Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện và định lượng hai đồng phân butylparaben và isobutylparaben trong một số mỹ phẩm

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục quản lý Dược [4] quy định cụ thể về việc sử dụng paraben trong mỹ phẩm như sau: - Butylparaben và các muối, propylparaben và các muối tham chiếu 12a Annex

TRONG MỘT SỐ MỸ PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

TRONG MỘT SỐ MỸ PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

Người hướng dẫn:

1 TS Lê Thị Hường Hoa

2 GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu

Nơi thực hiện:

Khoa Mỹ Phẩm Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới GS.TS Thái Nguyễn

Hùng Thu, TS Lê Thị Hường Hoa – hai người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và

truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới DS Ngô Thị Duyên cùng với sự giúp đỡ,

hướng dẫn của các cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ Phẩm – Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô bộ môn Hóa Phân Tích – Độc Chất, các thầy, các cô trong trường đã trang bị cho tôi kiến thức quý báu và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh em trong gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên hỗ trợ tôi lúc khó khăn

Hà Nội, ngày 07 tháng 05 năm 2018 Sinh viên

Nguyễn Huỳnh Đức

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ PARABEN 2

1.1.1 Đặc điểm chung 2

1.1.2 Tính chất của butylparaben và isobutylparaben 2

1.1.3 Ứng dụng của paraben 3

1.1.4 Độc tính của paraben 3

1.1.5 Hành động của cơ quan quản lý đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben 4

1.1.6 Một số nghiên cứu về phân tích paraben trong mỹ phẩm 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 5

1.2.1 Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 5

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 6

1.2.3 Cấu tạo của máy HPLC 6

1.2.4 Các thông số của quá trình sắc ký 8

1.2.5 Tối ưu hóa quá trình tách sắc ký 9

1.2.6 Ứng dụng của HPLC 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 12

2.1.1 Dung môi và hóa chất 12

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 12

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.4.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 13

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích bằng HPLC 13

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 16

3.1.1 Kết quả khảo sát chọn cột 16

3.1.2 Kết quả khảo sát chọn pha động 17

3.1.3 Kết quả khảo sát bước sóng 20

3.1.4 Điều kiện sắc ký 21

3.2 KẾT QUẢ LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU 21

3.2.1 Khảo sát dung môi pha mẫu 21

3.2.2 Khảo sát độ ổn định của chất nghiên cứu trong dung môi pha mẫu 22

3.2.3 Chuẩn bị mẫu 23

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 23

3.3.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống 23

3.3.2 Độ đặc hiệu 24

3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 25

3.3.4 Độ đúng 26

3.3.5 Độ lặp lại 28

3.3.6 Độ chính xác trung gian 29

3.3.7 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 31

3.4 ÁP DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU MỸ PHẨM THỰC TẾ THU THẬP ĐƯỢC 32

3.5 BÀN LUẬN 33

3.5.1 Về hai paraben nghiên cứu 33

3.5.2 Về phương pháp nghiên cứu 34

3.5.3 Về kiểm tra các mẫu mỹ phẩm 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

GC – MS: Gas Chromatography Mass Spectrometry (Phương pháp sắc ký khí khối phổ) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối

ACN: Acetonitril

MeOH: Methanol

CTCPDP: Công ty cổ phần Dược phẩm

TNHH: Trách nhiệm hữu hạn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của butylparaben và isobutylparaben 2

Bảng 2.1 Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường 12

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ổn định của dung môi pha mẫu 22

Bảng 3.2 Đánh giá độ thích hợp hệ thống 23

Bảng 3.3 Kết qủa xác định khoảng nồng độ tuyến tính của IBP và BuP 25

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng của IBP trong mẫu sữa rửa mặt 26

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của BuP trong mẫu sữa rửa mặt 27

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của IBP trong mẫu nước súc miệng 27

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của BuP trong mẫu nước súc miệng 28

Bảng 3.8 Độ lặp lại của phương pháp trong nền mẫu sữa rửa mặt 28

Bảng 3.9 Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu nước súc miệng 29

Bảng 3.10 Độ chính xác trung gian của phương pháp trong nền mẫu sữa rửa mặt 30

Bảng 3.11 Độ chính xác trung gian của phương pháp trong nền mẫu nước súc miệng 31

Bảng 3.12 LOD và LOQ của IBP và BuP 31

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra các paraben có mặt trong mẫu mỹ phẩm 32

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên cột C18 – Shimadzu, 25cm 16

Hình 3.2 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C18 – Phenomenex, 15cm 16 Hình 3.3 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C6-Phenyl, 25cm 17

Hình 3.4 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C6-Phenyl với các hệ pha động có thành phần khác nhau 17

Hình 3.5 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn paraben với các pha động sử dụng nước và đệm có pH khác nhau 18

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn thêm vào nền mẫu sữa rửa mặt với các pha động có thành phần khác nhau 19

Hình 3.7 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn thêm vào nền mẫu với pha động ACN : Đệm pH 2,5 với các tỷ lệ khác nhau 20

