Nghiên cứu xây dựng một số tiêu chuẩn và đánh giá tác dụng sinh học của bài thuốc phong đan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC THỊNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA BÀI THUỐC PHONG ĐAN LUẬN VĂN THẠC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC

CỦA BÀI THUỐC PHONG ĐAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC THỊNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ TIÊU CHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC

CỦA BÀI THUỐC PHONG ĐAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06

Người hướng dẫn khoa học: TS Đào Thị Thanh Hiền

TS Đỗ Thị Nguyệt Quế

HÀ NỘI 2014

Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới cô giáo TS ĐỖ THỊ NGUYỆT QUẾ và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược lực - Trường đại học Dược Hà

Nội đã giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành được nội dung về nghiên cứu tác dụng sinh học trong luận văn này

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cán bộ cùng các anh chị kỹ thuật viên tại Viện dược liệu đã tạo điều kiện và tận tình chỉ bảo giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tại viện

Xin gửi lời cảm ơn tới em sinh viên TRỊNH THỊ VÂN và các em sinh viên

khóa 64 làm đề tài tại bộ môn Dược học cổ truyền – trường đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình và toàn thể đồng nghiệp tại trường đại học Y Dược Thái Nguyên đã luôn ủng

hộ cổ vũ, động viên tôi trong trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 08 năm 2014

Học viên

Nguyễn Quốc Thịnh

1.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 15

1.2.3.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 16

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu 18

2.1.2 Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu 18

2.2.3 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc 19

2.2.3.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc 19 2.2.3.3 Kiểm tra sự có mặt của các vị thuốc bằng SKLM 19 2.2.3.4 Định lượng hàm lượng Z-ligustilid trong cao đặc bằng phương

pháp HPLC

19

2.2.5 Thử tác dụng sinh học đối với cao đặc bài thuốc 20

3.1 Nghiên cứu xây dựng một số tiêu chuẩn cao đặc từ dịch chiết

ethanol 70% của bài thuốc Phong đan

3.1.1 Đánh giá tính đúng của các vị thuốc trong bài thuốc 24

3.1.3 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc 41

3.1.3.2 Định tính một số nhóm chất chính trong cao đặc 43 3.1.3.3 Kiểm tra sự có mặt các vị thuốc trong cao bằng SKLM 45 3.1.3.4 Định lượng hàm lượng Z-ligustilid trong cao đặc bằng phương

pháp HPLC

51

3.2 Thử tác dụng sinh học của cao đặc bài thuốc Phong đan 56

3.2.3 Chống viêm cấp 59

4.1 Về xây dựng một số tiêu chuẩn cao đặc từ dịch chiết ethanol 70%

của bài thuốc Phong đan

63

4.1.1 Kiểm tra chất lượng các vị thuốc đầu vào của nghiên cứu 63

4.2 Về đánh giá tác dụng sinh học của cao đặc bài thuốc Phong đan 65

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

HPLC High performance liquid chromatography (Sắc

ký lỏng hiệu năng cao)

HPTLC High performance thin layer chromatography

(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1 - Tính khối lượng cao đặc thu được 39

2 Bảng 3.2 - Mất khối lượng do làm khô của bài thuốc được điều

chế từ 10 thang

41

3 Bảng 3.3 - Hàm lượng chất chiết được trong nước của cao thuốc 42

4 Bảng 3.4 - Tóm tắt kết quả định tính của cao đặc bài thuốc 43

5 Bảng 3.5 - Tóm tắt kết quả định tính sự có mặt của vị thuốc trong

cao bằng SKLM

47

6 Bảng 3.6 - Chương trình dung môi chạy HPLC 51

7 Bảng 3.7 - Diện tích píc của mẫu chuẩn Z-ligustilid 53

8 Bảng 3.8 - Hàm lượng Z-ligustilid trong các mẫu thử 55

9 Bảng 3.9 - Số chuột chết ở các lô trong vòng 72 giờ 57

10 Bảng 3.10 - Mô tả tình trạng chuột ở các lô trong vòng 7 ngày 57

11 Bảng 3.11 - Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau của cao bài

thuốc

58

12 Bảng 3.12 - Tác dụng chống viêm cấp của cao thuốc 60

13 Bảng 3.13 - Tác dụng chống viêm mạn của cao thuốc 62

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ STT Tên các hình vẽ, sơ đồ Trang

26 Hình 3.26 - Đặc điểm vi học bột Mã tiền chế 38

31 Hình 3.31 - SKĐ cao thuốc và Z-ligustilid chuẩn ở 366nm 49

32 Hình 3.32 - SKĐ Phòng phong và cao thuốc 50

33 Hình 3.33 - SKĐ Hoàng kỳ và cao thuốc 50

34 Hình 3.34 - SKĐ Bạch thược và cao thuốc 50

35 Hình 3.35 - SKĐ cao thuốc, chuẩn strychnin, brucin ở 254nm, và

phun TT

50

36 Hình 3.36 - Phổ UV của mẫu chuẩn Z-ligustilid 52

37 Hình 3.37 - SKĐ của mẫu chuẩn Z-ligustilid 52

39 Hình 3.39 - Đường chuẩn Z-ligustilid 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh phong thấp hay còn gọi là bệnh thấp khớp, viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp, thống phong, thống tý, thấp tý Bệnh thuộc phạm vi chứng tý của YHCT [13], [15] Tý có nghĩa là không thông “Thông bất thống, thống bất thông” Đau khớp là do khí huyết ở kinh lạc bị bế tắc không thông nên biểu hiện lâm sàng là đau ở một khớp hay nhiều khớp, đau có tính chất sưng nóng đỏ đau hoặc không có sưng nóng đỏ chỉ đau Bệnh hay gặp ở người cơ thể yếu đuối, khí huyết bất túc nên

tà khí như “phong”, “hàn”, “thấp”, “nhiệt” dễ dàng xâm nhập cơ nhục, khớp xương, làm tổn thương huyết mạnh và tâm, đưa đến sưng đỏ, đau nhức, nặng nề, tê bại trong cơ thể, các khớp xương, chân tay, Trong cuộc sống hiện đại tỉ lệ mắc bệnh phong thấp ngày càng gia tăng không chỉ ở người cao tuổi mà còn ở cả lứa tuổi trẻ

do lối sống ít vận động Theo đông y, một nguyên nhân hay gặp trong bệnh phong thấp là do can thận hư kết hợp với phong hàn thấp gây ra Vì vậy, để điều trị tận gốc căn bệnh này, ngoài tác dụng khu phong, trừ thấp, hoạt huyết thông kinh lạc thì quan trọng nhất là phải bổ can thận

Dựa trên nguyên lý điều trị của Y học cổ truyền là “khu phong trừ thấp, bổ huyết bổ can thận để trừ phong thấp” và tham khảo một số bài cổ phương điều trị phong thấp như Kiện bộ hổ hoàn, Độc hoạt kí sinh thang, thuốc phong bà Giằng [15], [21], [34], chúng tôi đã thiết kế bài thuốc “Phong đan” bao gồm những vị thuốc có tác dụng trừ phong thấp, hoạt huyết thông kinh, bổ can thận với mục đích điều trị bệnh phong thấp với hiệu lực cao và an toàn khi sử dụng lâu dài

