Ma túy lưu giữ trong tóc lâu nhưng với lượng rất nhỏ do đó phải sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu kết hợp với phương pháp phân tích có độ nhạy cao.. Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu thường d
Trang 11
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
MỞ ĐẦU
Tệ nạn ma túy đang là hiểm họa của các quốc gia, dân tộc trên toàn thế giới;
là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm phát sinh tội phạm, tệ nạn xã hội và lây nhiễm HIV/AIDS Những hậu quả do tệ nạn ma túy gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát triển kinh tế - xã hội và an ninh trật tự của đất nước
Hàng năm, các chất ma túy tổng hợp được vận chuyển trái phép vào Việt Nam với số lượng rất lớn, các chất này được sử dụng nhiều trong các vũ trường, quán bar, karoke…Các chất ma túy tổng hợp phổ biến phải được kể đến như amphetamine (AM), methamphetamine (MA), 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), 3,4-Methylendioxymethamphetamin (MDMA), ketamine Những loại ma túy này vẫn lưu thông trên thị trường một cách bất hợp pháp dưới dạng viên nén, tinh thể, dạng lỏng với các tên gọi Adam, Eva, Love, VW, Ice, Tên lửa, Thiên thần, viên lắc, thuốc lắc, viên chúa, viên hoàng hậu, ecstasy, mercedes, đá, nước vui…Sự thay thế của ma túy tổng hợp cho ma túy truyền thống là xu hướng tất yếu trên thế giới và ở Việt Nam Khoảng 5 năm trở lại đây Việt Nam chứng kiến sự bùng phát của ma túy tổng hợp ATS đặc biệt là Ecstasy và ma túy đá [1]
Đối tượng sử dụng các chất ma túy tổng hợp hiện nay tập trung chủ yếu là tầng lớp thanh niên, trung niên sống ở Thành phố, thị xã Số người sử dụng ma túy tăng cao có ảnh hưởng xấu tới trật tự an ninh xã hội Sử dụng ma túy tổng hợp thường tụ tập theo nhóm đông người ở các vũ trường, quán bar hay nhà nghỉ, nhà riêng…
Việc chứng minh người sử dụng ma túy tổng hợp khó khăn hơn các chất ma túy dạng thuốc phiện vì chúng kích thích thần kinh trung ương tạo cảm giác sảng khoái, tỉnh táo, phấn chấn, tinh thần nhanh nhẹn, tăng tính năng động tự tin, tăng vận động, nói năng, giảm mệt mỏi, dịu đau Các trạng thái này khó phát hiện ra người nghiện so với ma túy dạng thuốc phiện làm co đồng tử, ức chế hô hấp
Phân tích, giám định mẫu máu, nước tiểu hiện đang là phổ biến nhưng có một số bất lợi đó là lượng ma túy bị đào thải và chuyển hóa nhanh, lấy mẫu không thuận tiện, không giữ được yếu tố bí mật và đặc biệt với mẫu máu rất khó lấy mẫu
Trang 22
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
nếu không có chuyên môn gây ảnh hưởng đến sức khỏe Để khắc phục những nhược điểm đó phương pháp tối ưu nhất là phân tích ma túy trên mẫu tóc Ma túy lưu giữ trong tóc lâu nhưng với lượng rất nhỏ do đó phải sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu kết hợp với phương pháp phân tích có độ nhạy cao
Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện Methamphetamine trong mẫu tóc bằng phương pháp Sắc ký khí khối phổ kép (GC/MS/MS)”
Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:
1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp GC/MS/MS để phân tích chất ma túy tổng hợp MA cho kết quả chính xác nhờ vào việc so sánh cả thời gian lưu và khối phổ của chất phân tích với chất chuẩn [8,13]
2 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp SPE sử dụng chất hấp phụ C8 dùng để chiết, và làm sạch MA từ mẫu tóc
3 Tạo dẫn xuất HFBA vào nhóm amin của chất MA làm tăng khả năng bay hơi của chất phân tích, giúp phù hợp hơn trong quá trình phân tích sắc ký, tăng độ nhạy cho thiết bị phân tích sắc ký [1]
4 Quy trình sử dụng chất nội chuẩn đánh dấu Amphetamin-D5 (AM-d5) cho vào mẫu tóc ngay từ đầu trước khi tiến hành các bước xử lý mẫu sẽ giúp loại ảnh hưởng sai số trong các thao tác phân tích, tăng độ chính xác của kết quả đo
5 Thẩm định phương pháp đã xây dựng và ứng dụng phân tích trên một số
mẫu thực tế
Trang 33
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ma túy
Định nghĩa và phân loại [6,9]
*Định nghĩa:
Các chất ma túy là các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ làm thay đổi trạng thái ý thức, trí tuệ Nếu dùng lặp lại nhiều lần
sẽ làm cho người dùng lệ thuộc vào nó, gây nguy hại cho cá nhân và cho cộng đồng
*Phân loại các chất ma túy:
Các chất ma túy có thể phân loại theo những cách sau đây:
- Phân loại theo nguồn gốc
- Phân loại theo tác dụng dược lý
- Phân loại theo cấu trúc hóa học
- Phân loại theo cách thức sử dụng Tuy nhiên hiện nay trên thế giới, cách phân loại ma túy theo nguồn gốc và tác dụng dược lý là phổ biến
*Phân loại dựa theo nguồn gốc
Các chất ma túy được phân loại theo nguồn gốc gồm có 3 nhóm chính:
Nguồn gốc tự nhiên:gồm các chất ma túy được chiết xuất từ nguyên liệu có
nguồn gốc tự nhiên, như canabionls trong cây cần sa, morphine trong cây thuốc phiện,…
Nguồn gốc bán tổng hợp:là các chất ma túy có nguồn gốc tự nhiên được tổng
hợp thêm 1 hoặc vài nhóm chức như heroine được tổng hợp từ morphine
Nguồn gốc tổng hợp:gồm các chất ma túy có nguồn gốc tổng hợp như
amphetamine (AM), methamphetamine (MA), MDA, MDMA, diazepam,…
Các chất ma túy có nguồn gốc tổng hợp được phân loại theo dược lý gồm các nhóm chất khác nhau như: Nhóm kích thích thần kinh trung ương như AM, MA, MDA, MDMA,…nhóm an thần gây ngủ như diazepam, dẫn xuất phenothiazin,…
Trang 4Việcsửdụngamphetamintrongytếbắtđầuvàocuốinhữngnăm1920vớivaitròmộtthuốcthôngmũivàgiãnphếquảnđểthaythếchoephedrin.Sauđóvàonhữngnăm1930,thuốcđượcmởrộngtrênlâmsàngvớitácdụngkíchthíchthầnkinhtrungương,chốngtrầmcảm,ủrũ.AmphetaminvàmethamphetaminđượcdùngrộngrãitrongquânđộiởthếchiếnthứIIđểtăngcườngsứcchịuđựng,sự tỉnhtáo,tránhmệtmỏi…Đồng thờivớiviệc sử dụng, các
dụngnhiềuhơn,nhấtlàởngườitrẻtuổi.Càngngày,táchạicủacácthuốcnàycàngthểhiệnnghiêmtrọng:dễgâynghiện,dùngliềucaogâyloạnthần,hoangtưởng,dễkíchđộng,bạolựcvìthếchúngcònđượcgọilà“cácchấtloạnthần”,“ma túyđiên”,“matúybạolực”[5][17][41]
HiệnnaycácchấtnhómATSđượctổnghợpvàbuônbántráiphépvớisốlượngngàycàngnhiều.Đâylàloạimatúytổnghợpxuấthiệnphổbiếnhiệnnayvớinhiềuhìnhthứcđadạng:matúyđá,hồngphiến,thuốclắc,…vànhiềunhấtlàmethamphetamindạngtinhthể(matúyđá)[7][17]
CôngthứcchungcủanhómATS:
R2 R1
R3 CH2 CH CH2R5
R4 NH R6
Trang 5Ghichú:kíhiệu*làgiữaC3vàC4củanhânthơmcóliênkết–OCH2-O-
Trang 6+ MA là chất hữu cơ có nhóm chức amin bậc 2, tồn tại ở cả hai dạng là base
và muối của các acid khác nhau như HCl, H2SO4,…
+ MA có nhóm chức amin bậc 2 nên dễ dàng tham gia phản ứng acyl hóa với 1 anhydride acid để tạo amide, phản ứng thực hiện trong điều kiện bình thường mà không cần xúc tác, xảy ra nhanh
1.3.2 Tácdụngdượclý
TácdụngkíchthíchthầnkinhcủaMAlàrấtnhanh,thậmchícóngaytrongkhitiêm.Thờigiantácdụngcóthểkéodài4-8giờởngườichưanghiệnvà2-
Trang 7 Tácdụngkíchthíchhệthầnkinhtrungương:
MAtácdụngchủyếulênnão,vỏnão,ngoàiracòntácdụnglênhệthốnglướihoạthóacủahệthầnkinhtrungương.Cáctácdụngnàygâyranhữngthay
đổitrạngtháitinhthầnnhưcảmgiácsảngkhoái,tỉnhtáo,phấnchấn,tinhthầnnhanhnhẹn,tăngtínhnăngđộng,tựtin,tăngvậnđộng,nóinăng,giảmmệtmỏi,dịuđau.Cáctrạngtháinàycóthểgiúpchoconngườicảithiệnđượcnhữngcôngviệcđơngiản,thậmchílàmđượcnhiềuviệchơn,nhấtlànhữngvậnđộngthểchấtnhưđiềnkinh,nhảymúa,…tuynhiênvớicáccôngviệcphứctạpthìhiệuquảgiảmvàkhảnăngsaisóttrongcôngviệctăngdothiếukhả
năngtậptrung.Docáctácđộnglênthầnkinhnhưtrên,ngườisửdụngMAcóxuhướngtiếptụcsửdụnghếtlầnnàyđếnlầnkhácđểthỏamãnkíchthíchbảnthânvàdầnlệthuộcvàonó,đólàsựnghiệnMA.ViệcdùngMAkéodàihoặcliềucaothườnggâychánchường,mệtmỏi,ảogiác,hoangtưởng,hoảngloạn,đauđầu,chóngmặt,rốiloạnvậnmạch,lẫnlộn,suynhượctinhthần,suygiảmkhảnăngtìnhdục[4][6][22]
Tácdụngkíchthíchhệthầnkinhgiaocảm[6][9][22]:MAcótácdụngkiểuαvàβnhưcácchấtcườnggiaocảm:
- Tácdụnglêntimmạch:kíchthíchtrựctiếplàmtăngnhịptim,gâycomạch,làmtănghuyếtápcảtâmthulẫntâmtrương.Dùngliềulớncóthểgâyloạnnhịptim,cothắtmạchvànhgâyđauthắtngực
- Tácdụnglêncáccơtrơnkhác:làmgiảmcothắtcơtrơndạdày,ruột,giảmchuyểndịchthứcăn
tuynhiênchưađủđểđiềutrịhiệuquả.Mặcdùvậytheomộtsốbáocáo,nócóthểtănghiệuquảgiảmđaucủacácopiat
- Kíchthíchtrungtâmhôhấp:đốivớitìnhtrạngbìnhthường,tácdụngnàylàkhôngđángkểnhưngkhiđãbịứcchếhôhấpbởicácchấttácdụngtrênhệthầnkinhtrungươngthìMAc
Trang 8 Cơchếtácdụng:
TácdụnglênthầnkinhtrungươngcủaMAlàdolàmtănggiảiphóngcácchấttrunggianthầnkinhlàdopamin,serotoninvànoradrenalin.Sựthayđổitrongvậnđộngvàhànhvicưxửliênquannhiềunhấtbởidopamin[6][9][17]
Hình 1.2 Cơ chế tác dụng lên thần kinh trung ƣơng của MA
1.3.3 Dượcđộnghọcvàphânbốtrongtóc
Trang 99
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
MAdễdànghấpthuquađườnguốngvàđườngtrựctràng,phânbốnhanhchóng vàomáu, dễ dàng qua hàng ràomáu não để gâyratác dụng.MA đạt nồng độđỉnhkhoảng3-
6giờsaukhiuống.Nócũngđượchấpthutốtsaukhihítbằngmũihoặctiêm.MAvàocơthểsẽđượcchuyểnhóavàthảitrừphầnlớnquanướctiểu,mộtphầnnhỏMAphânbốvàotóc[4][16][
22][32]
Hình1.3.SơđồchuyểnhóacủaMA
Trong24giờđầu,MAđượcđàothảiquađườngnướctiểukhoảng43%ởdạngkhôngbiếnđổi,khoảng15%ởdạng4-
hydroxymethamphetamin,khoảng5%ởdạngamphetaminvàmộtsốchấtchuyểnhóakhácởdạngbiếnđổihoặckếthợp[5][39]
Vềsựphânbốtrongtóc,cơchếcủanórấtphứctạpvàhiệnnayvẫnchưarõràng,nhiềugiảthuyếtchorằngMAđãkhuếchtán(thụđộnghaychủđộng)từcácmạchmáunuôidưỡngnangtócvàonangtóc,nằmchủyếuởtủytóc.MAtồntạitrongtóctrongvàithángđếnthậmchíhàngnăm[16][22][31]
Trang 1010
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
Hình1.4
GiảthuyếtcơchếMA đivàotrongtóc
Thântócgồm3lớp:lớpbiểubì(cuticle),lớpgiữa(cortex)vàlớptủy(medulla).Lớpbiểubìlàphầnngoàicùng,gồmcáclớpkeratintrongsuốtxếpchồnglênnhaunhưvảycá,cótácdụngbảovệsợitóckhỏihóachấtvànhữngảnhhưởngbênngoài.Lớpbiểubìcònđượcphủmộtmànglipidmỏngđểtóckhôngthấmnước.Lớpgiữabaogồmnhiềubósợinhỏhợpthànhvàchứacácsắctốcủatóc.Lớptủylàphầntrongcùngcủasợitóc,chứacáchạtchấtbéovàkhôngkhí[11][33][36]
Trang 11dụngnhưβ-1.5.Tổngquanvềsắckýkhíkhốiphổkép (GC-MS/MS)
1.5.1 Kháiniệm
Trang 1212
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
Sắckýkhí(GC)làmộtphươngpháptáchcácchấttừmộthỗnhợpởthểkhíbayhơivớiphađộnglàmộtchấtkhíthườnglàkhítrơ.Mẫuphântíchđượcđưavàođầucộtvàquátrìnhrửagiảiđượcthựchiệnnhờdòngkhítrơquacộtsắcký,tuynhiênphađộngkhôngtươngtácvớichấtphântíchmàchỉlàmchứcnăngvậnchuyểnchấtphântích quacột.Phatĩnhcủa GCcó
kýkhí-
lỏng(GLC)còngọilàsắckýkhíphânbốhaychấtrắntrongsắckýkhí-rắn(GSC)còngọilàsắckýkhíhấpphụ,nhưngvìquátrìnhhấpphụcónhiềuhạnchếnênGSCítđượcứngdụngngoạitrừphântíchmộtsốchấtkhí[2][26]
Khối phổ (MS) làmộtkỹthuật dựa trên việcđo tỷsố khối lượng vàđiện tíchcủaion(m/z)đểcungcấpthôngtinđịnhtínhxácđịnhcấutrúcvàđịnhlượngcácchất.Kỹthuậtnàylàmộtkỹthuậtphântíchmạnhđượcsửdụngtrongnhiềulĩnhvựckhácnhauđểxácđịnhcácchấtvôcơvàhữucơ[2][26]
Khối phổ kép (MS/MS)
Sựkếthợphaikỹthuậttrên,GCvàMS,đãchorađờikỹthuậtsắckýkhíkhốiphổGC-MS.PhươngphápGC-MSsửdụngkĩthuậtGCđểtáchcácchấtvà
pháthiệnchúngvớidetectorMSnhờđópháthuyđượcưuđiểmcủacảhaiphươngpháp,pháttriểnvàmởrộngứngdụngcủahaikĩthuậtnày
1.5.2 HệthốngGC-MS-MS
Hình1.6.Sơđồmáysắckýkhíkhốiphổ
Khímang
Phađộngtrongsắckýkhíhaycòngọilàkhímanggiữvaitròvậnchuyểnchất phân tích qua cột.Khímangthường là khí có phântửlượng nhỏ,phải
Trang 1313
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
đảmbảoyêucầutrơvềmặthóahọc,đảmbảotinhkhiếtvàphùhợpvớitừngloạidetector.Mộtsốloạikhímangthườngdùnglàheli,nitơ,hydro,argon,…
Đikèmvớibìnhcấpkhímangcòncóvangiảmáp,đồnghồkiểmtralưulượngkhí[2][20][26]
Buồngtiêmmẫu
Mẫuphântíchlỏnghoặckhíđượctiêmnhanhvàodòngphađộngvớimộtlượngvừađủbằngbơmtiêmnhỏhoặcvantiêmmẫu.Cỡmẫuthườngthayđổitừvàiµlđến20µl.Mẫuđượctiêmquađệmsiliconchịunhiệtvàobuồnghóahơi,buồngnàyđượcđốtnóngtớinhiệtđộthíchhợpvànốivớicộttách[2][20][26]
Cónhiềukỹthuậttiêmmẫukhácnhau
Vớicộtmaoquảnthườngdùng3kỹthuậttiêmmẫusau:
- Kỹthuậttiêmchiadòng(split):chiadòngkhímang1:100đến1:1000đểgiảmlượngmẫuvàocột(giảm90%hoặchơn).Độnhạycủamẫugiảmvìchỉmộtphầnnhỏvàocộ
t
- Kỹthuậtkhôngchiadòng(splitless):toànbộmẫungưngtụởđầucộtđãlàmlạnh,sauđótăngnhiệtđộlàmbayhơimẫu.Độnhạytăngnhưngcónguycơgiãnrộngpic
- Kỹthuậttiêmthẳngvào cột(on-column):mẫuđược ngưngtụởđầucột sauđólàmbayhơitheochươngtrìnhnhiệtđộ.Tăngđộnhạy,giảmphânhủymẫudonhiệt[2]
Vớicộtnhồi,thườngdùng2kỹthuậttiêmmẫusau:
- Kỹthuậtbayhơinhanh(flashvaporization):mẫutiêmvàovùngcónhiệtđộcaohơn20-
250Csovớinhiệtđộcột.Mẫubayhơinhanh,cóthểxảyraphânhủymẫudonhiệtđộcao
-
Kỹthuậttiêmthẳngvàocột(on-column):mẫuđượctiêmthẳngvàođầucộtnhồi.Tăngđộnhạy,giảmphânhủymẫudonhiệt[2]
Cộtvàlòcột
Chươngtrìnhnhiệtđộcộtcủasắckýkhílàthôngsốrấtquantrọngcầnkiểmsoátchính
đảmnhiệmnhiệmvụđiềunhiệtnày.Trongsắckýkhícó2loạicột:cộtnhồi(packedcolumn)
Trang 1414
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
vàcộtmaoquản(capillarycolumn).Ngàynaydonhiềuưuđiểmnênngườitasửdụngphổbiếncộtmaoquản.Sauđâylàcácđặcđiểmcủa2loạicộttrên:
Hình 1.7 (a) Hình ảnh cột mao quản; (b) cấu tạo cắt ngang của cột
Trang 15Mộtsốphatĩnhlỏngdùngchosắckýkhí-lỏngnhư:polydimethylsiloxan(100%methyl),poly(phenylmethyl)siloxan(50%phenyl),poly(trifluoropropyldimethyl)siloxan,polyethylenglycol,… [2][20]
Detectorkhốiphổ
Detectorkhốiphổlàmộtdetectorđặcbiệtvìngoàivaitròphát
hiệnkhốiphổcòncókhảnăngtáchcácchấtđồngrửagiảidựatrênsựkhácnhauvềkhốilượngcủachúng
tạothànhtrongbuồngionhóa,đượcgiatốcvàtáchriêngnhờbộphântíchkhốitrướckhiđếnđượcdetector.Tấtcảquátrìnhnàydiễn ra tronghệ chân không: áp suất hệ dao động
Tínhiệutươngứngvớicácionsẽđượcthểhiệnbằngmộtsốvạch(pic)cócườngđộkhácnhautậphợplạithànhmộtkhốiphổđồhoặcphổkhối.Nócungcấpthôngtinđịnhtính(khốilượngphântử,nhậndạngcácchất)xácđịnhcấutrúcvàđịnhlượngcácchất[2][5][28]
Trang 16- Detector:cónhiệmvụchuyểncácionđếnthànhtínhiệuđiệnđobằnghệđiệntửcủamáy
- Bộxửlýdữliệu:tínhiệutừdetectorđượckhuếchđạitrướckhichuyểnthànhtínhiệusốphục vụxử lýdữ liệutheo yêucầukhácnhaunhư: ghiphổkhối,địnhlượng,…[2][25]
1.5.3 MộtsốkỹthuậtMS/MS
Kỹthuậtphântíchtoànthang(MS1Scan)
Vớimộthỗnhợpnhiềuchấtsaukhiđượctáchraquacộtsắckýkhívàđưavàodetectorkhốiphổ,detectorsẽghinhậntổngcườngđộcácionsinhratừmỗichất.TacómộtsắckýđồtoànbộionTIC(TotalIonChromatogram)vàphổkhốiđượclấytoànbộcácion(MS1Scan).MS1scanchođầyđủthôngtinvề
chấtphântíchhơn,tuynhiênđộnhạykhôngcao,nhiễuđườngnềncóthểlớn[2][4][5]
Trang 1717
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
Kỹthuậtphântíchchọnlọcion(MS1Sim)
Kỹthuậtnàychỉchokhốiphổkếnhậndiệnmộtionvàghisắckýđòtheothờigian.KỹthuậtSIMcótácdụnglàmgiảmbớtnhiễuđườngnềnvàdođótăngđộnhạy,tứctăngtỷlệtínhiệu(S)trênnhiễuđườngnền(N)[2][4][5]
Kỹ thuật phân tích toàn thang tìm ion con (Product Ion) (MS1 là SIM, MS2 là scan)
Kỹthuậtnàymục đích nhằm tìm các mảnh ion con sau khi đã biết được mảnh ion mẹ nhờ kỹ thuật MS1Scan
Kỹ thuật phân tích định lượng độ nhậy cao NMR (MS1 là SIM, MS2 là
SIM)
Kỹ thuật này mục đích dùng để định lượng đối với các chất có hàm lượng rất thấp, thông qua kỹ thuật Product Ion tìm được mảnh con MS2 sau đó dùng sim 2 lần MS1 và MS2 được một mảnh ion chọn lọc tăng độ nhạy và giảm nhiễu nền
Phương pháp này tối ưu việt hơn rất nhiều so với MS1Sim
1.5.4 Cácphươngphápxácđịnhmethamphetamintrongtóc
Phươngphápsắckýkhíkhốiphổ
PhươngphápsắckýkhíkhốiphổngàycàngđượcsửdụngrộngrãitrongphântíchMA.MáysắckýkhítáchMAvàđưavàodetectorkhốiphổ,cókhảnăngđịnhtính,địnhlượngMAvớiđộnhạyvàđộchínhxáccao.Đểsửdụngphươngpháp này,MA cần được tạo dẫn xuấtđể tăngkhả năng bay hơivàbền với điều kiệnsắcký[15][16][29][35][36][40]
Phươngphápsắckýlỏngkhốiphổ(LC-MS)
PhươngphápsắckýlỏngkhốiphổcũnglàmộtphươngphápđãđượcsửdụngnhiềuđểpháthiệnMA.Vớimẫutóc,chiếtMAbằngphươngphápthíchhợprồiđưavàohệthốngLC-MSmàkhôngcầntạodẫnxuấtnhưvớiGC-
MS.BộphậnLCcóchứcnăngchiatáchMAtrongdungdịch,đưavàobộphậnkhốiphổvớivaitròdetectorđểđịnhtính,địnhlượng[16][28][31][36]
Phươngphápsắckýlỏng siêu hiệu năng thời gian bay (UHPLC-TOF)
Phươngphápsắckýlỏngsiêu hiệu năng thời gian baylàmộtphươngphápmớiđượcsửdụngnhiềuđểpháthiệnMA với hàm lượng
Trang 1818
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
nhưvớiGC-MS.BộphậnU H P LCcóchứcnăngchiatáchMAtrongdungdịch với lượng bơm nhọ và
áp suất cao,đưavàobộphậnkhốiphổ (TOF)vớivaitròdetectorđểđịnhtính,địnhlượng cho độ nhậy và khối lượng phân tử có độ chính xác rất cao[16][28][31][36]
Phươngphápmiễndịch
Nguyênlýcủaphươngphápnàylàsửdụngkhángthểđặchiệuvớichấtcầnphântích(khángnguyên)vàdạngđánhdấucủachấtphântích.Dạngđánhdấucủachất phân tích sẽ tranh chấp với chất phân tíchđể kết hợp với kháng thể theo cơ chếphảnứnggiữakhángnguyênvớikhángthể.Kếtquảlàsốlượngcácphântửbịđánhdấusẽtỷlệnghịchvớilượngchấtcầnphântíchtrongmẫu.Tùy
thuộcvàobảnchấtcủachấtđánhdấumàcácphươngphápphântíchsẽđượcápdụng.PhươngphápnàythườngứngdụngđểtạocáckitxácđịnhnhanhMA.MẫutócsaukhiđượcxửlývàchiếtsẽđượcđemxácđịnhbằngphươngphápmiễndịchđểpháthiệnMA[5][10][13][16]
Trang 1919
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
1.6 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu thường dùng trong phân tích ma túy
Trước khi phân tích các chất ma túy tổng hợp trong mẫu tóc, mẫu máu và nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ thường phải sử dụng các kỹ thuật chiết mẫu, làm sạch và dẫn xuất hóa Mục đích của chiết và làm sạch là tách chất ma túy ra khỏi nền mẫu, mẫu dịch sinh học, loại một số tạp chất trong mẫu dịch sinh học có ảnh hưởng đến quá trình phân tích, kỹ thuật dẫn xuất hóa mẫu làm tăng độ nhạy của phép phân tích, phù hợp hơn với điều kiện phân tích sắc ký Một số các kỹ thuật sử dụng là chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn, dẫn xuất nhóm amine bằng tác nhân acyl hóa
1.6.1 Kỹ thuật chiết lỏng lỏng[27,34]
Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật đã được sử dụng từ rất lâu trong phòng thí nghiệm Là kỹ thuật được dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi hoặc mẫu dạng lỏng sang 1 dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất Các dung môi thường sử dụng để chiết các chất ma túy tổng hợp
là ethylacetat, chloroform, diclomethan, aceton…hoặc có thể kết hợp dung môi theo
tỷ lệ thích hợp làm tăng hiệu suất chiết Dịch chiết sau đó được tinh khiết hoá bằng các chất hấp phụ làm sạch khác nhau như silicagel, florisil, nhôm oxit, C18…., tuỳ từng đối tượng mẫu mà chọn các chất hấp phụ khác nhau Phương pháp này đơn giản nhưng tốn dung môi, thời gian phân tích và có ảnh hưởng nguy hại đến con người do sử dụng các dung môi chiết
1.6.2 Kỹ thuật chiết pha rắn[24,25,27]
Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các chất ảnh hưởng của nền hoặc làm giàu các chất cần phân tích trước khi tiến hành phân tích
Kỹ thuật này dùng để chiết trực tiếp mẫu lỏng hoặc làm sạch chất phân tích
đã được chiết bằng dung môi theo kỹ thuật khác Kỹ thuật SPE dùng để làm giàu mẫu Thông thường nồng độ chất phân tích trong mẫu quá thấp không phù hợp cho việc phân tích GC do đó cần phải sử dụng kỹ thuật SPE để làm giàu chất phân
Trang 2020
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
tích đến mức nào đó đủ để phát hiện cũng như loại bỏ tạp chất không quan tâm ra khỏi chất phân tích
Kỹ thuật chiết pha rắn có sự thay đổi lớn trong một số những năm gần đây như các loại chất hấp phụ dùng cho mẫu sinh học tăng lên rất nhiều, có khả năng
tự động hóa Một số nhà sản xuất đã đưa ra thiết bị có khả năng tự động hóa trong quá trình chuẩn bị mẫu dịch sinh học
* Cơ chế chiết: Tương tự sắc ký lỏng gồm pha thuận, pha đảo và trao đổi ion Pha
tĩnh thường dùng là silicagel, Florisil®, oxit nhôm, C8, C18, …
* Áp dụng: Sử dụng SPE để chiết, làm sạch và làm giàu chất phân tích hiện rất
phổ biến, SPE được sử dụng để chiết và làm sạch hóa chất bảo vệ thực vật, các chất ma túy, các loại thuốc … từ các mẫu nước tiểu, máu, dược liêu…
Để làm sạch mẫu bằng SPE thường qua 4 bước
Bước 1- Điều kiện hoạt hóa cột (luyện cột): Luyện cột chiết pha rắn nhằm hoạt hóa
cột chuẩn bị nhận mẫu
Bước 2-Chuyển mẫu vào cột chiết: Chuyển mẫu chiết lên cột, sau đó sử dụng áp
suất giảm hoặc để mẫu tự chảy với tốc độ khoảng 1-3 ml/phút tùy thể tích cột
Bước 3- Loại tạp chất: Sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để rửa
giải tạp chất bẩn ra trước
Bước 4-Rửa giải hợp chất cần phân tích: Sử dụng lượng nhỏ dung môi hữu cơ mà
nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại tạp chất không loại được trong quá trình rửa
Hình 1.9 Nguyên tắc hoạt động của chiết pha rắn
Trang 2121
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
Kỹ thuật chiết pha rắn có những ưu điểm sau:
-Chất phân tích được thu hồi cao và nhiễm bẩn ít
-Lượng dung môi dùng ít, do đó tiết kiệm kinh phí và ít ảnh hưởng đến người làm -Thời gian xử lý mẫu nhanh, có thể làm nhiều mẫu cùng lúc
-Dễ tự động hóa quá trình phân tích
-Tính chọn lọc tốt
1.6.3 Kỹ thuật vi chiết pha rắn[10,19]
Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME) dựa trên cơ chế hấp phu ̣ của chất phân tích từ pha nước hoă ̣c pha khí lên sợi pha tĩnh được phủ hay tẩm chất hấp phu ̣ nh
polydimethylsiloxan …
Vi chiết pha rắn là kỹ thuật chiết mới phát triển, trong đó, những chất phân tích được hấp phụ trực tiếp từ mẫu trên đầu sợi silica được phủ pha tĩnh thích hợp Quá trình hấp phụ trên sợi xảy ra trong nền mẫu hoặc trong khoảng không gian hơi trên mẫu Việc chiết dựa trên sự phân tách chất phân tích giữa pha tĩnh và nền mẫu Chất phân tích được hấp phụ trên sợi cho đến khi đạt tới cân bằng Sợi sau đó được đưa vào trong buồng tiêm mẫu của máy sắc ký khí (GC), tại đó, nó được đun nóng
và những chất phân tích được giải hấp bằng nhiệt
Trong vài năm gần đây, có nhiều nghiên cứu ứng dụng SPME, và kỹ thuật này ngày càng được sử dụng nhiều Ban đầu SPME chỉ được thực hiện với những mẫu nước Gần đây, SPME thể hiện khả năng ứng dụng cao khi phân tích những mẫu sinh học như nước tiểu
Pittông Ống hình trụ Khóa hình chữ Z
Kim đưa sơ ̣i vi chiết qua Septa inlet
Sơ ̣i phủ pha tĩnh
Hình 1.10 Sơ đồ cấu ta ̣o và hình ảnh thiết bị vi chiết pha rắn
Trang 2222
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
1.6.4 Kỹ thuật dẫn xuất hóa bằng tác nhân acyl[10,25,27]
Các chất hữu cơ muốn phân tích được bằng phương pháp sắc ký khí thì mẫu phải chuyển thành dạng hơi ở điều kiện nhiệt độ làm việc của thiết bị Tuy nhiên một số nhóm chất thường khó thực hiện được do khả năng bay hơi kém như axits amin, axit béo, … Do đó, để phân tích được các hợp chất này bằng phương pháp sắc ký khí thì chúng phải được chuyển hóa để tạo dẫn xuất dễ bay hơi hơn Ví dụ amine chuyển hóa tạo thành amide, axit chuyển hóa tạo thành ester, … Ngoài việc làm tăng khả năng bay hơi của chất phân tích thì phương pháp dẫn xuất hóa còn cho phép chuyển hóa những nhóm phân cực thành những nhóm ít phân cực hơn để hạn chế khả năng hấp phụ trong quá trình sắc ký
Ngoài việc làm tăng khả năng bay hơi của mẫu thì kỹ thuật dẫn xuất hoá thường áp dụng cho việc phân tích các chất có nồng độ thấp, tăng độ phát hiện các chất trong mẫu dịch sinh học có tạp chất lớn Sau khi tạo dẫn xuất thì khả năng thích ứng với thiết bị sắc ký, detector là tốt hơn, tạo nên các pic cân đối hơn
Mục tiêu của dẫn xuất hoá:
- Tạo các hợp chất mới phù hợp hơn cho phân tích (tăng khả năng bay hơi, bền nhiệt …)
- Làm tăng hiệu quả sắc ký (Thay đổi thời gian lưu, giảm hoặc loại bỏ doãng pic, tăng độ phân giải và hệ số đối xứng )
- Tăng khả năng phát hiện Dẫn xuất hoá bằng tác nhân Acyl
Phản ứng acyl hoá xảy ra khi nhóm chức alcol (OH), thiol (SH), amine (NH) phản ứng với 1 acid anhydride, phản ứng này tạo este, thioeste, amit tương ứng và phụ thuộc vào tác nhân dẫn xuất hoá là axit hoặc amidazole Phản ứng xảy ra gần như hoàn toàn mà không cần xúc tác Phản ứng này làm tăng độ nhạy của detector khối phổ, cộng kết điện tử
Phương trình phản ứng minh hoạ:
R1NH2 + (R2CO)2O = R1NHOCR2 + R2COOH
Trang 2323
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
Tác nhân dẫn xuất hoá phải được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách làm bay hơi dưới dòng khí nitơ trước khi bơm vào hệ thống GC Sau khi làm bay hơi hết tác nhân dẫn xuất hoá, tiến hành hoà tan chất lại bằng dung môi thích hợp như ethyl acetate
Các tác nhân dẫn xuất hiện nay thường sử dụng để tạo dẫn xuất với nhóm amin của ma túy tổng hợp là TFAA, HFBA, …
Trang 2424
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
CHƯƠNG2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyênliệu,thiếtbị
Hóachất,thuốcthử
