Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện nhanh norovirus trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật RT LAMP

Nhằm nâng cao hiệu quả của công tác kiểm soát an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và lợi ích kinh tế quốc dân từ nguồn nuôi thủy hải sản, hướng tới mục tiêu phát

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH LỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu chung về Norovirus 1

1.1.1 Cấu tạo Norovirus 1

1.1.2 Cơ chế nhân bản của Norovirus 2

1.2 Tác hại của Norovirus đến sức khỏe 4

1.3 Tình hình nhiễm Norovirus tại Việt Nam và trên thế giới 5

1.3.1 Tình hình nhiễm Norovirus trên thế giới 5

1.3.2 Tình hình nhiễm Norovirus tại Việt Nam 6

1.4 Đối tượng thực phẩm có nguy cơ nhiễm Norovirus 9

1.5 Các phương pháp xác định Norovirus 10

1.5.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử 10

1.5.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 10

1.5.3 Kỹ thật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 11

1.5.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 12

1.6 Giới thiệu phương pháp RT-LAMP 12

1.7 Một số nghiên cứu xác định Norovirus bằng phương pháp LAMP 18

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.1 Chủng vi rút 19

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 19

2.1.3 Oligonucleotid 19

2.1.4 Hóa chất 19

2.1.5 Thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 21

2.2.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch RNA vi rút 21

2.2.3 Phương pháp Real-time RT-PCR 23

2.2.4 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 25

2.2.5 Phương pháp giải trình tự gen 26

2.2.6 Phương pháp RT-LAMP 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu của các chủng Norovirus tại Việt Nam 28

3.1.1 Phát hiện Norovirus GI và GII bằng phương pháp Real-time RT-PCR 28

3.1.2 Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu từ các chủng Norovirus đã phát hiện 32

3.2 Lựa chọn và hiệu chỉnh mồi LAMP 32

3.2.1 Lựa chọn mồi LAMP 32

Lựa chọn mồi LAMP xác định Norovirus nhóm GI 33

Lựa chọn mồi LAMP xác định Norovirus nhóm GI 34

3.2.2 Hiệu chỉnh mồi LAMP 34

3.3 Tối ưu hóa phản ứng RT-LAMP 40

3.3.1 Tối ưu lượng enzyme AMV Reverse transcriptase 41

3.3.2 Tối ưu nhiệt độ và nồng độ Betain 42

3.3.3 Tối ưu thời gian phản ứng 43

3.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 45

3.4.1 Xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP 45

3.4.2 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 46

3.5 Thử nghiệm quy trình tách chiết RNA 48

3.6 Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình 50

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FAO Tổ chức nông lương lien hợp quốc

RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

SFPA Ủy ban bảo vệ biển và thủy sản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về đặc điểm

nhiễm Norovirus trẻ mắc viêm dạ dày ruột và trẻ khỏe mạnh 6

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR 23

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng Real-time RT-PCR 24

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-LAMP 27

Bảng 3.1 Danh sách các mồi lựa chọn cho phản ứng RT-LAMP 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc Norovirus 1

Hình 1.2 Cấu tạo vùng đọc mở Norovirus 2

Hình 1.3 Cơ chế nhân bản của Norovirus 3

Hình 1.4 Phân nhóm Norovirus 4

Hình 1.5 Phân bố tỉ lệ nhiễm Norovirus và Rotavirus ở trẻ dưới 5 tuổi [30] 8

Hình 1.6 Phân bố genotype của Norovirus ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam năm 2010 9

Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng LAMP 16

Hình 2.1 Quy trình tách chiết RNA bằng Trizol 21

Hình 2.2 Quy trình tinh sạch RNA theo phương pháp Boom 22

Hình 2.3 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR 25

Hình 2.4 Quy trình phản ứng RT-LAMP 26

Hình 3.1 Đồ thị khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR với Norovirus GI 29

Hình 3.2 Đồ thị khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR với Norovirus GII 30

Hình 3.3 Đồ thị khuếch đại của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện Norovirus GII của 18 mẫu hàu Thái Bình Dương 31

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự chủng Norovirus nhóm GII 32

Hình3.5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP sử dụng bộ mồi đặc hiệu cho Norovirus nhóm GI của tác giả Fukuda năm 2006 và Yoda năm 2007 33

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP sử dụng bộ mồi đặc hiệu cho Norovirus nhóm GII của tác giả Fukuda năm 2006 và Yoda năm 2007 34

Hình 3.7 So sánh trình tự mồi B2 (Fukuda,2006) với các gen Norovirus nhóm GII của Việt Nam bằng phần mềm trực tuyến Blast 35

Hình 3.8 Vùng bắt cặp của mồi LAMP trên gen hoàn chỉnh của Norovirus 36

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra vùng bắt cặp của mồi Norovirus trên bộ gen hoàn chỉnh của Norovirus tại Việt Nam bằng phần mềm ClustalW 37

Hình 3.10 Kết quả so sánh mồi B2 sau khi đã hiệu chỉnh với các gen Norovirus của Việt Nam bằng phần mềm Blast 38

Hình 3.11 Vị trí tổ hợp mồi RT-LAMP trên trình tự gen Norovirus Việt Nam nhóm

GI và GII hoàn chỉnh 39Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP khảo sát nồng độ Enzyme AMV 41Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP khảo sát nồng độ Betaine

và nhiệt độ trên gel agarose 42

Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP tối ưu hóa thời gian phản ứng 44

Hình 3.15 Kết quả xác định độ nhạy phản ứng RT-LAMP đối với Norovirus nhóm GI và GII 45 Hình 3.16 Kết quả xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP đối với Norovirus nhóm GI 46 Hình 3.17 Kết quả xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP đối với Norovirus nhóm GII 47

Hình 3.18 Sơ đồ thử nghiệm quy trình tách chiết RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 48Hình 3.19 Kết quả thử nghiệm phản ứng RT-LAMP trên mẫu RNA sau tách chiết bằng

Trizol và mẫu RNA tách chiết bằng Trizol kết hợp tinh sạch bằng phương pháp Boom 49Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP trên gel agarose 50Hình 3.21 Kết quả các ống eppendorf chứa sản phẩm phản ứng RT-LAMP sau khi li tâm 51

