NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆNESCHERICHIA COLI O157 TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR Võ Văn Giàu, Lại Trịnh Anh Khoa, Phạm Vũ Việt Dũng, Nguyễn Tiến Dũng Trung tâm
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
ESCHERICHIA COLI O157 TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ
THUẬT MULTIPLEX-PCR
Võ Văn Giàu, Lại Trịnh Anh Khoa, Phạm Vũ Việt Dũng, Nguyễn Tiến Dũng
Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4
TÓM TẮT: Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình PCR sử dụng hai cặp mồi
chuyên biệt để phát hiện E.coli O157 trong thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy cặp mồi stx1F/stx1R đặc hiệu cho gen stx1 và cặp mồi stx2F/stx2R đặc hiệu cho gen stx2 của vi khuẩn
E coli O157 Kỹ thuật multiplex PCR với hai cặp mồi để khuếch đại các gen mục tiêu stx1, stx2 đã được xây dựng thành công Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp được xây dựng
có độ nhạy đạt 98%, độ chính xác đạt 98%, độ đặc hiệu 100%, tỷ lệ dương tính giả 0% và tỷ
lệ âm tính giả 4% Hiệu quả phân tích E coli O157 bằng phương pháp mới được xây dựng
tương đương với phương pháp nuôi cấy theo tiêu chuẩn ISO 16654:2001 nhưng có thời gian cho kết quả phân tích ngắn hơn, chỉ sau 2 ngày.
SUMMARY: The objective of this study was developing the multiplex PCR method using two
pairs of specific primers to detect E coli O157 in food The study results show that stx1F/stx1R primers are specific for stx1 and primers stx2F/stx2R are specific for stx2 genes
in E coli O157 The multiplex PCR method with two pairs of primers for amplifying the stx1, stx2 target genes to detect E coli O157 in food has been set up successfully The results of evaluating of method show that the multiplex PCR method have sensitivity is 98%, accuracy is 98%, specificity is 100%, the false positive rate is 0% and false negative rate is 4% The above results indicate the multiplex PCR has been set up and the standard method according
to ISO 16654:2001 are equivalent for detection of E coli O157 in food, but the time for analysis of multiplex PCR is shorter, only 2 days.
I ĐẶT VẤN ĐỀ: E coli O157 là một trong những dòng E coli gây ngộ độc
thực phẩm nghiêm trọng ở người Vi khuẩn này đã từng gây nên những vụ ngộ
độc thực phẩm nghiêm trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới với các hội chứng
tiêu chảy, viêm ruột xuất huyết, hội chứng tán huyết tăng urê (HUS)
Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli O157 là độc tố Shiga toxin (Stx) hay
Shiga-like toxin (Slt) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo
với nhau là Stx1 và Stx2 Một dòng E coli O157 có thể sản sinh một trong hai
độc tố Stx1, Stx2 hoặc cả hai Stx1 và Stx2 Độc tố Stx tác động lên các loại tế
bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, Gb4 Hậu quả là làm tổn hại những tế bào thành mạch máu, gây nên triệu chứng phù thủng Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng tán huyết tăng urê (HUS) ở người
Hiện nay, các phòng kiểm nghiệm tại Việt Nam phân tích E coli O157 trong
thực phẩm chủ yếu sử dụng phương pháp nuôi cấy Về mặt hình thái học, khuẩn
lạc của E coli O157 rất khó phân biệt với các E coli non-O157 trên các môi
trường phân lập, điều này làm giảm tính đặc hiệu của phương pháp và gây nên tỉ
lệ âm tính giả cao Ngoài ra phương pháp nuôi cấy đều tồn tại hạn chế là thời gian phân tích từ 4 – 6 ngày, không phù hợp với yêu cầu phân tích nhanh các
mẫu thực phẩm nghi ngờ nhiễm E coli O157 phục vụ cho mục đích giám sát
khẩn cấp Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng một phương pháp phát hiện
nhanh vi khuẩn E coli O157 trong thực phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR với
độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương hoặc cao hơn phương pháp
nuôi cấy
Trang 2II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Chủng vi sinh vật: Các chủng dùng trong nghiên cứu được liệt kê ở Bảng 1.
