Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm và thử độc tính cấp cao khô của dây khai ( cotosapelta tomentosa (blume) vahl ) họ cà phê (rubiaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH XUÂN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CAO KHÔ CỦA DÂY KHAI Coptosapelta tome

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP

CAO KHÔ CỦA DÂY KHAI

(Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl.)

HỌ CÀ PHÊ (Rubiaceae)

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP

CAO KHÔ CỦA DÂY KHAI

(Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl.)

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nguyên liệu 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản và phân bố của họ Cà phê 3

1.1.2 Một số đặc điểm của chi Coptosapelta Korth … ……… 4

1.1.3 Đặc điểm của dây Khai 5

1.2 Các phương pháp chế biến cao thuốc 10

1.2.1 Theo Dược điển 10

1.2.2 Theo kinh nghiệm 12

1.3 Một số chỉ tiêu kiểm nghiệm của cao thuốc 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng 15

2.2 Phương tiện nghiên cứu 15

2.2.1 Hóa chất 15

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 16

2.2.3 Động vật thí nghiệm 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Nghiên cứu hiển vi 16

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 16

2.3.3 Nghiên cứu các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô của dây Khai…….17

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 18

2.3.5 Thử độc tính cấp 18

CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Cảm quan 20

3.2 Đặc điểm hiển vi 21

3.2.1 Đặc điểm vi học bột 21

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá và thân Dây khai 22

3.3 Đặc điểm hóa học 25

3.3.1 Kết quả định tính 25

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 27

3.3.3 Xác định chỉ số phá huyết 31

3.3.4 Định lượng saponin toàn phần có trong cao và thân của Dây khai bằng phương pháp cân 34

3.3.5 Chiết xuất và phân lập 35

3.4 Xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao khô của dây Khai 44

3.4.1 Hàm ẩm 44

3.4.2 Cắn không tan trong nước 47

3.4.3 Tro toàn phần 48

3.4.4 Giới hạn kim loại nặng 49

3.4.5 Giới hạn nhiễm khuẩn 50

3.5 Thử độc tính cấp 50

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Nguyễn Viết Thân người thầy đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi tận tình

trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thanh Bình - giảng viên bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội là người đã hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược Liệu, bộ môn Vi Sinh – Công nghiệp dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS-Lương y Nguyễn Xuân Tuyển và Hội Đông Y tỉnh Ninh Thuận; PGS.TS Nguyễn Thị Tâm nguyên cán bộ giảng dạy tại Bộ môn Dược Liệu, Trường đại học Dược Hà Nội; tới

TS.Phạm Thị Giảng và toàn thể cán bộ nhân viên phòng kiểm nghiệm đông

dược – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương đã giúp đỡ tôi hoàn chỉnh đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể bạn bè, các bạn sinh viên trường Đại Học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới bố mẹ, gia đình, những người thân đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2011

Học viên

Nguyễn Thanh Xuân

C- NMR: Carbon (13) nuclear magnetic resonance spectrometry (Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân carbon 13)

DANH MỤC HÌNH TRONG TÀI LIỆU

Trang

Hình 1.1 Chất A: 3-O-β`-D- glucopyranosyl sitosterol (C35H60O6) 7

Hình 3.1 Hình ảnh Dây khai tại thực địa 20

Hình 3.3 Hình ảnh cao khô Dây Khai lưu hành trên thị trường 21 Hình 3.4 Một số đặc điểm vi học bột lá Dây Khai 22 Hình 3.5 Một số đặc điểm vi học bột thân Dây Khai 23 Hình 3.6 Một số đặc điểm vi học bột cao khô Dây Khai 23

Hình 3.8 Đặc điểm vi phẫu thân Dây Khai 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu sau khi khai triển hệ 1 30 Hình 3.10 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu sau khi khai triển hệ 2 30 Hình 3.11 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu sau khi khai triển hệ 3 31 Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết phân đoạn EtOAc 38 Hình 3.13 Sắc ký đồ CT1 dưới đèn UV 254nm 38 Hình 3.14 Sắc ký đồ CT1 dưới ánh sáng thường sau khi phun 38 thuốc thử

DANH MỤC BẢNG TRONG TÀI LIỆU

Trang

Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu sử dụng trong đề tài 15

Bảng 3.3 Chuẩn bị ống nghiệm trong phản ứng phá huyết 33

Bảng 3.4 Hàm lượng saponin toàn phần trong các mẫu nghiên cứu 35

Bảng 3.5 Độ lệch chuẩn (SD) của các kết quả phần định lượng 35

Bảng 3.7 Hàm lượng nước của mẫu cao xác định bằng phương pháp

cất với dung môi 46

Bảng 3.8 Phần trăm mất khối lượng do làm khô của mẫu cao 47

Bảng 3.9 Phần trăm lượng cắn không tan trong nước của mẫu cao48

Bảng 3.10 Hàm lượng tro toàn phần các mẫu cao 49

Bảng 3.11 Kết quả thử độc tính cấp cao khô của Dây khai

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ninh Thuận là một địa phương có địa hình bao bọc bởi núi và biển, khí hậu tương đối khắc nghiệt ít mưa, nhiều nắng gió, độ ẩm thấp tạo nên một vùng đất khô cằn Ở đây có 34 dân tộc anh em sinh sống trong đó đông nhất

là dân tộc Kinh, Chăm và Rắclây … Đồng bào các dân tộc ở đây có truyền thống chữa bệnh bằng cây cỏ Người dân tộc Rắclây ở Ninh Thuận có nhiều kinh nghiệm sử dụng Dây khai và cao khô nấu từ Dây khai với tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, dùng ngoài để rửa, làm lành vết thương, uống để điều trị các bệnh xương khớp Gần đây, cao này còn được sử dụng để chữa Gút, làm thuốc bổ huyết, tăng cường sinh lực Cao khô Dây khai còn được sử dụng rộng rãi ở nhiều tỉnh miền Nam và nam Trung bộ nước ta, thậm chí còn được bán sang các nước láng giềng như Lào, Campuchia…

