Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện đồng thời 3 paraben bị cấm sử dụng trong các mẫu son, phấn và kem bôi da mỹ phẩm

Năm dẫn chất này gồm: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben Công văn số 6577/QLD-MP của Cục Quản lý Dược [4] quy định cụ thể về việc sử dụng pa

1 TS Lê Thị Hường Hoa

2 GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu

Nơi thực hiện:

Khoa mỹ phẩm

Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin cảm ơn GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, TS Lê Thị

Hường Hoa - hai người thầy đã hướng dẫn cho tôi những kỹ năng cần thiết trong quá

trình thực hiện khoá luận

Khoá luận của tôi được thực hiện tại Khoa Mỹ phẩm- Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới ThS Hoàng Thanh Tâm cùng với

sự giúp đỡ, hướng dẫn của cán bộ, nhân viên trong khoa Mỹ phẩm

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Hoá Phân tích và Khoa Mỹ phẩm (Viện kiểm nghiệm) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trường và các thầy cô đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã luôn động viên tôi trong quá trình học tập cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Liên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ PARABEN 3

1.1.1 Đặc điểm chung 3

1.1.2 Ứng dụng của paraben 4

1.1.3 Độc tính của paraben 5

1.1.4 Hành động đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben 6

1.1.5 Một số nghiên cứu về phân tích Paraben trong mỹ phẩm 7

1.1.6 Các paraben bị cấm được nghiên cứu xác định trong đề tài 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 8

1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký 8

1.2.3 Cấu tạo máy HPLC 9

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 11

1.2.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 12

1.2.6 Ứng dụng HPLC 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 16

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU 20

3.1.1 Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu 20

3.1.2 Cách chuẩn bị mẫu 20

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 21

3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 21

3.2.2 Cách tiến hành 21

3.2.3 Cách đánh giá kết quả 21

3.3 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH 21

3.3.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống: 21

3.3.2 Độ đặc hiệu 22

3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 25

3.3.4 Đánh giá độ đúng 28

3.3.5 Độ lặp lại 33

3.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.3.7 Áp dụng kiểm tra các mẫu mỹ phẩm 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC: Hight performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng cao)

UV-VIS: tử ngoại- khả kiến

IPP: Isopropylparaben

IBuP: Isobutylparaben

BenP: Benzylparaben

LOD: Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ: Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry (Phương pháp sắc ký khí khối phổ)

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối

CSSX: cơ sở sản xuất

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của một số paraben thường gặp 3

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích 16

Bảng 3.1 Độ thích hợp của hệ thống sắc ký 22

Bảng 3.2 Thời gian lưu của các chất nghiên cứu trên các loại mẫu thử khác nhau 25

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isopropylparaben 25

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isobutylparaben 26

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của benzylparaben 27

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên nền son 29

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên nền son 29

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền son 30

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên nền kem 30

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên nền kem 31

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền kem 31

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben trên nền phấn 32

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben trên nền phấn 32

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên nền phấn 33

Bảng 3.15 LOD và LOQ của các paraben nghiên cứu 33

Bảng 3.16 Kết quả phân tích đồng thời các paraben cấm 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 3.1 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu kem

so với mẫu chuẩn 23Hình 3.2 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu son

so với mẫu chuẩn 24Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu phấn

so với mẫu chuẩn 24Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ isopropylparaben 26Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ isobutylparaben 27Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ benzylparaben 28Hình 3.7 Sắc ký đồ phát hiện các paraben trong mẫu khăn ướt Rosy 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, nhu cầu chăm sóc cho bản thân càng trở nên thiết yếu, do đó mỹ phẩm trở thành sản phẩm tiêu dùng quen thuộc Mỹ phẩm còn là loại sản phẩm, hàng hóa có lợi nhuận cao nên vì lợi nhuận mà việc sản xuất, kinh doanh, buôn bán mỹ phẩm kém chất lượng, không an toàn là khó tránh khỏi, do đó việc đảm bảo chất lượng các sản phẩm mỹ phẩm cần được quan tâm nhiều hơn, đặc biệt là các cơ quan quản lý