Hình 3.8 Phổ hấp thụ UV-VIS của butylparaben (a) và isobutylparaben (b) 21

Hình 3.9 Sắc kí đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP với điều kiện sắc kí được lựa chọn 21

Hình 3.10 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn trong mẫu tự tạo với các dung môi pha mẫu khác nhau 22

Hình 3.11 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của IBP 25

Hình 3.12 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của BuP 26

Hình 3.13 Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip 32

Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail 32

Hình 3.15 Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt ngừa mụn Esunvy 33

Hình 3.16 Sắc ký đồ của mẫu Nước súc miệng Listerine Total Care 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay kinh tế ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống ngày càng được nâng cao, nhu cầu về chăm sóc của bản thân ngày càng cần thiết, do đó mỹ phẩm trở thành một trong những sản phẩm tiêu dùng hàng đầu Mỹ phẩm còn là loại sản phẩm, hàng hóa có lợi nhuận cao, nên vì lợi nhuận mà việc sản xuất kinh doanh, buôn bán mỹ phẩm kém chất lượng không an toàn là khó tránh khỏi Do đó việc quan tâm đến công tác kiểm soát chất lượng mỹ phẩm trở nên rất quan trọng đối với các cơ quan quản lý

Paraben là những ester của acid p-hydroxy benzoic Các paraben được sử dụng trong mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe khác làm chất bảo quản, có tác dụng làm chậm sự phát triển của nấm và vi khuẩn hoặc hạn chế sự phân hủy của dược chất Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy sử dụng các paraben có thể gây ra rối loạn nội tiết, hình thành và phát triển ung thư vú ở phụ nữ Hơn nữa, các nghiên cứu invitro còn chỉ ra rằng các paraben còn kích thích việc tăng sinh các tế bào ung thư [6] Do đó việc phát hiện và định lượng các paraben rất cần thiết trong điều kiện hiện nay

Ngày 13 tháng 4 năm 2005, dựa trên kết quả của kỳ họp Hội đồng Mỹ phẩm ASEAN lần thứ 21, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP [4] về việc cập nhật quy định các chất được sử dụng trong mỹ phẩm, trong đó công bố danh sách 5 paraben cấm dùng trong mỹ phẩm là isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben Ngoài ra, cũng theo công văn này thì butylparaben và các muối, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid) và dạng hỗn hợp các paraben với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid) Như vậy, butylparaben là chất có giới hạn hàm lượng còn đồng phân isobytlparaben là chất bị cấm dùng trong mỹ phẩm Do đó việc phát hiện và định lượng được 2 paraben trên là rất cần thiết

Với những yêu cầu đó, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện

và định lượng hai đồng phân butylparaben và isobutylparaben trong một số mỹ phẩm” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 2 paraben trên trong nền sữa rửa mặt và nước súc miệng

2 Triển khai áp dụng phương pháp với một số mẫu mỹ phẩm thu được trên thị trường

Paraben được sử dụng trong nhiều loại mỹ phẩm, cũng như trong thực phẩm và thuốc Mỹ phẩm có thể chứa paraben bao gồm dầu gội, sữa rửa mặt, son, chất dưỡng

ẩm, các sản phẩm chăm sóc tóc, kem đánh răng, phấn trang điểm… [7], [9]

1.1.2 Tính chất của butylparaben và isobutylparaben

Paraben được tạo ra từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxy benzoic Chúng có công thức hóa học chung là R-para-hydroxy benzoat trong đó R có thể là 1 nhóm alkyl hay aryl [9]

Bảng 1.1 Tính chất của butylparaben và isobutylparaben

1.1.3 Ứng dụng của paraben

Các paraben có tác dụng diệt khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây hại khác nhau) và chống lại nhiều loại vi nấm nên thường được sử dụng làm chất bảo quản trong thực phẩm, mỹ phẩm và thuốc [7], [8], [10]

Cơ chế tác dụng của các paraben hiện nay chưa được xác định rõ Các paraben được cho là phá vỡ khả năng vận chuyển chất qua màng [12] hoặc ức chế tổng hợp ARN hay ADN [13] hay một số enzym quan trọng như là ATPase hay phosphotransferases ở một số loài vi khuẩn [7], [14]

1.1.3.1 Trong thực phẩm

Các paraben đã được thêm vào thực phẩm hơn 50 năm trước và qua các năm số lượng các loại thực phẩm có sử dụng paraben ngày càng tăng Các paraben được sử dụng ở nhiều loại thực phẩm như là nước trái cây, dầu mỡ, các loại gia vị và rau củ… với nồng độ từ 450 đến 2000 ppm [10]

1.1.3.2 Trong mỹ phẩm

Paraben được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm, đặc biệt là methylparaben và propylparaben [10] Mỹ phẩm có thể chứa paraben bao gồm dầu gội, sữa rửa mặt, son, chất dưỡng ẩm, các sản phẩm chăm sóc tóc, kem đánh răng, phấn trang điểm… [7], [9], [10] Sự phổ biến của các paraben xuất phát từ độc tính thấp, phổ kháng khuẩn rộng, ổn định về mặt sinh học và chi phí thấp của chúng [10] Các paraben cũng có khả năng chịu nhiệt và ổn định ở khoảng pH rộng (hiệu quả ở pH từ 4,5 - 7,5) Bởi vì bền ở nhiệt độ cao, các sản phẩm chứa paraben có thể được hấp tiệt khuẩn mà không làm mất tính kháng khuẩn của nó [10]