Điều đáng quan tâm ở đây là hiện nay do có nhiều tác dụng lại chưa có

hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dây khai nên dễ dẫn đến giả mạo, nhầm lẫn gây ảnh hưởng đến lợi ích người sử dụng đồng thời gây khó khăn cho việc nghiên cứu các tác dụng trên Vì vậy, năm 2010 Hội Đông y Ninh Thuận cùng phối hợp với bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội thực hiện đề tài nghiên cứu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm và tác dụng sinh học cao khô của Dây khai Đề tài này nhằm mục đích bảo tồn, phát huy và kiểm nghiệm một sản phẩm điều trị bệnh ở địa phương cũng như của nền y học cổ truyền Việt Nam đồng thời đảm bảo lợi ích người bệnh

“Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm và thử độc tính

cấp cao khô của Dây khai (Coptosapelta tomentosa (Blume) Vahl họ Cà phê (Rubiaceae)” là một phần trong đề tài nghiên cứu về cao khô Dây khai

với mục tiêu:

- Nghiên cứu một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao khô của Dây khai

- Thử độc tính cấp cao khô của Dây khai

Nội dung đề tài:

- Nghiên cứu đặc điểm vi học, hóa học của Dây khai và cao khô Dây khai bằng các phản ứng định tính, định lượng nhằm xác định tính đúng của nguồn nguyên liệu điều chế cao và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô của Dây khai

- Nghiên cứu một số chỉ tiêu kiểm nghiệm về: Hàm ẩm, cắn không tan trong nước, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, giới hạn nhiễm khuẩn của Dây khai góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô Dây khai

- Phân lập, chiết xuất một số hợp chất có trong cao Khai nhằm mục đích cung cấp thêm tiêu chuẩn để kiểm nghiệm cao khô của Dây khai

- Thử độc tính cấp cao khô của Dây khai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nguyên liệu

Nguyên liệu để điều chế cao là phần trên mặt đất của cây Dây khai Trong hệ thống phân loại thực vật, Dây khai là một loài thuộc chi

Coptosapelta, họ Cà phê (Rubiaceae)[16]

1.1.1 Đặc điểm hình thái cơ bản và phân bố của họ Cà phê

Họ Cà phê được phân chia thành ba họ phụ là Rubioideae, Chichonoideae và Ixoroideae (Bremer et al.1995,1999), giả thuyết gần đây chấp nhận hai họ phụ là Rubioideae và Chichonoideae (bao gồm Ixoroideae)

(Robbrecht và Manen 2006) Coptosalpelta Korth và Luculia là hai chi không

được xếp vào các họ phụ Các chi này có những đặc điểm phân loại đơn ngành như quả, tràng hoa … và đặc điểm di truyền thực vật [30][31][34][40]

Họ Cà phê (Rubiaceae) thuộc bộ Long đởm, liên bộ Long đởm, phân lớp Hoa môi Họ Cà phê được đặc trưng bởi cây gỗ, cây bụi , cây thảo hoặc dây leo Lá đơn nguyên, mọc đối, có lá kèm Lá kèm có khi dính lại với nhau và to như phiến lá, trông như có 4 hoặc 8 lá mọc vòng Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp thành xim hay dạng đầu Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 4-5 Đài ít phát triển, dính với bầu, có 4-5 răng Tràng hợp, tiền khai hoa van, lớp hay vặn Nhị nằm xen kẽ với các thuỳ của tràng và dính vào ống hay họng của tràng Bầu gồm 2

lá noãn dính nhau thành bầu dưới với 2 hoặc nhiều ô, mỗi ô có 1 đến nhiều noãn Quả nang, quả mọng hoặc quả hạch Hạt có phôi nhỏ nằm trong nội nhũ [10][32]

Họ Cà phê có 450 chi, 6500-7000 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, một số ở vùng ôn đới Việt Nam có trên 90 chi, khoảng 4300 loài [2][10]

1.1.2 Một số đặc điểm của chi Coptosapelta Korth

Dây leo hoặc bụi leo, nhẵn, không có gai Lá mọc đối, đôi khi mặt dưới

có phòng ẩn lỗ khí,lá kèm rụng sớm, mọc đối chữ thập với phiến lá, hình tam giác Cụm hoa mọc ở đầu cành hoặc nách lá, cụm đơn (hoặc cụm xim hai ngả

có vài đến nhiều hoa), có cuống, có lá bắc Hoa có thể không cuống, có cuống, có cuống nhỏ, lưỡng tính hoặc đơn tính Hoa mẫu 5 Tràng hoa màu vàng nhạt hoặc màu trắng chuyển vàng khi già, tràng hình đinh, có lông, không lông hoặc có lông tơ bao phủ mặt trong; tiền khai hoa kiểu vặn phải Nhị 5, đính vào họng tràng, thò ra ngoài, chỉ nhị ngắn, bao phấn đính gốc Bầu nhụy 2 ô, mỗi ô có nhiều noãn, đính noãn trung trụ, núm nhụy hình thoi nhô ra ngoài Quả nang, gần cầu, mở lỗ hoặc đôi khi cắt vách, cứng, đài hoa tồn tại; hạt nhiều, kích thước trung bình hoặc to, dẹt, có cánh Nội nhũ dày, phôi thẳng, lá mầm ngắn, rễ mầm cuộn tròn [16][41]