Ngày 13 tháng 4 năm 2015, dựa trên kết quả kỳ họp Hội đồng mỹ phẩm ASEAN lần thứ 21, Cục quản lý dược ban hành công văn số 6577/QLD-MP về việc cập nhật quy định về các chất dùng trong mỹ phẩm, trong đó có công bố danh sách

5 paraben không được dùng trong mỹ phẩm là isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben

Paraben là nhóm chất kháng khuẩn và kháng nấm, được dùng làm chất bảo quản để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn (do nấm hoặc vi khuẩn) và hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của thuốc, mỹ phẩm [36] Ước tính có khoảng 75-90% sản phẩm mỹ phẩm có sử dụng dẫn chất paraben làm chất bảo quản (thường ở mức rất thấp) [39] Dù chưa đủ bằng chứng đề khẳng định nhưng nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các dẫn chất paraben có thể gây ung thư vú cho người sử dụng [37] Để đảm bảo lợi ích và an toàn cho người tiêu dùng, Uỷ ban mỹ phẩm châu Âu đã đưa ra quy định cập nhật năm dẫn chất paraben vào danh mục các chất không dùng trong mỹ phẩm: isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben, phenylparaben, pentylparaben [13]

Do điều kiện chỉ có 3 chất chuẩn isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện đồng thời 3 paraben bị cấm sử dụng trong các mẫu son, phấn và kem bôi da mỹ phẩm” nhằm 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng được quy trình phân tích 3 paraben isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben trong son, phấn và kem bôi da mỹ phẩm

2 Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm tra một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường để sơ bộ đánh giá việc lạm dụng các chất này trong mỹ phẩm

1 CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ PARABEN

1.1.1 Đặc điểm chung

Paraben được biết đến là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học được

sử dụng rộng rãi nhất trong các loại mỹ phẩm, ngoài ra một số gốc paraben còn được dùng trong thực phẩm, thậm chí cả dược phẩm [16], [21], [22], [32]

Paraben thường được sử dụng làm chất bảo quản Paraben có thể tìm thấy trong dầu gội, các chất dưỡng ẩm, gel cạo râu, chất bôi trơn cá nhân, kem đánh răng, phấn trang điểm [36] Chúng cũng được sử dụng như chất phụ gia thực phẩm

Paraben được tạo ra từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxybenzoic [8] Cấu trúc hóa học chung của một paraben là para –hydroxybenzoat trong đó R có thể là một nhóm alkyl hay aryl

Bảng 0.1 Tính chất của một số paraben thường gặp

Tên paraben Alkyl 4-hydroxybenzoat

Methyl Ethyl Propyl Butyl

Công thức phân tử C 8 H 8 O 3 C 9 H 10 O 3 C 10 H 12 O 3 C 11 H 14 O 3 Khối lượng mol 152,15 166,17 180,20 194,23 Thể chất

Tinh thể không màu hoặc dạng bột màu trắng

Tinh thể không màu hoặc dạng bột màu trắng

Tinh thể trắng

Tinh thể không màu hoặc dạng bột màu trắng Nhiệt độ nóng chảy/điểm đông

Các paraben đều ít tan trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol và các dung môi hữu cơ khác [3]

1.1.2 Ứng dụng của paraben

Các paraben có tác dụng diệt khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây hại khác nhau) và chống lại nhiều loại vi nấm nên thường được sử dụng làm chất bảo quản

Cơ chế hoạt động của các paraben hiện vẫn chưa được xác định rõ Paraben được cho là phá vỡ quá trình vận chuyển chất qua màng [15] hoặc ức chế tổng hợp ADN và ARN [25] hay một số enzym quan trọng

Hiệu quả bảo quản kết hợp với chi phí thấp, lịch sử sử dụng lâu dài của các paraben, cũng như sự không hiệu quả của một số chất bảo quản tự nhiên như các chất bảo quản chiết xuất từ hạt bưởi [38] có thể giải thích lý do tại sao paraben lại phổ biến như vậy Một hỗn hợp paraben có thể bảo vệ sản phẩm khỏi đa dạng các loại vi sinh vật Paraben có phổ kháng khuẩn rộng, còn có thể sử dụng trong khoảng

pH môi trường rộng (từ 3 đến 8), có nghĩa là gần như có thể bao quát tất cả các sản phẩm chăm sóc da trên thị trường [12], [21], [23], [31] Paraben cũng có khả năng chịu nhiệt rất tốt và tính ổn định cao Trong khi đó, các loại chất bảo quản khác thì

có giới hạn về phạm vi vi sinh vật, môi trường pH, và tính ổn định kém hơn nhiều Các loại mỹ phẩm không chứa paraben thường có giá thành đắt và hạn sử dụng ngắn

