Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương dịch sinh vật là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC , sắc ký khí GC, sắc ký khí gắn với máy khối phổ GC - MS

( KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SĨKHOẢ 1997- 2002 )

Người hướng dẫn : ThS NGUYỄN THỊ KIỂU ANH

PGS TS TRẦN TỬ AN Noi thực hiện : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH Thời gian thực hiện : 3- 5/2002

HÀ NỘI - 05/2002

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

ThS NGUYỄN THỊ KIỂU ANH PGS.TS TRẦN TỬ AN

đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô trong bộ môn HOÁ PHÂN TÍCH đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội ngày 26/5/2002

Sinh Viên

VŨ THỊ THANH LOAN

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đ ề 1

Phần 1: Tổng quan 2

1.1 Đại cương về Ketoprofen 2

1.1.1 Công thức và tính chất lý hoá 2

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học 2

1.1.3 Chỉ đ ịn h 3

1.1.4 Chống chỉ định 3

1.1.5 Tác dụng không mong m uốn 3

1.1.6 Liều dùng 4

1.1.7 Dạng bao chế 4

1.1.8 Các phương pháp định lượng 4

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu ng cao ( HPLC) 6

1.2.1 Phân loại các phương pháp sắc ký 6

1.2.2 Đặc điểm, phương pháp 6

1.2.3 Nguyên tắc của phương pháp 7

1.2.4 Một số thông số đặc trưng của HPLC 7

1.2.5 Pha tĩnh và pha động trong HPLC 9

1.2.6 Cách tính kết quả trong phương pháp H PLC 10

Phần 2 : Thực nghiệm và kết quả 11

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11

2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất 11

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm 12

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận x é t 14

2.2.1 Khảo sát tìm dung môi chiết xuất 14

2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc k ý 16

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen trong huyết tương 2 1 Phần 3 : Kết luận và đề xuất 30

Tài liệu tham khảo 32

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

A Diện tích pic

ACN Acetonitril

AcOH Acid acetic

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IS Chất nội chuẩn

MeOH Methanol

R Tỷ số diện tích pic

Tri Triethylamin

ĐẶT VẤN ĐỂ •

Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm Trong khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương

Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí ( GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện

di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phương pháp hay được dùng hơn cả, do tính ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế

Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát

Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng

ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu:

-Xây dựng một chương trình sắc ký HPLC nhằm định lượng ketoprofen trong huyết tương cho kết quả tin cậy và lặp lại

-Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen trong huyết tương theo thời gian bảo quản

/- - Tên khoa học: acid 2 Ợ- benzoyl phenyl) propionic.

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi Thực tế không tan trong nước ở 20°c, tan hoàn toàn trong kiềm mạnh, ethanol 96°, aceton, cloroform và ether pKa = 5,94 trong hỗn hợp methanol - nước (3 : 1) Cực đại hấp thụ trong methanol ở bước sóng 255 nm Nhiệt độ nóng chảy khoảng 95°c

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học [5] [6].

Ketoprofen là thuốc chống viêm phi Steroid, thuộc dẫn chất của acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm Ketoprofen ức chê quá trình tổng hợp prostaglandin và ức chế sự kết tập tiểu cầu

Ketoprofen được hấp thu rất nhanh vào máu, đạt nồng độ tối đa sau 45 -

60 phút nếu đặt hậu môn và 60- 90 phút sau khi uống Liên kết với protein huyết tương 99%, thời gian bán thải là 1,5-2,5 giờ Sau khi uống 4 giờ nồng độ ketoprofen trong bao hoạt dịch cao hơn trong máu Thuốc qua được hàng rào nhau thai Một phần nhỏ chuyển hoá bằng cách hydroxyl hoá, còn phần lớn liên hợp với acid glucuronic Thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75- 90%), một ít

qua phân (1-8%) Ở nước tiểu (65-75%) là dạng glucuronyl, 1% là dạng chưa biến đổi Sau khi uống 6 giờ ketoprofen sẽ bị thải trừ 50% qua thận.