*Phân bố: Chi Coptosapelta Korth gồm có 16 loài chủ yếu phân bố ở

Châu Á đặc biệt là Đông Nam Á: Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Malaysia, Myanma, New Guinea (Úc), Phillipin, Thái Lan, Việt Nam

[30][41][43].16 loài thuộc chi Coptosapelta Korth đó là[43]:

Coptosapelta beccarii Valeton

Coptosapelta carrii Merr & L.M.Perry

Coptosapelta diffusa (Champ.) Steenis

Coptosapelta flavescens Korth syn Coptosapelta tomentosa Valeton ex

K.Heyne

Coptosapelta fuscescens Valeton

Coptosapelta griffithii Hook.f

Coptosapelta hameliiblasta (Wernham) Valeton

Coptosapelta hammii Valeton

Coptosapelta janowskii Valeton

Coptosapelta laotica Valeton

Coptosapelta lutescens Valeton

Coptosapelta maluensis Valeton

Coptosapelta montana Korth ex Valeton

Coptosapelta olaciformis (Merr.) Elmer

Coptosapelta parviflora Ridl

Coptosapelta valetonii Merr

Chi Coptosapelta Korth ở Việt Nam có 1 loài là Coptosapelta

tomentosa (Blume) Valeton ex K.Heyne syn Coptosapelta flavescens

Korth.[29] Ngoài ra, ở vùng Kontum giáp Lào của nước ta còn tìm thấy có

loài Coptosapelta laotica Valeton [22][25]

1.1.3 Đặc điểm của Dây khai

* Tên gọi

Tên khoa học: Coptosapelta tomentosa (Blume) Valeton ex K.Heyne họ

Cà phê (Rubiaceae)

Tên đồng nghĩa: Coptosapelta flavescens Korth., [22][29]

Tên Việt Nam: Dây cổ rùa, Dây khai, Dây họng trâu, Dóc, Dây vàng hoan [25][29]

* Đặc điểm thực vật: Dây leo gỗ, dài 5-7m hoặc hơn Cành tròn màu

nâu sẫm, lúc non có lông, sau nhẵn Lá mọc đối, có cuống rất ngắn dài 12mm, phiến lá mỏng, hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 4,5-11cm, rộng 2,5-6cm, gốc gần tròn, đầu có mũi nhọn ngắn, mặt trên màu xanh lục, mặt dưới rất nhạt, có lông nhỏ ở các gân Lá kèm hình tam giác hẹp, dài khoảng 3-6mm, rụng sớm Cụm hoa là một xim ở ngọn hay kẽ lá đầu cành, dài 6-8cm,

3-có lông mang nhiều hoa màu trắng đến vàng nhạt, mùi thơm hắc Nụ hoa hình trụ, dài 14-18mm Hoa mẫu 5; đài liền, thùy của đài hình tròn hay tam giác, dài khoảng 1mm; tràng liền, có ống ngắn hơn các thùy, cánh hoa xòe rộng và

hơi cong Nhị 5, đính ở họng tràng Bầu 2 ô, cao 2,5mm, vòi nhụy dài 7-9mm, thò ra ngoài ống tràng Quả nang hình cầu có núm nhọn ở đầu, đường kính 6-8mm, có 2 ô, khi chín nứt thành 2-3 mảnh, chứa nhiều hạt nhỏ, dẹt, có cánh Mùa hoa vào khoảng tháng 9-12, mùa quả vào tháng 1 - 4 [25][29] Rễ chặt ra

có mùi khai nồng, rất khó chịu nên có người còn gọi là cây Rễ khai [25][29] Lưu ý: Tránh nhầm lẫn với những dược liệu sau đây: [25][29]

- Dây khay (Milletia) được dùng để duốc cá do tên gọi gần giống

- Dây vàng hoan lào (Coptosapella laotica Valet Ex Pit.); cũng là dây

leo, mọc rải rác trong rừng thứ sinh ở Lào và Kontum

- Dây bồ khai, hay Dây hương (Erythropalum scandens Bl.), họ Dương

đầu (Olacaceae) Nhiều địa phương dùng ngọn non làm rau ăn

* Phân bố:

Trên thế giới loài Coptosapelta tomentosa (Blume) Valeton ex K.Heyne

phân bố ở Việt Nam, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Phillipin, Lào [43]

Loài này thường mọc ở các rừng nhiệt đới hoặc ven bờ sông ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương [33]