Bảng 1 Chủng vi khuẩn sử dụngtrong nghiên cứu
TT Tên chủng Số lượng Nguồn gốc Ký hiệu
Mồi trong phản ứng khuếch đại PCR cho E coli O157: Hai cặp mồi stx1F/stx1R
và stx2F/stx2R được nhóm nghiên cứu thiết lập dựa vào trình tự bảo tồn của các
gen tương ứng được công bố trên Gen Bank Trình tự mồi được thiết kế bằng
mềm Oligo Explorer 1.1.0 và được tổng hợp bởi công ty Sigma Trình tự các mồi như trong Bảng 2
Bảng 2: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên gen Trình tự oligonucleotide Kích thước khuếch đại (bp)
stx1 stx1F: 5'- gag cga aat aat tta tat gtg -3’
stx1R: 5'- ttg atg atg gca att cag tat -3’ 520
stx2 stx2F: 5'- cca tga caa cgg aca gca gtt -3’
stx2R: 5'- cct gtc aac tga gca ctt tgc -3’ 780
Mẫu sử dụng trong nghiên cứu: Bao gồm thịt heo, thịt bò, thịt gà, mẫu thủy sản
và rau được thu nhận tại các chợ, siêu thị tại thành phố Hồ Chí Minh
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Tăng sinh: Cân 25g mẫu cho vào túi nilon vô trùng, thêm vào túi 225ml
môi trường Modified Tryptone Soya Broth with Novobiocine (mTSB), đồng nhất trong 30 giây, ủ ở 41,5oC trong 10–24 giờ Chuyển 1ml dịch canh khuẩn vào ống eppendoft 1,5ml để ly trích DNA dùng cho phân tích bằng kỹ thuật multiplex PCR
2.2.2 Xử lý dịch vi khuẩn và ly trích DNA: Dịch vi khuẩn trong eppendorf được
ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút; loại bỏ phần nước; rửa lại bằng 0,5ml
đệm TE; ly tâm với tốc độ như trên để loại bỏ phần nước, phần kết tủa được
huyền phù lại với 0,5ml TE, đun cách thủy 10 phút ở 100oC, ly tâm 3000 vòng/phút, dịch nổi được sử dụng làm khuôn DNA trong các phản ứng PCR
2.2.3 Thành phần phản ứng PCR: Tất cả các thí nghiệm khuếch đại bằng phản
ứng PCR được thực hiện với dung tích phản ứng là 50l trong ống eppendorf 0,2ml, thành phần như sau: 25l dung dịch Fast start PCR Master Mix, 2,5l mỗi mồi với nồng độ 0,5M, 5l khuôn DNA, thêm nước cất để đủ 50,0l
2.2.4 Chương trình phản ứng PCR: Được tiến hành theo 3 bước sau: (i) 94oC trong 5 phút; (ii) 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm: biến tính ở 94oC trong 1 phút, bắt cặp ở 54oC trong 1 phút, kéo dài ở 72oC trong 2 phút; (iii) giữ ở nhiệt độ 72oC
Trang 3log(LOD50) = L - d(Pi– 0,5) = m; hay LOD50=10m
trong 10 phút để cho các đoạn DNA chưa tổng hợp hoàn chỉnh sẽ tiếp tục được
tổng hợp, sau đó giữ ổn định ở 4oC
2.2.5 Phân tích sản phẩm: 5µl sản phẩm khuếch đại trộn với 2,5l đệm tải mẫu
và nạp vào các giếng trên gel agarose 2% đã có chất nhuộm SYBR® Safe DNA 10,000X Điện di ở 130V, 250mA trong 25 phút Quang sát và ghi nhận kết quả bằng thiết bị Universal Hood II (Biorad) và Video graphic Printer (Sony) Xác
định kích thước sản phẩm bằng thang DNA chuẩn của hãng Invitrogen
2.2.6 Xác định E coli O157 bằng phương pháp nuôi cấy: theo ISO 16654:2001 2.2.7 Xác định giới hạn phát hiện LOD50: được thực hiện theo phương pháp
Spearman-Karber 50% Endpoint Chuẩn bị một dãy pha loãng nhị phân dịch vi
khuẩn E coli O157 từ mật độ ban đầu khoảng 25 CFU/ml Hút 1ml mỗi dịch
pha loãng để gây nhiễm vào 25g mẫu Thực hiện 10 lần lặp lại cho một mật độ
gây nhiễm Phân tích mẫu gây nhiễm bằng bằng phương pháp đã định Giới hạn
phát hiện LOD50của phương pháp được xác định theo công thức như sau:
Trong đó: L là logarit cơ số 10 của số vi khuẩn được gây nhiễm thấp nhất mà tại đó 100% số lần lặp lại cho kết quả dương tính; d: Hệ số pha loãng của dịch
vi khuẩn (d=2); P i : tỉ lệ mẫu cho kết quả phát hiện dương tính trong khoảng 50% Pi 100% tương ứng với với nồng độ pha loãng thứ i, n là số lần lặp lại
đối với nồng độ pha loãng thứ i (n=10)
2.2.5 Xác các thông số kỹ thuật của phương pháp: Các thông số của phương
pháp multiplex PCR cần được xác định bao gồm: độ chọn lọc, độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỉ lệ âm tính giả, tỉ lệ dương tính giả Các thông số này được xác định dựa trên phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 được thực hiện
theo hướng dẫn xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh vật tại ISO
16140:2003
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tính chuyên biệt của cặp mồi phát hiện gen stx1 và stx2: Để đánh giá tính
chuyên biệt của cặp mồi stx1F/stx1R và stx2F/stx2R trong việc phát hiện gen mã hóa cho độc tố Stx1 hoặc Stx2, các dòng vi khuẩn trong Bảng 1 đã được sử dụng, trong đó 3 chủng E coli O157:H7, 12 chủng E coli non-O157 và 3 vi sinh
vật gây bệnh khác
Kết quả khảo sát cho thấy, đối với cặp mồi stx1F/stx1R, tất cả các dòng E coli
O157:H7 đều cho sản phẩm khuếch đại với kích thước 520bp, các dòng E coli
non-O157 và các vi sinh vật gây bệnh khác như Salmonella, Shigella sonnei và Vibrio cholerae đều không cho tín hiệu khuếch đại (Hình 1).
Hình 1 Kết quả khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi stx1F/stx1R
MR: Thang chuẩn; 1-2: E coli ATCC 25922 và 11775; 3-8 và 10-13: chủng E coli E1 đến E10; 9: E coli O157:H7(TN); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất
520bp
600bp
500bp
Trang 4Đối với cặp mồi stx2F/stx2R, trong số các chủng khảo sát chỉ có duy nhất có
chủng E coli O157:H7 (NL) cho kết quả dương tính với kích thước sản phẩm khuếch đại là 78bbp Chủng E coli O157:H7 (TW); chủng E coli O157:H7 (TN); 10 chủng E coli non-O157 và các chủng vi sinh vật khác đều không cho
sản phẩm khuếch đại với cặp mồi này (Hình 2)
Kết quả như trên chứng tỏ cặp mồi stx1F/stx1R chỉ cho sản phẩm khuếch chuyên biệt với các E coli O157, không cho tín hiệu khuếch đại với các E coli non-O157 và các vi sinh vật khác Cặp mồi stx2F/stx2R chỉ cho tín hiệu khuếch
đại với những dòng E coli O157 có mang gen mã hóa cho Stx2 Họ độc tố Stx
của E coli O157 gồm hai nhóm chính là Stx1 và Stx2, một dòng có thể sản sinh
độc tố Stx1, Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, thậm chí nhiều dạng của Stx2 như
Stx2c, Stx2hb, Stx2e Stx2g Có đến 60% chủng E coli thuộc nhóm huyết thanh này mang stx1 Các chủng chỉ mang stx2 có độc lực mạnh hơn so với những
chủng chỉ mang gen stx1 hoặc mang đồng thời cả hai gen này.
3.2 Xây dựng phương pháp phát hiện E coli O157 dựa trên phản ứng mutiplex PCR với hai cặp mồi khuếch đại 2 đoạn gen stx1 và stx2
Độc tố Shiga của vi khuẩn E coli O157có thể được tạo ra từ chủng mang stx1
hoặc stx2 hay cả hai gen này Do đó để phát hiện được tất cả các E coli mang
độc tố shiga, chúng tôi đã phối hợp cả hai cặp mồi phát hiện đồng thời stx1 và
stx2 trong cùng một phản ứng khuếch đại PCR Kết quả cho thấy phản ứng
multiplex PCR được thiết lập đã khuếch đại đồng thời hai đoạn gen có kích thước 520bp và 780bp (Hình 3) Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, với phản
ứng multiplex PCR đã thiết lập, chỉ có các E coli O157 mới cho một trong hai
hoặc đồng thời hai sản phẩm khuếch đại có kích thước như trên
Hình 2 Kết quả khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi stx2F/stx2R
MR: Thang chuẩn; 12: E coli ATCC 25922 và 11775; 38 và 1013: Các chủng E coli E -E10; 9: E coli O157:H7 (NL); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất
800bp
Hình 3 Kết quả khảo sát sự chuyên biệt của các cặp mồi khuếch đại các gen stx1, stx2
ở các chủng vi sinh vật khác nhau trong phản ứng multiplex-PCR
MR: Thang chuẩn; 1-2: E coli ATCC 25922 và 11775; 3-8 và 10-13: chủng E coli E1 - E10; 9: E coli O157:H7 (NL); 14: Salmonella; 15: Shigella; 16: V cholerae; 17: Nước cất
780bp
520bp
Trang 5Trên cơ sở khả năng khuếch đại chuyên biệt các đoạn gen stx1, stx2 của phản
ứng multiplex PCR đã thiết lập, quy trình phát phát hiện E coli O157 trong thực
thực phẩm đã được thiết lập gồm các bước như sau: 25g mẫu thực phẩm được tăng sinh và phân tích như 2.2.1 đến 2.2.5 Kết quả phân tích được xác định là
dương tính với E coli O157 khi có một trong hai hoặc cả hai sản phẩm khuếch
đại có kích thước tương ứng là 520bp và 780bp Kết quả phân tích trong mẫu
được xác định là âm tính với E coli O157 khi không xuất hiện sản phẩm khuếch
đại, hoặc sản phẩm khuếch đại có kích thước khác với sản phẩm trên Để đảm
bảo độ tin cậy của quy trình phát hiện, trong mỗi lần phân tích phải có các mẫu
đối chứng âm tính và dương tính với E coli O157 đi kèm Mẫu đối chứng
dương tính là mẫu có chứa E coli O157 mang cả 2 gen stx1 và stx2.
3.3 Xác định các thông số kỹ thuật của quy trình multiplex PCR được thiết lập: Các thông số được đánh giá là: Giới hạn phát hiện LOD50, độ chọn lọc, độ đặc hiệu, tỉ lệ dương tính giả, tỉ lệ âm tính giả Các thông số này được xác định
dựa trên phương pháp tham chiếu là ISO 16654:2001
3.3.1 Xác định giới hạn phát hiện LOD 50 của phương pháp: Các thí nghiệm để
xác định LOD50 được thực hiện với 80 mẫu, bao gồm: 40 mẫu cá tra fillet, 40
mẫu thịt heo tươi, các mẫu này đã được xác định âm tính với E coli O157 Chủng E coli O157:H7 (NL) được sử dụng để gây nhiễm vào các mẫu đã chuẩn
bị với các mật độ khác nhau Kết quả phát hiện E coli O157 trong các mẫu đã
gây nhiễm được trình bày trên Bảng 3
Bảng 3 Kết quả xác định LOD 50 của phương pháp Mật độ vi khuẩn
trong 25g (CFU)
Hệ số pha loãng
Số lần lặp lại
Số lần cho kết quả dương tính Tỉ lệ dương tính
Áp dụng công thức tính toán LOD50 theo mục 2.2.6, kết quả xác định được như
sau: LOD50 trung bình là 2,3 CFU/25g, với độ tin cậy 95%, giá trị LOD50 của phương pháp giao động trong khoảng 2 - 3 CFU/25g mẫu
3.3.2 Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp: Các thông số này được
xác định cho 4 nhóm mẫu là: hải sản, thịt heo, thịt gà và rau xà lách Mỗi nhóm