1.1.3 Chỉ định [5] [6]:

Ketoprofen được chỉ định điều trị dài hạn các triệu chứng trong:

- Viêm thấp khớp mãn tính, đặc biệt là viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống

- Bệnh cứng khớp gây đau và tàn phế

Điều trị ngắn hạn các triệu chứng trong các cơn cấp tính của các bệnh:

- Bệnh thấp khớp ngoài khớp (đau vai cấp tính, viêm gân ).

- Loét dạ dày- tá tràng tiến triển

- Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng

- Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) và cho con bú

1.1.5 Tác dụng không mong muốn [6]

- Tác dụng phụ ở đường tiêu hoá: khó chịu vùng dạ dày- ruột, đau dạ dày,

buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng thì loét dạ dày, xuất huyết tiêu hoá, thủng ruột

- Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ

- Phản ứng quá mẫn ở da (nổi ban, mề đay, ngứa) và đường hô hấp (suyễn,

nhất là những người dị ứng với aspirin và các kháng viêm không Steroid khác)

- Giảm nhẹ hồng cầu ở người bị thiếu máu, một vài trường hợp giảm bạch cầu

nhẹ đã được ghi nhận

1.1.6 Liều dùng[6]:

- Liều khởi đầu: 300 mg chia làm 3 lần, uống khi no

- Liều duy trì: 150-200mg hoặc nạp ngày 1-2 viên thuốc đạn

- Tiêm bắp ngàyl00-200mg chia 2 lần

Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường uống

và các kháng viêm không Steroid khác (kể cả salicylat liều cao) do làm tăng nguy cơ loét và xuất huyết tiêu hoá

1.1.7 Dạng bào chê [5] [6].

- Viên nang 25mg, 50mg, 75mg

- Viên nén 100mg, 150mg

- Viến bao tan ở ruột 50mg.

- Viên bao tác dụng kéo dài 200mg, viên nang tác dụng kéo dài 100mg, 150mg, 200mg

- Thuốc tiêm 100mg

- Thuốc mỡ 2,5%

% Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron

1.1.8 Các phương pháp định lượng.

♦ Phương pháp acid- bazơ:

Định lượng ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương bằng chỉ thị đỏ phenol [9] [18] hoặc bằng phương pháp đo điện thế [ 1 2]

•Ỉ& Tiến hành:

Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol Thêm 25ml nước và vài giọt đỏ phenol Chuẩn độ với NaOH 0,1N

Song song làm một mẫu trắng trong cùng điều kiện,

lm l NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C16H140 3

- Hoặc: Hoà tan khoảng 200mg Ketoprofen (cân chính xác) vào 25ml alcol

Thêm 25ml nước Chuẩn độ với NaOH 0,1N, xác định điểm tương đương bằng bước nhảy điện thế

lml NaOH 0,1N tương đương với 25,43mg C|6H140 3

♦ Phương pháp quang phổ[7] [9] [10]:

Dùng để định lượng ketoprofen trong chế phẩm

Hoà một lượng chế phẩm có chứa khoảng 50 mg ketoprofen (cân chính xác) trong 300 ml methanol 75 %, lắc trong 10 phút, thêm methanol 75 % vừa

đủ 500 ml Lọc Lấy 5 ml dịch lọc pha loãng thành 100 ml với methanol 75 %

và đem đo độ hấp thụ của dung dich này ở bước sóng 258nm; cuvet thạch anh

có chiều dày 1 cm với mẫu trắng là methanol 75%

Tính kết quả dựa vào A (1%, lcm) ở bước sóng 258 nm là 662

♦ Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ).

Dùng để định lượng ketoprofen trong huyết tương và xác định tạp chất trong nguyên liệu

1 [9] [10] [18] Đêm phosphat pH 3,5 - ACN

6 [16]

Đêm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ).