Dây khai là loại cây nhiệt đới điển hình, ở Việt Nam nó phân bố chủ yếu

ở phía Nam từ Tây Ninh trở vào đến các đảo Phú Quốc, Côn Đảo Dây khai là cây ưa sáng, thường mọc ở rừng nguyên sinh xanh ẩm quanh năm hay rừng mới thứ sinh, đất đai còn màu mỡ Ngoài ra ở một số vùng có rừng như: An Khê (Gia Lai), Vĩnh Thạnh (Bình Định), Trà My, Phước Sơn (Quảng Nam), Đắc Nông (Đắc Lắc), Nghệ An … thường cũng gặp nhiều Dây khai [29]

* Thành phần hóa học của Dây khai

Sơ bộ phân tích trong thân và rễ Dây khai có saponin, alcaloid, tinh dầu, đường với tỷ lệ thấp [23][29]

Nhóm nghiên cứu của Trần Hùng ( Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu xác định được cấu trúc của một số saponin có trong thân

và rễ Dây khai theo định hướng tác dụng kháng viêm Từ phân đoạn EtOAc của cao thân và rễ Dây khai đã phân lập được 4 glycosid sau: [23]

Chất A: 3-O-β-D- glucopyranosyl sitosterol (C35H60O6)

Chất B: 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L-rhamnopyranosylyl] quinovic acid (C42H66O14)

Chất C : 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-] quinovic acid (C42H66O14)

Me HO

O O HO

OH

HO HO

O

HO

OH Me

Ngoài ra, sự tích lũy nhôm trong lá, một đặc điểm nhận dạng về hóa học

của họ Cà phê, đƣợc tìm thấy trên một số lƣợng lớn loài trong họ này Trong

đó có một số loài thuộc chi Coptosapelta [39][46]

* Tác dụng sinh học và công dụng của Dây khai

- Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn:

Chất B: R = (1), R’ = H Chất C: R = (2), R’ = H Chất D: R = (1), R’ = 3

Theo kinh nghiệm dân gian lâu đời của dân tộc Re ở Quảng Ngãi, Bình Định rễ khai dùng làm thuốc trị đau nhức (sắc) hoặc tán thành bột mịn dùng ngoài làm thuốc trị vết thương nhiễm trùng, mưng mủ Nước sắc rễ hoặc thân Dây khai còn dùng làm thuốc bổ máu cho phụ nữ sau khi sinh [25][29]

Năm 1981, nhóm nghiên cứu Trần Ngọc Tiếng, Lê Thị Lệ Dung đã nghiên

cứu hoạt tính kháng khuẩn của rễ Dây khai Coptosapelta flavencens, họ Cà

rễ loài Coptosapelta tomentosa (Blume) Valeton ex K.Heyne 3 lần trong một

ngày để chữa giun, tên địa phương của loài này là Salah [36]

Loài Coptosapelta tomentosa (Blume) Val ex K.Heyne còn dùng để chữa

sán và giải nhiệt [33]

Ở Malaysia, dịch chiết nước của loài Coptosapelta tomentosa (Blume)

Val ex K.Heyne làm thuốc bổ dùng thường xuyên cho phụ nữ sau khi sinh, chữa bệnh ký sinh đường tiêu hóa, làm dịu cơn sốt, tăng cường sinh lực, sức

- Theo kinh nghiệm dân gian, bài thuốc chữa tê thấp, lưng gối nhức mỏi,

tụ máu bầm tím: rễ khai, rễ cỏ xước hay ngưu tất mỗi thứ 100g, nấu thành

cao; rễ thổ cao ly sâm 50g, làm khô, tán bột Trộn thành bánh Ngày dùng 5–10g chia 2 lần, hâm với nước sôi trong 30 phút Để nguội thêm đường rồi uống [25]

1.2 Các phương pháp chế biến cao thuốc

1.2.1 Theo Dược Điển

Theo DĐVN quá trình điều chế cao thuốc có 3 giai đoạn:

1.2.1.1 Giai đoạn 1: Chiết xuất dược liệu

Tùy thuộc vào bản chất dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm cũng như điều kiện, quy mô sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết suất: ngâm, hầm, hãm sắc, ngấm kiệt, chiết suất ngược dòng, chiết suất bằng thiết bị siêu âm, chiết suất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác [3][4][15]

* Nấu

- Dụng cụ nấu thường dùng là thùng nhôm hoặc thép không rỉ, không dùng dụng cụ bằng sắt Giữa lòng thùng đặt chiếc ống đục nhiều lỗ để múc nước thuốc ra

- Dược liệu dùng để nấu cao phải được chia nhỏ (thái, bào) và sao, tẩm đúng quy cách rồi xếp vào thùng (xung quanh chiếc ống đặt trong thùng) Trên mặt dược liệu có đặt vỉ để khi đun sôi dược liệu không nổi lên trên

- Đổ nước (nước sạch dùng để uống), lượng nước thường gấp 4-6 lần khối lượng của dược liệu, nói chung nước phải ngập dược liệu trên 5-10 cm

- Thời gian nấu:

Dược liệu là thân rễ cứng nấu khoảng 6-8 giờ (2 lần)

Dược liệu là lá, hoa, cành nhỏ, nấu khoảng 4-6 giờ (2 lần)

Dược liệu là xương động vật nấu khoảng 12-36 giờ (3 lần)

Trong thời gian nấu nếu cạn thì cho thêm nước sôi Nấu khi được cả nước 1, nước 2, trộn làm một, rồi đem cô đến khi đạt yêu cầu [20][24]

* Ngấm kiệt:

Phương pháp này áp dụng chế cao dược liệu thảo mộc rất tốt vì:

- Tiết kiệm được thời gian và dung môi

- Nước thuốc chiết được rất đậm đặc và rút kiệt được các hoạt chất

- Không phải dùng sức nóng nên thuốc bào chế ra có chất lượng cao hơn cách nấu [20][24]

1.2.1.2 Giai đoạn 2: Cô cao thuốc

- Nguyên tắc: Cô ở nhiệt độ càng thấp càng tốt và thời gian cô càng ngắn càng tốt [20][24]

- Cách cô:

* Cao lỏng:

Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc, cô dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ đúng theo quy ước nếu không có chỉ dẫn khác Trong trường hợp điều chế cao lỏng bằng phương pháp ngâm nhỏ giọt thì phải để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 lượng dược liệu đem chiết Sau đó cô đặc các phần dịch chiết tiếp theo trên cách thủy hoặc cô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60oC, cho đến khi loại hết dung môi Hòa tan cắn thu được trong dịch chiết đầu đậm đặc, nếu cần thì thêm dung môi tới khi thu được cao lỏng đạt tỷ lệ hoạt chất quy định

Để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc [15]

* Cao đặc và cao khô:

Cao đặc: dịch chiết được cô đặc để độ ẩm còn lại không quá 20% Cao khô: Tiếp tục sấy khô để độ ẩm không quá 5% Để đạt đến thể chất quy định, quá trình cô đặc và sấy khô dịch chiết thu được thường được tiến hành trong các thiết bị dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60oC Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới áp suất giảm thì được phép cô cách thủy và sấy ở nhiệt độ không quá 80o

C Tuyệt đối không được cô trực tiếp trên lửa [15]

Trường hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành loại tạp chất bằng phương pháp thích hợp tùy thuộc vào bản chất của dược liệu, dung môi và phương pháp chiết suất [15]

1.2.1.3 Giai đoạn 3: Thêm chất bảo quản

Cao lỏng rất khó bảo quản do chóng bị mốc, do đó phải thêm chất bảo quản bằng một trong các cách sau:

- Mỗi lít cao lỏng để nguội đóng chai rồi đổ lên trên 20-30 ml ethanol 95%, để nguyên không lắc, đậy nút kén cất đi đến khi dung mới lắc đều

- Cứ 1 lít cao lỏng đun sôi với khoảng 800 g đường hay mật và thêm 10ml cồn acid benzoic 20%

Chai lọ, nút đóng gói cao thuốc trước khi dung phải được rửa sạch, sấy khô để việc bảo quản cao thuốc được tốt [20]

1.2.2 Theo kinh nghiệm

Trong thực tế khi đi khảo sát tại Ninh Thuận, quy trình chế biến cao khô của Dây khai gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Xử lý dược liệu

Dược liệu dùng để nấu cao là phần trên mặt đất của Dây khai Sau khi thu hái và rửa sạch, dược liệu được chặt ra thành từng đoạn dài khoảng 15 – 20cm với những dược liệu nhỏ đường kính thân 2 – 3cm, với dược liệu đường kính lớn hơn thì chẻ ra sao cho các đoạn có kích thước tương đương nhau

Giai đoạn 2: Chiết xuất dược liệu và tạo cao khô

Hệ thống nồi chiết xuất gồm 3 nồi được đun nóng:

+ Nồi 1: Dùng để nấu cao Sau khi dược liệu được xử lý, tiến hành xếp dược liệu vào nồi đổ nước ngập trên dược liệu chừng 5 – 10cm rồi đun trực tiếp trên bếp lửa Khoảng 5 giờ múc dịch chiết một lần rồi lại bổ sung nước nóng, tiếp tục đun đến khi dịch chiết lấy ra không còn màu

+ Nồi 2: Dùng để cô thành cao lỏng Dịch chiết lấy ra từ nồi 1 được đưa vào nồi cô trên bếp lửa, vừa cô vừa quấy đến khi đạt thể chất nhất định sau đó được đưa sang nồi 3

+ Nồi 3: Dùng để tạo cao khô Dịch chiết từ nồi 2 có thể chất lỏng được đưa sang nồi 3 đun sau đó sấy cách thủy để cao không bị cháy đến khi hàm lượng nước trong cao đạt khoảng 5%

Giai đoạn 3: Tạo bánh

Cao sau khi cô đạt đến hàm ẩm tiêu chuẩn được đem ra cắt và nhồi vào khuôn có lót miếng giấy hoặc nilong, chờ nguội lấy ra khỏi khuôn và gói lại tạo thành bánh

1.3 Một số chỉ tiêu kiểm nghiệm của cao thuốc

- Độ tan: Cao lỏng phải hòa tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao [15]

- Độ trong, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã

mô tả trong chuyên luận riêng, phải đồng nhất không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ [15], [20]

Cách tiến hành: Lấy riêng phần phía trên của chai thuốc chỉ để lại khoảng 10-15ml Chuyển phần còn lại trong chia vào một bát sứ men trắng, nghiêng bát cho chúng chảy trên thành bát tạo thành một lớp dễ quan sát Quan sát dưới ánh sáng tự nhiên, thuốc phải đạt các yêu cầu quy định Nếu không đạt phải thử lại lần hai với chai khác, nếu không đạt coi như lô thuốc không đạt tiêu chuẩn này

- Định tính: Phải có phản ứng định tính của các dược liệu dùng để bào chế cao thuốc [15]