Đến nay vẫn chưa có khẳng định paraben là độc chất có thể phát triển tế bào ung thư [17] Các hoạt động kháng khuẩn của paraben tăng cùng với tăng chiều dài chuỗi alkyl Do đó, thông thường trong sử dụng, người ta phối hợp hai paraben trở lên để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hoạt tính kháng khuẩn của chúng mạnh nhất với vi khuẩn Gram (+) và kém nhất

đối với Pseudomonas [12], [33]

Ở Châu Âu, nồng độ cho phép của paraben trong mỹ phẩm là 0,4% cho mỗi chất và 0,8% cho cả nhóm

Điều tra của Hiệp hội Ung thư Mỹ và FDA thấy rằng nồng độ hiện tại của các paraben trong các sản phẩm tiêu dùng là không nguy hiểm Cũng trong hai năm

2005 và 2007, đứng trước bối cảnh có những dữ liệu mới về mối liên quan giữa những hóa chất có hoạt tính estrogen có trong các sản phẩm chăm sóc da với việc gia tăng tỷ lệ ung thư vú, đặc biệt là nghiên cứu phát hiện ra sự có mặt của paraben trong tế bào ung thư vú của 20 bệnh nhân được công bố bởi Phillippa D.Darbre [10] Hội đồng đánh giá các thành phần dùng trong mỹ phẩm của Mỹ đã tiến hành xem xét, đánh giá lại tính an toàn của 4 paraben phổ biến nhất nêu trên và kết luận rằng vẫn chưa có bằng chứng xác đáng chứng minh paraben có thể gây ung thư vú

và khuyến cáo người tiêu dùng không nên quá lo lắng vấn đề này

Nguyên nhân chính gây ra mối lo ngại về tính an toàn của paraben chính là hoạt tính giả estrogen của nhóm chất này Hoạt tính giả estrogen của paraben được

mô tả lần đầu tiên bởi Routledge và đồng nghiệp năm 1998 [34] và sau đó được

chứng minh bởi nhiều thử nghiệm in vitro và in vivo [7], [9], [19], [20], [29], [30],

[34] Phần lớn nghiên cứu đã công bố đều xác nhận hoạt tính giả estrogen của

paraben, chỉ có 1 trong số 25 nghiên cứu in vitro và 7 trong số 30 nghiên cứu in vivo

là báo cáo kết quả âm tính khi đánh giá tác dụng này của paraben[10] Tuy vậy, đa

số các nghiên cứu in vivo này đều tiến hành trên chuột mà chưa có dữ liệu nghiên

cứu trên người- trong đó có nghiên cứu đánh giá hoạt tính giả estrogen của paraben yếu hơn tác dụng của 17 beta-estradiol 104 lần và trong một nghiên cứu khác về sự gia tăng của tế bào ung thư vú MCF-7, tác dụng của paraben cũng yếu hơn 17 beta-estradiol từ 105-106 lần Nhiều hợp chất hóa học có hoạt tính giống estrogen thì đồng thời cũng có hoạt tính kháng androgen Do đó, gần đây đã có những báo cáo ghi nhận khả năng paraben liên kết với các receptor androgen ở người và ghi nhận các paraben kháng androgen thể hiện ở sự đối kháng tác dụng với testosteron trên một số gen được nghiên cứu Trên chuột trưởng thành uống propylparaben và butylparaben liên tiếp đã phát hiện ra sự sinh tinh, thải trừ testosteron và khối lượng mào tinh hoàn của chuột đều biến đổi [26], [27], [28] Tuy nhiên, sự thay đổi này cũng có thể do tác dụng kháng androgen của paraben qua những con đường chuyển hóa trung gian khác góp phần tạo nên và việc quy kết tác dụng kháng androgen của paraben có liên quan đến rối loạn chức năng sinh sản nam vẫn chưa có bằng chứng thuyết phục