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký của hãng Merck, … gồm: aceton, diclometan, hexan, ethanol, methanol, isopropanol, amoniac, HCl, acetic acid, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, ethylacetate, TFAA, HFBA, khí nitơ, heli 99,999%, cột SPE C8 loại 100mg của Alltech, nước cất loại ion, …
- Chấtchuẩnmethamphetamin1,0mg/mltrongmethanol,sốlôFE082712-03, Expires: 07/2017, USDEAExempt/TK#61-82
- Bộ chiết pha rắn 10 vị trí của Agilent
- Máy gia nhiệt có độ chính xác ± 0,5oC
- Bộ làm khô mẫu bằng khí nitơ
- Máy ly tâm Rotina 380, tốc độ max 14000rpm
- Cân phân tích Satorius độ chính xác 10 - 4g
- Thiết bị phân tích sắc ký khí 7890B và detector khối phổ 7000 của hãng Agilent
Trang 2525
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
- Cột mao quản HP5-MS, dài 30m, đường kính 0,25mm, độ dày lớp film 0,25µm (pha tĩnh tẩm 5% Phenyl Methyl Siloxane)
2.2 Phươngphápnghiêncứu
- Nghiên cứu tổng quan tài liệu
- Phương pháp thống kê và xử lý số liệu bằng phần mềm Exel, Chemstation
DungdịchchuẩnMAtrongmethanol100ng/ml:lấychínhxác1mldungdịchchuẩnMA1µg/mlđãphaởtrênvàobìnhđịnhmức10ml,thêmlượngmethanolvừađủ,lắcđều
Xửlímẫu:
Cânkhoảng10mgtócvàomỗiốngnghiệm.Rửabằngnướccất(siêuâm5phút),lytâm15 phút,gạn bỏ lớp nước Rửa bằngmethanol (siêu âm5 phút),lytâm10phút,gạnbỏlớpmethanol.Tócđượccắtngắnkhoảng1mm
Vớicácmẫutrắngđểtạomẫunhiễm:
Trang 2626
Phạm Đức Trọng – Luận văn Khoa học Hóa học
o Thêm50,100,200μldungdịchMAchuẩn1μg/mlđểtạomẫunhiễmtươngứng50,100,200ng
o Thêm50, 100,200μldungdịchMAchuẩn100ng/mlđểtạomẫunhiễmtươngứng5, 10,20ng
Thêmchínhxác100µldungdịchnộichuẩnAM-d5ứngvới100ngchấtnộichuẩnvàomỗimẫu
Bảng 2.1 Chuẩn bi ̣ mẫu hỗn hơ ̣p chất chuẩn trong tóc
Thông số cần lấy
Các ống nghiệm có nồng độ MA, IS khác
nhau
Lươ ̣ng IS (ng) 100 100 100 100 100 100 Nồng đô ̣ IS gốc (µg/ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Thể tích IS lấy ((µl)) 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
Nồng đô ̣ MA (µg/ml) 0,1 0,1 0,1 1,0 1,0 1,0 Thể tích MA lấy ((µl)) 50,0 100,0 200,0 50,0 100,0 200,0 Trọng lượng mẫu tóc (mg) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Thủy
phân:thêmvàomỗimẫu1mldungdịchNaOH1M,bịtkínmiệngốngnghiệm,đemthủyphânnhiệtđộ90-95oCtrong10-15phút,đểnguội
ChiếtbằngSPE:
Luyện cột bằng 3ml methanol tốc độ 2ml/phút Thêm 3ml dung dịch đệm phosphate 0,1M; pH = 6 tốc độ 2ml/phút Nạp mẫu vào cột với tốc độ 2ml/phút Rửa cột với 10ml nước cất, tốc độ 5ml/phút Thêm 5ml dung dịch HCl 0,1N tốc độ 5ml/phút Rửa bằng 5ml methanol tốc độ 2ml/phút Hút khô cột 1 phút Rửa giải bằng 5ml dung dịch methanol tốc độ 2ml/phút Dịch rửa giải được làm khô dưới dòng khí nitơ tới cắn [4]
Trang 27Detector setting: chọn Delta EMV (tăng độ nhạy)
Collision enegy: 15eV Chương trình nhiệt độ cột tách: Nhiệt độ ban đầu 80OC, giữ đẳng nhiệt 3 phút, tăng 30ºC/phút đến 200ºC giữ đẳng nhiệt 1 phút, tăng 30ºC/phút đến 270ºC, giữ đẳng nhiệt 5 phút Tổng thời gian sắc ký là: 14,5 phút
Lựachọnnộichuẩn
So với các kỹ thuật ngoại chuẩn, thêm chuẩn, dùng nội chuẩn để định lượng trong phân tích sắc ký khí có độ chính xác hơn cả Kỹ thuật này loại trừ được sai số trong quá trình bơm mẫu, đô ̣ đáp ứng của detector với chất phân tích giữa các ngày khác nhau Đường nội chuẩn được xây dựng dựa vào tương quan tuyến tính giữa tỷ
lê ̣ diê ̣n tích pic và t ỷ lệ lượng chất phân tích Trong phân tích GC /MS/MS thì mảnh phổ dùng để định lượng là mảnh phổ có tín hiệu mạnh nhất tức là cho diện tích pic