- Định lượng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất trong cao [15]

- Tỷ trọng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà yêu cầu về tỷ trọng của cao [15]

- Sai số thể tích đóng chai: 100 ml được sai số +6 ml [15]

- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác):

Cao đặc: Không quá 20%

Cao khô: Không quá 5% [15]

- Độ nhiễm khuẩn: Đạt yêu cầu về độ nhiễm khuẩn theo phụ lục 13.6, DĐVN IV [15]

- Hàm lượng cồn: Đạt 90-110% lượng ethanol ghi trên nhãn (áp dụng cho cao lỏng và cao đặc)

- Kim loại nặng: đáp ứng yêu cầu quy định trong chuyên luận riêng

- Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn-nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 10.14, DĐVN IV [15] Xác định dung môi tồn dư

- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu quy định trong Phụ lục 12.17 DĐVN IV [15] Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu thân, lá cây Dây khai và cao khô Dây khai được lấy tại xã Phước Bình, huyện Bác Ái, tỉnh Ninh Thuận, đơn vị lấy mẫu

và giám định tên khoa học của nguyên liệu là Tỉnh hội Đông Y Ninh Thuận

Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu sử dụng trong đề tài

Mẫu cao 1 (C1) Tháng 8/2003 Mẫu cao 2 (C2) Tháng 10/2010 Mẫu cao 3 (C3) Tháng 10/2010 Mẫu cây Dây khai 1 (T1) Tháng 10/2010 Mẫu cây Dây khai 2 (T2) Tháng 3/2011

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

- Hóa chất: javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất…

- Dung môi hữu cơ: chloroform, acid acetic, ethylacetat, acid formic, toluene, …

- Thuốc thử: các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của Merck

- Dụng cụ: dụng cụ thủy tinh và bộ dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm (cốc có mỏ, bát sứ, chày, cối, thuyền tán, đũa thủy tinh, lam kính, soxhlet, cột triển khai sắc ký đường kính 1,5 và 3 cm…)

- Các thuốc thử: vanillin/H2SO4 đặc, Dragendorff,

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Tủ sấy dược liệu SHELLAB

- Máy xác định độ ẩm SATORIUS

- Cân phân tích Precisa

- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay BUCHIROTAVAPOR R-200

- Phổ khối đo trên máy 5989 - MS tại phòng Cấu trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ đo trên máy NMR - Bruker - 500MHz tại phòng Cấu trúc - Viện Hóa học - Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng do ban động vật Học viện Quân y cung cấp, không phân biệt giống, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 20,0  2,0 g

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu hiển vi

- Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (thân, lá) được cắt vi phẫu bằng máy cắt bằng tay, tẩy và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu dưới kính hiển vi nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu [6][27]

- Soi bột: lá, thân, cao dược liệu được nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán và cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột theo tài liệu [6]

2.3.2 Nghiên cứu hóa học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong mẫu dược liệu và mẫu cao bằng phản ứng hóa học [5][7][26]

- Định lượng saponin toàn phần có trong mẫu dược liệu và mẫu cao theo quy trình trong tài liệu “Hóa học saponin” [28]

- Xác định lượng chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp chiết với nước nóng theo Phụ lục 12.10 Dược điển Việt Nam IV [15]

- Sắc ký lớp mỏng:

+ Sử dụng bản mỏng Silicagel tráng sẵn của Merck Chuẩn bị dịch chiết trong cùng một phân đoạn cloroform của các mẫu nghiêu cứu Chấm sắc ký bằng hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG hiện vết bằng đèn ở bước sóng 254nm và 366nm Chụp ảnh sắc ký [1][14][35]

- Chiết xuất và phân lập:

+ Chiết xuất: Tiến hành theo các tài liệu: Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [19], hóa học Saponin [28]

+ Phân lập chất bằng sắc ký cột mở với chất hấp phụ Silicagel Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Sắc ký cột được tiến hành trên cột Silicagel pha thuận, cỡ hạt 0.063 – 0.2mm (Merck)

Nhận dạng các chất phân lập dựa trên số liệu các phổ: Phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR, 13C-NMR) Các đo lường trên được thực hiện tại Phòng Cấu trúc phân tử - Viện Hóa học – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

2.3.3 Nghiên cứu các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao khô của dây Khai

- Cảm quan: Quan sát mẫu ở ánh sáng thường về các chỉ tiêu màu sắc,

mùi vị [15]

- Mất khối lượng do làm khô (hàm ẩm): Độ ẩm là lượng nước chứa trong

100g mẫu thử Có nhiều phương pháp xác định độ ẩm

+ Phương pháp xác định hàm ẩm bằng phương pháp cất với dung môi theo Phụ lục 12.13, DĐVN IV [15]

+ Phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp sấy theo Phụ lục 9.6 DĐVN IV [15]

- Cắn không tan trong nước: Đối với cao được điều chế bằng dung môi

nước, cần xác định lượng cắn không tan trong nước để xác định tạp chất có trong cao Phương pháp tiến hành được thực hiện theo tr.682 DĐVN IV [15]

- Tro toàn phần: Là lượng tro khi tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều

kiện nung nhất định trong 1g chế phẩm thử Tiến hành theo Phụ lục 9.8,

DĐVN IV [15]

- Xác định giới hạn kim loại nặng: Hàm lượng kim loại nặng toàn phần có

trong mẫu thử được xác định theo nguyên tố Chì, theo Phụ lục 9.4, tr 682,

DĐVN IV [14] [15]