Với mục đích trên, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu xây dựng một số tiêu chuẩn và đánh giá tác dụng sinh học của bài thuốc Phong đan” Với những mục tiêu cụ thể như sau:

+ Xây dựng một số tiêu chuẩn cao đặc từ dịch chiết ethanol 70% của bài thuốc

Phong đan

+ Đánh giá một số tác dụng sinh học của cao đặc bài thuốc Phong đan theo hướng chữa phong thấp

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về bệnh phong thấp

1.1.1 Theo quan điểm y học cổ truyền

1.1.1.1 Khái niệm

Phong thấp là bệnh để chỉ các chứng đau nhức hay tê mỏi liên quan đến bộ máy vận động của cơ thể như gân, cơ, xương khớp, bắp thịt, thần kinh vận động Có khi chỉ có cảm giác nặng nề, không có cảm giác đau nhức ở nơi cố định nào, có khi đau nhức chạy từ nơi này đến nơi khác, có khi vùng đau có sưng, nóng ở một nơi cố định… Thông thường thì vùng đau ở vai, thắt lưng, cổ tay, khuỷu tay, cổ gáy, các khớp ngón tay, khớp xương hông, đầu gối, cổ chân, bàn chân, các khớp ngón chân [40]

1.1.1.2 Dịch tễ

Bệnh phong thấp có tỷ lệ người mắc rất cao, chiếm khoảng 2/3 bệnh nhân về xương khớp trong năm nhất là các tháng trong mùa mưa lạnh Ở một số nước tỷ lệ mắc bệnh lên đến 10 - 20% Diện mắc có thể gặp ở mọi lứa tuổi, mọi giới, mọi nghề Người cao tuổi (trên 50 tuổi ) mắc bệnh nhiều hơn người trẻ tuổi Bệnh ít gây chết người nhưng gây ra tê nhức khó vận động, ảnh hưởng đến năng suất lao động

và chất lượng cuộc sống của người bị bệnh [24], [38]

1.1.1.3 Nguyên nhân và triệu chứng

Bệnh phát sinh do chính khí bất túc, tấu lí sơ hở nên ngoại tà như phong, hàn, thấp, nhiệt dễ dàng xâm nhập làm cơ nhục, gân cốt, kinh lạc bị trệ tắc, vận hành khí huyết bị rối loạn [3]

Phong hàn thấp nhiệt xâm nhập: Do bệnh nhân sống nơi ẩm thấp, khí hậu nóng lạnh thay đổi đột ngột nên phong, hàn, thấp nhân lúc cơ thể hư yếu mà xâm nhập, lưu trú ở kinh lạc, trệ tắc ở cơ khớp làm cho khí huyết ứ trệ gây nên chứng tý [3], [11] Gây nên đau nhức xương khớp dữ dội, đau có tính chất cố định, gặp lạnh đau tăng, nếu được ôn ấm thì đau giảm, kèm theo: co duỗi khớp khó khăn, da tại chỗ khớp đau không nóng, sắc da không bị hồng; chất lưỡi hồng nhạt, rêu lưỡi trắng mỏng nhớp, mạch huyền khẩn hoặc trầm trì huyền

Đàm và ứ giao kết, trệ tắc kinh lạc: Nếu chứng tý không được điều trị thích đáng hay do uống nhiều thuốc khứ phong hóa thấp hoặc ôn tán hàn thấp hoặc thanh nhiệt hóa thấp… làm hao thương khí huyết, tổn thương âm dịch gây khí trệ huyết ứ, đàm trọc trệ lạc, đàm và ứ kết hợp nên trệ tắc kinh lạc gây sưng nề các khớp, có thể gây biến dạng khớp, co duỗi khớp khó khăn Đây là chứng tý mãn tính điều trị khó khăn và kéo dài do chính khí cơ thể đã hư yếu

Chứng tý lâu ngày điều trị không khỏi lại cảm phải tà khí làm cho tà từ kinh lạc xâm nhập vào tạng phủ gây nên chứng bệnh cho tạng phủ [3], [11]

1.1.1.4 Điều trị

Theo “Trung y học khái luận”, về mặt chữa bệnh, bệnh này do ba tà khí phong, hàn, thấp cùng xâm nhập mà phát ra cho nên phép chữa trị chủ yếu là khu phong, tán hàn, trừ thấp nhưng lại cần xem xét thuộc về loại khí nào nặng hơn để chọn cách chữa khác nhau [54]

Lãn Ông đề ra “chữa phong nên bổ huyết, chữa hàn nên bổ hỏa, chữa thấp nên kiện tỳ, tuy dùng thuốc phong thấp nhưng nên dùng thuốc bổ huyết để khống chế không cho bệnh tà chủ yếu vào hai kinh can thận, bổ nguồn gốc của tinh huyết để tác dụng đến gân xương, vì đó là bên trong có hư gây nên” [43]

Có nhiều phương pháp để chữa phong thấp và thuốc điều trị bệnh này cũng rất dồi dào cả thuốc nam và thuốc bắc Nhưng nhìn chung phương pháp nào cũng phải:

- Bổ khí huyết để nâng thể trạng

- Khu phong, tán hàn, trừ thấp, thanh nhiệt, thông kinh hoạt lạc để chống viêm, giảm đau [38]

Tóm lại, khi chữa bệnh các phương pháp đều nhằm lưu thông khí huyết ở cân,

cơ xương, đưa tà khí (phong, hàn, thấp, nhiệt) ra ngoài, bồi bổ khí huyết, can, thận

để chống tái phát và chống thoái hóa khớp, biến dạng khớp, teo cơ, cứng khớp nhằm phục hồi chức năng của các khớp xương

1.1.2 Theo quan điểm y học hiện đại

1.1.2.1 Khái niệm

Trong YHHĐ, phong thấp là thuật ngữ chỉ những bệnh ảnh hưởng đến khớp xương và tổ chức mềm xung quanh nói chung (cơ, gân, màng khớp) bao gồm rất

nhiều bệnh có triệu chứng đau nhức tê mỏi ở bộ máy vận động như : Viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, viêm khớp mạn tính, viêm cột sống dính khớp, gout… Đây là những bệnh tự miễn, thuộc hệ miễn dịch của cơ thể [3], [36], [38]

Một số dạng phong thấp thường gặp như sau: Viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, thoát vị đĩa đệm, bệnh viêm cơ lưng mạn tính, đau thần kinh cổ cấp tính, bệnh gout, thấp tim, Lupus ban đỏ hệ thống

Theo GS Hoàng Bảo Châu thì chứng tý bao gồm các bệnh như: Viêm khớp dạng thấp, thấp khớp cấp, thống phong, viêm cột sống dính khớp, đau nhức cơ khớp [22]

Tóm lại, phong thấp là danh từ chỉ nhiều bệnh, nhiều chứng trạng không thống nhất về tên gọi giữa YHCT và YHHĐ Vì vậy cần xem xét kỹ trong chẩn đoán để điều trị nhiều đúng bệnh Sau đây là chi tiết hơn về một số dạng phong thấp trong YHHĐ