Cl8 5 ịim

4,6 X 250mm Huyết tương

♦ Phương pháp điện di mao quản: Định lượng ketoprofen trong huyết tương [14] và tách đồng phân của ketoproíen [17]

1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC ).

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại ra đời vào những năm cuối 1960 Nó được xây dựng và phát triển không ngừng và ngày càng thể hiện rõ tính ưu việt, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sinh dược học của thuốc

1.2.1 Phân loại các phương pháp sắc ký [ 2],

- Sắc ký phân bố: + sắc ký lỏng- lỏng

- Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

- Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel ( sắc ký theo loại c ỡ )

Trong phân tích sinh dược học và kiểm nghiệm, người ta hay sử dụng phương pháp sắc ký lỏng phân bố pha liên kết (Bonded Phase Chromatography )

- Nếu R là một nhóm ít phân cực như octyl (Cg), octadecyl (C|g) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol, acetonitril thì có sắc ký pha đảo (sắc ký pha ngược).

- Nếu R là nhóm khá phân cực như: alkylamin -(- CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -(- CH2- )n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc ký pha thuận

- Cách chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính chất phân cực giống các chất cần tách và khác với pha động

1.2.3 Nguyên tắc của phương pháp [2] [3].

Các chất trong hỗn hợp được tách dựa trên khả năng phân bố khác nhaucủa chúng vào hai pha không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc nhau: một phatĩnh và một pha động

Dung dịch mẫu thử được đưa vào hệ thống sắc ký qua van tiêm mẫu và được dung môi pha động kéo tới cột phân tích nhờ một bơm cao áp Tại cột xảy ra quá trình tách, nhữns phân tử nào có ái lực thấp với pha tĩnh thì được rửa giải ra trước, còn những phân tử nào có ái lực mạnh với pha tĩnh thì được rửa giải ra sau Chất ra khỏi cột được phát hiện bằng detector gắn với máy ghi, máy tính hay máy tích phân Thời gian lưu tR là đặc trưng định tính của chất, chiều cao hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất, sắc ký được tiến hành so với chuẩn

1.2.4 Một số thông số đặc trưng của HPLC [2]:

Ví dụ: Ta có 1 sắc đồ sau:

- Thời gian lưu tR (phút) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến lúc xuất hiện đỉnh của pic So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó.

- Thời gian chết tM (phút) là thời gian của một chất không bị lưu giữ tức là bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử dung môi

- Thời gian lưu hiệu chính tR’ được tính theo công thức:

Wl/2 chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh

- Độ phân giải Rs là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký

tR.B ÍR,A

R, =

-1/2(Wb + Wa )^

Để tách riêng hai chất, Rs > 1,5 ( khi 2 sắc đồ có độ lớn cùng c ỡ )

- Chiều cao pic hay diện tích pic là đặc trưng định lượng của chất Khi so sánh chiều cao pic hay diện tích pic của mẫu thử và chuẩn trong cùng điều kiện làm

ta tính được hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử

1.2.5 Pha tĩnh và pha động trong HPLC [3].

Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10|am, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trên cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong kỹ thuật HPLC.Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha liên kết Bản chất chính của sự tách trong loại sắc ký này là dựa trên khả năng tách của các chất trong hai pha không hoà lẫn vào nhau

- Các yêu cầu chung của pha tĩnh trong kỹ thuật HPLC:

+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký, khổng có

* các phản ìtng hoá hoc phu với dung môi rửa giải hay với chất phân tích

+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký

+ Tính chất bề mặt phải ổn định

+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

+ Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

- Pha tĩnh thường được chế tạo trên các chất nền sau:

+ Pha tĩnh trên nền Silicagel (Si02)

+ Pha tĩnh trên nền Oxid nhôm (AI 20 3)

+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ (polystyren, cellulose )