- Xác định giới hạn nhiễm khuẩn: theo Phụ lục 13.6, DĐVN IV [15], tiến

hành chuẩn bị mẫu, nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, đếm tổng số vi sinh vật, vi nấm sau thời gian nhất định

3ml nước cất, tỷ lệ đặc nhất có thể pha mà thuốc vẫn qua kim để cho chuột uống) và tỷ lệ 1:5 (1g cao khô Dây khai pha với 5 ml nước cất), được dùng cho chuột nhắt trắng uống với các mức liều tăng dần Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100 % số chuột trong nhóm được sử dụng

để tính toán Sau khi cho dùng thuốc, chuột được nuôi dưỡng và theo dõi chu đáo, nước uống tự do Thời gian theo dõi liên tục trong 72 giờ Số chuột chết được đếm theo nhóm và phẫu thuật

Tính toán: theo phương pháp cải tiến của Livschitz P.Z.(1986)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Cảm quan

- Mẫu dược liệu là những lát dây gỗ cứng hoặc những đoạn dây (còn non), có mùi khai, nồng đặc trưng, màu vàng, vị đắng Lá hình trứng, một trên xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt, cuống lá ngắn, có lông

Hình 3.1 Hình ảnh Dây khai tại thực địa

Hình 3.2 Hình ảnh lá, thân Dây khai

- Cao khô của Dây khai lưu hành trên thị trường dưới dạng từng bánh cao khô có khối lượng 1kg, được gói bằng một lớp giấy, có thể có túi nilong bọc ngoài Cao màu nâu đen, có mùi đặc trưng của dược liệu, vị đắng hơi chát

Hình 3.3 Hình ảnh cao khô Dây khai lưu hành trên thị trường

* Kết quả:

- Một số đặc điểm vi học bột lá Dây khai:

+ Đặc điểm bột: bột màu xanh, mùi nhẹ, không vị

+ Soi trên kính hiển vi thấy các đặc điểm: (Hình 3.4)

+ Soi trên kính hiển vi thấy những đặc điểm: (Hình 3.5)

a Mảnh mang màu

b Mảnh mạch điểm

c Thể cứng

- Một số đặc điểm vi học bột cao Dây khai: Tiến hành lấy mẫu trên 3

mẫu cao khác nhau và tìm kiếm những đặc điểm lặp lại

+ Đặc điểm bột: bột màu nâu, có mùi thơm đặc trưng của cao và dược liệu, vị đắng, hơi chát

+ Soi trên kính hiển vi thấy những đặc điểm lặp lại: (Hình 3.6)

a: Thể cứng ở nhiều góc độ khác nhau tìm thấy trên 3 mẫu cao

b: Mảnh mang màu và tế bào có chứa chất tiết mang màu

c: Các mảnh mô tế bào

* Nhận xét: Kiểm nghiệm bột cao bằng phương pháp hiển vi sơ bộ tìm

thấy một số đặc điểm bền nhiệt còn tồn tại như thể cứng, sợi Những đặc điểm này cũng tìm thấy trong mẫu lá và thân Dây khai

Hình 3.4 Một số đặc điểm vi học bột lá Dây khai

Hình 3.5 Một số đặc điểm vi học bột thân Dây khai

Hình 3.6 Một số đặc điểm vi học của bột cao Dây khai

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá và thân Dây khai:

* Tiến hành: Thực hiện qua các bước sau:

- Làm mềm dược liệu bằng phương pháp làm mềm nóng [6], cắt bằng máy cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng

- Tẩy lát cắt dược liệu bằng Cloramin B đã pha bão hòa tới khi lát cắt trắng hoàn toàn để tẩy sạch các chất trong tế bào

- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất nhiều lần

- Ngâm Cloralhydrat trong 10 phút để tẩy tinh bột khoai còn dính trên lát cắt và làm tiêu bản sáng

- Rửa sạch nhiều lần bằng nước cất

- Ngâm trong dung dịch acid acetic 5% để tẩy làm sáng tiêu bản

- Nhuộm Xanh methylen (đã pha loãng theo tỷ lệ 1:4) trong vòng 1 phút

- Đặc điểm vi phẫu của lá Dây khai (Hình 3.7):

Mô tả: Phần gân lá trên và dưới đều lồi Ngoài cùng là lớp biểu bì (1) (hình 3.7a) cấu tạo bởi những tế bào nhỏ, xếp thành một lớp đều đặn, mang lông che chở (4) Mô dày (2) nằm sát lớp biểu bì trên và dưới (Hình 3.7a)

Mô dậu (3) là một hàng tế bào xếp sát tế bào biểu bì mang chất tiết (Hình 3.7b) Mô mềm (5) cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng, tròn hoặc đa giác không đều nhau (Hình 3.7c) Trong cùng là bó libe-gỗ gồm các cung libe (7) dưới và cung gỗ (8) ở trên (Hình 3.7d) Lớp tế bào sợi (6) nằm ngay sát phía dưới cung libe

Phần phiến lá:

Mô tả: Ngoài cùng là lớp biểu bì có cấu tạo tương tự biểu bì phần gân lá

Mô dậu (3) là một hàng tế bào xếp sát tế bào biểu bì mang chất tiết Mô mềm (5) cấu tạo bởi những tế bào thành mỏng