1.1.2.2 Phân loại và điều trị

 Viêm khớp dạng thấp

a Định nghĩa

Viêm khớp dạng thấp (Rheumatoid Arthritis – RA) là một bệnh tự miễn hệ thống gây viêm khớp mạn tính ở người lớn, biểu hiện bằng viêm không đặc hiệu màng hoạt dịch của nhiều khớp, diễn biến kéo dài, tăng dần, cuối cùng dẫn tới dính

và biến dạng khớp [19], [20]

RA có thể gặp ở mọi nơi trên thế giới, chiếm tỷ lệ 0,5 – 3% dân số (người lớn) Ở Việt Nam, RA chiếm 0,5% dân số và 20% bệnh nhân mắc bệnh khớp Bệnh hay gặp ở nữ (70 – 80%), trong độ tuổi trung niên (từ 35 đến 55 tuổi chiếm 80%) [19]

b Nguyên nhân

- Tác nhân khởi phát có thể do virus

- Yếu tố cơ địa: Bệnh thường gặp ở nữ, khởi phát ở lứa tuổi 25 – 55

- Yếu tô di truyền: RA hay xảy ra ở những người có gen HLA-DRB1, HLA-DR1 và HLA-DR4 Bệnh có tính gia đình [19], [20]

c Triệu chứng

Khởi phát bằng viêm một khớp (khớp cổ tay, khớp bàn tay, khớp ngón tay, khớp gối, khớp cổ chân….) với tính chất sưng đau rõ, cứng khớp vào buổi sáng Kéo dài vài tuần tới vài tháng sau đó chuyển sang giai đoạn toàn phát

Giai đoạn toàn phát biểu hiện viêm đa khớp Các khớp viêm tiến triển tăng dần

và nặng dần [19], [20]

d Điều trị

• Theo YHHĐ

- Các thuốc được ưu tiên sử dụng

+ Cloroquin, hydrocloroquin 200-400mg/ngày, phát huy tác dụng sau 3-6 tháng + Methotrexat 7,5-15mg/tuần, phát huy tác dụng sau 2-4 tuần điều trị Cần theo dõi

số lượng bạch cầu, men gan, chức năng hô hấp…

+ Thuốc chống viêm không steroid: Indomethacin, diclofenac, piroxicam…

+ Corticoid: Hiện nay có xu hướng chỉ định điều trị sớm và liều cao ngay từ khi mới phát hiện bệnh, kết hợp với các thuốc khác đến khi đạt hiệu quả thì giảm liều + Thuốc giảm đau: Tùy mức độ đau đều có thể sử dụng thuốc giảm đau ngoại biên hay thuốc giảm đau trung ương [19], [20]

• Theo YHCT

- Viêm khớp dạng thấp có đợt tiến triển cấp (phong thấp nhiệt tý)

Triệu chứng: Các khớp sưng, nóng, đỏ, đau (đối xứng), co duỗi, cử động khó khăn, sốt, ra mồ hôi, sợ gió, rêu lưỡi vàng mỏng, chất lưỡi đỏ, nước tiểu vàng, mạch hoạt sác

Điều trị: Khu phong, thanh nhiệt giải độc, hoạt huyết, lợi niệu trừ thấp

Cổ phương: Bạch hổ quế chi thang gia vị (gồm Thạch cao 40 g, Tri mẫu 12 g, Thương truật 8 g, Tang chi 12 g, Ngạch mễ 12 g, Quế chi 6 g, Hoàng bá 12 g, Kim ngân 20 g, Phong kỳ 12 g)

- Viêm khớp dạng thấp kéo dài có biến dạng, teo cơ, dính cứng khớp

Điều trị: Nếu còn sưng đau các khớp, khu phong, thanh nhiệt, trừ thấp, thêm các thuốc trừ đàm [20]

 Thoái hóa khớp

a Định nghĩa

Thoái hóa khớp là hiện tượng hư hỏng phần sụn đệm giữa hai đầu xương, kèm theo phản ứng viêm và hiện tượng giảm thiểu lượng dịch nhầy giúp bôi trơn điểm nối giữa hai đầu xương [20], [29]

c Điều trị

• Theo YHHĐ: Dùng các thuốc giảm đau chống viêm không steroid như aspirin, indomethacin, voltaren, meloxicam, felden, profenid [20]

• Theo YHCT [20], [29]

- Thể thận khí hư, vệ ngoại bất cổ, tà khí thừa cơ xâm nhập:

Triệu chứng: Đau nhức các khớp xương (lưng, gối), hạn chế vận động các khớp, mệt mỏi, thở ngắn, sợ lạnh, chi lạnh, tiểu tiện nhiều lần, lưỡi bè to, rêu lưỡi trắng mỏng, mạch trầm tế

Điều trị: Ích khí, bổ thận, khử tà, thông kinh lạc

Cổ phương: Bài thuốc Thận khí hoàn vị gia (Thục địa 320 g, Sơn thù 160 g, Bạch linh 120 g, Phụ tử chế 40 g, Đỗ trọng 120 g, Cẩu tích 120 g, Hoài sơn 160 g, Trạch tả 120 g, Đan bì 120 g, Quế chi 40 g, Tục đoạn 120 g, Cốt toái bổ 120 g)

- Thể can thận âm hư

Triệu chứng: Lưng, cổ, tứ chi đau mỏi, hạn chế vận động, chân tay tê bì, đau đầu âm ỉ, ù tai, hoa mắt, chóng mặt, ngủ ít, lưỡi hồng, rêu lưỡi mỏng, mạch huyền tê sác

Điều trị: Bổ can thận, thông kinh lạc

Cổ phương: Bài thuốc Lục vị địa hoàng hoàn gia vị (Thục địa 320 g, Sơn thù

160 g, Hoài sơn 160 g, Bạch linh, Tục đoạn, Cốt toái bổ, Trạch tả, Đan bì, Đỗ trọng, Đan sâm, Đương quy mỗi vị 120 g, Xuyên khung 40 g)

- Thể khí trệ huyết ứ:

Triệu chứng: Khớp xương đau nhức, không lan, hạn chế vận động, chân tay tê

bì, sưng nóng một số khớp ở tứ chi, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, chất lưỡi hồng, có điểm ứ huyết, rêu lưỡi mỏng, mạch trầm sáp

Điều trị: Hành khí hoạt huyết, thông kinh lạc

Cổ phương: Bài thuốc Tứ vật đào hồng gia giảm (Xuyên khung, Thục địa, Tục đoạn, Cốt toái bổ, Cẩu tích, Đương quy, Bạch thược, Đỗ trọng, Đan sâm mỗi vị 15

g, Đào nhân 8 g, Hồng hoa 8 g)

 Hội chứng Gout

a Định nghĩa

Là tình trạng một nhóm bệnh lý gồm nhiều thời kỳ viêm khớp tái đi tái lại, tương ứng với sự hiện diện của các tinh thể acid uric hoặc tinh thể muối urat ở trong dịch khớp Trong nhiều trường hợp có thể có sự tích tụ các tinh thể này ở ngoài khớp như ở trong thận, trong một số mô dưới da[20]

b Nguyên nhân

Do tăng lượng acid uric trong cơ thể: Tăng bẩm sinh do thiếu men HGPT, yếu

tố di truyền cơ địa, ăn nhiều thức ăn có chứa nhiều purin, uống nhiều rượu, giảm thải acid uric qua thận do viêm thận mạn tính hoặc suy thận làm acid uric ứ lại gây bệnh [20]

c Điều trị

• Theo YHHĐ: Điều trị cơn gout cấp thường dùng colchicin ở liều tấn công Có thể dùng phenylbutazon hoặc indocid để tăng thải acid Ngừa tái phát có thể dùng colchicin liều thấp và dùng các thuốc probenecid, allopurinol, hoặc sulfinpyrazon để tăng sự thải acid uric[20]