Tăng nhạy cảm với ánh nắng mặt trời

Các nghiên cứu chỉ ra rằng methylparaben sử dụng trên da có thể phản ứng với UVB (tia tử ngoại có bước sóng 290-320nm) dẫn đến tăng quá trình lão hóa da

và tổn thương ADN [18]

1.1.4 Hành động đối với sản phẩm mỹ phẩm chứa paraben

Ngày 28-7-2015, Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế đã cho biết: “Thực hiện quyết định của Hội đồng mỹ phẩm ASEAN về việc cập nhật quy định các chất dùng trong

mỹ phẩm, Cục Quản lý Dược đã có thông báo việc đưa 5 dẫn chất paraben vào danh mục các chất không dùng trong mỹ phẩm Năm dẫn chất này gồm: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben

Công văn số 6577/QLD-MP của Cục Quản lý Dược [4] quy định cụ thể về việc sử dụng paraben trong mỹ phẩm như sau:

- Butylparaben và các muối, propylparaben và các muối (tham chiếu 12a Annex V) được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,14% (tính theo acid) và dạng hỗn hợp các paraben với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid)

- 05 paraben (isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben) được bổ sung vào Annex II (các chất không được dùng trong mỹ phẩm)

Quyết định ngừng lưu hành các sản phẩm mỹ phẩm chứa 5 loại paraben: (isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben) của Cục Quản lý Dược (Bộ Y tế) là một trong nhiều động thái của các nước ASEAN trong tiến trình xây dựng cộng đồng chung Dù rằng chưa thể khẳng định tác hại của paraben trong mỹ phẩm, đây là một nỗ lực bảo vệ sức khỏe của người dân trong khu vực

1.1.5 Một số nghiên cứu về phân tích Paraben trong mỹ phẩm

Tham khảo phương pháp hòa hợp của ASEAN (2005) [6] paraben được xác định bằng phương pháp HPLC với:

- Pha động: tetrahydrofuran:nước:methanol:aceton nitril tỷ lệ 5:60:10:25

Paraben cũng có thể được xác định bằng phương pháp HPLC với pha động: methanol: nước (20:80), detector UV-VIS, bước sóng 254nm [14]

Ngoài phương pháp HPLC, cũng đã có nghiên cứu sử dụng phương pháp

GC-MS để xác định các paraben trong các tế bào ung thư vú ở người [35]

1.1.6 Các paraben được nghiên cứu trong đề tài

Uỷ ban mỹ phẩm châu Âu đã đưa ra quy định cập nhật 5 dẫn chất paraben vào danh mục các chất không dùng trong mỹ phẩm bao gồm isopropylparaben, isobutylparaben, pentylparaben, benzylparaben và phenylparaben [13] Tuy nhiên,

do yêu cầu tại cơ sở chỉ có 3 chất chuẩn, do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định 3 paraben bị cấm là isopropylparaben, isobutylparaben và benzylparaben

Isopropylparaben Isobutylparaben Benzylparaben

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1 Sắc ký

Sắc ký là một nhóm các phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động [2]

1.2.1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (High performance liquid chromatography) là một kỹ thuật tách trong

đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến

ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất

ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1], [2]

1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký

Pha tĩnh được nhồi vào cột theo một kỹ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký (sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion…)

Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua, chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký

Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng quan các tương tác:

- Tương tác giữa các chất phân tích với pha tĩnh

- Tương tác giữa chất phân tích với pha động

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động

Mẫu phân tích được hoà tan trong pha động Pha động có thể là một chất lỏng (có thể ở trạng thái siêu tới hạn) hoặc chất khí được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hoà lẫn vào nó Pha tĩnh được cố định trong cột Các chất tan sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào tương tác giữa: chất tan - pha tĩnh - pha động Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau mà các thành phần của mẫu sẽ tách ra riêng biệt

1.2.3 Cấu tạo máy HPLC

Do bản chất hoá học của các chất phân tích rất khác nhau nên có nhiều kỹ thuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận được kết nối với nhau

1.2.3.1 Hệ thống cấp pha động

Pha động thường được chứa trong bình thuỷ tinh Có hai cách để dùng pha động rửa giải:

- Đẳng dòng: thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Chương trình hoá dung môi: Pha động là một hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2 - 4 dung môi được đựng trong các loại bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định Có hai kiểu thực hiện chương trình dung môi:

- Chương trình dung môi áp suất thấp: Các dung môi đựng trong các bình riêng Mỗi bình có van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hoà trộn, sau đó dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu

- Chương trình dung môi áp suất cao: Điểm khác chủ yếu là mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hoà trộn được thực hiện ở áp suất cao Chương trình này có tốn kém và cồng kềnh hơn so với loại hoà trộn ở áp suất thấp Tuy nhiên, nó có độ đúng

và độ lặp lại cao hơn

1.2.3.2 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:

- Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên (với 1 psi= 0.068 atm)

- Đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01-5,0 ml/phút

- Có thể chịu được sự tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn)

- Những máy sắc ký lỏng hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn Khoảng bơm có lưu lượng dao động từ 2-3ml/phút, áp suất có thể lên tới 10000 psi

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm Gần đây có loại cột nhỏ với đường kính trong 1-2 mm, dài 3-7,5 cm

Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặc liên kết hoá học với một chất hữu cơ) Bên cạnh Silicagel người ta còn dùng các hạt khác: nhôm oxyd, polyme xốp, chất trao đổi ion

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động

và trong mẫu phân tích làm tăng tuổi thọ của cột

1.2.3.5 Detector và bộ phận ghi tín hiệu

Detector là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu được ghi trên sắc ký đồ Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

1.2.4.1 Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố

K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì việc tách càng dễ dàng hơn

1.2.4.2 Thời gian lưu

Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector được gọi

là thời gian lưu tR Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động Thời gian tM của chất không lưu gọi là thời gian chết

1.2.4.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha Khác với hệ số phân bố K, hệ số k’ không chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất A

mà còn phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích pha tĩnh và thể tích pha động

Để tách riêng hai chất A, B cần α > 1, thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 – 2 Nếu α lớn quá, thời gian phân tích sẽ dài

1.2.4.5 Tính đối xứng của pic sắc ký

1.2.4.6 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ

1.2.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.2.5.1 Lựa chọn cột (pha tĩnh)

Phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu là sắc ký phân bố Trong sắc

ký phân bố có 2 loại:

- Sắc ký phân bố pha thuận

- Sắc ký phân bố pha đảo

Trong sắc ký phân bố pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực còn pha động không phân cực Trong sắc ký phân bố pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực hay ít phân cực

Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC:

- Phải trơ và bền vững trong môi trường sắc ký

- Silica đã alkyl hóa: được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm –OH trên

bề mặt Silica bằng gốc alkyl của mạch Carbon (C2, C8, C18) hay các gốc Carbon vòng

- Silica sulfon hóa hay nitro hóa: để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi cation Silica amin hóa dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion

1.2.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của

2-4 dung môi theo tỉ lệ nhất định Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách Pha động có thể ảnh hưởng tới:

Do vậy, việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng Yêu cầu của pha động:

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Phải hòa tan được chất mẫu

- Phải bền vững theo thời gian

- Phải có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detector

- Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường

1.2.6.1 Định tính

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng điều kiện sắc ký (pha động, pha tĩnh, nhiệt độ) là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phần, việc định tính bằng quang phổ thường gặp khó khăn Do vậy, HPLC thường dùng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ

1.2.6.2 Phân tích định lượng

Dữ liệu thực nghiệm dùng trong định lượng là chiều cao pic hoặc diện tích pic Chiều cao pic dễ đo, tuy nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp, cân đối Diện tích pic được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy

Những phương pháp thường dùng trong phân tích sắc ký:

- Phương pháp chuấn ngoại: tiến hành chạy sắc ký ở cả hai mẫu chuẩn và thử

trong cùng điểu kiện So sánh diện tích pic của mẫu thử với diện tích pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

- Phương pháp thêm chuẩn: thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các

chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu

và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của chất trong mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ C và sự tăng của diện tích pic S

- Phương pháp nội chuẩn: người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong

mẫu phân tích và trong dung dịch đối chiếu Tỉ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn

Một số yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

 Pic của chất chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác

 Pic của chất chuẩn nội phải gần với pic của chất phân tích

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: hàm lượng phần trăm của chất phân tích