Hình 3.7 Đặc điểm vi phẫu Hình 3.8 Đặc điểm vi phẫu

b Đặc điểm vi phẫu của thân (Hình 3.8):

Mô tả: Từ ngoài vào trong có:

Ngoài cùng là lớp bần (1) gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, nhiều chỗ

bị bong ra (Hình 3.8a) Mô mềm vỏ (2) gồm các tế bào dẹt nằm ngang, thành mỏng, xen kẽ đôi lúc có các tế bào mô cứng (3) Libe (4), gỗ (5) nằm xen kẽ chiếm phần lớn diện tích bề mặt lát cắt (Hình 3.8b, 3.8c) Trong cùng là mô mềm ruột (6) gồm các tế bào hình tròn, hoặc gần tròn, thành mỏng chứa nhiều

tế bào sợi (3) Tế bào sợi thành dày (3) tập trung nhiều ở phần lõi thân (Hình 3.8d)

3.3 Đặc điểm hóa học

3.3.1 Kết quả định tính

Sơ bộ định tính các nhóm chất có trong lá, thân và cao của Dây khai

bằng phản ứng hóa học thu đƣợc bảng kết quả sau:

- Lá Dây khai không chứa saponin

- Đối chiếu thành phần hóa học của cao Dây khai và dược liệu mang tên Dây khai thấy sự tương đồng về thành phần hóa học của cao và thân Dây khai

Vì vậy đề tài tập trung vào nghiên cứu thân Dây khai để góp phần xây dựng một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Dây khai và nguyên liệu bào chế cao Dây khai

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng:

* Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

dung tích 100ml

Phân đoạn 1: dung môi ether dầu hỏa, 800

C trong 3 giờ, để bay hơi túi đựng dược liệu, sau đó chiết ở phân đoạn tiếp theo

Phân đoạn 2: dung môi CHCl3, 700C trong 6 giờ Cất thu hồi dung môi, lấy cắn hòa tan vào methanol, lọc làm dịch chấm sắc ký

Chấm sắc ký bằng máy chấm sắc ký CAMAG

Chụp ảnh sắc ký ở ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254nm và 366nm

- Đối với thân Dây khai: Cho 30g dược liệu vào một nồi thủy tinh, cho

nước vừa ngập dược liệu Nấu sôi trong vòng 10 giờ, trong quá trình nấu thỉnh thoảng khuấy đều để tránh bọt và bổ sung thêm nước Cứ 2 giờ gạn dịch

chiết một lần, cô dịch chiết tới thể chất cao mong muốn Phần cao thu đƣợc tiến hành chiết bằng soxhlet nhƣ trên

* Hệ dung môi triển khai sắc ký:

Hệ 1: Cloroform- ethylacetat- acid formic (92:8:2)

*Nhận xét: Đã xác định các vết đặc trƣng và lặp lại ở mẫu dịch chiết

thân và cao Dây khai, đây là tiêu chuẩn định tính quan trọng để kiểm nghiệm

cao Dây khai

Bảng 3.2 Kết quả khai triển SKLM

Dưới đèn 366nm Vết 1: Huỳnh quang xanh sáng 0.23

Vết 2: Huỳng quang xanh sáng (rõ) 0.29

a b

Hình 3.11 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu sau khi khai triển hệ 3

3.3.3 Xác định chỉ số phá huyết:

* Tiến hành:

Chuẩn bị các dung dịch cần thiết:

a) Dung dịch đệm: Dung dịch đệm phosphat PH 6,8 (TT)

b) Dung dịch máu bò 0,2% đã loại fibrin

Cho vào bình định mức dung tích 50ml, 20ml dung dịch đệm, thêm

chính xác 1,0ml dung dịch máu bò đã loại fibrin Lắc nhẹ Thêm dung dịch

đệm vừa đủ 50ml (dd A)

Cho vào bình định mức dung tích 50ml, 20ml dung dịch đệm, thêm

chính xác 5ml dung dịch A Lắc nhẹ Thêm dung dịch đệm vừa đủ 50ml

Chuẩn bị dung dịch thử:

- Pha dung dịch cao Dây khai 5%

Cân chính xác 2,5g cao vào bình nón dung tích 100ml Cho thêm 50ml

dung dịch đệm vừa đun sôi Lắc đều cho tan Lọc nóng qua bông vào trong

cốc có mỏ Để nguội Chuyển dung dịch vào trong bình định mức 50,0ml

Tráng bình nón bằng dung dịch đệm và lọc qua lớp bông đã sử dụng Thêm dung dịch đệm đến đủ 50,0ml Lắc đều (dd B)

- Pha dung dịch thân Dây khai 15%

Cân chính xác 7,5g bột thân Dây khai đã tán nhỏ Cho bột vào bình nón dung tích 100ml Cho thêm 50ml dung dịch đệm vừa đun sôi Lắc và đặt trên nồi cách thuỷ sôi Đun sôi trong 30 phút Lọc nóng qua bông vào trong cốc có

mỏ Để nguội Chuyển dung dịch vào trong bình định mức 50,0ml Tráng bình nón bằng dung dịch đệm và lọc qua lớp bông đã sử dụng Thêm dd đệm đến đủ 50,0ml Lắc đều (dd C)

Lấy 20 ống nghiệm nhỏ (5ml), đánh số thứ tự từ 1 đến 20 tiến hành nhƣ sau: