

Enzyme cố đinh 31

Phương pháp

- Gắn enzyme với nhau bằng liên kết đồng hóa trị

Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị

• Ưu điểm: Tạo độ bền cao tránh được sự thất thoát E trong

quá trình phản ứngthích hợp cho các reactor liên tục

• Nhược điểm:

• Lượng enzyme cố định thường thấp hơn so với phương pháp khác

• Hoạt tính của enzyme có thể giảm do biến đổi cấu trúc hình thể của

enzyme trong quá trình cố định và do sự tiếp xúc hạn chế giữa cơ chất

và trung tâm hoạt động của enzyme

chất mang có bản chất háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể ức chế

enzyme vừa được liên kết;

chất mang tốt nhất là mang điện tích trái dấu với enzyme

thường là polypeptide, carboxylmetylcellulose (CMC), silicagel,

polyacrylamide

Điều kiện của chất mang và enzyme

• Enzyme:

trị với chất mang: nhóm -COOH (axit aspartic, axit glutamic), ε –

imidazol (histidin)

Enzyme cố đinh 35

Phương pháp

Qua hai giai đoạn chính

Một số phương pháp dùng để hoạt hóa chất mang như dùng

cyanogen bromide, diazot hóa (diazotation), azide acid, các chất

ngưng tụ (condensing reagent)

Phương pháp Cyanogen Bromide (CNBr)

• Nghiên cứu bởi Axen và cộng sự

• Sự kích hoạt chất mang có nhóm

hydroxyl (-OH) (1) như

polysaccharides, hạt thủy tinh,

hay gốm, sứ với cyanogen

Phương pháp acid azide

• carboxylmethyl cellulose (CMC) (7) được chuyển đổi thành

nhiệt độ thấp để tạo ra enzyme cố định (11)

Phương pháp diazot hóa

• Các chất mang có nhóm

amino thơm (12) được diazot

• Nguyên tắc: liên kết chéo đồng hóa trị các phân tử enzyme lại

với nhau, tạo thành cấu trúc đại phân tử không tan nhờ các tác

nhân lưỡng cực hoặc đa chức mà không cần đến chất mang

• Tác nhân gắn kết thường là: glutaraldehyt với tỷ lệ tác nhân

enzyme khoảng 1 – 10%

Phương pháp gắn các enzyme với nhau bằng liên kết

đồng hóa trị

Ngoài glutaraldehyde (tác nhân tạo liên kết ngang phổ biến nhất)

nhiều hợp chất khác như toluene diisocyanate, hay

hexamethylene diisocyanate (21) cũng được sử dụng

Enzyme cố đinh 41

Gói enzyme trong gel (entrapment)

• Nguyên tắc: Phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới không

gian của một polyme không tan trong nước

• Để chuẩn bị chế phẩm theo phương pháp này, có thể thực hiện

các cách sau:

Kiểu mắt lưới (lattice): enzyme được gói trong mạng lưới được làm từ

polysaccharides, protein hay các polymer tổng hợp

Kiểu bao vi thể (microcapsule): enzyme được gói trong các bao vi thể

Ưu, nhược điểm của phương pháp gói enzyme trong

khuôn gel

Ưu điểm:

với nhiều enzyme

- Toàn bộ lượng enzyme được gói trong khuôn gel và nhận được

bề mặt tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme là lớn trên một thể tích

nhỏ

điều kiện các enzyme này có điều kiện hoạt động tối ưu gần

- Phương pháp này chỉ thích hợp cho những cơ chất có phân tử

nhỏ Kích thước của lỗ xốp phải đủ lớn để cơ chất và sản phẩm

đi qua, cho nên có thể làm thất thoát enzyme

các gốc tự do thường làm biến tính enzyme

reactor kích thước nhỏ

- Chất mang không thể phục hồi được

Để khắc phục những nhược điểm trên cần:

 Lựa chọn điều kiện về pH, nhiệt độ và các điều kiện khác của

enzyme

khuếch tán vào và kết hợp với enzyme

 Sản phẩm tạo thành có thể khuếch tán ra ngoài mắt lưới

Enzyme cố đinh 45

Phương pháp kiểu mắt lưới

Phương pháp kiểu mắt lưới (lattice) được sử dụng rộng rãi nhất

trong kiểu cố định bao gói

Việc đưa enzyme vào gel bằng cách trùng hợp gel trong dung

dịch enzyme có nồng độ cao nhờ tác dụng của các hóa chất như

gel polyacrylamide, polymer tự nhiên (alginate, k-carreageenan);

nhờ bức xạ (gel polyvinyl alcohol, pyrrolidone); hoặc nhờ ánh

sáng (polyethylenglycol dimetacrylate)

• Alginate (acid alginic) là acid

bao gồm các đơn vị cấu tạo của

các acid D-mannuronic và

bằng liên kết β-1,4

• Đây là nguyên liệu tự nhiên

tuyệt vời và được sử dụng rộng

rãi để bao gói enzyme

Alginate

Nguyên tắc: Muối natri của alginate (sodium alginate I) với khả

năng hòa tan trong nước, được hòa trộn với dung dịch enzyme

Sau đó, thêm từng giọt dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành

gel calcium alginat không tan có chứa enzyme

• Ưu điểm của phương pháp: đơn giản, nguyên liệu an toàn, rẻ

tiền, dễ kiếm

• Nhược điểm: loại gel này có thể bị hòa tan dần trong sự hiện

diện của các tác nhân bao gói khác như ion phosphate

Enzyme cố đinh 49

κ-Carrageenan

• κ-Carrageenan là hỗn hợp các polysaccharide tương tự

agar-agar được chiết tách ra tảo đỏ, hòa tan trong nước hoặc trong

dung dịch muối, có khoảng 4-5% carragenin, là polysaccharide

có chứa galactose và galactose sulfate