được xác định bằng tỉ số (tính theo %) của diện tích pic chất đó và diện tích các pic

có trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và pic các chất có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện)

2 CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Dung môi và hóa chất

- Chất chuẩn Isopropylparaben (Canada) số lôLot#2-PLL-65-3 hàm lượng 98%

- Chất chuẩn Isobutylparaben(Canada) số lô Lot#3SCC165-1 hàm lượng 98%

- Chất chuẩn Benzylparaben (Canada) số lô Lot#4-JTN-11-1 hàm lượng 98%

- Methanol HPLC (Merck)

- Nước tinh khiết

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Máy sắc ký lỏng Shimadzu với 5 module:

 Bơm: Model LC- 10Atvp

 Detector mảng diod: Mode SPD-M10Avp

 Module điều khiển: Model SCL-10Avp

 Degasser: loại DGU- 14A

 Bộ trộn dung môi: loại FCV- 10Alvp

- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg

- Máy lắc siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích

STT Tên mẫu Nơi sản xuất Thành phần

1 Son Phấn Nụ Hoàng

Cung

CSSX Phấn Nụ Hoàng Cung- Bà Phương

Không có chất bảo quản nhóm paraben

2 Kem Gladys 45G631 Đài Loan Không có chất bảo quản nhóm paraben

3 Phấn bôi da Make up

Blusher Hàn Quốc Không có chất bảo quản nhóm paraben

- Một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường dùng để xác định sự có mặt của 3 paraben bị cấm (Phụ lục)

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Xây dựng phương pháp phát hiện 3 paraben cấm: isopropylparaben, isobutylparaben, benzylparaben có mặt trái phép trong mỹ phẩm với hai quy trình:

- Quy trình xử lý mẫu

- Quy trình phân tích, phát hiện 3 paraben cấm bằng HPLC

 Đánh giá phương pháp đã xây dựng:

- Tính đặc hiệu

- Độ chính xác của phương pháp (gồm độ đúng và độ lặp lại)

- Khoảng tuyến tính

- Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện

 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 3 paraben cấm: isopropylparaben, isobutylparaben và benzylparaben trong một số chế phẩm mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Xây dựng phương pháp phân tích với HPLC:

Sử dụng là 3 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: son, phấn, kem bôi da để xây dựng và thẩm định phương pháp Tiến hành thực nghiệm để tìm ra điều kiện sắc

ký thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê

- Xây dựng quy trình xử lý mẫu:

Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên trong môi trường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích)

- Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp: cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha

động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector PDA, thể tích tiêm mẫu Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết pic và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ

số tương đương của pic nghi ngờ thu được từ mẫu thử với pic thu được từ mẫu

chuẩn Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao pic thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn

Do đặc thù của mẫu mỹ phẩm, nếu có chứa chất cấm ở hàm lượng rất nhỏ nên chúng tôi chọn vùng giới hạn định lượng để đánh giá phương pháp, bao gồm các nội dung: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại

- Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu: mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: pic của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các pic khác (nếu có trong nền mẫu), pic của chất cần phân tích có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Nếu có đáp ứng pic phải không quá 1,0% so với đáp ứng pic của mẫu chuẩn Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết Hệ số chồng phổ UV-VIS của pic hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dung dịch thử/tự tạo với pic tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 0,99 trở lên

- Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (5 dung dịch) Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp

- Độ đúng:

Xác định trên các mẫu tự tạo Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu không có chất

cần phân tích Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 75%, 100% và 150% so với nồng độ phân tích Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính Tính lượng thu hồi theo công thức:

Tỷ lệ thu hồi (%) =

Lượng chất phân tích tìm lại

x100 Lượng chất chuẩn thêm vào

Tham khảo hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng: Tỷ lệ thu hồi 98,0-102,0% và RSD của tỷ lệ thu hồi không quá 2,0% ở mỗi mức nồng độ

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Có thể tiến hành theo cách pha loãng hoặc dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng Giá trị LOD = (3,3 x δ)/a, trong đó: δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng của mẫu nền (placebo), a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) giữa nồng độ và đáp ứng pic của chất cần phân tích LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt)

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê trên Microsoft Excel 2003

3 CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 KHẢO SÁT LỰA CHỌN CÁCH XỬ LÝ MẪU

3.1.1 Lựa chọn dung môi hòa tan mẫu

Lựa chọn dung môi để chiết rất quan trọng, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ trên một số dung môi hòa tan mẫu như ethanol, methanol, methanol - nước, và nhận thấy hỗn hợp dung môi methanol - nước (50 : 50) là hệ dung môi phù hợp với điều kiện tại cơ sở, đồng thời hòa tan được hoạt chất cần phân tích, ít lẫn tạp chất và loại được nhiều thành phần khác có trong các nền mẫu

Đối với mẫu son rắn, chúng tôi phân tán mẫu trước trong methanol, lắc siêu

âm trong 10 phút, sau đó thêm nước bằng thể tích methanol Với phấn và kem thì

xử lý đơn giản hơn, chỉ cần cho hỗn hợp dung môi methanol - nước (50:50) và lắc siêu âm 10 phút

3.1.2 Cách chuẩn bị mẫu

3.1.2.1 Chuẩn bị mẫu thử từ son nước và son rắn

Cân khoảng 0,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 25 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút sau đó thêm nước vừa đủ đến vạch Lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 5ml dịch lọc đầu Lọc qua màng lọc 0,45µm

3.1.2.2 Chuẩn bị mẫu thử từ phấn và kem bôi da

Cân khoảng 0,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm 25 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút sau đó thêm nước vừa đủ đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45µm (với các mẫu kem, lọc trước qua giấy lọc rồi mới lọc qua màng lọc)

3.1.2.3 Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Cân chính xác khoảng 20,0 mg từng chất chuẩn vào bình định mức 50ml thêm methanol để hòa tan và vừa đủ tới vạch Hút và pha loãng tiếp bằng pha động

để được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 2-16 µg/ml Các dung dịch này được sử dụng để pha dãy chuẩn hoặc pha dung dịch hỗn hợp chuẩn

- Dung dịch chuẩn đánh giá (QC): cân chính xác 0,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml, thêm một lượng mẫu chuẩn sao cho đạt nồng độ 100-120% của quy trình phân tích và xử lý giống như mẫu thử (Dùng trong quy trình thường quy để kiểm tra mẫu)

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký

Chúng tôi thử nghiệm và chọn được điều kiện sắc ký tương đối thích hợp dùng để phân tích như sau:

3.3 ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH

Đánh giá phương pháp bao gồm các nội dung: độ thích hợp của hệ thống sắc

ký, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng

3.3.1 Đánh giá độ thích hợp hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ từng paraben khoảng 8 µg/ml vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ, kết quả thu được như ở bảng 3.1

Vậy hệ thống đạt yêu cầu về độ thích hợp hệ thống:

Độ lặp lại tốt với RSD của thời gian lưu nhỏ hơn 0,3% và diện tích pic nhỏ hơn 2,0%; số đĩa lý thuyết trên 4000, hệ số bất đối nhỏ hơn 1,5 và độ phân giải trên 1,5 Do vậy đáp ứng yêu cầu phân tích cho cả 3 paraben isopropyl paraben, isobutyl paraben và benzylparaben

a)

b)

c)

Hình 3.1 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu

kem so với mẫu chuẩn a) mẫu nền kem b) mẫu tự tạo nền kem c) mẫu hỗn hợp chuẩn

a) b) c)

Hình 3.2 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu

son so với mẫu chuẩn

a) mẫu nền son b) mẫu hỗn hợp chuẩn c) mẫu tự tạo nền son

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu với 3 paraben nghiên cứu trên nền mẫu

phấn so với mẫu chuẩn

a) mẫu nền phấn b) mẫu tự tạo nền phấn c) mẫu hỗn hợp chuẩn

Kết quả thu được như ở hình 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy: Trên sắc ký đồ mẫu placebo không xuất hiện pic ở thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu bất kỳ chất nào trong số 3 paraben nghiên cứu Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu tự tạo cho 3 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của 3 pic chính thu được từ sắc ký

đồ của dung dịch hỗn hợp chuẩn

Thứ tự rửa giải và thời gian lưu của các chất trong các mẫu khác nhau thể hiện trên bảng 3.2

Bảng 3.2 Thời gian lưu của các chất nghiên cứu trên các loại mẫu thử khác nhau

Isopropyl paraben Isobutyl paraben Benzyl paraben

3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính

Với lượng chất chuẩn isopropylparaben sử dụng là 21,3 mg sử dụng các độ pha loãng 200/1 đến 100/2 để có các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 25-200%

so với nồng độ dự kiến định lượng Trong khoảng nồng độ 2,13-17,04 mcg/ml, hệ

số tương quan (r) thu được là 0,9999 Đường chuẩn có hệ số góc là 71114 và hệ số chắn (intercept) là 2496,4 Kết quả được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3.Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isopropylparaben

STT Nồng độ IPP

(mcg/ml)

% so với nồng độ định lượng

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

isopropylparaben

Với lượng chất chuẩn isobutylparaben sử dụng là 22,3 mg sử dụng các độ pha loãng 200/1 đến 100/2 để có các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 25-200%

so với nồng độ dự kiến định lượng Trong khoảng nồng độ 2,23-17,84 mcg/ml, hệ

số tương quan (r) thu được là 0,9996 Đường chuẩn có hệ số góc là 54981 và hệ số chắn (intercept) là 20874 Kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của isobutylparaben

STT Nồng độ IBuP

(mcg/ml)

% so với nồng độ định lượng

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

isobutylparaben

Với lượng chất chuẩn benzylparaben sử dụng là 20,5 mg sử dụng các độ pha loãng 200/1 đến 100/2 để có các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 25-200% so với nồng độ dự kiến định lượng Trong khoảng nồng độ 2,05-16,40 mcg/ml, hệ số tương quan (r) thu được là 0,9996 Đường chuẩn có hệ số góc là 55720 và hệ số chắn (intercept) là 351,54 Kết quả được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của benzylparaben

STT Nồng độ BenP

(mcg/ml)

% so với nồng độ định lượng

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ

benzylparaben

3.3.4 Đánh giá độ đúng

Thêm chính xác một lượng chất chuẩn paraben vào nền mẫu placebo, sao cho sau khi xử lý theo qui trình phân tích nồng độ dung dịch cuối cùng đem sắc ký phải nằm trong khoảng 75 - 150% so với nồng độ định lượng Tiến hành ở 3 mức nồng

độ khác nhau: 75%, 100% và 150%, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần Dựa vào diện tích pic của chất tương ứng trong dung dịch chuẩn hỗn hợp để tính ra lượng chất chuẩn tìm thấy

3.3.4.1 Kết quả khảo sát độ đúng của 3 paraben trên nền son

Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền son Phấn Nụ Hoàng Cungvới IPP, IBuP

và BenP thu được kết quả như ở các bảng 3.6, 3.7 và 3.8

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben

Lượng chuẩn IPP thêm (g)

Diện tích pic IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

Lượng chuẩn IBuP thêm (g)

Diện tích pic IBuP (mAu.s)

Lượng IBuP tìm lại (g)

% thu hồi

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với benzylparaben trên

Lượng chuẩn BenP thêm (g)

Diện tích pic BenP (mAu.s)

Lượng BenP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

3.3.4.2 Kết quả khảo sát độ đúng của 3 paraben trên nền kem

Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền kem Gladys 45G631với IPP, IBuP và BenP thu được kết quả như ở các bảng 3.9, 3.10 và 3.11

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben

Lượng chuẩn IPP thêm (g)

Diện tích pic IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isobutylparaben

Lượng chuẩn IBuP thêm (g)

Diện tích pic IBuP (mAu.s)

Lượng IBuP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

Lượng chuẩn BenP thêm (g)

Diện tích pic BenP (mAu.s)

Lượng BenP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

3.3.4.3 Kết quả khảo sát độ đúng của 3 paraben trên nền phấn

Thực hiện khảo sát độ đúng trên nền phấn bôi da Make up Blusher với IPP, IBuP và BenP thu được kết quả như ở các bảng 3.12, 3.13 và 3.14

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với isopropylparaben

Lượng chuẩn IPP thêm (g)

Diện tích pic IPP (mAu.s)

Lượng IPP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)

Lượng chuẩn IBuP thêm (g)

Diện tích pic IBuP (mAu.s)

Lượng IBuP tìm lại (g)

% thu hồi

Trung bình

RSD (%)