• Theo YHCT

- Gout nguyên phát: Với triệu chứng đau dữ dội ở một khớp trời lạnh đau tăng lên, đêm đau nhiều không ngủ được

Điều trị: Tán hàn, khu phong, trừ thấp, và hành khí hoạt khuyết Dùng bài thuốc Ô đầu thang gia giảm (Phụ tử chế 8g, Ma hoàng 12g, Bạch thược 12g, Hoàng

kỳ 12g, Phục linh 12g, Cam thảo 8g) [20]

- Gout thứ phát: Tùy thuộc vào thể bệnh chính kèm theo gout như thận âm hư, can

âm hoặc can huyết hư, tỳ thận dương hư mà dùng bài thuốc cho thích hợp nhưng vị

thuốc chính là lá Sa kê từ 20-30g [20]

1.2 Những thông tin về bài thuốc nghiên cứu

1.2.1 Bài thuốc

- Công thức bài thuốc gồm các vị sau:

(g/thang)

- Tục đoạn (Radix Dipsaci japonicas) 10

- Phòng phong (Radix Ledebouriellae seseloidis) 10

- Hy thiêm (Herba Siegesbeckiae orientalis) 10

- Độc hoạt (Radix Angelicae pubescenis) 8

- Tần giao (Radix Gentianae macrophyllae) 8

- Thiên niên kiện (Rhizoma Homalomenae occultae) 6

- Bạch thược (Radix Paeoniae lactiflorae) 6

- Đương quy (Radix Angelicae sinensis) 6

- Xuyên khung (Rhizoma Ligustici wallichii) 6

- Hoàng kỳ (Radix Astragali membranacei) 6

- Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae) 6

- Đỗ trọng (Cortex Eucommiae ulmoides) 4

- Mã tiền chế (Semen Strychnin nux-vomica) 0,5

- Xuất sứ bài thuốc:

Bài thuốc do nhóm nghiên cứu thiết kế dựa trên tham khảo ba bài thuốc điều trị phong thấp như Kiện bộ hổ hoàn, Độc hoạt kí sinh thang, thuốc phong bà Giằng [15], [21], [34]

+ Chỉ định: Trị phong thấp (đau lưng, đau dây thần kinh tọa, đau các khớp, đau cột

sống)

+ Liều dùng: Ngày dùng 01 thang, sắc chia 3 lần, uống ấm Dùng dưới dạng thuốc

sắc hoặc cao đặc

+ Chống chỉ định: Không dùng cho phụ nữ có thai và cho con bú, trẻ em

1.2.2 Các vị thuốc trong bài thuốc

 Tục đoạn [16], [18], [33], [41]

- TK: Sâm nam, Đầu vù, Rễ kế

- TKH: Dipsacus japonicas Miq., họ Tục đoạn (Dipsacaceae)

- BPD: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Tục đoạn (Radix Dipsaci japonicas)

- TPHH: Alcaliod là lamiin, tannin, saponin, ít tinh dầu và chất màu

- Tính vị, quy kinh: Khổ, tân, ôn, quy vào kinh phế

- Công năng: Bổ can thận trừ phong thấp, cường cân cốt, chỉ huyết, an thai

- Chủ trị: Thắt lưng và đầu gối đau yếu, di tinh, động thai, rong kinh, băng huyết, đới hạ, sang chấn, gãy xương, đứt gân

- Tác dụng sinh học [69], [72]:

Bảo vệ chống loãng xương: Liều 300, 500 mg/kg/ngày trên chuột

Điều trị gãy xương: Giúp khép mép các xương bị gãy

 Phòng phong [16], [18], [33], [41]

- TK: Thiên phòng phong, Đông phòng phong, Bàng phong

- TKH: Ledebouriellae seseloides Wolff., họ Hoa tán (Apiaceae)

- BPD: Rễ đã được phơi khô của cây Phòng phong (Radix Ledebouriellae

seseloides)

- TPHH: Coumarin, chất đắng, đường, những chất có tính chất Phenola

- Tính vị, quy kinh: Vị cay ngọt, tính ôn, không độc, quy vào 5 kinh bàng quang, can, phế, tỳ và vị

- Công năng: Giải biểu trừ phong hàn, trừ phong thấp, trừ co thắt

- Chủ trị: Đau đầu do hàn, mày đay, phong thấp tê đau, đau các khớp xương

- Tác dụng sinh học [39], [50], [51], [80]:

Hạ nhiệt: Thuốc sắc 20%, thuốc ngâm vơi liều 10 mg/kg thỏ

Kháng Histamin: Ức chế co thắt cơ trơn ruột chuột lang

Giảm đau: Phòng phong sắc uống hoặc tiêm dưới da giúp tăng ngưỡng chịu đau của

chuột

Điều hòa miễn dịch: Trong thí nghiệm gây choáng váng trên chuột lang, phòng

phong giúp nâng cao tỷ lệ sống qua cơn choáng váng

Chống viêm: Ức chế tổng hợp Nito oxyd (NO) trong quá trình viêm

 Hy thiêm [16], [18], [33], [41]

- TK: Cỏ đĩ, Cứt lợn,Hy tiên, Chư cao, Hổ cao

- TKH: Siegesbeckia orientalis L., họ Cúc (Asteraceae)

- BPD: Bộ phận trên mặt đất đã phơi hay sấy khô của cây Hy thiêm (Herba Siegesbeckiae orientalis)

- TPHH: Alcaloid, flavonoid, chất đắng là darutin

- Tính, vị, quy kinh: Vị đắng, tính hàn, hơi có độc, quy vào 2 kinh can và thận

- Công năng: Trừ phong thấp, thanh nhiệt, giải độc

- Chủ trị: Đau lưng, gối, xương khớp, chân tay tê buốt, mụn nhọt

- Tác dụng sinh học [50], [51], [79], [80]:

Chống viêm cấp: Các chế phẩm chứa kirenol 0,4 – 0,5% có tác dụng chống viêm

cấp

Ức chế miễn dịch: Dịch chiết ethanol ức chế lympho T, B trên chuột

Giảm đau: Phân đoạn n-butanol với liều 120 mg/kg tăng ngưỡng chịu đau của chuột

tại thời điểm 3 giờ

 Độc hoạt [16], [18], [33], [41]

- TK: Hương độc hoạt, Mao đương quy

- TKH: Angelica pubescens Maxim., họ Hoa tán (Apiaceae)

- BPD: Rễ phơi hay sấy khô của cây Độc hoạt (Radix Angelicae pubescentis)

- TPHH: Ostol, bergapten, angelol, và angelica

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, tính ôn, quy vào 2 kinh can, thận

- Công năng: Khu phong, trừ thấp, thông tý, chỉ thống

- Chủ trị: Phong hàn thấp tý, thắt lưng và đầu gối đau, thiếu âm phục phong, đầu thống

 Thiên niên kiện [16], [18], [33], [41]