MỞ ĐẦU

An toàn thực phẩm luôn đóng vai trò quan trọng đặc biệt trong mọi thời đại

và ở mọi quốc gia, được tiếp cận với thực phẩm an toàn là quyền cơ bản của mỗi con người Ngày nay, Chính phủ tại nhiều quốc gia đã nhận định rõ tầm quan trọng của việc cung cấp thực phẩm an toàn vệ sinh, hầu hết các nước đã thiết lập hệ thống luật pháp, tăng cường công tác thanh tra, giám sát, khắc phục kịp thời các sự cố về

an toàn thực phẩm nhằm bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng và khuyến khích thương mại Thực phẩm đảm bảo chất lượng an toàn vệ sinh không những làm giảm tỷ lệ bệnh tật, tăng cường khả năng lao động mà còn góp phần phát triển kinh tế, văn hoá, xã hội và thể hiện nếp sống văn minh của một dân tộc An toàn thực phẩm đã mang lại uy tín cùng với lợi nhuận lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp, công nghiệp chế biến thực phẩm cũng như dịch vụ du lịch và thương mại

Đặc điểm khí hậu nóng ẩm ở nước ta cùng với ảnh hưởng của sự biến đổi khí hậu toàn cầu đã tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc, vi rút phát triển gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm Theo đánh giá của Tổ chức nông lương liên hợp quốc (FAO), hàng năm có hơn 20% nông sản bị nhiễm nấm mốc, còn thiệt hại do thực phẩm ô nhiễm vi khuẩn gây thối hỏng và biến chất sản phẩm thực phẩm còn nặng nề hơn rất nhiều Khác với vi khuẩn, khi nhiễm vào thực phẩm, vi rút không phát triển trong thực phẩm, không làm ảnh hưởng đến bản chất của thực phẩm, không làm hư hỏng sản phẩm nên rất khó nhận biết tuy nhiên lại gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người tiêu dùng Sự lây nhiễm vi rút vào thực phẩm cũng tương tự như vi khuẩn, không chỉ từ trang trại chăn nuôi, ao hồ, nơi kinh doanh buôn bán thực phẩm mà còn ở tất cả các khâu sơ chế, chế biến thực phẩm và từ bàn tay người tiếp x c với thực phẩm

Thời gian gần đây tại Việt Nam, trong số các sản phẩm thực phẩm không gia nhiệt thì nhuyễn thể hai mảnh vỏ là sản phẩm được tiêu thụ với số lượng lớn do có chất lượng cảm quan đặc trưng với hàm lượng chất dinh duỡng cao hơn những sản phẩm cùng loại; đặc biệt, sản lượng xuất khẩu các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ của

nước ta sang các thị trường chung Châu Âu đã tăng nhanh trong những năm gần đây Tuy nhiên, trong sáu tháng đầu năm 2014, Cơ quan thẩm quyền Châu Âu (EU)

đã cảnh báo 23 lô hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam về chỉ tiêu

Norovirus Đến tháng 7 năm 2014, Cục quản lý chất lượng Nông lâm sản và Thủy

sản thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra công văn số 1349 CL1 yêu cầu về việc lấy mẫu giám sát nhuyễn thể hai mảnh vỏ [1]

/QLCL-Vấn đề nhiễm Norovirus trong thực phẩm không những ảnh hưởng lớn đến

sức khỏe người tiêu dùng mà còn gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế quốc dân

và tính cạnh tranh lành mạnh của thực phẩm Việt Nam trên thị trường quốc tế

Trước thực trạng đó, nhiều quy định đã được đưa ra nhằm kiểm soát Norovirus

trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ Tại Liên minh châu Âu, đã có quy định tập trung vào việc kiểm soát và phân loại khu vực nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo mức độ ô nhiễm nguồn nước Ủy ban bảo vệ biển và thủy sản (SFPA) kết hợp với phòng thí nghiệm quốc gia Ireland, trực thuộc Viện hải dương học đã có những nghiên cứu

giám sát mức độ ô nhiễm Norovirus trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ [21]

Hiện nay, các phương pháp truyền thống phát hiện Norovirus đang sử dụng ở

phòng thí nghiệm thường mất nhiều thời gian, độ nhạy không cao nên chỉ phù hợp trong trường hợp phân tích mẫu bệnh phẩm Nhằm nâng cao hiệu quả của công tác kiểm soát an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và lợi ích kinh tế quốc dân từ nguồn nuôi thủy hải sản, hướng tới mục tiêu phát triển một

phương pháp phát hiện nhanh, chính xác mức độ nhiễm Norovirus trong thực phẩm

với giá thành hợp lý là yêu cầu rất cấp thiết Do vậy, đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện nhanh Norovirus trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật RT- LAMP” đã được thực hiện với 6 nội dung chính như sau:

1 Xác định trình tự đoạn gen mục tiêu của các chủng Norovirus tại Việt Nam

2 Lựa chọn và hiệu chỉnh mồi LAMP

3 Tối ƣu hóa phản ứng RT-LAMP

4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP

5 Thử nghiệm quy trình tách chiết RNA

6 Xác định độ nhạy của toàn bộ quy trình

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về Norovirus

1.1.1 Cấu tạo Norovirus

Norovirus là một loại vi rút thuộc họ Caliciviridae, gây ra bệnh viêm dạ dày ruột ở người Chủng nguyên thủy của Norovirus là vi rút Norwalk, được phát hiện

từ một đợt bùng phát viêm dạ dày ruột cấp tính tại một trường tiểu học ở Norwalk, Ohio năm 1968 Các vi rút này rất nhỏ và không có màng bao quanh, sRNA (+), với

đường kính khoảng 27-35 nm Các Norovirus có tính di truyền và đa dạng về kháng

nguyên, được chia làm 40 dạng, bộ gen là RNA sợi đơn có kích thước gần 7.6kb

Các phân tích về trình tự toàn bộ chiều dài bộ gen của Norovirus đã chỉ ra rằng các

chủng vi rút trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về nucleotide Trong cùng genocluster, trình tự vỏ capsid của vi rút thường rất giống nhau và có cấu tr c đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng Vỏ capsid gồm có

90 dimer của một protein vỏ đơn, có trọng lượng phân tử là 58 kDa [12]

Hình 1.1 Cấu trúc Norovirus[21]

