BÁO cáo đồ án PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trường Đại học công nghiệp thực phẩm TP.HCM, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm của trường đã tạo điều kiện cho

ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

-o0o -

BÁO CÁO ĐỒ ÁN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

XÁC ĐỊNH AURAMINE O, RHODAMINE B, PARAROSANILINE TRONG THỰC PHẨM ĐÃ CHẾ BIẾN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

GVHD: Ths Phan Thị Xuân SVTH: Nguyễn Phương Giang LỚP: 04DHDB1

MSSV: 2022130023

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/2016

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô trường Đại học công nghiệp thực phẩm TP.HCM, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm của trường đã tạo điều kiện cho em thực hiện đồ án môn học để có nhiều kinh nghiệm hơn cho bài khóa luận tốt nghiệp Và em cũng xin chân thành cảm ơn cô Phan Thị Xuân đã nhiệt tình hướng dẫn em hoàn thành tốt đồ án môn học phân tích thực phẩm

Trong quá trình thực hiện đồ án khó tránh khỏi sai sót, rất mong các thầy cô bỏ qua Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm làm đồ án chưa có nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các Thầy, Cô để em có thể học hỏi thêm được nhiều kinh nghiệm và sẽ hoàn thành tốt hơn trong bài báo cáo tốt nghiệp sắp tới

Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM,ngày 19 tháng 5 năm 2016

Sinh viên thực hiện Nguyễn Phương Giang

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Sinh viên : Nguyễn Phương Giang MSSV 2022130023

Nhận xét :

Điểm đánh giá:

Ngày … tháng … năm 2016 ( ký tên, ghi rõ họ và tên)

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN

Sinh viên : Nguyễn Phương Giang MSSV 2022130023

Nhận xét :

Điểm đánh giá:

Ngày … tháng … năm 2016 ( ký tên, ghi rõ họ và tên)

MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH ẢNH 3

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 4

LỜI MỞ ĐẦU 5

Chương 1: TỔNG QUAN 6

1.1 Đại cương về Auramine O[1] 6

1.1.1 Công thức cấu tạo 6

1.1.2 Đặc tính hóa lý 6

1.1.3 Ứng dụng: 6

1.1.4 Độc tính của AO 7

1.2 Đại cương về Rhodamine B[2] 7

1.2.1 Công thức cấu tạo 7

1.2.2 Đặc tính hóa lý: 7

1.2.3 Ứng dụng: 7

1.2.4 Độc tính của Rhodamine B 7

1.3 Một vài nét về Pararosaniline[3] 8

1.3.1 Công thức cấu tạo 8

1.3.2 Đặc tính hóa lý 8

1.3.3 Ứng dụng 8

1.3.4 Độc tính của PA 8

Chương 2: THỰC NGHIỆM[4] 9

2.1 Hóa chất cần sử dụng 9

2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 9

2.3 Chuẩn bị mẫu 9

2.4 Kiểm tra hiệu suất thu hồi và xác nhận phương pháp 10

2.5 Phân tích HPLC 10

2.6 Phân tích TLC 11

2.7 Phân tích LC/MS 11

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN[4] 12

3.1 Tối ưu hóa việc chuẩn bị dung dịch mẫu 12

3.2 Tối ưu hóa quá trình làm sạch trên cột chiết pha rắn 12

3.3 Tối ưu hóa các điều kiện HPLC 15

3.4 Kiểm chứng phương pháp 16

3.5 TLC 18

3.6 LC/MS 19

KẾT LUẬN 21

TÀI LIỆU KHAM KHẢO 22

DANH SÁCH HÌNH ẢNH

Hinh 1.1 Công thức cấu tạo của AO[4] 6 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của RB[4] 7 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của PA[4] 8 Hình 3.1 Hiệu suất (%) thu hồi của PA từ cột Oasis HLB ở điều kiện pH khác nhau[4] 13 Hình 3.2 Hiệu suất thu hồi (%) của PA, AO, RB khi được làm sạch trong cột Oasis HLB

sử dụng các dung môi rửa giải khác nhau: 1% acetic acid trong THF:MeOH (1:4) (A) và 1% acetic acid trong MeOH (B) [4] 14 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC (tại 450 và 550 nm) của dung dịch chuẩn PA, AO, RB (0.1µg/mL) ở giá trị pH khác nhau (pH 6.5, 4.5, 3.5) [4] 16 Hình 3.4 Sắc ký đồ (tại 450 và 550nm) của dung dịch chuẩn PA, AO và RB (0.1µg/mL), mẫu trắng và mẫu từ bột cà ri nhão[4] 18 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC của một dung dịch chuẩn (STD), một mẫu trắng (BK), và một mẫu (SMP) từ bột cà ri nhão tại 254 và 366nm, dưới ánh sáng trắng sử dụng hệ thống dung môi A [2-butanone-methanol-5%Na2SO4 (1:1:1, v/v/v)] và B [2-butanone-methanol- 1.6M ammonium formate (pH 2.5) (7:2:7, v/v/v)] [4] 19

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

PA Pararosaniline

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

PDA Photodiode array detector

ESI Ion hóa tia điện

SIM Selected Ion Monitoring

RT Thời gian lưu

LỜI MỞ ĐẦU

Màu thực phẩm tổng hợp được sử dụng trên toàn thế giới để tránh mất đi màu sắc ban đầu của thực phẩm sau chế biến, đồng thời làm cho sản phẩm thực phẩm hấp dẫn hơn trong mắt người tiêu dùng Màu thực phẩm tổng hợp có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với màu thực phẩm tự nhiên về giá trị màu sắc, tính đồng nhất và khả năng áp dụng cho nhiều loại thực phẩm Màu thực phẩm tổng hợp đã được ủy quyền và quy định về liều lượng sử dụng cho thực phẩm ở nhiều quốc gia Tuy nhiên việc sử dụng một số chất màu cơ bản như pararosaniline (PA), auramine O (AO) và Rhodamine B (RB) được coi là trái phép tại một

số quốc gia như Nhật Bản, EU và Hoa Kỳ Vì việc sử dụng PA và AO trong thực phẩm có thể gây ảnh hưởng xấu cho người sử dụng và độc tính của 2 chất này được xếp vào nhóm 2B do Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế công bố (2010) RB cũng được chứng minh là

có gây ngộ độc cho người và động vật Tuy bị cấm sử dụng trong thực phẩm, nhưng những chất màu này vẫn được phát hiện trong nhiều loại thực phẩm ở một số nước đang phát triển như Malaysia, Philippines, Ấn Độ, Argentina và Trung Quốc Tại Việt Nam, trong thời gian vừa qua, các cơ quan chức năng đã phát hiện ra nhiều vụ việc các cơ sở kinh doanh có

sử dụng AO trộn vào thức ăn cho gà trong thời gian chăn nuôi để tạo màu vàng bắt mắt cho

da thân, da chân gà và cả lòng đỏ trứng gà Ngoài ra rất nhiều vụ việc măng, dưa cải muối chua được ngâm AO để tạo màu vàng tự nhiên cũng được phát hiện trên khắp cả nước RB cũng được phát hiện là có sử dụng để tạo màu đỏ cho tương ớt, bột ớt và hạt dưa Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng các chất màu trên là vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Mặc dù đã có một số phương pháp phát hiện và xác định các chất màu trên trong thực phẩm, nhưng các phương pháp này lại có một số nhược điểm như tốn thời gian thực hiện, không được ứng dụng hoàn toàn vào các loại thực phẩm khác nhau và không có phương pháp xác định đồng thời PA, AO và RB

Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector photodiode array (HPLC-PDA) rất hữu dụng trong việc xác định và phát hiện PA, AO, RB ở hàm lượng thấp (khoảng 0.5 µg/g) trong nhiều loại thực phẩm Ngoài ra, còn đề cập đến hai phương pháp khác là phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và phương pháp sắc ký lỏng ghép detector khối phổ (LC/MS), phương pháp TLC có ưu điểm là chi phí thấp, nhanh chóng, đơn giản, cho phép phát hiện chất màu cơ bản Còn phương pháp LC/MS dùng để định tính các chất màu trên Các phương pháp trên được áp dụng cho các loại thực phẩm giàu chất béo, các sản phẩm chứa ớt (gochujang và tương ớt), thực phẩm giàu protein ( bột tôm và súp bột) Dựa trên các kết quả nghiên cứu về phân tích hàm lượng AO, RB và PA trong các mẫu thực phẩm mà có thể đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm tại các cơ sở sản xuất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về Auramine O [1]

1.1.1 Công thức cấu tạo

Auramine O là một hợp chất hóa học, được sử dụng để làm thuốc nhuộm cho công nghiệp

Các tên gọi khác: C.I 41000; Basic Yellow 2; Canary yellow; Pyoktaninum aureum; 4,4'-(imidocarbonyl)bis(N,N-dimethylaniline)monohydrochloride

Công thức phân tử là C17H21N3.HCl

Phân tử khối là 303.8

Công thức cấu tạo của Auramine O

Hinh 1.1 Công thức cấu tạo của AO[4]

AO kết hợp với RB tạo thành thuốc nhuộm auramine-rhodamine Chất này được sử dụng như một chất khử trùng và làm thuốc nhuộm vi khuẩn Lao (Mycobacterium tuberculosis)

AO được dùng trong công nghiệp nhuộm vải, giấy, gỗ … và dùng làm màu sơn quét tường, ngoài ra còn có thể được sử dụng trong việc in ấn, tạo màu trong các loại mực AO được khuyến cáo chỉ sử dụng trong công nghiệp, tuyệt đối không được sử dụng trong thực phẩm, ngay cả trong chăn nuôi chất này cũng bị cấm sử dụng (Thông tư số 42/2015/TT-BNNPTNT ngày 16/11/2015 của Bộ Nông nghiệp và PTNT về Danh mục bổ sung hóa chất,

Việt Nam, trong đó có AO)

1.1.4 Độc tính của AO

Qua đường hô hấp, AO gây kích ứng dữ dội đường hô hấp, sẽ gây sặc, lên cơn viêm phế quản, viêm phổi … Qua đường tiêu hóa, AO gây đau bụng, nôn ói, đau rát cổ, tiêu chảy Tiếp xúc da sẽ gây ngứa, bong tróc, viêm loét da

Parodi (1982) nghiên cứu trên động vật cho thấy AO gây ung thư cho chuột cống và chuột nhắt

Nhiều thí nghiệm cho thấy AO làm tổn thương acid nhân DNA của nhiều dòng tế bào, đặc biệt là tế bào gan, thận và tủy xương

1.2 Đại cương về Rhodamine B [2]

1.2.1 Công thức cấu tạo

Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu công nghiệp Công thức phân tử là C28H31ClN2O3

Phân tử khối là 479,02g/mol

Công thức cấu tạo của Rhodamine B

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của RB[4]

1.2.2 Đặc tính hóa lý:

RB ở dạng bột màu đỏ đến tím, không mùi Nhiệt độ nóng chảy khoảng 210 - 211oC Tan tốt trong methanol, ethanol Độ hòa tan trong nước là ~15g/L ở 20oC

1.2.3 Ứng dụng:

RB là chất hoá học dùng để nhuộm giấy, màu sơn, vải sợi, da và nhựa; tuyệt đối cấm

sử dụng trong thực phẩm và thuốc RB còn là một loại phẩm màu phát quang dùng trong y học để chẩn đoán virus, vi khuẩn và một số xét nghiệm sinh hóa RB không có tên trong Danh mục phụ gia được sử dụng trong thực phẩm của Bộ Y tế

1.2.4 Độc tính của Rhodamine B

Qua tiếp xúc, RB gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da, mắt Qua đường hô hấp nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận

Tuy chưa xác định được nồng độ tối thiểu cho phép của RB nhưng nếu tích tụ dần trong cơ thể, nó gây nhiều tác hại đối với gan thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh và là một tác nhân nghi ngờ gây ung thư

1.3 Một vài nét về Pararosaniline [3]

1.3.1 Công thức cấu tạo

Giống như AO và RB, Pararosaniline cũng là một hợp chất hóa học được sử dụng làm thuốc nhuộm công nghiệp

Công thức phân tử là C19H18ClN3

Phân tử khối là 323.83g/mol

Công thức cấu tạo của PA

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của PA[4]

1.3.2 Đặc tính hóa lý

PA tồn tại ở dạng tinh thể màu xanh lá cây, không mùi Nhiệt độ nóng chảy khoảng

268 – 270oC Ít hòa tan trong nước, độ hòa tan trong nước là 10g/l ở 25oC

1.3.3 Ứng dụng

PA là chất hoá học dùng để nhuộm giấy, màu sơn, vải sợi, da và nhựa; tuyệt đối cấm

sử dụng trong thực phẩm và thuố PA không có tên trong Danh mục phụ gia được sử dụng trong thực phẩm của Bộ Y tế

1.3.4 Độc tính của PA

PA được xếp vào nhóm 2B (nhóm chất có thể gây ung thư cho người) do Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế công bố (2010)

2-butanone, ethyl acetate và hexane được mua từ Kanto Chemical Co., Inc (Tokyo Japan)

Dung môi methanol và acetonitrile được cung cấp bới Merck (Darmstadt, Germany) Chất chuẩn RB (độ tinh khiết 98.3%) được mua từ Wako Pure Chemical Industry,Ltd., chất chuẩn AO (độ tinh khiết 90.8%) và PA (độ tinh khiết 94.4%) được mua từ Chroma Technology Corp và Acros Organics (Geel, Belgium)

Dung dịch NaCl bão hòa có chứa 0.1M NaOH được chuẩn bị bằng cách hòa tan 4g NaOH trong 1L dung dịch NaCl

Dung dịch amoni formate 1.6M (pH 2.5) được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 10g amoni formate hòa tan vào 50 mL nước, chuyển dung dịch vào bình định mức 100mL, sau

đó điều chỉnh pH bằng 2.5 bằng formic acid Địch mức tới vạch bằng nước

2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Các dung dịch chuẩn gốc AO, RB, PA được chuẩn bị bằng cách hòa tan mỗi chuẩn trong methanol trong bình định mức với nồng độ 1mg/mL (Tức là 1000ppm) Các dung dịch chuẩn gốc này được pha loãng với methanol thành các nồng độ 250ppm và 25ppm dùng để kiểm tra hiệu suất thu hồi Để dựng đường chuẩn, Dung dịch chuẩn gốc được pha loãng bằng methanol có chứa 1% acid acetic thành 5 dung dịch chuẩn làm việc ở nồng độ 0.05, 0.1, 0.5, 1 và 2 µg/mL

môi để chiết Sau đó thêm 1mL NaOH 2.5M (trừ bột tôm) và thêm 50mL dung dịch NaCl bão hòa (chứa 0.1M NaOH) đến lớp chiết ethyl acetate trong phễu chiết Lắc hỗn hợp và tháo bỏ lớp cuối cùng Sau đó thêm 40mL hexane và 20mL HCl 0.1M đến lớp chiết ethyl acetate còn lại trong phễu chiết và lại lắc hỗn hợp Các chất màu cơ bản được chiết đến lớp sau cùng và được bỏ vào bình định mức 100mL Thêm 20mL HCL 0.1M vào các lớp còn lại khi khuấy trộn và lớp này được thu thập (với phần còn lại) vào bình định mức 100mL Định mức tới vạch bằng nước

Lấy 20mL dung dịch chuẩn bị phía trên và điều chỉnh pH của nó từ 10 -12 (sử dụng NaOH 2.5M) Hỗn hợp này được sử dụng để tối ưu hóa quá trình làm sạch trên cột chiết pha rắn Cột được rửa bằng 10mL nước Mill-Q và tách rửa bằng 4mL acetic acid 1% trong methanol Thêm một lượng methanol có chứa acetic acid vào hỗn hợp để có được thể tích cuối cùng là 5mL dung dịch mẫu cho thí nghiệm HPLC

2.4 Kiểm tra hiệu suất thu hồi và xác nhận phương pháp

Kiểm tra hiệu suất thu hồi được thực hiện để đánh giá độ đúng của phương pháp này Thêm 0.1mL các dung dịch chuẩn (25 µg/mL) vào 5g bột tôm, bột súp, bột cà ri nhão, tương ớt, gochujang, và thịt gà tandoori (thái cắt) khi không có PA, AO, và RB Các mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và sau đó được xử lý tương tự như bước “chuẩn

bị mẫu” Đường chuẩn được xây dựng với các dung dịch chuẩn PA, AO, RB ở nồng độ 0.05- 50 hoặc 100µg/mL nhằm kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn Độ chính xác trong ngày (RSDr ) và độ chính xác trong nhiều ngày (RSDR ) được đánh giá bằng cách phân tích các mẫu bột cà ri nhão giống hệt nhau khi thêm chuẩn PA, AO, RB (0.5µg/g) trong cùng một ngày và năm ngày khác nhau Các giới hạn định tính (LOD) và định lượng (LOQ) của PA, AO và RB được ước lượng bằng tỷ lệ S/N >3 và S/N > 10 của mỗi peak trong dung dịch chuẩn

2.5 Phân tích HPLC

Hệ thống LC gồm Hewlett Packard 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) có chứa một đầu dò PDA G1315A (theo dõi tại 550nm đối với PA và RB, và 450nm đối với AO), cột L (octadecylsilane (ODS), i.d: 4.6mm x 150mm; kích cỡ hạt: 5µm; kích thước lỗ:

12 nm ) và gia nhiệt cột tại 40°C

Các pha động gồm:

Pha động A: ammonium acetate (20mmol/L), có pH=4,5 (được điều chỉnh bằng cách thêm từng giọt acetic acid)

Pha động B: acetonitrile

Các điều kiện Gradient như sau:

(1) Gradient tuyến tính từ 20% đến 60% pha động B (trong vòng 15 phút)

(2) rửa giải isocratic 60% pha động B (5 phút)

Các bộ phận máy được kiểm soát (và dữ liệu được thu thập và phân tích) bằng phần mềm Agilent Chem-station

độ phòng và quan sát dưới ánh sáng trắng, ở 254nm cho RB và 366nm cho AO và RB Ghi nhận kết quả của các tấm bằng cách sử dụng dụng cụ quan sát TLC (Camag)

2.7 Phân tích LC/MS

Phân tích LC được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị HPLC-electrospray ionization -MS (HPLC-ESI-MS) từ Shimadzu (LCMS-2010; Shimadzu, Kyoto, Nhật Bản)

Quá trình tách sắc ký được thực hiện trên pha nghịch đảo HPLC cột L- ODS (i.d: 2.1mm

x 150mm, kích thước hạt: 5µm; kích thước lỗ: 12nm) Pha động gồm 20mmol/L ammonium acetate (pH 4.5) (pha động A) và acetonitrile (pha động B)

Điều kiện Gradient như sau:

(1) Một gradient tuyến tính từ 20% đến 60% pha động B (trong vòng 15 phút)

(2) Rửa giải isocractic ở 60% pha động B (5 phút) Tốc độ dòng chảy là 0,2 mL / phút

và thể tích tiêm là 5 µL; lò cột được duy trì ở 40 ° C

Các dung dịch mẫu được tiêm và phân tích ở ESI (+) với chế độ theo dõi ion chọn lọc (SIM) sử dụng khối lượng ion chọn lọc của m/z 288 [PA-Cl], m/z 268 [AO-Cl], và m/z 443 [RB-Cl-H] cho đầu dò LC / MS