+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon

Trong 4 loại này thì nền Silicagel được sử dụng nhiều nhất và pha tĩnh được chê tạo trên nền này cũng có nhiều ưu việt hơn, như khả năng chịu áp cao, độ trương nở nhỏ khi thay đổi dung môi rửa giải, bền với nhiệt

•Ỉ& Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trinh sắc ký Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ như Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay cũng có thể là hỗn hợp của hai hay nhiều dung môi trộn với nhau theo những tỷ lệ phù hợp

Nó cũng có thể là dung dịch nước của các muối có chứa chất đệm, chất tạo

phức, chất làm chậm Nói chung, để có được hiệu quả tốt mỗi loại sắc ký sẽ có

các hệ dung môi rửa giải riêng cho nó Pha động là môt trong những

yếu tố quyết định thời gian lưu giữ của chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký,^K>7° /' ảnh hưởng tới sự phân giải của chất trong pha tĩnh

% Pha động trong kỹ thuật HPLC cần phải thoả mãn một số điều kiện sau:

+ Phải trơ đối với pha tĩnh

+ Phải hoà tan được chất mẫu

+ Phải bền vững theo thời gian

+Phải có độ tinh khiết cao

+ Phải nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

+ Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích

Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là hệ dung môi phân cực, nó

là những dung môi trộn lẫn đượcvới nước và trong nhiều trường hợp thì nước

lại là một thành phần chính của pha động Tiêu biểu và được dùng khá phổ

biến trong loại sắc ký phân bố pha liên kết là các dung môi methanol,

tetrahydroíuran, acetonitril, hay hỗn hợp của methanol, acetonitril với nước,

với đệm

Sắc ký phân bố pha liên kết được sử dụng rất phổ biến để tách nhiều loại

hỗn hợp mẫu từ vô cơ đến hữu cơ, chất không phân cực đến phân cực

Trong hệ pha này thì thành phần của pha động cũng ảnh hưởng đến kết quả

tách sắc ký

1.2.6 Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC.

- Phương pháp đường chuẩn

- Phương pháp thêm

- Phương pháp so sánh

Đối với việc xác định nồng độ hoạt chất trong dịch sinh học, tính toán kết

quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng bằng cách chủ động cho chất chuẩn

với nồng độ khác nhau vào dịch sinh vật x ử lý mẫu và đem chạy sắc ký

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nguyên vật liệu và hoá chất

Nguyên vật liệu:

- Ketoprofen 99,3% (Đạt theo BP 2001)

- Ibuprofen 99,0 % (Đạt theo USP 24)

- Naproxen 99,6% (Đạt theo USP 24)

^ Hoá chất:

- Acetonitril ( HPLC grade-Merck )

- Methanol ( HPLC grade- Merck )

- Acid acetic băng ( HPLC grade - Merck )

- Triethylamin ( PA grade - Merck )

^ Dụng cụ:

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Bơm cao áp Merck- Hitachi L-6000

+ Detector Merck-Hitachi L-4000 u v

+ Máy tích phân Merck -Hitachi D-2500 chromato-integrator.+ Van tiêm mẫu Rheohyne 1725 -USA

- Máy quang phổ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mỹ)

- Máy lọc nước siêu sạch Elga (Anh)

- Cân phân tích Satorius (Đức)

- Ly tâm điện Jouan (Pháp)

- Máy siêu âm Branson (Mỹ)

- Máy lắc Labinco

- Autopipet 10-100mcl, 1 0 0 - lOOOmcl

- Dụng cụ thuỷ tinh, bơm tiêm, ống nghiêm, bình định mức

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm

Khảo sát điều kiên sác ký

• Khảo sát chọn dung môi chiết Ketoprofen trong huyết tương

Khả năng chiết hoạt chất được biểu thị bằng hiệu suất chiết và khả năng loại tạp cản trở sự phát hiện ketoprofen trong mẫu phân tích

Mẫu thử được xử lý với các dung môi khác nhau theo sơ đồ sau:

Huyết tương (lm l)

'Dung môi hữu cơ (5ml)

Lọc

Hình 1: Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương ( chiết đơn )

Để tăng hiệu suất chiết, nhằm mục đích chiết kiệt hết hoạt chất trong huyết

thêm hai lần từ lúc thêm dung môi hữu cơ đến khi thu được cắn Tất cả các dịch chiết của 3 lần được tập trung vào một ống nghiệm, đuổi dung môi thu được cắn như sơ đồ 1.