- TK: Sơn thục

- TKH: Homalomena occulta (Lour.) Schott, họ Ráy (Araceae)

- BPD: Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Thiên niên kiện (Rhizoma Homalomenae occultae)

- TPHH: Tinh dầu (0,8-1%) Trong đó thành phần chính là linalol và terpineol

- Tính vị, quy kinh: Vị khổ, tân, ôn Quy vào các kinh can, thận

- Công năng: Bổ can thận trừ phong thấp, cường cân cốt

- Chủ trị: Phong hàn thấp gây nên: Thắt lưng, đầu gối lạnh đau, chân co rút tê bại

- Tác dụng sinh học [61], [63]

Kích thích tăng sinh tế bào tạo xương: Ở nồng độ 10-7 – 10-5 mol/l

Kháng histamine, chống viêm, giảm đau, giảm nhẹ các triệu chứng của viêm khớp dạng thấp: Thành phần tinh dầu

 Tần giao [16], [18], [33], [41], [72]

- TK: Thanh táo, Tần cửu, Tần qua, Trường sơn cây

- TKH: Gentiana macrophylla Pall., họ Long đởm (Gentianaceae)

- BPD: Rễ đã được phơi hay sấy khô của một số loài Tần giao (Radix Gentianae

macrophyllae)

- TPHH: Alcaloid là justixin, getianin A,B,C, và một lượng rất ít tinh dầu (0,001%)

- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, cay và bình, quy vào 4 kinh: Vị, đại tràng, can, đảm

- Công năng: Bổ can thận trừ phong thấp, thanh thấp nhiệt, ngừng tê đau

- Chủ trị: Phong thấp đau khớp, gân mạch co rút, khớp đau bứt rứt, chân tay co quắp, sốt vào buổi chiều Trẻ em cam tích phát sốt

- Tác dụng sinh học

Chống viêm, giảm đau: Với liều 100 - 400 mg/kg; riêng ở liều 15 mg cao/kg có tác

dụng giảm đau cao hơn aspirin

 Bạch thược [16], [18], [33], [41]

- TK: Thược dược

- TKH: Paeonia lactiflora Pall., họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

- BPD: Rễ đã cạo bỏ lớp bần và phơi hay sấy khô của cây Thược dược (Radix

Paeoniae lactiflorae)

- TPHH: Tinh bột, tanin, calci oxalat, tinh dầu, chất béo, chất nhầy, acid benzoic

- Tính vị, quy kinh: Vị đắng, chua hơi hàn, quy vào 3 kinh can, tỳ và phế

- Công năng: Bổ huyết, dưỡng âm, thư cân, bình can, chỉ thống

- Chủ trị: Huyết hư, da xanh xao, đau sườn ngực, mồ hôi trộm, kinh nguyệt không

đều, âm hư phát sốt, chóng mặt đau đầu, chân tay co rút, đau bụng do can khắc tỳ

 Đương quy [16], [18], [33], [41]

- TK: Tần quy, Vân quy

- TKH: Angelica sinensis (Oliv.) Diels., họ Hoa tán (Apiaceae)

- BPD: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Đương quy (Radix Angelicae sinensis)

- TPHH: Có tinh dầu n-butylidenphtalide, n-butylphtalide, Z-ligustilid, E-ligustilid

[35], acid ferunic [59], [65], [66] Ngoài ra còn có coumarin, becgapten,

sesquitecpen, saflora và một ít vitamin B12

Z-ligustilid 3-Butylidenephthalide Acid ferunic

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, cay, tính ôn Quy vào 3 kinh tâm, can, tỳ

- Công năng: Bổ huyết, hoạt huyết, điều kinh, giảm đau, nhuận tràng

- Chủ trị: Huyết hư, chóng mặt Kinh nguyệt không đều, bế kinh, đau bụng kinh, táo

bón do huyết hư Phong thấp tê đau, sưng đau do sang chấn

- Tác dụng sinh học

Đương quy đã được chứng minh có tác dụng chống ung thư và chống oxy hóa

Ngoài ra các hợp chất tinh khiết từ Đương quy như Z-ligustilid,

3-butylidenephthalide, hoặc cao chiết của Đương quy có thể hoạt hóa các biểu hiện

gen thông qua thành phần chống oxy hóa và tạo ra tác dụng chống viêm [59], [62],

[65], [67], [73]

 Xuyên khung [16], [18], [33], [41]

- TK: Khung cùng, Tang ky

- TKH: Ligusticum wallichii Franch., Họ Hoa tán (Apiaceae)

- BPD: Thân rễ đã phơi hay sấy khô của cây Xuyên khung (Rhizoma Ligustici wallichii)

- TPHH: Tinh dầu có các thành phần Z-ligustilid, wallichilide, Butylidenephthalide,3-Butylidene-7-Hydroxyphthalide [76] Ngoài ra còn có một alcaloid dễ bay hơi có công thức C27H37N3, cnidium lacton, một acid gần giống acid ferunic với công thức C10H10O4 [34]

- Tính vị, quy kinh: Vị cay, tính ôn, quy vào 3 kinh can, đởm và tâm bào

- Công năng: Hành khí bổ huyết, trừ phong, giảm đau

- Chủ trị: Điều kinh, nhức đầu, hoa mắt, cảm mạo phong hàn, phong thấp nhức mỏi, ngực bụng đau tức, nhọt độc sưng đau

- Tác dụng sinh học:

Xuyên khung dùng với liều 3-6 g/ngày dưới dạng thuốc sắc, hay ngâm rượu có tác dụng phát tán phong hàn, trị đau đầu, phá ứ tụ, thông huyết mạch, giảm đau, tiêu phù [34]

 Hoàng kỳ [16], [18], [33], [41]

- TKH: Astragalus membranaceus (Fisch.), họ Đậu (Fabaceae)

- BPD: Rễ phơi hay sấy khô của cây Hoàng kỳ (Radix Astragali membranacei)

- TPHH: Có cholin betain, nhiều loại acid amin và sacaroza

- Tính vị, quy kinh: Có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và tỳ

- Công năng: Bổ khí trừ thấp, cố biểu, lợi tiểu, trừ mủ, sinh cơ

- Chủ trị: Khí hư mệt mỏi, kém ăn; trung khí hạ hãm, tiêu chảy lâu ngày, sa tạng phủ, tiện huyết, rong huyết; ra mồ hôi; nhọt độc khó vỡ; nội nhiệt tiêu khát; viêm thận mạn

 Ngưu tất [16], [18], [33], [41], [68]

- TK: Hoài ngưu tất, Cây cỏ xước

- TKH: Achyranthes bidentata Blume., họ Rau giền (Amaranthaceae)

- BPD: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Ngưu tất (Radix Achyranthis bidentatae) -TPHH: Chứa một Saponin, khi thủy phân sẽ cho acid oleanic và galactoza, rhamnoza, glucoza

- Tính, vị, quy kinh: Vị chua, đắng, bình, không độc, quy vào 2 kinh can và thận

- Công năng: Bổ can thận trừ phong thấp, hoạt huyết thông kinh, mạnh gân cốt

- Chủ trị: Dùng trị đau lưng gối, mỏi gân xuơng; bế kinh, kinh nguyệt không đều, tăng huyết áp

- Tác dụng sinh học:

Chống viêm: Liều 20 g/kg, dịch chiết ethanol liều 5 g/kg

Ức chế sự tiêu xương, chống loãng xương: 300 - 500 mg/kg/ngày làm tăng mật độ

thoáng xương đùi ở chuột

 Đỗ trọng [16], [18], [33], [41]

- TKH: Eucommia ulmoides Oliv., họ Đỗ trọng (Eucommiaceae)

- BPD: Vỏ thân đã phơi hay sấy khô của cây Đỗ trọng (Cortex Eucommiae ulmoides)

- TPHH: Có gutta pecka (chất nhựa), tinh dầu, chất màu, chất anbumin, chất béo và muối vô cơ

- Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, hơi cay, tính ôn, quy vào 2 kinh can và thận

- Công năng: Bổ can thận trừ phong thấp, mạnh gân cốt, an thai, hạ áp

- Chủ trị: Đau nhức cơ khớp, tảo tiết, động thai ra máu, tăng huyết áp

- Tác dụng sinh học: Không có độc, liều vừa phải có tác dụng kích thích

 Mã tiền chế [16], [18], [33], [41]

- TK: Củ chi

- TKH: Strychnos nux-vomica L , họ Mã tiền (Loganiaceae)

- BPD: Hạt đã phơi hay sấy khô lấy từ quả chín của cây Mã tiền hoặc một số loài

thuộc chi Strychnos khác có chứa strychnin

- TPHH: Alcaloid chủ yếu là strychnin và brucin, vomixin, struxin Ngoài ra có acid clorogenic, 4-5% chất béo, loganin 1,5%

R1 = R2 = H : Strychnin

R1 = R2 = OCH3 : Brucin

- Tính vị, quy kinh: Vị khổ ôn, có đại độc Quy vào các kinh can, tỳ

- Công năng: Thông kinh hoạt lạc giảm đau, mạnh gân cốt, tán kết tiêu sưng

- Chủ trị: Phong thấp, tê, bại liệt; đau khớp dạng phong thấp, nhức mỏi chân tay, đau dây thần kinh, sưng đau do sang chấn, nhọt độc sưng đau

- Tác dụng sinh học:

Kích thích thần kinh trung ương, tăng phản xạ của tủy, tăng cường kiện và dinh dưỡng cho cơ thể ở liều 10 - 15 mg/lần, tối đa 50 mg/ngày dạng cao mã tiền [34]

Mã tiền đã chế biến theo YHCT dùng chữa đau nhức, sưng khớp, tiêu hóa kém, suy nhược thần kinh,bại liệt, liệt nửa người, chó dại cắn Liều uống tối đa mã tiền chế 0,10 g/lần và 0,30 g/ngày [6]

Độc tính: Mã tiền rất độc Khi bị ngộ độc có hiện tượng ngáp, tăng tiết nước bọt, nôn mửa, sợ ánh sáng, mạch nhanh và yếu, chân tay cứng đờ, co giật nhẹ rồi đột nhiên có triệu chứng như uốn ván nặng với hiện tượng co cứng hàm, lồi mắt, đồng tử mở rộng, bắt thịt co thắt gây khó thở, sau chết vì liệt hô hấp Với liều 60-90mg strychnin có thể gây chết người do liệt hô hấp [6],[34]

1.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc

1.2.3.1 Định nghĩa

N

O N

H

H H H O

H

R1

R2

 Cao thuốc: Là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định

các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý (rửa sạch, phơi khô hoặc sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp thích hợp khác [18]

Cao thuốc được chia làm 3 loại:

- Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng trong

đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc

- Cao đặc: Là khối đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20 %

- Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Cao khô không được có độ ẩm lớn hơn 5 % [18]

 Tiêu chuẩn: Là quy định về đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý, dùng làm

chuẩn để phân loại, đánh giá sản phẩm, hàng hóa, dịch vụ, quá trình, môi trường và các đối tượng khác trong hoạt động kinh tế - xã hội nhằm nâng cao chất lượng và hiệu quả của các đối tượng này Tiêu chuẩn do một tổ chức công bố dưới dạng văn

bản để tự nguyện áp dụng

- Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn

Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn của Việt Nam bao gồm:

+ Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN

+ Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS

- Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn

Tiêu chuẩn được xây dựng dựa trên một hoặc những căn cứ sau:

+ Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài

+ Kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật

+ Kinh nghiệm thực tiễn

+ Kết quả đánh giá, khảo nghiệm, thử nghiệm, kiểm tra, giám định [14], [26]

1.2.3.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc

Đạt yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chính sau đây:

- Độ trong, độ đồng nhất nhất về màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật

lạ [18]

- Mất khối lượng do làm khô [18]

+ Cao đặc không quá 20 %

+ Cao khô không quá 5 %

- Định tính: Phải có phản ứng định tính của các dược liệu dùng để bào chế cao thuốc

- Định lượng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất trong cao

- Các chỉ tiêu khác: Giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn, đo PH, dư lượng bảo vệ thực vật, ….[18]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bài thuốc Phong đan gồm 13 vị thuốc các vị thuốc trong bài thuốc đã được kiểm định và đạt theo tiêu chuẩn DĐVN IV

2.1.2 Nguyên vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

 Thiết bị

Kính hiển vi quang học Labomed USA, máy đo PH Eutech Instruments pH 510, tủ sấy Memmert, máy cất thu hồi dung môi Buchi, cân phân tích, cân kỹ thuật, máy lắc siêu âm, máy ly tâm, hệ thống chiết

Hệ thống máy HP-TLC, HPLC Shimadzu và các dụng cụ, thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tính đúng của dược liệu

Các vị thuốc mua về được sơ chế sạch, loại tạp, chế biến, sau đó kiểm tra chất lượng vị thuốc theo các tiêu chuẩn ghi trong DĐVN IV và các tài liệu khác Các chỉ tiêu để đánh giá tính đúng của vị thuốc là mô tả dược liệu, kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi và kiểm nghiệm bằng phương pháp hóa học

2.2.2 Bào chế cao đặc bài thuốc

 Chiết tinh dầu

Cân chính xác một lượng Đương quy, Thiên niên kiện, Độc hoạt, Xuyên khung tương ứng với khối lượng vị thuốc trong 10 thang thuốc Cất tinh dầu 5 giờ

Để riêng tinh dầu cất được và bã dược liệu

 Nấu cao đặc bài thuốc

Cao đặc được điều chế bằng phương pháp đun nóng hồi lưu dược liệu và bã dược liệu đã cất tinh dầu ở trên với dung môi là ethanol 70% đến cao lỏng, cô cách thủy hoặc cất thu hồi dung môi đến cao đặc (Mất khối lượng do làm khô dưới 20%) Phối hợp tinh dầu cất được vào cao đặc

2.2.3 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc

Khảo sát các chỉ tiêu của cao đặc dựa theo các tiêu chuẩn DĐVN IV

2.2.3.1 Các chỉ tiêu hóa lý

• Về cảm quan: Độ đồng nhất, màu sắc, mùi vị: dùng thị giác, khứu giác, vị giác để đánh giá

• Độ ẩm: Theo phụ lục 9.6 DĐVN IV

• pH: Đo dung dịch cao đặc ở nồng độ pha loãng 1%, sử dụng máy đo pH

• Xác định chất chiết được trong nước bằng phương pháp chiết nóng: Theo phụ lục 12.10 DĐVN IV