Các paraben có thể được sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với nhau để tăng hoạt tính kháng khuẩn [7] Hoạt tính kháng khuẩn của chúng mạnh nhất trên nấm men và nấm mốc [10]

1.1.3.3 Trong thuốc

Paraben được sử dụng lần đầu tiên ở trong thuốc từ năm 1950 và từ đó đến nay chúng được sử dụng trong nhiều loại chế phẩm như là chất bảo quản [10] Trong số các paraben, propylparaben là chất có tác dụng chống nấm tốt nhất Paraben được sử dụng trong nhiều dạng bào chế như là thuốc đặt, viên nén, hỗn dịch, dung dịch thuốc tiêm… [10] Nồng độ của các paraben trong các chế phẩm rất đa dạng, nhưng hiếm khi vượt quá 1%

1.1.4 Độc tính của paraben

1.1.4.1 Phản ứng dị ứng

Đối với những người có da bình thường, phần lớn paraben không gây kích ứng

và không nhạy cảm Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da và viêm da tiếp xúc

- 4 -

hoặc gây bệnh rosacea (chứng đỏ mặt) ở những người bị dị ứng với paraben, chiếm một tỷ lệ nhỏ trong dân số nói chung [15]

1.1.4.2 Hoạt tính giả estrogen

Những năm gần đây có rất nhiều lo ngại về việc phơi nhiễm các chất estrogen tổng hợp Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự bất thường chức năng của hệ miễn dịch, tác động lên hệ thần kinh, hay sự xuất hiện của các khối u có thể liên quan đến sự phơi nhiễm các chất độc, bao gồm cả estrogen Nguyên nhân của việc giảm số lượng tinh trùng ở nam giới được cho là liên quan đến nồng độ estrogen và các chất giả estrogen trong cơ thể

Hoạt tính giả estrogen của các paraben được mô tả lần đầu tiên bởi Routledge

và đồng nghiệp năm 1998 [18], sau đó một số thử nghiệm in vivo trên động vật và nghiên cứu intro đã chứng minh hoạt tính giả estrogen [16], [17], [18] Tuy nhiên, đa

số các nghiên cứu in vivo đều tiến hành trên chuột chưa có dữ liệu nghiên cứu trên người Trong các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra các paraben có hoạt tính estrogen yếu, trong khi chất chuyển hóa của chúng là acid p-hydroxybenzoic lại không thể hiện hoạt tính này [16] Mặc dù có những báo cáo về độc tính của paraben nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu in vivo trên người được tiến hành để đánh giá tác động của các paraben lên sự bài tiết testosteron và chức năng sinh sản ở nam giới Do đó, vẫn chưa đủ dữ liệu để khẳng định độc tính của các paraben lên rối loạn chức năng sinh sản ở nam giới

1.1.4.3 Ung thư vú

Bởi vì estrogen là yếu tố nguy cơ lớn trong sự hình thành và phát triển ung thư

vú nên có ý kiến cho rằng các paraben có thể làm tăng tỷ lệ ung thư vú ở phụ nữ Năm

2004, Darbre và các cộng sự đã báo cáo có sự xuất hiện của các paraben (nồng độ cỡ nanogram) trong các tế bào ung thư ở 20 bệnh nhân [10] Đứng trước bối cảnh đó, Hội đồng đánh giá các thành phần trong Mỹ phẩm của Mỹ đã xem xét và đánh giá lại tính

an toàn của 4 paraben phổ biến nhất (methyl, ethyl, propyl và butylparaben) và đã có kết luận là vẫn chưa có bằng chứng thuyết phục chứng minh paraben có thể gây ung thư vú [19] và khuyến cáo người tiêu dùng không nên quá lo lắng về vấn đề này

1.1.4.4 Tăng nhạy cảm với ánh sáng mặt trời

Các nghiên cứu chỉ ra rằng methylparaben sử dụng trên da có thể phản ứng với UVB (tia tử ngoại có bước sóng từ 290-320nm) và dẫn đến quá trình lão hóa và tổn thương ADN [20], [21]

1.1.5 Hành động của cơ quan quản lý đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben

Ngày 28-7-2015, Cục Quản lý Dược, Bộ Y Tế đã cho biết: “Thực hiện quyết định của Hội đồng Mỹ phẩm ASEAN về việc cập nhật quy định các chất dùng trong

mỹ phẩm Cục Quản lí Dược đã có thông báo về việc đưa 5 dẫn chất paraben vào danh

mục các chất không dùng trong mỹ phẩm Năm dẫn chất này bao gồm: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentyl paraben

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục quản lý Dược [4] quy định cụ thể về việc

sử dụng paraben trong mỹ phẩm như sau:

- Butylparaben và các muối, propylparaben và các muối (tham chiếu 12a Annex V) được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các paraben với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid)