Bộ gen của Norovirus được chia thành 3 vùng đọc mở (ORF1, ORF2, và

ORF3) Vùng đọc mở thứ nhất ORF1 (~5 kb) mã hóa một phân tử polyprotein có kích thước 194kDa, phân tử polyprotein này bị phân cắt bởi chính protease của

Norovirus để tạo thành 6 phân tử protein gồm (1) p48, protein chưa rõ chức năng

(~48 kDa); (2) NTP nucleoside triphosphatase (~40 kDa) có khả năng liên kết và thủy phân toàn bộ NTP; (3) p22 tương tự như protein 3A, chưa rõ chức năng

(~22kDa); (4) VPg, protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân bản và dịch mã RNA (~16 kDa); (5) 3C, 3C-like protease (~19 kDa), có vai trò phân cắt ORF1 polyprotein thành các phân tử protein và (6) RdRp, RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) (~57 kDa) ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1, vỏ ORF3 mã hóa một protein VP2 cơ bản nhỏ chưa biết chức năng [10]

Hình 1.2 Cấu tạo vùng đọc mở Norovirus[10]

1.1.2 Cơ chế nhân bản của Norovirus

Quá trình nhân lên của vi rút bắt đầu từ khi vi rút hấp phụ lên bề mặt của tế bào cho đến l c vi rút trưởng thành và ra khỏi tế bào, quá trình này được chia làm 8 giai đoạn: (1) Giai đoạn vi rút hấp phụ lên bề mặt tế bào, quá trình này được quyết định bởi mối tương tác giữa thụ thể của vi rút với thụ thể của tế bào Sự hấp phụ chỉ xảy ra khi thụ thể của vi rút và tế bào hoàn toàn ăn khớp với nhau; (2) Giai đoạn vi rút xâm nhập vào tế bào, các tế bào tự mọc ra các chân giả bám lấy vi rút rồi khép lại, đưa vi rút vào bên trong tế bào; (3) Giai đoạn tháo vỏ, sau khi vi rút vào tế bào, nhờ tế bào tiết ra enzym decapsidase để cởi vỏ capsid, từ đó axit nucleic được giải phóng; (4) Giai đoạn dịch mã được thực hiện ngay sau khi vi rút xâm nhập vào tế bào chủ thông qua tương tác với VPg ở đầu 5’ của genome, polyprotein ORF1 được phân tách thành các protein nhỏ hơn nhờ enzyme protease NS6 (5) Giai đoạn tổng hợp các thành phần của vi rút, toàn bộ quá trình sinh tổng hợp của tế bào chủ bị đình chỉ và thay vào đó là quá trình sinh tổng hợp các thành

tạo thành lắp ráp với nhau tạo thành sợi RNA mới (6) Giai đoạn sao chép RNA, dưới tác dụng của enzyme RdRp, RNA được tổng hợp tử cả hai đầu polyA và VPg; (7) Genome và protein mới được tạo thành lắp ráp với nhau, đồng thời màng sinh chất bao lấy nucleocapsid tạo vỏ ngoài cho vi rút, quá trình này được diễn ra ở màng sinh chất; (8) Giai đoạn xuất bào, dưới tác dụng của enzim, màng tế bào bị phá vỡ, các vi rút thoát ra ngoài theo lối xuất bào[10]

Hình 1.3 Cơ chế nhân bản của Norovirus[10]

1.1.3 Phân nhóm Norovirus

Về mặt đa dạng di truyền, Norovirus được phân chia thành 5 nhóm

genogroup chính và ít nhất 31 kiểu gen dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa protein capsid VP1 [34] Trong đó, genogroup I (GI) và II (GII) là hai nhóm gen phổ biến gây bệnh ở người Các số liệu dịch tễ đã chỉ ra rằng GII.4 là kiểu gen

thường gặp nhất (trên 70%) trong các vụ dịch do Norovirus gây ra trên toàn thế giới

[13] Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã nhận thấy thể gen của

Norovirus có chiều hướng biến đổi liên tục tạo ra các biến thể mới có khả năng lây

nhiễm mạnh trên toàn thế giới, gây trở ngại trong việc xây dựng các biện pháp sinh

học phân tử nhằm xác định nhanh Norovirus [37]

Hình 1.4 Phân nhóm Norovirus [37]

1.2 Tác hại của Norovirus đến sức khỏe

Norovirus là nguyên nhân phổ biến của các ca viêm dạ dày ruột cấp ở hầu hết các nhóm tuổi Triệu chứng của bệnh viêm dạ dày ruột do Norovirus gây ra

thường bao gồm buồn nôn, đau bụng, nôn, tiêu chảy nhẹ và tự khỏi Tuy nhiên, trong một số trường hợp có thể gây ra tiêu chảy liên tục, dẫn đến mất nước và có thể gây tử vong nếu không được điều trị kịp thời Quá trình ủ bệnh thường xẩy ra từ 24-

48 giờ và các triệu chứng có thể kéo dài từ 12-60 giờ Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị kháng vi rút đặc hiệu trong những trường hợp viêm dạ dày ruột do

Norovirus cũng như không có vaccine để ngăn ngừa bệnh mà chỉ tập trung vào

chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt là việc phòng chống mất nước Đối với trẻ em và người cao tuổi, nguy cơ mất nước rất cao dễ dẫn đến rối loạn sự cân bằng điện giải và có thể phải nhập viện [13]

Việc nuôi cấy Norovirus ở người không khả thi nên hầu hết các dữ liệu bệnh

học, miễn dịch học đều thu được từ những nghiên cứu trên nhóm người tình nguyện khỏe mạnh bị gây nhiễm vi rút Kết quả đã cho thấy, sự viêm nhiễm chính thường xảy ra ở phần dưới của ruột non với sự dãn nỡ của lông nhung và sự co ngắn của vi lông nhung Những vết viêm loét của niêm mạc phát triển sau đó, và thường dẫn

đến tiêu chảy Quá trình viêm nhiễm do Norovirus đã kích thích cơ thể sinh ra

kháng thể IgG, IgA đặc hiệu và kháng thể IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có

sự phơi nhiễm trước đó Hầu hết các bệnh nhân đều đề kháng với sự tái nhiễm

Norovirus trong khoảng 4 - 6 tháng Tuy nhiên, không có sự miễn dịch Norovirus

lâu dài [3]

Norovirus có khả năng lây nhiễm rất cao do liều gây bệnh thấp (<100 phần

tử vi rút) và mức thải vi rút cao trong phân người bệnh (108-10 phiên bản thể gen RNA/g phân) Quá trình thải vi rút này có thể kéo dài đến 2 tuần tính từ thời điểm

các triệu chứng bắt đầu xuất hiện Đồng thời, Norovirus khá bền đối với các tác

nhân vật lý và hóa học, ch ng có khả năng chịu nhiệt đến 600C và bền trong nước chứa 10ppm clo, đây chính là nguyên nhân chủ yếu gây ra các vụ dịch do

Norovirus Hiện nay, việc phòng ngừa và khống chế các vụ dịch do Norovirus gây

ra chủ yếu dựa vào việc xác định các phương thức truyền nhiễm, sự lan truyền bệnh

được ngăn chặn bằng việc kiểm soát ô nhiễm Norovirus đối với thực phẩm và

nguồn nước, duy trì vệ sinh cá nhân, và hạn chế sự truyền bệnh từ người sang người [13]

1.3 Tình hình nhiễm Norovirus tại Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Tình hình nhiễm Norovirus trên thế giới

Theo các số liệu thống kê dịch tễ gần đây, Norovirus được coi là một trong

những nguyên nhân chính gây bệnh lan truyền do thực phẩm trên toàn thế giới Ở

Mỹ, Norovirus là nguyên nhân của 2/3 các ca viêm dạ dày ruột do thực phẩm

nhiễm khuẩn (23 triệu ca/năm) Các đối tượng thường bị bệnh viêm dạ dày ruột do

Norovirus bao gồm trẻ em, người già, người bị suy giảm miễn dịch, nhân viên nhà

hàng, bệnh viện, quân đội, người đi du lịch đến các vùng có dịch [16] Đối với trẻ

em, Norovirus là nguyên nhân thứ hai, sau Rotavirus gây ra bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ dưới năm tuổi Ước tính hàng năm trên thế giới, Norovirus gây ra trên

2 triệu ca viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ em với trên 200 000 trường hợp bị tử

vong Tại các nước phát triển, Norovirus là nguyên nhân dẫn tới 900.000 ca nhập

viện mỗi năm, trong đó có 64.000 ca ở trẻ dưới 5 tuổi Ở các nước đang phát triển, trên 1,1 triệu ca tiêu chảy ở trẻ dưới 5 tuổi trong đó hơn 218.000 ca tử vong do

Norovirus gây ra [29] Đến nay, vacxin Rotavirus đã được phổ biến tại nhiều quốc gia, nên Norovirus có nguy cơ trở thành tác nhân gây bệnh đường ruột ở trẻ em phổ

biến nhất trong tương lai gần

Bảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về đặc điểm

nhiễm Norovirus trẻ mắc viêm dạ dày ruột và trẻ khỏe mạnh

Tài liệu tham khảo

1.3.2 Tình hình nhiễm Norovirus tại Việt Nam

1.3.2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm, ở nước ta từ năm 2002 đến năm

2010, tại 63 tỉnh/thành phố đã xảy ra 1.689 vụ ngộ độc thực phẩm (NĐTP) với 52.468 người mắc và 461 người tử vong Ngộ độc thực phẩm chủ yếu xảy ra tại gia đình chiếm 60,6%, bếp ăn tập thể chiếm 13,1%, đám cưới/giỗ chiếm 9,1% và thức

ăn đường phố chiếm 5,7% tổng số vụ NĐTP Số người mắc NĐTP tập trung chủ yếu tại các khu công nghiệp, khu chế xuất có bếp ăn tập thể (tự nấu hay được cung

cấp suất ăn sẵn) chiếm tới 45,85% tổng số ca mắc NĐTP trong năm nhưng số người

tử vong do NĐTP xảy ra tại gia đình lại cao nhất (85,25% số ca tử vong do NĐTP) Năm 2014 đã xảy ra 194 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.203 người mắc, 4.160 người

đi viện và 43 người tử vong So với năm 2013, số vụ ngộ độc tăng lên 27 vụ (16,2%) Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật vẫn chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), trong đó tác nhân chính là vi khuẩn gây bệnh và độc tố nấm mốc Vẫn có tới 27,3% số vụ ngộ độc chưa xác định được nguyên nhân [4], trong số đó có thể tác

nhân gây ngộ độc là Norovirus đã không được phát hiện do năng lực xét nghiệm

của các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh còn hạn chế, cho đến nay vẫn chưa có thường

quy xác định Norovirus trong thực phẩm phổ biến thống nhất trong toàn ngành Y tế

Do vậy, việc xây dựng phương pháp xác định Norovirus trong thực phẩm đang trở

thành một trong những vấn đề được quan tâm

1.3.2.2 Tình hình nhiễm Norovirus tại Việt Nam

Một nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12/1999 đến tháng 11/2000, trong

448 mẫu phân trẻ em tiêu chảy tại Bệnh viện Nhi Đồng I và Nhi Đồng II có 72 mẫu

dương tính với Norovirus [11] Nghiên cứu dịch tễ học phân tử thực hiện năm 2007

(Nguyễn Vân Trang và cs) đã chỉ ra trong 501 mẫu phân trẻ em bị viêm dạ dày ruột

tại viện Nhi TW có 180 mẫu dương tính với Norovirus [5] Một nghiên cứu khác

được thực hiện từ tháng 5/2009 đến tháng 12/2012 (Phan Vũ Trà My và cs) ở 3 bệnh viện tại TP.HCM (BV Nhi Đồng I, Nhi Đồng II và BV Nhiệt đới), trong 1419

mẫu phân trẻ em dưới 5 tuổi có 293 mẫu dương tính với Norovirus, đặc biệt trẻ dưới 2 tuổi có số trường hợp nhiễm Norovirus cao nhất, chiếm 90% trường hợp

nhập viện [30]

Hình 1.5 Phân bố tỉ lệ nhiễm Norovirus và Rotavirus ở trẻ dưới 5 tuổi [30]

1.3.2.3 Biến động kiểu gen Norovirus qua các năm ở Việt Nam

Từ 2007-2013, kiểu gen Norovirus GII.4 luôn là kiểu gen lưu hành chiếm

ưu thế Sự xuất hiện của các dòng GII.4 ở Việt Nam cùng thời điểm trên thế giới xuất hiện dòng GII.4 mới tương ứng Song song tồn tại với các đa dạng chủng GII.4 là genotype GII.3, chiếm tỷ lệ không dưới 20% Như vậy, sự xuất hiện của các đa dạng chủng GII.4 ở nước ta đồng thời với sự lưu hành toàn cầu của các

chủng này trên thế giới Các chủng Norovirus phổ biến ở miền Bắc bao gồm GI.8, GII.3, GII.4, GII.13, trong khi đó các genotype Norovirus lưu hành ở miền Nam đa

dạng hơn với việc thêm nhiều type thuộc nhóm gen GI và GII như GI.3 GI.4, GI.5, GII.6, GII.9 và GII.12, kết quả này được thể hiện ở hình 1.3.2 [5]

Hình 1.6 Phân bố genotype của Norovirus ở miền Bắc và miền Nam Việt Nam năm 2010

[30]

1.4 Đối tượng thực phẩm có nguy cơ nhiễm Norovirus

Đối tượng thực phẩm có nguy cơ nhiễm Norovirus thường là các loại

nhuyễn thể hai mảnh vỏ và các loại rau quả ăn sống Đặc biệt, Norovirus là nhóm

vi rút xuất hiện phổ biến nhất trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ do kiểu sinh sống lọc

nước để lấy thức ăn Nghiên cứu dịch tễ học đầu tiên chứng minh mối liên hệ giữa

vi rút gây viêm dạ dày ruột và nhuyễn thể hai mảnh vỏ được thực hiện vào mùa

đông năm 1976-1977 tại Anh, nơi xảy ra 33 vụ ngộ độc riêng biệt với khoảng 800

người nhập viện do sử dụng sò đã qua nấu chín (Appleton và Pereira, 1977)

Norovirus là vi rút gây bệnh xuất hiện nhiều nhất trong các loại nhuyễn thể hai

mảnh vỏ, chiếm 83,7%, tiếp đến là HAV chiếm 12,8% (Bellou và cs, 2013) Rất

nhiều các nghiên cứu khẳng định sự có mặt của Norovirus trong nhuyễn thể hai

bảnh vỏ đã được thực hiện tại châu Âu, châu Đại Dương, Mỹ và Úc (Bellou và cs,

2013) [21]

Để bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng khỏi nguy cơ từ việc sử dụng nhuyễn

thể hai mảnh vỏ ô nhiễm, nhiều quy định đã được đưa ra nhằm kiểm soát chất

lượng của nhóm thực phẩm này; tại Liên minh châu Âu (Anonymous, 2004), đã có

nhiều quy định tập trung vào việc kiểm soát và phân loại khu vực nuôi trồng

nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo mức độ ô nhiễm nguồn nước; tại Ireland, Ủy ban bảo

vệ biển và thủy sản (SFPA) kết hợp với phòng thí nghiệm quốc gia trực thuộc Viện

hải dương học đã có những nghiên cứu giám sát mức độ ô nhiễm Norovirus trên

nhuyễn thể hai mảnh vỏ [21] Trong 6 tháng đầu năm 2014, Cơ quan thẩm quyền Châu Âu (EU) đã cảnh báo 23 lô hàng nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam về

chỉ tiêu Norovirus; tháng 7 năm 2014, Cục quản lý chất lượng Nông lâm sản và

Thủy sản thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra công văn số 1349 /QLCL-CL1 yêu cầu về việc lấy mẫu giám sát nhuyễn thể hai mảnh vỏ [1]

Vấn đề nhiễm Norovirus trong thực phẩm không những ảnh hưởng lớn đến

sức khỏe người tiêu dùng mà còn gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế quốc dân

và tính cạnh tranh lành mạnh của thực phẩm Việt Nam trên thị trường quốc tế Vì vậy, việc phát triển một phương pháp phát hiện nhanh, chính xác mức độ nhiễm

Norovirus trong thực phẩm với giá thành hợp lý là yêu cầu cấp thiết, nhằm nâng cao

hiệu quả của công tác kiểm soát an toàn thực phẩm, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dung

1.5 Các phương pháp xác định Norovirus

1.5.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử

Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử để phát hiện các hạt vi rút có kích

thước 27-30nm là phương pháp truyền thống để phát hiện Norovirus trong các mẫu

bệnh phẩm Tuy nhiên phương pháp này chỉ cho phép phát hiện với lượng vi rút tối thiểu là 106 hạt vi rút/g mẫu bệnh phẩm; do đó chỉ phù hợp với việc phát hiện

Norovirus trong mẫu bệnh phẩm với lượng lớn Norovirus Ngoài ra, phương pháp này yêu cầu trình độ kĩ thuật cao, thiết bị đắt tiền do Norovirus không có hình thái

bề mặt điển hình như một số vi rút khác nên không được ứng dụng phổ biến

1.5.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

Kỹ thuật ELISA được phát triển để phát hiện trực tiếp các yếu tố quyết định

kháng nguyên trên capsid của Norovirus Kỹ thuật này cho phép xác định

Norovirus trong mẫu phân với một quy trình đơn giản, có thể ứng dụng được tại

nhiều phòng thí nghiệm Một số bộ sinh phẩm đã được ra đời cho phép phát hiện

Norovirus bằng việc sử dụng các giếng được phủ trước bởi các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho Norovirus nhóm GI và GII, phù hợp để xác định đặc hiệu Norovirus

nhóm GI và GII trong vòng 2 giờ Tuy nhiên, độ nhạy của các bộ sinh phẩm này còn thấp (78,9%) khi so sánh với phương pháp RT-PCR (>90%) Kỹ thuật ELISA thường được sử dụng trong bệnh viện với cỡ mẫu lớn, yêu cầu xác định nhanh; tuy nhiên kết quả âm tính cần được khẳng định lại bằng kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật ELISA cho phép xác định nhanh với giá thành rẻ nhưng độ nhạy chưa cao nên

không thể ứng dụng để phát hiện Norovirus trong các mẫu thực phẩm với lượng nhỏ

vi rút

1.5.3 Kỹ thật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

Kỹ thuật RT-PCR là kỹ thuật phân tích dựa trên sự khuếch đại axit nucleic,

kĩ thuật này có thể khắc phục hạn chế về độ nhạy của các phương pháp miễn dịch Với khả năng khuếch đại chính xác một trình tự gen mục tiêu lên hàng tỉ lần, các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic về lý thuyết có độ nhạy có thể đạt đến ngưỡng 1 bản

sao/phản ứng Trong số các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để phát hiện Norovirus,

RT-PCR (Reverse Trancription Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được sử dụng phổ biến hơn cả Đoạn gen mục tiêu thường được sử dụng để phát hiện

Norovirus trong các phương pháp RT-PCR là vùng gen mã hóa RNA-dependent

RNA polymerase trong vùng đọc mở ORF1 do có tính bảo thủ cao Tuy nhiên, chưa

có một tổ hợp mồi nào cho phép khuếch đại được toàn bộ các chủng Norovirus vì

tính đa hình trong các trình tự gen mục tiêu Trong một nghiên cứu so sánh hiệu quả

của 3 phương pháp phát hiện Norovirus trên một tập hợp gồm 244 mẫu bệnh phẩm,

Rabenau và các cộng sự (2003) đã chỉ ra phương pháp RT-PCR có độ nhạy cao nhất (94,1%), sau đó đến phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử (58,3%) và ELISA (31,3%) Gần đây, các phương pháp dựa trên kỹ thuật REAL-TIME TaqMan RT-PCR đã cho phép cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại, giảm thời gian phân tích

và hạn chế hiện tượng nhiễm tạp, trở thành phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện,

định lượng Norovirus trong các mẫu phân tích; tuy nhiên, các phương pháp dựa trên

kỹ thuật RT-PCR có một hạn chế cơ bản là việc cần sử dụng một thiết bị chu trình nhiệt có giá thành cao và/hoặc một hệ thống điện di cồng kềnh, không thích hợp với các phép phân tích hiện trường [17, 19]

1.5.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)

RT-LAMP là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng phổ biến nhất trong số các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt axit nucleic hiện có; với kỹ thuật này, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước

Ra đời vào năm 2000, kỹ thuật RT-LAMP sử dụng đặc tính chuyển vị mạch của enzyme Bst DNA polymerase và 4 cặp mồi nhắm đến 6 vùng khác nhau trên gen mục tiêu [25] Nhờ việc tạo ra các cấu trúc thòng lọng đơn nhánh (loop structures), quá trình khuếch đại có thể diễn ra tại một nhiệt độ mà không cần thông qua giai đoạn biến tính như ở kỹ thuật PCR Khi được tối ưu hóa, khả năng khuếch đại DNA của LAMP là rất cao, đến hàng chục tỉ lần trong thời gian 1 giờ Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, gi p đơn giản hóa và rút ngắn thời gian phân tích [2]

1.6 Giới thiệu phương pháp RT-LAMP

Phương pháp RT-LAMP có khả năng khuếch đại gen một cách đặc hiệu bằng việc sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được thiết kế đặc biệt nhận diện 6 vùng đặc trưng trên gen đích (target gene) và quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cố định, dùng phản ứng thay thế mạch Quá trình khuếch đại và phát hiện gene của RT-LAMP có thể được hoàn thành chỉ trong một bước bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở nhiệt độ cố định (khoảng 65°C)

Hình 1.7 (A): Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP[24]

Phương pháp này cho hiệu quả khuếch đại cao với lượng DNA được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút, có thể khuếch đại các đoạn RNA với quy trình tương tự như với DNA, chỉ cần thêm một bước phiên mã ngược, Do tính đặc hiệu cao, sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại có thể chứng tỏ sự có mặt của đoạn gene quan tâm Đối với phản ứng RT-LAMP, việc thiết kế mồi phù hợp là rất khó và đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng Bốn loại mồi được thiết kế dựa trên sáu vùng đặc trưng trên gen mục tiêu (vùng F3c, F2c và F1c ở đầu 3’ và các vùng B1, B2 và B3 ở vùng 5’) gồm có: (1) Mồi FIP (Forward Inner Primer), mồi xuôi trong chứa vùng F2 (ở đầu 3') bổ sung với vùng F2c và trình tự giống hệt của vùng F1c ở đầu 5’; (2) Mồi F3, mồi xuôi ngoài, chứa vùng F3 bổ sung với vùng F3c; (3) Mồi BIP (Backward Inner Primer), mồi ngược trong gồm vùng B2 ở đầu 3'

bổ sung với vùng B2c và trình tự giống hệt của vùng B1c ở đầu 5'; (4) Mồi B3, mồi ngược ngoài, gồm vùng B3, bổ sung với vùng B3c

Ngoài ra, hai mồi loop (mồi B-Loop hoặc mồi F-loop) có chứa các trình tự

bổ sung với các vùng tạo cấu trúc vòm mạch đơn (giữa các vùng B1 và B2 hoặc giữa các vùng F1 và F2) ở đầu 5’ của cấu trúc dạng thòng lọng được sử dụng làm tăng một lượng lớn các điểm bắt đầu cho quá trình tổng hợp DNA trong phương pháp LAMP Một ví dụ được minh họa ở hình dưới, trong đó có một sản phẩm khuếch đại chứa 6 vùng thòng lọng Trong phương pháp LAMP thông thường, 4 trong các vùng thòng lọng này không được sử dụng, nhưng qua việc dùng mồi loop, tất cả các vùng mạch đơn có thể được dùng như là điểm bắt đầu để tổng hợp DNA

Hình 1.7 (B): Bộ mồi Loop của phản ứng LAMP [24]

Nguyên tắc của phản ứng LAMP

Khi gen mục tiêu và các thành phần của phản ứng được ủ ở nhiệt độ không đổi trong khoảng 60-65°C, các bước của quá trình phản ứng diễn ra như sau:

- Bước 1: DNA mạch đôi ở trạng thái cân bằng động học tại nhiệt độ khoảng 65°C, mồi FIP bám vào mạch bổ sung của đoạn gen đích và khởi động quá trình tổng hợp DNA sử dụng DNA polymerase có hoạt tính thay thế mạch, thay thế

và giải phóng DNA mạch đơn, do đó đoạn DNA mạch đôi được chuyển thành mạch đơn mà không cần biến tính nhiệt như ở phương pháp PCR

- Bước 2: Nhờ hoạt tính thay thế chuỗi của DNA polymerase, mạch DNA

bổ sung với DNA đích được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3’ của vùng F2 của FIP

- Bước 3: Mồi F3 gắn vào vùng F3c, phía ngoài của FIP trên DNA đích và khởi động quá trình tổng hợp mạch DNA thay thế, giải phóng mạch bổ sung gắn với FIP

- Bước 4: Một mạch kép được được hình thành từ mạch DNA được tổng hợp từ mồi F3 và mạch DNA khuôn

- Bước 5: Mạch bổ sung gắn với FIP được giải phóng thành mạch đơn do sự thay thế của mạch được tổng hợp từ mồi F3 Sau đó, mạch đơn được giải phóng này

hình thành một cấu trúc stem-loop cái móc ở đầu 5’ do có sự bổ sung của các vùng F1c và F1

- Bước 6: Mạch đơn DNA ở bước (5) đóng vai trò như một khuôn mới cho quá trình tổng hợp DNA bắt đầu từ BIP và sự tổng hợp DNA thay thế mạch có mồi B3 Đoạn BIP sẽ gắn với mạch DNA được tạo ra từ bước (5) Từ đầu 3’ của BIP, quá trình tổng hợp mạch DNA thay thế được bắt đầu Từ đây, DNA chuyển từ cấu trúc loop sang cấu trúc mạch thẳng Mồi B3 sẽ gắn với phần bên ngoài của BIP và sau đó, nhờ hoạt tính của DNA polymerase và bắt đầu từ đầu 3’, mạch DNA được tổng hợp từ BIP sẽ được thay thế và giải phóng thành một mạch đơn trước quá trình tổng hợp DNA từ mồi B3

- Bước 7: Mạch DNA kép được tạo ra từ quá trình được miêu tả trong bước (6)

- Bước 8: Mạch bổ sung gắn với BIP được thay thế trong bước (6) sẽ tạo thành một cấu trúc với các stem-loop cái móc ở mỗi đầu, cấu trúc này sẽ đóng vai trò như cấu trúc khởi đầu cho chu trình LAMP

Hình 1.7 (C): Nguyên tắc phản ứng LAMP [24]

- Bước 8 – 11: Cấu trúc quả tạ (dumbbell-like) sau đó nhanh chóng được biến đổi tạo thành một DNA có dạng móc nhờ sự tổng hợp DNA FIP gắn với vùng mạch đơn trong vùng thòng lọng và làm mồi cho sự tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng mạch vừa mới tổng hợp Mạch đơn vừa mới được giải phóng này sẽ hình thành một cấu trúc thòng lọng ở đầu 3’ do nó có các vùng có trình tự bổ sung là B1c

và B1 Tiếp đó, từ đầu 3’ của vùng B1, quá trình tổng hợp DNA bắt đầu, dùng cấu trúc tự có của nó làm khuôn, và giải phóng mạch bổ sung gắn với FIP (bước (9)) Mạch đơn vừa được giải phóng sau đó hình thành nên một cấu trúc hình quả tạ do

cả 2 đầu đều chứa các vùng bổ sung là F1-F1c và B1c-B1 (bước (11)) Cấu trúc này

là cấu trúc chuyển giao (turn-over) của cấu tr c được hình thành ở bước 8 Tương

tự như các bước từ 8 đến 11, cấu tr c được hình thành sau bước 11 sẽ dẫn đến sự

BIP gắn với vùng B2c và làm mồi cho quá trình tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng mạch DNA được gắn mồi B1 Theo đó, các cấu tr c tương tự như bước (9)

và (10) cũng như cấu tr c tương tự như ở bước (8) cũng được tạo ra Với cấu trúc được tạo ra ở bước (10), BIP gắn vào vùng B2c mạch đơn, và quá trình tổng hợp DNA tiếp tục bằng việc thay thế trình tự DNA mạch kép Kết quả của quá trình này

là hình thành vô số các cấu trúc khác nhau chứa các trình tự lặp lại đảo ngược luân phiên nhau của trình tự đích ban đầu ở trên cùng một mạch

Hình 1.7 (C) Các bước tại cấu trúc vòng trong phản ứng LAMP [24]

Phản ứng RT-LAMP diễn ra tương tự như phản ứng LAMP thông thường nhưng có thêm quá trình phiên mã ngược tạo cDNA Quá trình tạo cDNA được thực hiện với sự tham gia của mồi BIP Các giai đoạn tiếp theo diễn ra tương tự như phản ứng LAMP thường [35]

Ưu điểm của phản ứng LAMP

Phản ứng RT-LAMP sử dụng đặc tính chuyển vị mạch của enzyme Bst DNA polymerase và 4 cặp mồi nhắm đến 6 vùng khác nhau trên gen mục tiêu Nhờ việc tạo ra các cấu trúc thòng lọng đơn nhánh (loop structures), quá trình khuếch đại có thể diễn ra tại một nhiệt độ mà không cần thông qua giai đoạn biến tính như ở kỹ thuật PCR [15] Việc sử dụng enzyme Bst DNA polymerase thay vì sử dụng enzyme Taq polymerase như trong phản ứng PCR cho phép phản ứng LAMP có thể giảm sự ảnh hưởng của các tác nhân ức chế phản ứng hơn so với phản ứng PCR thông thường [18, 23, 26]; như vậy trong một số trường hợp có thể giảm thiểu bước

tinh sạch, nâng cao hiệu quả kinh tế Ở phản ứng LAMP, quá trình diễn ra phản ứng đến đọc kết quả được thực hiện trong cùng một ống phản ứng, kết quả được quan sát bằng mắt thường sau khi li tâm hoặc nhờ sự có mặt của chất huỳnh quang, do đó góp phần giảm nguy cơ nhiễm tạp, tăng độ nhạy của phản ứng Có thể nhận thấy, RT-LAMP là phương pháp khuếch đại nucleic acid đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm, có khả năng giảm ảnh hưởng của chất ức chế đến phản ứng, cho độ nhạy cao,

phù hợp để xác định nhanh Norovirus trong thực phẩm

1.7 Một số nghiên cứu xác định Norovirus bằng phương pháp LAMP

Công trình đầu tiên sử dụng kỹ thuật RT-LAMP để phát hiện Norovirus là

nghiên cứu của Fukuda và các cộng sự (2006) sử dụng gen mục tiêu là vùng đi từ đầu C của gen mã hóa RNA-dependent RNA polymerase đến đầu N của gen mã hóa VP1, protein capsid Độ nhạy của phản ứng RT-LAMP đã xây dựng nằm trong khoảng 102-103 phiên bản/phản ứng tùy thuộc vào kiểu gen của chủng Norovirus

