Xây dựng một số tiêu chuẩn và đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu đủ

Hơn thế nữa, tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá đu đủ cũng đã được chứng minh trên một số mô hình dược lý gây giảm tiểu cầu trên chuột với các tác nhân khác nhau như: mô hình gây giảm t

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ HUY TRUNG

XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP

CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ HUY TRUNG

Mã sinh viên: 1301437

XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP

CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây đu đủ (Carica papaya L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Công dụng và tác dụng dược lý 7

1.1.6 Độc tính 12

1.1.7 Các nghiên cứu về lá đu đủ ở Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ 17

2.2.2 Đánh giá độc tính cấp của cao khô lá đu đủ 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ 17

2.3.2 Đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu đủ 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ 23

3.1.1 Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học mẫu thu hái 23

3.1.2 Phân lập carpain 24

3.1.3 Điều chế cao khô lá đu đủ 27

3.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ 27

3.2 Kết quả đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu đủ 30

3.3 Bàn luận 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh

Chi, người thầy giàu lòng đam mê, đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt

cho tôi rất nhiều kiến thức, niềm đam mê nghiên cứu và luôn tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh, người

thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm cũng như kiến thức quý báu trong nghiên cứu khoa học Phong cách làm việc của thầy là tấm gương cho tôi học tập

Tôi cũng xin được cảm ơn PGS TS Nguyễn Hoàng Anh, TS Nguyễn Thùy

Dương Những hỗ trợ quý báu của hai thầy cô đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ và mang lại cho tôi những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt những năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn và sự yêu thương tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi những lúc khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Ngô Huy Trung

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

1H-NMR proton nuclear magnetic resonance

13C-NMR carbon-13 nuclear magnetic resonance

DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV

DEPT distortionless enhancement by polarization transfer

ESI-MS electrospary ionization - mass spectrometry

GC-MS gas chromatography - mass spectrometry

HPTLC high performance thin layer chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá đu đủ 23

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân của CNPD 3 và của carpain 26

Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng cao khô 3 mẫu dược liệu 27

Bảng 3.4 Kết quả xác định hàm ẩm cao khô 3 mẫu dược liệu 28

Bảng 3.5 Kết quả xác định tro toàn phần các mẫu cao 28

Bảng 3.6 Kết quả định tính flavonoid trong cao khô lá đu đủ 28

Bảng 3.7 Kết quả định tính alcaloid trong cao khô lá đu đủ 29

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm cho thử độc tính cấp cao khô lá đu đủ 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Khu vực phân bố của cây đu đủ (Carica papaya L.) trên thế giới 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của một số flavonoid được phân lập từ lá cây đu đủ 5

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của một số alcaloid được phân lập từ lá đu đủ 6

Hình 2.1 Cây đu đủ (Carica papaya L.) 15

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình chiết xuất và phân lập carpain từ lá đu đủ 18

Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết methanol 3 mẫu dược liệu 25

Hình 3.2 Kiểm tra độ sạch của CNPD 3 25

Hình 3.3 Công thức cấu tạo của carpain 26

Hình 3.4 Ba mẫu cao CHN, CTH, CTB 27

Hình 3.5 Sắc ký đồ 3 mẫu cao khô lá đu đủ 29

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hằng năm, ở nước ta, dịch sốt xuất huyết gây ra hàm trăm nghìn ca mắc và nhập viện mỗi năm Đỉnh điểm là năm 2017, theo thống kê của Cục Y tế dự phòng – Bộ Y tế, trong 9 tháng đầu năm, cả nước ghi nhận tổng số hơn 90.626 trường hợp mắc bệnh, tăng 67,8 % so với cùng kỳ năm 2016, số tử vong tăng 7 trường hợp [12] Điều trị sốt xuất huyết chủ yếu là điều trị triệu chứng và theo dõi chặt chẽ phát hiện sớm sốc xảy ra để

xử trí kịp thời [2] Hiện nay đã có vaccin dự phòng sốt xuất huyết, tuy nhiên giá thành cao và vẫn còn những tranh cãi về mức độ an toàn [92], [94]

Cây đu đủ (Carica papaya L.) là loài cây ăn quả không những được trồng rất phổ

biến ở Việt Nam mà còn hầu hết các nước có khí hậu nhiệt đới trên thế giới Trong khi

ở nước ta, cây đu đủ chỉ được trồng chủ yếu để thu quả, lá mới chỉ được dùng ở một số vùng theo kinh nghiệm để hỗ trợ điều trị ung thư thì ở một số nước như Ấn Độ, Indonesia, lá đu đủ được dùng theo y học cổ truyền để điều trị nhiều loại bệnh bao gồm sốt rét, sốt xuất huyết [15], [30], [48]

Một số nghiên cứu, trong đó có cả những thử nghiệm lâm sàng tại Ấn Độ đã chứng minh hiệu quả điều trị của dịch chiết nước lá đu đủ trên bệnh nhân sốt xuất huyết [50] Carpain, alcaloid chính có trong lá đu đủ được cho là hợp chất chính liên quan đến tác dụng chống giảm tiểu cầu trên các bệnh nhân này [90]

Như vậy, việc sử dụng dịch chiết nước lá đu đủ để điều trị cho bệnh nhân sốt xuất huyết là rất tiềm năng do tính sẵn có và giá thành rẻ Để thuận tiện cho sử dụng, cao khô

lá đu đủ có thể là dạng bào chế trung gian Bên cạnh đó, để đảm bảo tính hiệu quả và an toàn, dạng cao khô này cần được xây dựng tiêu chuẩn và đánh giá độc tính đầy đủ

Do đó, đề tài “Xây dựng một số tiêu chuẩn và đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu

đủ” được thực hiện với hai mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ

2 Đánh giá độc tính cấp của cao khô lá đu đủ

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây đu đủ (Carica papaya L.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [81], vị trí phân loại của cây đu

đủ Carica papaya L có thể được tóm tắt như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây cao 2 – 10 m Thân đơn, có các sẹo xếp hình xoắn ốc Cuống lá rỗng, dài 60 –

100 cm, phiến lá dài 60 cm, xẻ chân vịt 5 – 9 lần, các thùy xẻ nông Cụm hoa đực ít gặp, buông thõng xuống đến 1 m

Hoa đực: không có cuống Ống tràng màu vàng, dài 1,6 – 2,5 cm, thùy hình mác, 1,8 x 0,45 cm, nhị 10, 5 dài, 5 ngắn, 5 nhị ngắn gần như không có chỉ nhị, chỉ nhị trắng,

có lông tơ trắng

Hoa cái: thường đơn độc hoặc kép dạng xim ngù, cuống ngắn hoặc gần như không

có Đài xẻ 5 thùy khoảng 1 cm Ống tràng vàng, hình mác hoặc thuôn, kích thước 5 – 6,2 x 1,2 – 2 cm, bầu hình trứng Núm nhụy xẻ sâu, gần như có lông ở viền

Hoa lưỡng tính: ống tràng 1,9 – 2,5 cm, thùy dạng thuôn 2,8 x 0,9 cm, nhị 5 hoặc

10, 1 vòng hoặc 2 vòng, bầu nhỏ hơn hoa cái

3

Quả màu cam đến vàng khi trưởng thành, hình trụ, cầu trụ hoặc dạng cầu méo dài

10 – 30 cm Thịt quả mềm, mùi thơm Quả có nhiều hạt màu đen khi trưởng thành Hạt hình trứng 2n = 18 Quả chín ngon, ăn được [6], [35]

1.1.3 Nguồn gốc và phân bố

Trên thế giới, chi Carica có 22 loài [93], phân bố rộng rãi ở vùng có khí hậu nhiệt đới [35] Ở Việt Nam, chi Carica chỉ có 1 loài duy nhất là Carica papaya L [6]

Cây đu đủ Carica papaya L có nguồn gốc ở vùng đất thấp từ nam Mexico qua miền

đông Trung Mỹ và bắc Nam Mỹ [53] Điều này có thể được minh chứng bởi thực tế rằng

tất các loài thuộc chi Carica đều không được biết đến trước khi châu Mỹ được phát hiện

[64] Cây này có lẽ được người Tây Ban Nha đưa vào Philipine vào khoảng năm 1550 Rồi từ đây, nó được đưa vào khu vực nhiệt đới của châu Á và châu Phi [86]

Ngày nay, đu đủ được trồng ở tất cả các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, bao phủ từ

vĩ tuyến 32 của bán cầu Bắc đến vĩ tuyến 32 của bán cầu Nam (hình 1.1) Đu đủ được trồng chủ yếu ở Australia, Columbia, Brazil, Coasta Rica, Ecuador, Hawai, Ấn Độ, Mexico, Nigeria, Peru, Sri LanKa, Venezuela, Nam Phi, Đài Loan, Mozambique, Cuba, Jamaica, Bangladesh và hầu hết các nước Đông Nam Á [64]

Hình 1.1 Khu vực phân bố của cây đu đủ (Carica papaya L.) trên thế giới [64]

- Các vitamin trong lá cây đu đủ gồm vitamin B1 (thiamin), vitamin B2 (riboflavin)

và vitamin C (acid ascorbic) [18]

- Một coumarin đã được xác định cấu trúc có mặt trong lá cây đu đủ đó là dimethoxycoumarin [26]

5,7 Prunasin, sambunigrin [72], [76] và tetraphyllin B [76] là 3 glycosid cyanogenic

đã được phân lập từ lá cây đu đủ

- Các acid hữu cơ của lá cây đu đủ đã được phân lập và xác định cấu trúc bao gồm:

acid protocatechuic, acid p-coumaric, acid caffeic, acid chlorogenic [26]

- Hai flavonoid là quercetin (1) và kaempferol (2) được xác định là thành phần của lá cây đu đủ [26] Ngoài ra, manghaslin (3), clitorin (4), rutin (5), nicotilorin (6) cũng đã được Julianti và cộng sự phân lập từ dịch chiết MeOH lá cây đu đủ

[48]

5

O

O OH

OH

O

H

OH OH

1

O

O OH

OH

O H

OH

2

O

O OH

O

O

H

OH OH

OH

OH OH

OH OH

OH

CH3O

O H

O H

OH O O

O

OH

OH

O H

O O

OH OH

CH3

4

O O

OH OH

OH

CH3O

OH OH

CH3

5

OH O

C

H3O H

O O

O

OH

OH

O H

O O

OH OH OH

OH

6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của một số flavonoid được phân lập từ lá cây đu đủ

- Các alcaloid đã được phân lập từ lá cây đu đủ là acid carpamic (7) [8], [48], methyl carpamat (8) [48], carpain (9) [20], [21], [22], [24], [25], [34], [39], [48], [49], [59], [87], [90], pseudocarpain (10) [39], [48], dehydrocarpain I (11), dehydrocarpain II (12) [82], carpainon (13) [5], cholin [59]

5 4 3

N H

12 11

O H

C

H3

7 6

5 4 3

12'

14'

13'

6' 8'

7'

3'

5' 4'

2'

1'

13 12

6 5

4

7

9 8

12'

14' 13'

6' 8'

7'

3'

5' 4'

2'

1'

13 12

6 5

4

7

9 8

12'

14' 13'

6' 8'

7'

3'

5' 4'

2'

1'

13 12

6 5

4

7

9 8

N H

10 9 8

13

NH

11' 9'

12'

14'

13'

6' 8'

7'

3'

5' 4'

2'

1'

13 12

6 5

4

7

9 8

11

7

Carpain (9) là alcaloid chính có trong lá cây đu đủ và là alcaloid đầu tiên được phân

lập từ lá cây đu đủ bởi Greshoff vào năm 1890 [25], [37] Alcaloid này cũng được tìm thấy trong một số loài khác của họ Caricaceae và một số loài thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) [25] Phải mất đến 75 năm sau khi lần đầu tiên được phân lập, cấu trúc đầy đủ của carpain mới được Coke và Rice xác định vào năm 1965 [25], [27] Công thức phân tử của nó là C28H50N2O4, chứa 2 nhân piperidin (có nhóm thế ở vị trị số 2, số

3 và số 6 so với nguyên tử N) được gắn với nhau nhờ liên kết ester Carpain cũng được cho là có hàm lượng cao nhất trong số các alcaloid có trong lá cây đu đủ, nằm trong khoảng từ 0,011 – 3,7 % [19], [20], [21], [24], [39], [42], [49], [59], [65]

Sau carpain, các dẫn chất của chất này cũng đã được phân lập từ lá cây đu đủ, như

pseudocarpain (10), một đồng phân quang học của carpain (9) [39], dehydrocarpain I (11) và dehydrocarpain II (12) [82] Đặc biệt, trái với hầu hết các ý kiến cho rằng carpain

là alcaloid có hàm lượng cao nhất trong lá cây đu đủ, kết quả nghiên cứu của Tang và cộng sự trên giống cây đu đủ ở đảo Hawai cho thấy, hàm lượng của dehydrocarpain I và

II còn cao hơn cả carpain [82] Gần đây, một alcaloid mới đã được phân lập từ lá cây đu

đủ bởi Hồ Thị Hà và cộng sự vào năm 2014 và được đặt tên là carpainon (13) [5]

1.1.5 Công dụng và tác dụng dược lý

1.1.5.1 Theo kinh nghiệm dân gian

Lá đu đủ được sử dụng làm thuốc chữa nhiều bệnh theo y học dân gian của nhiều nơi trên thế giới Nước sắc lá đu đủ được sử dụng phổ biến ở quần đảo Papua và Maluku, Indonesia để dự phòng và điều trị sốt rét [48] Ở Ấn Độ, một số quốc gia Nam Mỹ và châu Phi, việc sử dụng lá đu đủ để điều trị sốt rét cũng được ghi nhận [17], [51], [77], [85] Bên cạnh điều trị sốt rét, người dân Indonesia còn sử dụng lá đu đủ để tăng tiết sữa cho phụ nữ mới sinh, trừ giun, kích thích tiêu hóa và để hạ sốt [48], [84] Ở Inbolnd và Ghana, phần chuyển màu đỏ, vàng của lá đu đủ khô được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa [40] Một số nước châu Á như Sri Lanka dùng lá đu đủ để điều trị sốt xuất huyết Dengue [15], [30]

1.1.5.2 Theo y học hiện đại

Từ những kinh ngiệm dân gian về sử dụng lá đu đủ chữa nhiều bệnh khác nhau, các nghiên cứu đã được thực hiện và cho thấy lá đu đủ có những tác dụng dược lý sau đây:

8

❖ Kháng khuẩn và kháng virus

Tác dụng điều trị sốt xuất huyết và làm tăng tiểu cầu của lá đu đủ đã được ghi nhận

ở nhiều nghiên cứu Hỗn dịch của bột lá đu đủ trong dầu cọ cho thấy có tác dụng làm tăng tiểu cầu trên chuột nhắt trắng sau khi uống so với nhóm chứng được cho uống dầu

cọ và nước muối sinh lý [71] Hơn thế nữa, tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá đu đủ cũng đã được chứng minh trên một số mô hình dược lý gây giảm tiểu cầu trên chuột với các tác nhân khác nhau như: mô hình gây giảm tiểu cầu trên chuột cống bằng cyclophosphamid [63], hydroxyurea [36], busulfan [90] hay mô hình giảm tiểu cầu trên chuột nhắt trắng bị ức chế tủy xương bằng carboplatin [80] Bên cạnh đó, một số báo cáo ca đơn lẻ cho thấy có sự tăng tiểu cầu ở bệnh nhân mắc sốt xuất huyết Dengue sau khi được uống dịch chiết lá đu đủ [16], [75] Một số nghiên cứu lâm sàng về tác dụng điều trị sốt xuất huyết của lá cây đu đủ cũng đã được thực hiện Yunita và cộng sự đã đánh giá tác dụng của viên nang mềm chứa cao lá đu đủ trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên gồm 80 bệnh nhân với một nửa số bệnh nhân trong số này được sử dụng viên nang cao lá đu đủ Kết quả cho thấy, có sự tăng tiểu cầu rõ rệt đồng thời giảm thời gian nhập viện ở nhóm bệnh nhân được dùng thuốc so với nhóm đối chiếu [89] Một thử nghiệm lâm sàng khác được thực hiện bởi Subenthiran và cộng sự ở Malaysia, đánh giá tác dụng của nước ép lá đu đủ tươi trên 228 bệnh nhân mắc sốt xuất huyết cũng cho kết quả tương tự [78] Có một số ý kiến về nhóm chất trong lá đu đủ liên quan đến tác dụng điều trị sốt xuất huyết, chống giảm tiểu cầu Theo nghiên cứu của Zunjar và cộng sự thì alcaloid là nhóm chất chính liên quan đến tác dụng này Cũng theo nghiên cứu này, tác dụng chống giảm tiểu cầu có thể liên quan đến carpain, alcaloid chính có trong lá đu đủ Một nghiên cứu khác sử dụng công cụ Tin sinh học (bioinformatics tools) cho rằng flavonoid và một số hợp chất phenolic cũng có tác dụng kháng virus Dengue Cụ thể, quercetin có khả năng gắn tốt với một phức hợp enzyme có tên là NS2B-NS3, phức hợp enzym có vai trò quan trọng đối với sự nhân lên của virus [73]

Bên cạnh tác dụng kháng virus, tác dụng kháng nhiều loại vi khuẩn của cây đu đủ cũng đã được ghi nhận Một nghiên cứu được thực hiện ở Cameroon cho thấy dịch chiết methanol của một bài thuốc có chứa rễ cây đu đủ có khả năng ức chế vi khuẩn thương hàn hiệu quả với khoảng nồng độ ức chế tối thiểu MIC 0,02 – 0,06 mg/ml [55] Một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng dịch chiết quả và hạt của quả đu đủ có tác dụng kháng

9

khuẩn tốt trên các vi khuẩn như Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa và Shigella flexneri Cũng theo nghiên cứu này, dịch

chiết lá có tác dụng kháng khuẩn không tốt [32]

❖ Diệt ký sinh trùng

Nước sắc lá cây đu đủ được dùng theo kinh nghiệm dân gian để phòng và điều trị sốt rét ở Indonesia và một số nước châu Phi, đồng thời dịch chiết cồn và dịch chiết nước

lá cây đu đủ đều đã được chứng minh có tác dụng điều trị sốt rét trên mô hình in vivo

[48], [60] Năm 2014, Julanti và cộng sự đã công bố rằng có liên quan giữa tác dụng điều trị sốt rét và các alcaloid có trong lá đu đủ Trong các alcaloid này, nhóm nghiên

cứu cho rằng carpain có hoạt tính cao và chọn lọc trên mô hình in vitro Tuy nhiên, tác dụng của chất này trên mô hình in vivo lại không rõ ràng [48]

Một nghiên cứu gần đây cho thấy thân và lá cây đu đủ có hoạt tính trừ giun sán và

có thể sẽ là một loại thuốc tiềm năng bởi vì lợi ích về chi phí và tính sẵn có của nó

Nghiên cứu được thực hiện trên loài giun đất Ấn Độ trưởng thành (Pheretima

posthuman) Các dịch chiết của các dung môi khác nhau (cloroform, cồn…) ở các nồng

độ khác nhau (1 %; 2,5 %; 5 %) được đánh giá tác dụng thông qua các chỉ số về thời gian gây bất động, thời gian gây chết Kết quả cho thấy, khi tăng dần nồng độ dịch chiết cồn thì thời gian gây chết giảm dần và dịch chiết cồn có hiệu quả cao hơn so với dịch chiết cloroform và thuốc đối chiếu là albendazol [67]

❖ Tác dụng kháng ung thư

Tác dụng chống ung thư của lá cây đu đủ được thể hiện qua một vài báo cáo ca và

một số thử nghiệm in vitro Tuy nhiên chưa có thử nghiệm in vivo hay thử nghiệm lâm

sàng nào được thực hiện để đánh giá tác dụng chống ung thư của lá đu đủ

Các báo cáo ca tuy chưa có thông tin đầy đủ, nhưng việc kéo dài thời gian sống đã được quan sát thấy trên 5 bệnh nhân ung thư phổi, 3 bệnh nhân ung thư dạ dày, 3 bệnh nhân ung thư vú, 1 bệnh nhân ung thư tụy, 1 bệnh nhân ung thư gan và 1 bệnh nhân ung thư máu sau khi uống dịch chiết lá đu đủ [57]

Một số thử nghiệm in vitro đánh giá tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác

nhau của dịch chiết lá đu đủ đã được thực hiện Nghiên cứu của Morimoto và cộng sự cho thấy tác dụng kháng tế bào ung thư phụ thuộc nồng độ của dịch chiết nước lá đu đủ

10

trên nhiều dòng tế bào ung thư như ung thư vú, ung thu tử cung, ung thư dạ dày… [52] Khả năng kháng tế bào ung thư của dịch chiết nước lá đu đủ cũng được chứng minh trên

mô hình in vitro trong nghiên cứu của Noriko và cộng sự [61] Trong khi đó, Nguyen

T.T Thao và cộng sự không chỉ chứng minh tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư da của dịch chiết cồn và nước trong môi trường acid của lá cây đu đủ mà còn bằng phương pháp UHPLC-ToF-MS để chỉ ra rằng các flavonoid có phần aglycon là kaempferol và quercetin có thể là nhóm hoạt chất chính cho tác dụng này [56]

có tác dụng làm tăng sản xuất tiểu cầu, đặc biệt ở liều 300 mg/kg Trong 3 dịch chiết được nghiên cứu, dịch chiết quả làm tăng tiểu cầu nhiều nhất Tác dụng này giảm dần ở dịch chiết lá và dịch chiết hạt [43]

❖ Tác dụng chống tăng đường huyết

Một số nghiên cứu về tác dụng chống tăng đường huyết, điều trị đái tháo đường của

lá cây đu đủ đã được công bố Đánh giá tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết ở chuột cống trắng bằng streptozotocin của cắn thu được từ dịch chiết cloroform lá đu đủ, Juárez-Rojop và cộng sự đã ghi nhận tác dụng hạ glucose, triglycerid

và transaminase trong máu động vật thực nghiệm [47] Cũng trên mô hình tương tự, nghiên cứu được thực hiện bởi Sasidharan và công sự cho thấy dịch chiết cồn lá cây đu

đủ có tác dụng hạ glucose máu, tăng tái tạo tế bào β đảo tụy, giảm tỷ lệ mỡ ở gan trên nhóm chuột bị gây đái tháo đường so với nhóm chứng [69] Không những thế, dịch chiết

lá đu đủ còn được chứng minh giúp cải thiện tác dụng của một số thuốc điều trị đái tháo

11

đường Cụ thể là, dịch chiết lá đu đủ làm kéo dài thời gian khởi phát tác dụng hạ đường huyết của glimepirid và tăng tác dụng hạ đường huyết của metformin [33]

Tuy nhiên, vẫn chưa có ý kiến thống nhất về hợp chất hay nhóm hợp chất nào trong

lá đu đủ đóng vai trò chính đối với tác dụng chống tăng đường huyết Trong khi Rojop và cộng sự cho rằng các steroid đóng vai trò chính [47], thì flavonoid, alcaloid, saponin và tannin mới là các nhóm chất được Sasidharan và cộng sự kiến nghị [69]

Juárez-❖ Tác dụng chống oxy hóa

Sử dụng phương pháp 2,2-Diphenyl-1-Picryl-Hydrazyl (DPPH), Indran và cộng sự

đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa mạnh của dịch chiết nước lá đu đủ, với giá trị

IC50 = 60,2 µg/ml [45] Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cồn lá cây đu đủ cũng được ghi nhận bởi một nghiên cứu khác thực hiện bởi Sagnia và cộng sự [68] Các hợp chất nhóm flavonoid, vitamin A và C được cho là đóng vai trò chính cho tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết lá cây đu đủ [44]

❖ Kháng nấm

Theo một nghiên cứu ở Ấn Độ, lá cây đu đủ có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng nấm Dịch chiết cồn của lá, hạt (của quả chín và quả xanh) cây đu đủ

được đánh giá hiệu quả kháng nấm trên 3 chủng nấm gây bệnh Rhizopus stolonifer,

Fusarium spp và Colletotrichum gloeosporioides Kết quả cho thấy, dịch chiết lá có tác

dụng kháng nấm tốt nhất với IC50 đối với Fusarium spp là 0,625 mg/ml và trên 10 mg/ml đối với Colletotrichum gloeosporioides [29]

❖ Tác dụng chống viêm

Tác dụng chống viêm của lá cây đu đủ đã được công bố bởi Owoyele và cộng sự Kết quả của nhóm nghiên cứu cho thấy, dịch chiết có tác dụng giảm viêm rõ rệt trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan Đồng thời, trên mô hình gây u hạt thực nghiệm cũng có sự giảm rõ rệt số u hạt được tạo thành, từ 0,58 ± 0,07 g xuống còn 0,22

± 0,03 g Dịch chiết cũng giảm rõ rệt sự phù nề từ ngày theo dõi thứ 4 đến ngày theo dõi thứ 10 trên mô hình gây viêm khớp bằng formaldehyd [62]

12

❖ Tác dụng điều trị tăng huyết áp

Nghiên cứu của Girlandia và công sự đánh giá tác dụng chống tăng huyết áp của dịch chiết methanol lá đu đủ trên mô hình gây tăng huyết áp trên chuột cống bằng angiotensin I Kết quả cho thấy, tác dụng chống tăng huyết áp của dịch chiết methanol

lá đu đủ tương đương với enalapril [23]

❖ Tác dụng trên thần kinh trung ương

Tác dụng trên thần kinh trung ương của dịch chiết cồn lá đu đủ được Gupta và cộng

sự đánh giá trên chuột cống đực Dịch chiết (cao khô) ở liều ≥ 10 mg/kg tiêm màng bụng

đã gây tác dụng an thần phụ thuộc liều Liều ≥ 5 mg/kg có tác dụng làm giãn cơ Liều ≥

50 mg/kg bảo về hoàn toàn động vật khỏi cơn động kinh gây ra bởi pentylenetetrazol, trong khi liều 5 mg/kg chỉ cho tác dụng bảo vệ 50 % Với liều 100 – 200 mg/kg cho tác dụng bảo vệ 100 % khỏi cơn co giật do sốc điện [40]

❖ Tác dụng trên cơ trơn tử cung

Kết quả nghiên cứu của Teeratad chứng minh rằng carpain, alcaloid chính trong lá

đu đủ, có tác dụng gây giãn cơ trơn tử cung in vitro trên tử cung chuột cống cô lập [79]

1.1.6 Độc tính

Trong các tài liệu tham khảo về độc tính của lá cây đu đủ, đơn vị tính liều ở các nghiên cứu đều là khối lượng cao khô trên 1 kg khối lượng động vật thí nghiệm và động vật thí nghiệm đều là chuột cống, trừ nghiên cứu của Tarkang và cộng sự [83]

Về độc tính cấp của lá cây đu đủ, hầu hết các nghiên cứu không phát hiện thấy độc tính của dịch chiết lá cây đu đủ Halim và cộng sự đánh giá độc tính cấp của dịch chiết nước lá đu đủ cho tới mức liều 2000 mg/kg chuột bằng đường uống và không quan sát thấy chuột chết ở mức liều này [41] Theo 2 nghiên cứu khác, đánh giá độc tính cấp của dịch chiết cồn 80 % hoặc dịch chiết nước lá đu đủ ở mức liều cao hơn là 5000 mg/kg theo đường uống nhưng vẫn chưa phát hiện được liều gây chết LD50 [28], [83] Trong khi đó, nghiên cứu của Biu và cộng sự cho thấy LD50 của dịch chiết nước lá đu đủ chỉ

là 600 mg/kg chuột Tuy nhiên, đường dùng của nghiên cứu này lại khác so với các nghiên cứu vừa đề cập ở trên là tiêm màng bụng [22]

Đánh giá độc tính bán cấp của dịch chiết nước lá đu đủ trong 14 ngày theo đường uống, hai nhóm nghiên cứu của Charles và Afzan đều không quan sát thấy chuột chết ở

HDL-đủ lên cơ quan sinh sản của động vật thí nghiệm như giảm rõ rệt số lượng, khả năng di chuyển và sống sót của tinh trùng, giảm nồng độ testosteron [28]

Nghiên cứu của Ismail và cộng sự đánh giá độc tính bán trường diễn của dịch chiết nước lá đu đủ kết luận rằng dịch chiết nước lá đu đủ không gây ra bất kỳ độc tính nghiêm trọng nào trên chuột cống khi được uống trong 13 tuần liên tục ở liều cao Mức liều tối

đa được nghiên cứu là 2000 mg/kg Kết quả cụ thể cho thấy, sử dụng dịch chiết nước trong thời gian 13 tuần không gây chết, thay đổi bất thường về hành vi, khối lượng cơ thể cũng như sự tiêu thụ thức ăn, nước uống của động vật thí nghiệm [46]

1.1.7 Các nghiên cứu về lá đu đủ ở Việt Nam

Năm 1983, Đặng Hồng Vân và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc carpain từ

lá cây đu đủ [13]

Năm 1993, có 2 nghiên cứu về lá đu đủ được công bố Nghiên thứ nhất đã phân chia được 8 thành phần từ phân đoạn n-hexan (mang bản chất alcaloid) và 9 thành phần từ phân đoạn ethyl acetat (mang bản chất flavonoid) bằng phương pháp sắc ký cột Đồng thời, kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cho thấy cả 2 phân đoạn này đều có tác dụng kìm hãm hoạt động peroxidase trong máu người [1] Nghiên cứu còn lại phân lập

và xác định cấu trúc acid carpamic từ lá đu đủ [8]

Phân đoạn flavonoid từ dịch chiết lá đu đủ đã được đánh giá một số tác dụng sinh học bởi một nghiên cứu vào năm 1994 Nghiên cứu này chỉ ra rằng phân đoạn flavonoid

lá đu đủ có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt tế bào ung thư biểu mô người một cách chọn lọc, kích thích miễn dịch và có tác dụng kháng khuẩn tốt đối với một số chủng vi khuẩn

và nấm gây bệnh [11]

Năm 2014, một alcaloid mới đã được phân lập từ lá cây đu đủ bởi Hồ Thị Hà và cộng sự và được đặt tên là carpainon Hợp chất này đã được thử hoạt tính gây độc tế bào

14

trên một số dòng tế bào ung thư, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính chống oxy hóa, nhưng rất tiếc là hoạt chất không thể hiện hoạt tính trong các thử nghiệm được thực hiện [5]

Gần đây nhất, vào năm 2017, Đỗ Thị Hoa Viên và cộng sự cũng phân lập được carpain từ lá đu đủ Đồng thời, nghiên cứu này cũng xây dựng phương pháp định lượng carpain trong lá đu đủ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tuy nhiên, phương pháp định lượng này lại chưa được thẩm định [31]

15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

￭ Mẫu nghiên cứu:

Lá của cây đu đủ được thu hái ở 3 vùng: Hà Nội (tại Yên Sở, quận Hoàng Mai, tháng 11/2017), Thanh Hóa (tại huyện Hoằng Hóa, tháng 2/2018) và Thái Bình (tại huyện Vũ

Thư, tháng 3/2018) Mẫu thu hái ở Hà Nội được giám định tên khoa học là Carica

papaya L (tiêu bản số HNIP/18521/18)

Nguyên liệu sau khi làm sạch, cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ không quá 60 oC, nghiền thành bột và được bảo quản trong túi nilon kín Ba mẫu dược liệu được thu hái ở Hà Nội, Thanh Hóa và Thái Bình lần lượt được ký hiệu là HN, TH và TB

Hình 2.1 Cây đu đủ (Carica papaya L.)

2.1.2 Các trang thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất và dụng cụ

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích

- Hóa chất: amoniac đặc, natri sulfat khan, các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và thuốc thử hiện màu cho sắc ký lớp mỏng (thuốc thử Dragendorff)

- Dung môi hữu cơ: dicloromethan, ethanol, methanol, n-hexan đạt tiêu chuẩn phân tích

- Silica gel 60, kích thước hạt 40 – 63 µm của hãng MERCK (Đức)

- Bản mỏng tráng sẵn TLC silica gel 60 F254 của hãng MERCK (Đức)

- Dụng cụ: các dụng cụ thí nghiệm thường quy (vải lọc, bông, giấy lọc, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, pitpet…), các dụng cụ thí nghiệm khác (mao quản, bình khai triển sắc ký…)

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu thử

2.1.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Tủ sấy MEMMERT (Đức)

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Bể siêu âm Wisd (Trung Quốc)

- Máy cất quay Buchi ROTAVAPOR R-200 (Thụy Sỹ)

- Cân xác định hàm ẩm OHAUS (Trung Quốc)

- Lò nung Nabertherm (Đức)

- Bếp đun cách thủy MEMMERT (Đức)

17

- Hệ thống HPTLC CAMAG gồm hệ thống chấm sắc ký tự động Linomat V, bình khai triển tự động ADC2, buồng chụp sắc ký Visualizer, máy vi tính với phần mềm VisionCat (Thụy Sỹ)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AscendTM 500 (Mỹ) để ghi phổ 1H-NMR,

13C-NMR và DEPT đặt tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy khối phổ LTQ Obitrap XLTM (Mỹ) để ghi phổ MS đặt tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được hai mục tiêu của đề tài là xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ và đánh giá độc tính cấp của cao khô lá đu đủ, nội dung nghiên cứu gồm những bước sau đây:

2.2.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ

- Thu mẫu và đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của các mẫu thu hái

- Phân lập carpain từ lá cây đu đủ

- Điều chế cao khô từ dịch chiết nước của 3 mẫu thu hái

- Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ điều chế được với các chỉ tiêu: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

2.2.2 Đánh giá độc tính cấp của cao khô lá đu đủ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu và đánh giá mẫu thu hái

Mẫu dược liệu là vấn đề quan trọng đầu tiên cần được tuân thủ chặt chẽ khi tiến hành khảo sát và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu và chế phẩm từ dược liệu Trong đề tài này, 3 mẫu lá đu đủ được thu hái từ 3 vùng khác nhau (Hà Nội, Thanh Hóa, Thái Bình) Các mẫu dược liệu được đánh giá thông qua định tính sơ bộ thành phần hóa học theo phương pháp có trong các tài liệu tham khảo [9], [10] và bằng sắc ký lớp mỏng

18

2.3.1.2 Phân lập carpain

Bột dược liệu ban đầu được loại tạp bằng h-hexan để loại chất béo, sắc tố màu và các hợp chất không phân cực khác Loại bỏ dung môi, làm khô tự nhiên sau đó chiết bằng n-hexan trong môi trường kiềm Gạn lấy dịch chiết, lọc và thu hồi dung môi để lấy cắn

Phân lập bằng kỹ thuật sắc ký cột mở, pha tĩnh là silica gel Hệ dung môi pha động được lựa chọn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Kiểm tra và dồn các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, thuốc thử hiện màu Dragendorff Kiểm tra mức độ tinh khiết bằng sắc

ký lớp mỏng thu được hợp chất CNPD 3 (22,2 mg) (sơ đồ hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình chiết xuất và phân lập carpain từ lá đu đủ

Bột lá (100 g)

Bột lá đã loại tạp

600 ml x 3 lần n-hexan

Bột lá kiềm hóa

Chiết siêu âm 3 lần

Thu hồi dung môi n-hexan

thu hồi

CH 2 Cl 2 tối thiểu Hòa tan

Kiểm tra và dồn các phân đoạn bằng SKLM, TT Dragendorff

Phân lập và tinh chế

Kỹ thuật SKC mở

19

Cấu trúc của hợp chất CNPD 3 đươc nhận dạng dựa trên các dữ liệu phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), so sánh với các dữ liệu phổ carpain đã công bố

2.3.1.3 Điều chế cao khô lá đu đủ

Cân 100 g bột dược liệu, thêm 800 ml nước và đun sôi trong thời gian 1 giờ Lọc thu dịch chiết qua vải Lặp lại quá trình chiết 2 lần, mỗi lần đun sôi 30 phút Gộp dịch chiết thu được, để lắng và lọc lại qua giấy lọc Dịch lọc cô trên dụng cụ có đáy rộng để thu được cao đặc, rồi sấy 24 giờ trong tủ sấy có thông khí ở nhiệt độ 60 oC Nghiền và trộn đều thành bột, đóng gói trong túi PE có mép kín, ghi nhãn và bảo quản trong ngăn mát

tủ lạnh Phần trăm cao thu được tính theo công thức:

𝑚𝑑𝑙 × (1 − 𝐴𝑑𝑙)× 100

Trong đó: H (%): phần trăm cao thu được từ dược liệu

mc (g): khối lượng cao thu được

m dl (g): khối lượng dược liệu

Adl (%): độ ẩm dược liệu

2.3.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ

Xây dựng tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ dựa trên các dữ liệu thu được khi phân tích các chỉ tiêu: cảm quan, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

❖ Cảm quan

Mô tả các mẫu cao khô lá đu đủ về thể chất, màu sắc, mùi, vị

❖ Chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô (phụ lục 9.6 DĐVN IV)

Cân chính xác khoảng 0,5 g cao khô lá đu đủ và tiến hành như phụ lục 9.6 (DĐVN IV) bằng phương pháp sấy đến đến khối lượng không đổi [7] Mỗi mẫu cao xác định 3 lần

20

❖ Chỉ tiêu tro toàn phần (phụ lục 9.8 DĐVN IV)

Cân chính xác khoảng 1 g cao khô lá đu đủ và tiến hành theo phương pháp 2, ghi trong phụ lục 9.8 (DĐVN IV) [7] Mỗi mẫu cao xác định 3 lần

Tro toàn phần tính trên dược liệu khô kiệt theo công thức sau:

𝑋 (%) = (𝑎 − 𝑏)

𝑐 × (1 − 𝐴)× 100 Trong đó: X (%): độ tro toàn phần

a (g): khối lượng chén có tro

b (g): khối lượng chén cân

c (g): khối lượng cao đu đủ

A (%): độ ẩm cao đu đủ

❖ Chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học

Kết quả định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học cho thấy trong các mẫu lá cây đu đủ thu được dương tính với các phản ứng định tính các nhóm chất alcaloid, flavonoid, tannin, acid hữu cơ, trong đó 2 nhóm chất cho phản ứng dương tính rõ nhất là flavonoid

và alcaloid Kiểm soát sự có mặt của 2 nhóm chất này trong các mẫu cao khô thu được bằng các phản ứng hóa học:

￭ Định tính flavonoid: bằng các phản ứng cyanidin, với dung dịch NaOH 10 % và với dung dịch FeCl3 5 % Cách tiến hành cụ thể như sau:

Cân khoảng 1 g cao khô lá đu đủ Thêm 15 ml ethyl acetat, rồi chiết siêu âm trong

15 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp thu dịch lọc Chia dịch lọc vào 3 ống nghiệm nhỏ Đun cách thủy để bay hết dung môi trong ống nghiệm rồi thêm vào mỗi ống nghiệm khoảng 1 ml ethanol 90 %

- Ống nghiệm thứ nhất: Thêm một ít bột Mg kim loại rồi nhỏ từng giọt HCl đặc

- Ống nghiệm thứ hai: Nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10 %

- Ống nghiệm thứ ba: Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5 %

CH2Cl2, lắc nhẹ khoảng 5 phút rồi để yên cho tách lớp Gạn lấy lớp dưới, loại nước bằng

Na2SO4 khan, rồi chia vào 3 ống nghiệm nhỏ Đun cách thủy để bay hơi hết dung môi trong ống nghiệm Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch H2SO4 1 %

- Ống nghiệm thứ nhất: Nhỏ 1 giọt TT Bouchardat

- Ống nghiệm thứ hai: Nhỏ 1 giọt TT Mayer

- Ống nghiệm thứ ba: Nhỏ 1 giọt TT Dragendorff

❖ Chỉ tiêu định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Toàn bộ quá trình thực hiện sắc ký từ đưa mẫu lên bản mỏng, khai triển, hiện vết và chụp ảnh đều được thực hiện tự động trên hệ thống HPTLC

- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân khoảng 0,5 g mỗi mẫu cao khô lá đu đủ Hòa tan trong

10 ml nước cất, rồi chuyển dịch hòa tan vào bình gạn Kiềm hóa bằng dung dịch amoniac đặc đến pH 8 – 9 Thêm 10 ml CH2Cl2, lắc nhẹ khoảng 5 phút rồi để yên cho tách lớp Gạn lấy lớp dưới, loại nước bằng Na2SO4 khan, rồi đun cách thủy để bay hơi hết dung môi Ngay trước khi đưa lên bản mỏng, hòa tan cắn với 0,5 ml CH2Cl2

- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu: Dung dịch carpain trong CH2Cl2 nồng độ 1 mg/ml

- Chuẩn bị bản mỏng: Bản nhôm tráng sẵn silica gel GF254 kích thước 75 x 100 mm

- Hệ dung môi pha động: Dicloromethan – methanol – amoniac (20:1,5:0,1 V/V/V)

- Đưa mẫu lên bản mỏng: chấm dải 8 mm, 5 µl đối với cả mẫu thử và chất đối chiếu

Riêng đối với mẫu CTH, chấm thêm 1 dải với thể tích 40 µl Khoảng cách giữa các dải là 12 mm

- Khai triển: 70 mm

- Làm khô: trong không khí

- Phương pháp hiện vết: Nhúng với TT Dragendorff Quan sát ở ánh sáng thường

2.3.2 Đánh giá độc tính cấp cao khô lá đu đủ

Phương pháp thử độc tính cấp theo Đỗ Trung Đàm, hướng dẫn của Bộ Y tế và OECD [3], [4], [58]

Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại, uống nước bình thường

Động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và

lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật

Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau khi uống chế phẩm thử lần cuối)

2.3.2.2 Theo dõi, đánh giá

Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu…

Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

Số động vật chết: xác định tỉ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính toán

LD50

Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu có dấu hiệu đáng nghi ngờ mà không xác định được rõ nguyên nhân, cần làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

Tiếp tục theo dõi động vật cho đến 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử

2.3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Xác định LD50 (nếu có) bằng phương pháp phân tích hồi qui probit trên phần mềm SPSS

23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu cho tiêu chuẩn cao khô lá đu đủ

3.1.1 Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học mẫu thu hái

3.1.1.1 Định tính bằng phản ứng hóa học

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học mẫu thu hái như bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá đu đủ

3.1.2 Phân lập carpain

Hợp chất CNPD 3 phân lập được dạng tinh thể màu vàng nhạt, dương tính với phản ứng Dragendorff Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, thuốc thử Dragendorff trên 3 hệ dung môi khác nhau cho thấy CNPD 3 tương đối sạch, chỉ có 1 vết (hình 3.2) Phổ khối ESI-MS cho m/z ở 479,43 [M+H]+, khối lượng phân tử M = 478 tương ứng với công thức phân tử C28H50O4N2

Phổ 13C-NMR, DEPT135 cho thấy có 14 tín hiệu carbon, trong đó 1 nhóm carbon bậc 4 (δC 173,4); 9 nhóm CH2 (độ dịch chuyển trong khoảng δC 22 – 40 ppm); 3 nhóm

CH (δC 69,3; 56,5 và 54,0) và 1 nhóm CH3 (δC 14,1) Tại độ dịch chuyển δC 173,4 đặc trưng cho nhóm chức –COOH; độ dịch chuyển δC 69,3 thể hiện liên kết với nhóm hydroxyl Do trong công thức phân tử có số carbon là 28 nên có thể cho rằng hợp chất CNPD 3 là 2 phân tử gắn với nhau

Phổ 1H-NMR cho cho thấy có 1 pic proton của CH3 tại độ dịch chuyển tại δH 1,08

(3H; d; J = 6,5 Hz); 1 pic proton của CHOH tại độ dịch chuyển δH 4,82 (1H, s); 2 pic proton của nhóm CH lần lượt tại δH 2,97 và 2,71 Các pic proton còn lại của nhóm CH2

tại độ dịch chuyển δH từ khoảng 1,1 đến 2,0 ppm

Dựa trên các dữ liệu của phổ khối, phổ cộng hưởng từ và so sánh với dữ liệu đã công

bố (bảng 3.2), kết luận hợp chất CNPD 3 là carpain - alcaloid phổ biến trong lá đu đủ (hình 3.3)

1 Chất đối chiếu carpain 2 Mẫu Hà Nội

Hình 3.2 Kiểm tra độ sạch của CNPD 3

Chú thích:

Hệ II: Toluen – ethyl acetat – methanol – amoniac (3:3:1,5:0,1)

Hệ III: n-Butanol – acid acetic – nước (4:1:5, lấy lớp trên)

12'

14' 13'

6' 8'

7'

3'

5' 4' 2'

1'

13 12

CH315'C

H315

O1O

3 2

6 5

4

7

9 8