-05 paraben (isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben

và pentylparaben) được bổ sung vào Annex II (các chất không được dùng trong mỹ phẩm)

1.1.6 Một số nghiên cứu về phân tích paraben trong mỹ phẩm

Tham khảo phương pháp hòa hợp của ASEAN năm 2005, các paraben được xác định bằng phương pháp HPLC [22]:

Các paraben cũng có thể được xác định bằng phương pháp HPLC với pha động: Methanol : Nước = 20 : 80, detector UV-VIS, bước sóng 254nm

Ngoài phương pháp HPLC, cũng đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp

GC-MS để xác định các paraben trong tế bào ung thư ở người [24]

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.2.1 Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký là một nhóm các phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động [1] [2]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- High performance liquid chromatography)

là một kỹ thuật tách trọng đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lí [2]

- 6 -

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion…) [2]

Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua, chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký

Yếu tố quyết định hiệu quả của quá trình sắc ký ở đây là tổng quan các tương tác:

- Tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh

- Tương tác giữa chất phân tích với pha động

- Tương tác giữa pha động và pha tĩnh

Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động Pha tĩnh được cố định trong cột các chất phân tích sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa chất tan – pha tĩnh – pha động Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu sẽ tách ra riêng biệt

1.2.3 Cấu tạo của máy HPLC

Do bản chất hóa học của các chất phân tích rất khác nhau nên có rất nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau [2]

1.2.3.1 Hệ thống cấp pha động

Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: Siêu âm, sục khí trơ như heli…

Pha động thường được chứa trong bình thủy tinh Có hai cách để dùng pha động rửa giải:

- Đẳng dòng (isocratic): Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình

sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại đựng

trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định (chương trình dung môi)

Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi:

- Chương trình dung môi áp suất thấp: Các dung môi đựng trong các bình riêng Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu

- Chương trình dung môi áp suất cao: Điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có một bơm riêng việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao Chương trình này có tốn kém và cồng kềnh hơn so với loại trộn ở áp suất thấp Tuy nhiên, nó có độ đúng và độ lặp lại cao hơn

1.2.3.2 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000psi trở lên (với 1 psi = 0,068atm)

- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 – 5,0ml/phút

- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)

- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2-3ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi

1.2.3.3 Hệ tiêm mẫu

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột

mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) Vòng

chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50 – 20 µl Có vòng mẫu lớn hơn

Khi dùng van tiêm sẽ dễ dàng tự động hóa Phần mềm máy tính dễ dàng điều khiển và kiểm soát hệ bơm mẫu tự động (autosampler) Sai số tiêm mẫu dùng van khoảng 0,5%

bề mặt Ngoài ra còn có các chất nhồi cột khác như nhôm oxyd, polyme xốp, nhựa trao đổi ion… phụ thuộc vào loại hình sắc ký

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký

Điều nhiệt cột: Trong sắc ký lỏng, khác với sắc ký khí, vận hành thiết bị thường

ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại

- Khoảng hoạt động tuyến tính mạnh

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

- Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính

Hiện có nhiều detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa:

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K

Trong đó Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và Cm là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì việc tách càng dễ dàng hơn

1.2.4.2 Thời gian lưu

Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi là thời gian lưu tR Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động Thời gian tM của chất không lưu gọi là thời gian chết

1.2.4.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số dung lượng k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha:

Như vậy, hệ số k’ có thể được tính dễ dàng từ pic sắc ký Từ đó có thể thấy:

- Khác với hệ số phân bố K, hệ số k’ phụ thuộc không chỉ vào bản chất của chất

A, bản chất của hai pha mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha động và thể tích pha tĩnh

- Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh cho nên khó xác định chính xác thời gian tR Ngược lại, nếu k’ quá lớn (ví dụ 20 – 30), quá trình rửa giải quá dài Thường người ta chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 đến 5

Trong đó a là nửa chiều rộng phía trước pic, b là nửa chiều rộng phía sau pic

1.2.4.6 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ

1.2.5 Tối ưu hóa quá trình tách sắc ký

Tách bằng sắc ký được tối ưu hóa bằng cách thay đổi các điều kiện thực nghiệm

để có thể tách được các thành phần trong hỗn hợp với chi phí (thời gian, kinh tế) cực tiểu Một nội dung quan trọng trong tối ưu hóa là tìm cách tăng hiệu lực cột sắc ký Đầu tiên, cần xem xét độ phân giải của cột tức là khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên sắc ký đồ

1.2.5.1 Độ phân giải của cột

Độ phân giải của cột được tính theo công thức:

- 10 -

Phương trình trên mô tả sự phụ thuộc của độ phân giải Rs vào cột vào số đĩa N,

hệ số chọn lọc α và hệ sô dung lượng k’ Để tăng hệ số phân giải ta có thể:

- Tăng hệ số dung lượng k’B:

Nói chung khi tăng k’B sẽ tăng hệ số phân giải Rs Tuy nhiên k’B tăng sẽ tăng nhiều thời gian phân tích Để dung hòa độ phân giải và thời gian rửa giải người ta khuyên trị số k’ dao động từ 1 – 5

- Tăng hệ số chọn lọc α bằng cách:

+ Thay đổi thành phần pha động, kể cả thay đổi pH

+ Thay đổi pha tĩnh (đổi cột khác)

+ Tăng nhiệt độ cột: thường đi kèm tăng k’

1.2.5.2 Thời gian phân tích

Tối ưu hóa tách sắc ký là chọn điều kiện để tách định lượng các thành phần trong hệ với chi phí, thời gian là ít nhất Thời gian cần thiết cho một quá trình rửa giải được tính từ thời gian lưu của pic cuối cùng trên sắc ký đồ

1.2.6 Ứng dụng của HPLC

Sắc ký được coi là một kỹ thuật phân tích rất hiệu quả để tách và định lượng các hợp chất có cấu trúc hóa học gần giống nhau trong một hỗn hợp Vì vậy nó được dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc sinh vật

1.2.6.1 Định tính

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu Với những mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó khăn Do vậy, HPLC thường được dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ

1.2.6.2 Định lượng

Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic Chiều cao pic dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối Diện tích pic được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy

Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:

- Phương pháp chuẩn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử trong

cùng điều kiện So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử Có 2 phương pháp:

+ Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của

mẫu thử

+ Chuẩn hóa nhiều điểm: xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa

diện tích pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định

- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất

chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc

ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào

sự chênh lệch nồng độ ∆C và sự tăng của diện tích ∆S

- Phương pháp nội chuẩn: Người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân

tích và trong dung dịch đối chiếu Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội

là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

+ Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác

+ Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất cần phân tích

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích được xác

định bằng tỉ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích pic có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic của các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện)

- 12 -

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Dung môi và hóa chất

- Chất chuẩn isobutylparaben (Canada), số lô: 3-SCC-165-1, hàm lượng: 98%

- Chất chuẩn butylparaben (Sigma-Aldrich) số lô: BCBM9217V, hàm lượng: 99,1%

- Acetonitril HPLC (Merck)

- Nước tinh khiết

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng Agilent với 4 module:

+ Bơm cao áp 4 kênh dung môi (G1311B) + Hệ thống bơm mẫu tự động (G1329B) + Detector mảng Diod (DAD) (G1315D) + Phần mềm điều khiển toàn bộ hệ thống và xử lý số liệu

- Cân phân tích chính xác tới 0,01mg

- Máy lắc siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail: Nơi sản xuất: Công ty TNHH Quốc tế

Thiên Minh, Việt Nam, không có chất bảo quản nhóm paraben

- Mẫu nước súc miệng Colgate Plas: Nơi sản xuất: Công ty Colgate Palmolive,

Thái Lan, không có chất bảo quản nhóm paraben

- Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Một số mẫu sữa rửa mặt và nước súc miệng thu được trên thị trường

1 Sữa rửa mặt làm sạch da Công ty Yves Rocher 48L140

2 Sữa rửa mặt ngừa mụn Esunvy CTCPDP Gia Nguyên 48G726

3 Sữa rửa mặt làm sạch da Hydra vegetal Công ty Yves Rocher 47L137

4 Sữa rửa mặt là đào Naive Công ty Kraicie Home 48L04

5 Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip Thái Lan 48L05

6 Sữa rửa mặt trắng tinh khiết POND’S PT Unilever Indonesia 48L06

7 Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail Công ty TNHH Quốc tế Thiên Minh 48L07

8 Nước súc miệng Listerine Total Care Công ty TNHH Johnson and Johnson 48L08

9 Nước súc miệng diệt khuẩn Listerine Công ty TNHH Johnson and Johnson 48L09

10 Nước súc miệng Colgate Plas Công ty Colgate Palmolive 48L10

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng phương pháp để tách hai đồng phân isobutylparaben và butylparaben có

mặt trong mỹ phẩm với 2 quy trình:

+ Giới hạn pháp hiện và giới hạn định lượng

- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 2 paraben: isobutylparaben và butylparaben trong một số mẫu mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm của nền mẫu

và phương pháp phân tích)

2.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích bằng HPLC

Sử dụng 2 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm là sữa rửa mặt và nước súc miệng để xây dựng và thẩm định phương pháp Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký thích hợp

- Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc kí phù hợp: Cột sắc ký, pha động, tốc độ dòng,

bước sóng phát hiện, thể tích tiêm mẫu Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết của pic và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đương của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu chuẩn Định lượng bằng cách so sánh diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn so với mẫu thử

- Thẩm định phương pháp bao gồm:

+ Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn (chuẩn hỗn hợp và từng chuẩn đơn); mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình xử lý mẫu) và mẫu thử

- 14 -

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu tự tạo: pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic khác (nếu có trong nền mẫu), pic của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện pic

ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Nếu có đáp ứng pic phải không quá 1,0 % so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn Hệ số chồng phổ UV-VIS của pic hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử hoặc tự tạo với pic tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 0,99 trở lên

+ Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải lớn hơn hoặc bằng 0,997 (hay R2 ≥ 0,995)

+ Độ lặp lại:

Chuẩn bị ít nhất 6 mẫu (Mẫu chuẩn hoặc mẫu trắng có thêm chuẩn, tốt nhất làm trên mẫu thử có thêm chuẩn) Dựa vào diện tích pic thu được từ sắc ký đồ xác định lượng chất phân tích tìm lại được Tính tỷ lệ thu hồi của chất phân tích theo công thức

Yêu cầu : RSD của tỷ lệ thu hồi không quá 2%

+ Độ chính xác trung gian:

Độ chính xác trung gian được tiến hành trên 6 mẫu được chuẩn bị giống phần

độ lặp lại nhưng thực hiện khác ngày và khác kiểm nghiệm viên

Yêu cầu: RSD của tỷ lệ thu hồi không quá 2%

+ Độ đúng:

Xác định trên các mẫu tự tạo: Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các nền mẫu không có chất cần phân tích Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 75%, 100% và 125% so với nồng độ phân tích Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính Tính tỷ lệ thu hồi theo công thức như ở phần độ lặp lại

Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98,0 - 102,0 % và RSD của tỷ lệ thu hồi không quá 2% ở mỗi mức nồng độ

+ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn đáp ứng để xác định giới hạn phát hiện Từ đó, suy ra giá trị định lượng LOQ khoảng 3,3 lần LOD (kl/tt)

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Các kết quả thực nghiệm được tính toán và xử lý thống kê trên Microsoft Excel

2010 với các hàm thông dụng

- 16 -

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

3.1.1 Kết quả khảo sát chọn cột

Tiến hành sắc ký dung dịch hỗn hợp chuẩn với cùng pha động ACN:H2O (30:70) trên các cột C18 – Phenomenex 15cm, cột C18 - Shimadzu 25cm và cột C6-Phenyl 25cm Kết quả thu được như ở các Hình 3.1 đến 3.3

Hình 3.1 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên cột C18 – Shimadzu, 25cm

Hình 3.2 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C18 – Phenomenex,

15cm

Hình 3.3 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP trên Cột C6-Phenyl, 25cm

Dựa vào khả năng tách 2 đồng phân nghiên cứu của các cột, cột C6-Phenyl được chọn để tiếp tục nghiên cứu

3.1.2 Kết quả khảo sát chọn pha động

- 18 -

a) MeOH : H 2 O (52:48) b) ACN : H 2 O (32:68)

Tiến hành khảo sát với 2 thành phần thường được sử dụng trong HPLC pha đảo

là methanol (MeOH) và acetonitril (ACN) Kết quả thu được các sắc ký đồ như ở Hình 3.4

Kết quả cho thấy sử dụng pha động có thành phần acetonitril cho kết quả tốt hơn: píc gọn đẹp và độ phân giải cũng tốt hơn Do đó pha động ACN: H2O được chọn

để khảo sát tiếp

 So sánh sử dụng nước và các dung dịch đệm có pH khác nhau

Tiến hành chạy sắc ký với các pha động là ACN: H2O; ACN: Đệm pH 2,5 và ACN: Đệm pH 7,0 ở cùng tỷ lệ 33:67 Kết quả thu được như ở hình 3.5

Kết quả cho thấy với pha động ACN: Đệm pH 7,0 cho sắc ký đồ có nhiều nhược điểm nhất (pic doãng không đối xứng) Với pha động ACN: H2O và ACN: Đệm

pH 2,5 cho pic tương tự nhau về thời gian lưu (tR), hệ số phân giải (Rs) và độ đối xứng của pic Tuy nhiên khi triển khai với nền mẫu sữa rửa mặt, pha động là ACN:

H2O thì đường nền gần pic sắc ký biến đổi làm xuất hiện pic “lạ” (Hình 3.6) Trong khi đó pha động có thành phần là ACN : Đệm pH 2,5 không xuất hiện hiện tượng này nên được chọn để khảo sát tiếp về tỷ lệ

a)

b)

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn thêm vào nền mẫu sữa rửa mặt với các pha

động có thành phần khác nhau a) ACN : H 2 O b) ACN : Đệm pH 2,5

3.1.2.2 Khảo sát tỷ lệ pha động

Tiến hành sắc ký với pha động ACN : Đệm pH 2,5 với các tỷ lệ 33:67; 35:65 và 37:63 Kết quả thu được như ở hình 3.7

Dựa vào thời gian lưu và độ phân giải, tỷ lệ 35:65 được chọn và pha động được

sử dụng sẽ là ACN: Đệm pH 2,5 = 35:65 vì các píc tách hoàn toàn, cân xứng và thời gian lưu không quá dài

3.1.3 Kết quả khảo sát bước sóng

Tiến hành quét phổ UV-VIS của hai chất isobutylparaben và butylparaben Kết quả thu được như hình 3.8

200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 nm -10

Hình 3.8 Phổ hấp thụ UV-VIS của butylparaben (a) và isobutylparaben (b)

Dựa vào phổ UV-VIS của isobutylparaben và butylparaben, bước sóng phát hiện được lựa chọn là 254 nm

Hình 3.9 Sắc kí đồ của hỗn hợp chuẩn IBP và BuP với điều kiện sắc kí được lựa chọn

3.2 KẾT QUẢ LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU

3.2.1 Khảo sát dung môi pha mẫu

Sử dụng dung môi pha mẫu là MeOH và pha động (ACN: Đệm pH 2,5 =

35:65), tiến hành hành sắc ký trên mẫu tự tạo Kết quả thu được như ở hình 3.10

3.2.2 Khảo sát độ ổn định của chất nghiên cứu trong dung môi pha mẫu

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ổn định của dung môi pha mẫu

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic (mAu*s)

3.2.3 Chuẩn bị mẫu

3.2.3.1 Chuẩn bị dung môi pha mẫu (pha động)

Chuẩn bị đệm phosphat 0,05M pH 2,5: Cân 3,4g kali dihydrophosphat hòa tan trong 900ml nước, điều chỉnh đến pH 2,5 bằng acid phosphoric (H3PO4), sau đó thêm nước vừa đủ 1000ml [3]

Pha hỗn hợp dung môi ACN : Đệm phosphat pH 2,5 theo tỷ lệ 35:65 để được dung môi pha mẫu

3.2.3.2 Chuẩn bị mẫu sữa rửa mặt

Cân chính xác khoảng 0,5g sữa rửa mặt cho vào cốc có mỏ 50ml, thêm 10ml dung môi pha mẫu, dùng đũa thủy tinh phân tán đều kem trong cốc, chuyển vào bình định mức 50ml Tráng rửa cốc nhiều lần với 30ml dung môi pha mẫu và chuyển vào bình định mức trên, lắc siêu âm 10 phút Để nguội thêm dung môi pha mẫu vừa đủ đến vạch, lắc đều Sau đó, ly tâm 10 phút với tốc độ 10000 vòng/phút Lọc dịch lọc qua màng lọc 0,45µm

3.2.3.3 Chuẩn bị mẫu nước súc miệng

Cân chính xác khoảng 0,5g nước súc miệng vào bình định mức 50ml, thêm 30ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm 10 phút Để nguội, thêm dung môi pha mẫu vừa

Bảng 3.2 Đánh giá độ thích hợp hệ thống

STT

Isobutylparaben Butylparaben

Hệ số phân giải

Số đĩa

lý thuyết (IBP)

Thời gian lưu

(phút)

Diện tích píc (mAU*s)

Hệ số bất đối

Thời gian lưu (phút)

Diện tích píc (mAU*s)

Hệ số bất đối

- 24 -

bất đối nhỏ (gần 1) và độ phân giải lớn hơn 2 Như vậy, hệ thống đạt yêu cầu để phân tích cho 2 đồng phân

3.3.2 Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn các mẫu được chuẩn bị cụ thể như sau:

- Mẫu trắng: là dung môi pha mẫu (Acetonitril : Đệm phosphat pH 2,5 tỷ lệ 35:65)

- Mẫu nền (placebo):

+ Mẫu nền sữa rửa mặt: Cân chính xác khoảng 0,5g mẫu sữa rửa mặt (đã được kiểm tra xác định là không chứa isobutylparaben và butylparaben) vào cốc có mỏ 50ml rồi xử lý theo mục 3.2.3.2

+ Mẫu nền nước súc miệng: Cân chính xác khoảng 0,5g mẫu nước súc miệng (đã được kiểm tra xác định là không chứa isobutylparaben và butylparaben) vào bình định mức 50ml rồi xử lý theo mục 3.2.3.3

- Mẫu chuẩn:

+ Chuẩn IBP: Cân 10,26 mg chất chuẩn isobutylparaben (IBP) hòa tan trong 70ml methanol và định mức thành 100ml bằng methanol, lắc đều để được dung dịch chuẩn gốc IBP Hút 4,0 ml dung dịch chuẩn gốc IBP trên pha loãng thành 50,0ml bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45µm

+ Chuẩn BuP: Cân 10,17 mg butylparaben (BuP) hòa tan trong 70ml methanol và định mức thành 100ml bằng methanol, lắc đều để được dung dịch chuẩn gốc BuP Hút 4,0 ml dung dịch chuẩn gốc BuP trên pha loãng thành 50,0ml bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45µm

+ Chuẩn hỗn hợp: Hút 4,0 ml dung dịch chuẩn gốc IBP và 4,0 ml dung dịch

chuẩn gốc BuP pha loãng thành 50,0ml bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc 0,45µm

Kết quả thu được như sau:

- Mẫu chuẩn IBP: xuất hiện pic chính ở thời gian lưu khoảng 30,1 phút

- Mẫu chuẩn BuP: xuất hiện pic chính ở thời gian lưu khoảng 31,9 phút

- Mẫu chuẩn hỗn hợp: xuất hiện 2 pic chính IBP và BuP ở thời gian lưu khoảng 30,1 phút và 31,9 phút

- Mẫu trắng và các mẫu nền không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của IBP và BuP

- Mẫu tự tạo xuất hiện 2 pic chính có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 2 pic chính thu được từ sắc kí đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp, 2 pic này tách khỏi nhau và tách rõ trên nền mẫu

- Hệ số chồng phổ của pic trong mẫu tự tạo và trong dung dịch hỗn hợp chuẩn với: isobutylparaben là 999,9725 và butylparaben là 999,9873

3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính

Từ các dung dịch chuẩn gốc IBP và BuP, với độ pha loãng thích hợp để có được dung dịch có nồng độ khoảng 25% - 175% so với nồng độ định lượng dự kiến (8µg/ml) Tiến hành sắc ký và thu được kết quả như ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết qủa xác định khoảng nồng độ tuyến tính của IBP và BuP

STT

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích pic (mAU*s)

Nồng độ (µg/ml)

Diện tích pic (mAU*s)

- 26 -

Hình 3.12 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của IBP

Như vậy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ của IbuP và BuP trong khoảng nồng độ khảo sát với hệ số tương quan đều gần 1 (r  0,9999)

3.3.4 Độ đúng

Thêm chính xác các lượng chuẩn IBP và BuP vào nền mẫu, sao cho sau khi xử

lý theo qui trình phân tích nồng độ dung dịch thu được cuối cùng đem sắc ký phải nằm trong khoảng từ 75-125% so với nồng độ định lượng dư kiến (8µg/ml) Tiến hành ở 3 mức nồng độ khác nhau: 75%, 100% và 125%; mỗi nồng độ thực hiện 3 lần Dựa vào diện tích pic của chất tương ứng trong dung dịch chuẩn hỗn hợp để tính ra lượng thu hồi Kết quả được trình bày ở các bảng 3.4, 3.5, 3.6 và 3.7

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng của IBP trong mẫu sữa rửa mặt

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%)

RSD (%)

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ đúng của BuP trong mẫu sữa rửa mặt

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%)

RSD (%)

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%)

RSD (%)

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Tỷ lệ thu hồi trung bình (%)

RSD (%)

Bảng 3.8 Độ lặp lại của phương pháp trong nền mẫu sữa rửa mặt

STT

Isobutylparaben Butylparaben

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

% Thu hồi

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

% Thu hồi

Lượng tìm lại (mg)

% Thu hồi

Diện tích pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

% Thu hồi

Kết quả cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác trung gian trong nền mẫu sữa rửa mặt và mẫu nước súc miệng (RSD không vượt quá 2%)

% Thu hồi

% thu hồi trung bình (n=12)

RSD (%, n=12)

Bảng 3.11 Độ chính xác trung gian của phương pháp trong nền mẫu nước súc miệng

STT Diện tích

pic (mAu.s)

Lượng tìm lại (mg)

% Thu hồi

% thu hồi trung bình (n=12)

RSD (%, n=12)

3.3.7 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp đến khi thu được tín hiệu của pic gấp 3 lần nhiễu đường nền ta được giá trị LOD và biết rằng LOQ gấp khoảng 3,3 lần LOD Kết quả thể hiện ở bảng 3.12

Bảng 3.12 LOD và LOQ của IBP và BuP

STT Tên chất phân tích LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml)

- 32 -

3.4 ÁP DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU MỸ PHẨM THỰC TẾ THU THẬP ĐƯỢC

Tiến hành kiểm tra trên 10 mẫu mỹ phẩm Kết quả thu được ở bảng 3.13

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra các paraben có mặt trong mẫu mỹ phẩm

1 Sữa rửa mặt làm sạch da 48L140 Không công bố PB Không tìm thấy

2 Sữa rửa mặt ngừa mụn Esunvy 48G726 Không công bố PB Không tìm thấy

3 Sữa rửa mặt làm sạch da Hydra vegetal 47L137 Không công bố PB Không tìm thấy

4 Sữa rửa mặt là đào Naive 48L04 Không thông tin Không tìm thấy

5 Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip 48L05 Công bố có MP Không tìm thấy

6 Sữa rửa mặt trắng tinh khiết POND’S 48L06 Không công bố PB Không tìm thấy

7 Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail 48L07 Công bố có MP và

PP

Không tìm thấy

8 Nước súc miệng Listerine Total Care 48L08 Không công bố PB Không tìm thấy

9 Nước súc miệng diệt khuẩn Listerine 48L09 Không công bố PB Không tìm thấy

10 Nước súc miệng Colgate Plas 48L10 Không công bố PB Không tìm thấy

Một số sắc ký đồ của các mẫu mỹ phẩm có công bố chứa paraben được thể hiện

ở hình 3.13 và 3.14

Hình 3.13 Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt trắng da Nivea Pearl Caring Whip

Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu Sữa rửa mặt cao cấp Benew Snail

Kết quả cho thấy với cả 2 mẫu theo công bố có chứa paraben là 48L05 (có chứa methylparaben-MP) và 48L07 (có chứa MP và PP) đều không có pic trùng với IBP (có thời gian lưu là 30,1 phút) cũng như BuP (có thời gian lưu là 31,9 phút) Nên có thể khẳng định 2 mẫu này nhưng không chứa BuP và IBP So sánh với kết quả phân tích 2 mẫu này trong nghiên cứu khác của nhóm nghiên cứu [5] cũng cho kết quả tương tự là không có IBP và BuP trong cả hai mẫu Nghiên cứu [5] cũng đã chỉ ra trong 2 mẫu