• Tìm chất chuẩn nội

Dùng những chất có công thức hoá học gần giống với ketoproíen cho vào huyết tương đã chứa ketoproíen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 Chạy sắc ký để xác định thời gian lưu của chất chuẩn nội và ketoproíen, tính thừa số chọn lọc

a ( tốc độ di chuyển tỷ đối của hai c h ấ t) xem mức độ tách của hai chất Chất chuẩn nội phải tách hẳn với ketoproíen , hiệu suất chiết ổn định, bền vững, phát hiện dễ dàng ở điều kiện sắc ký trên

• Khảo sát chọn hệ dung môi (pha động) chạy sắc ký

M J Si Trong sắc ký phân bố pha liên kết, pha động là một hệ dung môi phân cực,

Chuẩn bị các hệ dung môi khảo sát, tiến hành chạy sắc ký với từng hệ dung môi,mẫu huyết tương có chứa ketoproíen và chuẩn nội được xử lý như sơ đồ hình l.Tính Rs của từng hệ dung môi từ đó chọn được hệ để phân tích ketoprfen trong huyết tương

% Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyêt tương

• Xâv dưng đường chuẩn trong pha đổng:

Pha 1 dãy dung dịch hỗn hợp ketoproíen và chất chuẩn nội trong pha động với nồng độ ketoprofen lần lượt là 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml và nồng độ chất chuẩn nội là 25mcg/ml Tiến hành chạy sắc ký, xác định thời gian lưu và diện tích pic của ketoprofen và chuẩn nội, từ

đó tính được tỷ số diện tích pic giữa ketoproíen và chất chuẩn n ộ i Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ ketoproíen và tỷ sô diện tích pic giữa ketoprofen

và chất chuẩn nội

• Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương.

Chủ động cho ketoproíen vào huyết tương để được một dãy các nồng độ

0.05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml Tiếp đó cho vào các

ống nghiệm cùng một nồng độ chất chuẩn nội x ử lý mẫu như sơ đồ hình

1.Chạy sắc ký, từ đó tìm ra mối tương quan giữa nồng độ ketoprroíen và tỷ số diện tích pic giữa ketoproíen và chất chuẩn nội

• Xác định tính chính xác của phương pháp (trong cùng một ngày và giữa các

ngày phân tích)

Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phương pháp

(biểu thị bằng RSD) Làm ở hai nồng độ : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml

• Xác định tính đúng của phương pháp: Bằng phương pháp thêm

Thêm chính xác một lượng mẫu chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ Ị ^ ^ ketoproíen, xử lý mẫu như sơ đồ hình 1 và tiến hành chạy sắc ký Tính %ị £2

ketoproíen chuẩn tìm lại được "

□ ÚNG DỤNG

Dùng phương pháp đã xây dựng để định lượng ketoproíen mẫu huyết tương

người sau khi uống viên nang ketoproíen 50 mg; 1,50 giờ và theo dõi độ bền

vững của ketoproíen trong huyết tương bảo quản ở - 30°c, sau 30; 60; 90

2.2.1 Khảo sát tìm dung môi chiết xuất

Dung môi hữu cơ dùng để chiết xuất phải có khả năng hoà tan tốt

ketoprofen và chất chuẩn nội, đồng thời phải loại được tạp chất và làm đông

vón protein huyết tương Khảo sát khả năng chiết của một số dung môi ta thu

được kết quả sau:

ngày.