2.2.3.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc

Các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc bài thuốc được định tính bằng các phản ứng hóa học với thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm chất, theo phương pháp hóa thực vật thường quy [5], [6], [7], [18], [32], [42], [45]

2.2.3.3 Kiểm tra sự có mặt của các vị thuốc bằng SKLM

Chiết riêng từng vị thuốc với lượng tương ứng có trong cao đặc của bài thuốc với cùng một quy trình chiết, chấm cùng một lượng trên bản mỏng, khảo sát trên nhiều hệ dung môi để chọn hệ thích hợp tách được các vết, có thể nhận biết được sự

có mặt của vị thuốc trong cao [5], [6], [7], [32], [45]

Sau khi khai triển sắc ký, hiện màu trên đèn tử ngoại và phun thuốc thử hiện màu

2.2.3.4 Định lượng hàm lượng Z-ligustilid trong cao đặc bằng phương pháp HPLC

 Khảo sát điều kiện sắc ký [1], [2], [35], [56], [71]

Tiêm chính xác riêng biệt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc

ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện khảo sát, ghi sắc ký đồ, diện tích píc, thời gian lưu

 Sử lý kết quả

- Dựa vào diện tích píc của chất chuẩn Z-ligustilid thiết lập đường chuẩn biểu thị liên quan giữa nồng độ và diện tích píc của chất chuẩn

- Dựa vào diện tích píc của các mẫu thử và đường chuẩn Z-ligustilid tính được nồng

độ của Z-ligustilid trong các mẫu thử

- Xây dựng công thức tính hàm lượng Z-ligustilid trong mẫu thử cao đặc 70% Phong Đan

2.2.4 Tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc

Căn cứ vào các kết quả khảo sát về cao đặc để dự kiến tiêu chuẩn của cao:

- Yêu cầu về chất lượng: Đưa ra các tiêu chí đánh giá về chất lượng

- Phương pháp thử: Nêu ra phương pháp, cách tiến hành cho từng chỉ tiêu

2.2.5 Thử tác dụng sinh học đối với cao đặc bài thuốc Phong Đan

2.2.5.1 Độc tính cấp

 Phương pháp nghiên cứu:

Chuột nhắt trắng được nhịn đói 4h trước khi uống cao thuốc, nước uống bình thường Sau 4h, chuột được chia thành 4 lô (mỗi lô 8-10 con)

- Lô chứng: Uống dung môi dùng để pha cao thuốc

- Lô thử: Uống cao thuốc với liều tăng dần đến liều tối đa chuột có thể dung nạp được bằng đường uống với thể tích hằng định mỗi lần 0,2ml/10g chuột

 Chỉ tiêu theo dõi:

- Tình trạng chung của chuột: Hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu,

- Tỉ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ

- Khi có chuột chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng

- Lô chứng: Uống dung môi dùng để pha cao thuốc (CMC – Na 0,5 %)

- Lô đối chiếu: Uống paracetamol pha trong CMC – Na 0,5

- Lô thử : Uống cao thuốc pha trong CMC – Na 0,5 % thử với liều tương đương liều dùng trên lâm sàng và gấp 3 liều lâm sàng [21], [34]

Chuột được uống cao thuốc, 30 phút sau khi uống gây đau quặn cho chuột bằng cách tiêm màng bụng Dd acid acetic 1% Đếm số đau quặn trong từng 5 phút một đến phút thứ 30 So sánh số cơn đau quặn ở từng thời điểm của các lô uống mẫu thử với lô chứng dùng dung môi pha mẫu thử để đánh giá tác dụng giảm đau của cao thuốc

 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng M± SE (M: giá trị trung bình từng lô, SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng

LSD test, DunnettT3 test để so sánh giá trị trung bình giữa các lô Phân tích thống

kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống

kê khi p< 0,05

2.2.5.3 Chống viêm cấp

 Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô

hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin [9], [52], [64], [74]

Chuột cống trắng, cả 2 giống, chia ngẫu nhiên làm 4 lô, mỗi lô 10 con

- Lô chứng: Uống dung môi dùng để pha cao thuốc (CMC - Na 0,5%)

- Lô đối chiếu: Uống indomethacin pha trong CMC - Na 0,5%

- Lô thử: Uống cao thuốc pha trong CMC - Na 0,5 % thử với liều tương đương liều dùng trên lâm sàng và gấp 3 liều lâm sàng [21], [34]

Chuột được cho uống dung môi dùng để pha mẫu thử và mẫu thử với cùng thể tích vào các thời điểm 01 ngày và 30 phút ngay trước khi gây viêm Gây viêm bàn chân chuột bằng cách tiêm dưới da bàn chân chuột carrageenin 1% Đo thể tích bàn chân vào các thời điểm khác nhau sau khi gây viêm Lập công thức so sánh mức độ phù chân chuột của các lô dùng cao thuốc so với lô chứng để đánh giá tác dụng chống viêm cấp của cao thuốc

 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng M± SE (M: Giá trị trung bình từng lô, SE: Sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng LSD test, DunnettT3 test để so sánh giá trị trung bình giữa các lô Phân tích thống

kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống

kê khi p< 0,05

2.2.5.4 Chống viêm mạn

 Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây viêm mạn bằng amian [52], [58], [77]

Chuột cống trắng, cả 2 giống, được chia ngẫu nhiên làm 3 lô, mỗi lô 8-10 con

- Lô chứng: Uống dung môi dùng để pha mẫu thử (CMC-Na 0,5%)

- Lô đối chiếu: Uống prednisolon trong CMC-Na 0,5%

- Lô thử: Uống cao thuốc pha trong CMC-Na 0,5 % với liều tương đương thử tác dụng chống viêm cấp

Chuột được gây viêm mạn bằng cách cấy dưới da sợi amian đã được tiệt khuẩn Sau khi cấy amian, vết mổ được khâu bằng chỉ để nối liền chỗ mổ ở lưng Chuột được cho uống dung môi pha mẫu thử hoặc mẫu thử với cùng thể tích vào cùng thời điểm hàng ngày trong vòng 7 ngày Ngày thứ 8, giết chuột, bóc tách u hạt và cân tươi ngay từng u hạt (khối lượng ướt) Sau khi cân tươi, u hạt được sấy khô đến khối lượng không đổi, cân xác định lại khối lượng khô

Tính tỷ lệ % giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô thử so với trọng lượng này ở lô chứng

 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng M± SE (M: Giá trị trung bình từng lô, SE: Sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng one-way ANOVA, dùng LSD test, DunnettT3 test để so sánh giá trị trung bình giữa các lô Phân tích thống

kê bằng phần mềm SPSS 16.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống

kê khi p< 0,05

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Nghiên cứu xây dựng một số tiêu chuẩn cao đặc từ dịch chiết ethanol 70% của bài thuốc Phong đan

3.1.1 Đánh giá tính đúng của các vị thuốc trong bài thuốc

 Tục đoạn

a Mô tả

Rễ hình trụ, hơi cong queo, đầu

trên to, đầu dưới thuôn nhỏ dần, đường

Hình 3.2 - Đặc điểm vi học bột Tục Đoạn

(1 Mảnh bần; 2 Mô mềm mang tinh thể calci oxalat; 3 Mảnh mạch vạch; 4

-Đám sợi; 5 - Mảnh mang màu; 6 - Tinh thể calci oxalat)

c Định tính

Dược liệu có phản ứng dương tính với các nhóm chất như alcaloid, saponin, tanin, polysaccarid [7], [18]

Nhận xét: Vị thuốc Tục đoạn có mô tả cảm quan và các đặc điểm vi học của bột phù

hợp với mô tả trong DĐVN IV Đồng thời dược liệu cho các phản ứng dương tính với những nhóm chất chính trong các chuyên luận riêng về Tục Đoạn [5], [6], [7], [18], [34], [42]

Như vậy xác định vị thuốc đạt yêu cầu sử dụng

 Phòng phong

a Mô tả

Mặt ngoài màu vàng nâu, sần sùi với

những vân ngang, lớp vỏ ngoài thường

bong tróc ra Thể chất nhẹ, dễ gãy, lõi

màu vàng nhạt Mùi thơm, vị đặc trưng,

hơi ngọt

Hình 3.3 - Ảnh vị thuốc Phòng Phong

b Soi bột

Hình 3.4 - Đặc điểm vi học bột Phòng Phong

(1 - Mảnh bần; 2 - Mảnh mô mềm mang tinh bột; 3 - Mảnh mạch; 4 - Sợi; 5 - Tế

bào mô cứng; 6 - Hạt tinh bột; 7 - Tinh thể calci oxalat)

Bột màu vàng nhạt, có vị cay hơi ngọt Soi dưới KHV thấy: Mảnh bần gồm các tế bào hình chữ nhật, thành mỏng Mô mềm gồm các tế bào chữ nhật dài, chứa nhiều tinh bột, các hạt tinh bột đơn hoặc tụ thành đám Rãi rác có các tinh thể calci oxalat, mảnh mạch và sợi dài Tế bào mô cứng có màu vàng da cam thành dày [18]

c Định tính

Dược liệu có phản ứng dương tính với nhóm chất flavonoid, polysaccarid [7], [18]

Nhận xét: Vị thuốc Phòng phong có mô tả cảm quan và các đặc điểm vi học của bột

phù hợp với mô tả trong DĐVN IV Đồng thời dược liệu cho các phản ứng dương tính với những nhóm chất chính trong các chuyên luận riêng về Phòng phong [5], [6], [7], [18], [34], [41]

Như vậy xác định vị thuốc đạt yêu cầu sử dụng

 Hy thiêm

a Mô tả

Thân rỗng ở giữa, đường kính 0,2 cm

đến 0,5 cm Mặt ngoài thân màu nâu nhạt, có

nhiều rãnh dọc song song và nhiều lông ngắn

Lá mọc đối, hai mặt đều có lông Thể chất dai,

Hình 3.6 -Đặc điểm vi học bột Hy Thiêm

(1-Lông che chở; 2-Mảnh biểu bì mang lỗ khí; 3-Mảnh mạch điểm; 4-Mảnh mạch xoắn; 5-Mảnh mô mềm; 6-Mảnh cánh hoa; 7-Lông tiết; 8-Đám hạt phấn)

c Định tính:

Dược liệu có phản ứng dương tính với alcaloid, flavonoid [7], [18]

Nhận xét: Vị thuốc Hy thiêm có mô tả cảm quan và các đặc điểm vi học của bột phù

hợp với mô tả trong DĐVN IV Đồng thời dược liệu cho các phản ứng dương tính với những nhóm chất chính trong các chuyên luận riêng về Hy thiêm [5], [6], [7], [18], [34], [41]

Như vậy xác định vị thuốc đạt yêu cầu sử dụng

 Độc hoạt

a Mô tả

Vị thuốc màu nâu Thể chất tương đối

rắn chắc, khi ẩm thì mềm Mặt bẻ gãy có

vỏ màu xám trắng, với nhiều khoang dầu

màu nâu rải rác Mùi thơm ngát đặc biệt, vị

đắng và hăng, nếm hơi tê lưỡi

Hình 3.7 - Ảnh vị thuốc Độc Hoạt

b Soi bột

Bột màu vàng nâu, vị hơi đắng Soi KHV thấy : Mảnh bần màu nâu sẫm, mảnh

mô mềm gồm các tế bào hình đa giác, mảnh mạch, có nhiều sợi dài đứng riêng lẻ, nhiều mảnh mang màu và rãi rác có các tinh thể calci oxalat hình khối [18]

Hình 3.8 -Đặc điểm vi học bột Độc Hoạt

(1 - Mảnh bần; 2 - Mảnh mô mềm; 3 - Mảnh mạch; 4 - Sợi; 5 - Mảnh mang màu; 6

- 7- Tinh thể Calci oxalat)

c Định tính

Dược liệu có phản ứng dương tính với coumarin [7], [18], [45]

Nhận xét: Vị thuốc Độc hoạt có mô tả cảm quan phù hợp với mô tả trong

DĐVN IV ược liệu cho các đặc điểm vi học của bột và phản ứng dương tính với những nhóm chất chính trong các chuyên luận riêng về Độc hoạt [5], [6], [7], [18], [34], [41] Như vậy xác định vị thuốc đạt yêu cầu sử dụng

b Soi bột

Bột màu vàng, soi KHV thấy mảnh mô mềm gồm các tế bào hình đa giác có thành mỏng, nhiều mảnh mạch dạng xoắn và dạng vạch Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình khối [18]

Hình 3.10 - Đặc điểm vi học bột Tần Giao

(1- Mảnh mô mềm; 2 - Mảnh mạch xoắn; 3 - Mảnh mạch vạch; 4 - Tinh thể Calci

oxalat)

c Định tính

Dược liệu có phản ứng dương tính với alcaloid [7], [18]

Nhận xét: Dược liệu Tần giao có mô tả cảm quan phù hợp với mô tả trong DĐVN

IV Dược liệu cho các đặc điểm vi học của bột và phản ứng dương tính với những nhóm chất chính trong các chuyên luận riêng về Tần giao [5], [6], [7], [18], [34], [41]

Như vậy xác định vị thuốc đạt yêu cầu sử dụng

 Thiên niên kiện

a Mô tả

Vị thuốc có nhiều xơ, chắc, cứng

Mặt ngoài màu nâu nhạt hay nâu sẫm Bẻ

ngang dược liệu hơi dai, vết bẻ có màu

nâu nhạt hay nâu sẫm,có một số sợi màu

vàng ngà lởm chởm Mùi thơm hắc, vị

cay

Hình 3.11 - Ảnh vị thuốc Thiên niên kiện

b Soi bột

Bột màu vàng nâu Soi KHV thấy: Nhiều sợi dài, thành hơi dày đứng riêng lẻ

Tế bào mô cứng có thành dày Mảnh mô mềm gồm những tế bào hình chữ nhật, hình bầu dục Nhiều mảnh mạch vạch, mạch xoắn Tế bào chứa tinh dầu màu cam

và các tinh thể calci oxalat hình cầu gai hoặc hình kim nằm rải rác bên ngoài Hạt tinh bột hình trái xoan nhìn rõ rốn hạt [8]

Hình 3.12 - Đặc điểm vi học bột Thiên niên kiện