Khi được thử nghiệm trên các mẫu phân từ các vụ dịch, độ tương đồng kết quả giữa phương pháp RT-LAMP và RT-PCR đạt gần 100% Trong một nghiên cứu tương

tự, Yoda và các cộng sự (2007) đã thiết kế 3 tổ hợp mồi để khuếch đại các trình tự gen mục tiêu tương ứng với nhóm GI, GII thường gặp và GIII ít gặp Độ nhạy của phương pháp RT-LAMP dao động từ 7-200 phiên bản/phản ứng tùy thuộc vào kiểu

gen của chủng Norovirus Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng như một số nghiên cứu về Norovirus bằng phương pháp LAMP khác trên thế giới tính đến thời điểm

hiện tại đều được thực hiện trên mẫu bệnh phẩm với lượng vi rút lớn

Do đó, việc nghiên cứu cập nhật hệ thống mồi LAMP có độ bao phủ cao với

các biến chủng Norovirus hiện nay cùng với việc xây dựng một quy trình phát hiện nhanh Norovirus hoàn chỉnh bao gồm cả công đoạn chuẩn bị mẫu, tách chiết RNA

để loại bỏ các chất ức chế trong thực phẩm là hết sức cần thiết, góp phần nâng cao hiệu quả của công tác kiểm soát an toàn thực phẩm

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Chủng E coli DH5α từ bộ sưu tập chủng của Trung tâm Nghiên cứu

phát triển Sinh học Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Tổng cộng 60 mẫu hàu được thu thập tại 2 siêu thị và 1 chợ hải sản lớn tại

Hà Nội, tần suất lấy mẫu 1 mẫu/1 địa điểm/15 ngày trong khoảng thời gian từ tháng 8/2013 đến tháng 5/2014

- GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas);

- AMV Reverse Transcriptase (Fermentas);

- RNase Inhibitor (Promega)

- GeneRuler™ 1kb Plus DNA Ladder (Fermentas);

- GeneRuler™ 100bp DNA Ladder (Fermentas);

- RiboRuler™ High Range RNA Ladder (Fermentas);

- Bst DNA Polymerase, Large Fragment và đệm (New England Biolabs);

2.1.5 Thiết bị

- Máy ly tâm Spectrafuge 16M (Labnet);

- Máy ly tâm góp mẫu (Labnet);

- Máy vortex (Labnet);

- Máy chu trình cá nhân (Labnet);

- Máy lắc Labroller (Labnet);

- Máy xay đa dụng (Phillip);

- Bể điện di loại nhỏ và nguồn (Labnet);

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Các mẫu hàu sống sau khi thu thập được rửa sạch dưới vòi nước Tiếp đó tách vỏ và mổ lấy phần ống tiêu hóa, băm nhuyễn tuyến tiêu hóa và cân 0,5  0,05 g phân phối vào ống eppendorf 2 ml Chuẩn bị 2 ống eppendorf cho mỗi mẫu Mẫu

sau khi xử lý được bảo quản ở -20°C đến khi phân tích

2.2.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch RNA vi rút

0,5g tuyến tiêu hóa nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Hình 2.1 Quy trình tách chiết RNA bằng Trizol

Các mô tiêu hóa sẽ được ly giải hoàn toàn bằng Trizol để giải phóng RNA

tổng số, bao gồm cả RNA của Norovirus Tiếp đó bổ sung chloroform nhằm phân

tách RNA vi rút; sau khi li tâm với tốc độ cao, dung dịch trong ống sẽ được phân làm 2 pha, RNA ở pha trên cùng, DNA và protein ở lớp phân pha Dùng pipet hút nhẹ nhàng phần dịch nổi để thu RNA đã tách chiết Toàn bộ quy trình tách chiết RNA bằng Trizol được tóm tắt trong Hình 2.1

800ul dịch nổi sản phẩm tách chiết bằng Trizol

Đảo trộn trong 5 giây

Đảo trộn mạnh

Hình 2.2 Quy trình tinh sạch RNA theo phương pháp Boom

RNA thu được sau khi tách chiết bằng Trizol được tinh sạch theo phương pháp của Boom và các cộng sự [31] Quy trình tinh sạch được tóm tắt trong Hình 2.2 Huyền phù Silica trước tiên được bổ sung vào mẫu RNA, sau đó ủ ở nhiệt độ thường Tiếp đó tiến hành li tâm ở 12000g để thu các hạt silica đã gắn RNA, các hạt silica cùng với RNA sau đó được rửa bằng dung dịch rửa Sau cùng bổ sung dung

dịch 10 mM Tris, pH 8,5 rồi ủ ở 60oC trong 10 phút và li tâm với tốc độ cao để thu đƣợc RNA tinh sạch

2.2.3 Phương pháp Real-time RT-PCR

Phản ứng khuếch đại các trình tự gen đặc hiệu của Norovirus GI và GII đƣợc

thực hiện với việc sử dụng ultrasens quantitative RT-PCR kit (Life Technologies) trên hệ thống MasterCycler RealPlex4 (Eppendorf) Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR đƣợc trình bày ở bảng 2.1 Các trình tự mồi và mẫu dò đƣợc sử dụng

để phát hiện Norovirus GI và GII thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR

Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng Real-time RT-PCR

GI

Mồi xuôi QNIF4 5’-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’

Mồi ngược NVILCR 5’-CCTTAGACGCCAT-CATCATTTAC-3’ Mẫu dò NVILCRpr 5’-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-3’

GII

Mồi xuôi QNIF2 5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’ Mồi ngược COG2R 5’-TCGACG-CCATCTTCATTCACA-3’

Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR như sau: ủ ở 550C trong 1 giờ để thực hiện phản ứng phiên mã ngược, tiếp theo biến tính ban đầu ở 950C trong

3 ph t rồi khuếch đại 45 chu kỳ (950C, 15 giây; 600C, 1 ph t; 650C, 1 ph t) Đọc tín hiệu tại kênh FAM vào cuối giai đoạn kéo dài ở 650C Giá trị chu kỳ ngưỡng Ct được xác định tự động dựa vào phần mềm EP realplex với chế độ đường nền (Noiseband) Một mẫu chỉ được coi là dương tính khi có giá trị Ct thu nhận được là nhỏ hơn 41