mẫu được thực hiện trên 30 mẫu gây nhiễm E coli O157và 30 mẫu không được
gây nhiễm vi sinh vật này Mật độ gây nhiễm trong khoảng 3 – 10 CFU/25g Kết quả đánh giá trung bình cho các nhóm mẫu được trình bày trong Bảng 4
Bảng 4 Các thông số kỹ thuật của phương pháp multiplex-PCR phân tích E coli
O157 so với phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 Thông số
đánh giá
Độ nhạy
(%)
Độ đặc
hiệu (%)
Độ chính
xác (%)
Dương tính
giả (%)
Âm tính giả (%) Kết luận
Phương
Yêu cầu ≥ 98,0 ≥ 90,4 ≥ 94,0 ≤ 9,6 ≤ 2,0 Tham chiếu(*)
( * Tham chiếu theo MMC-Microbiology Methods Committee, Canada)
Trang 6Các thông số kỹ thuật của phương pháp multiplex PCR trong Bảng 4 cho thấy
chúng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu của phương pháp phân tích tiêu chuẩn Quá trình nghiên cứu cũng cho thấy các hệ vi sinh vật và thành phần hóa học trong
các loại thực phẩm đã được đánh giá không ảnh hưởng đến việc phát hiện E coli
O157 bằng phương pháp multiplex PCR Thời gian cho kết quả phân tích bằng phương pháp này trong vòng 24 giờ Điều này giúp các phòng kiểm nghiệm có
định hướng sớm trong chẩn đoán các trường hợp ngộ độc thực phẩm
IV KẾT LUẬN
Đã xây dựng thành công quy trình phát hiện E coli O157 trong thực phẩm bằng
phản ứng multiplex PCR khuếch đại 02 đoạn gen mục tiêu stx1 và stx2 Qui
trình được thiết lập có các thông số cơ bản như sau: Thời gian tăng sinh trong
môi trường mTSB là 10-18 giờ, dịch tăng sinh được xử lý và khuếch đại với 2
cặp mồi stx1F/stx1R và stx2F/stx2R, nồng độ mỗi mồi là 5µM Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng là 2,5µM Nhiệt độ bước bắt cặp giữa mồi và khuôn
trong chương trình khuếch đại là 54oC Kết quả đánh giá hiệu lực quy trình multiplex-PCR so với phương pháp nuôi cấy theo ISO 16654:2001 cho thấy: độ
đặc hiệu tương đối (SP) đạt 100%; độ chính xác tương đối (AC) đạt 98%; độ
nhạy tương đối (SE) đạt 98%; tỷ lệ âm tính giả 4% và tỷ lệ dương tính giả 0%, LOD50 là 2CFU/25g Kết quả này cho thấy phương pháp multiplex PCR cho kết
quả phát hiện E coli O157 trong thực phẩm tương đương với phương pháp ISO
16654:2001
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trần Thanh Phong và cộng sự (2007) Phát hiện một số gen độc lực của E.
coli trên thịt bò, heo và trong phân bò, heo bằng kỹ thuật Multiplex PCR Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 3/2007.
2 Calderwood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barrett T J., Griffin P.
M., Strockbine N A et al (1996) Proposed new nomenclature for SLT (VT)
family ASM News 62:118-119.
3 ISO 16140:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Protocol
for the validation of alternative methods International Organization for Standardization.
4 ISO 16654:2001: Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Horizontal method for the detection of Escherichia coli O157.
5 Son Radu Shahilah Abdul Mutalib, Gulam Rusul, Zainori Ahmad, Tadaaki
Morigaki, Norio Asai,Yung Bu Kim, Jun Okuda, and Mitsuaki Nishibuchi.
(1998) Detection of E coli O157:H7 in the Beef Marketed in Malaysia Appr Envirol Microbiol, March 64(3), 1153-1156.
6 Terrance M Arthur, Joseph M Bosilevac, Xiangwu nou, and
Mmohammad koohmaraie (2005) Evaluation of Culture- and PCR-Based
Detection Methods for Escherichia coli O157:H7 in Inoculated Ground Beef Journal of Food Protection, Vol 68, No 8, 2005, Pages 1566–1574.