Qui trình nhân giống cây phong lan phi điệp

Kết quả nghiên cứu có thể góp phần tạo ra nguồn cây giống phong lan Phi điệp tím chất lượngtốt với số lượng nhiều, đáp ứng được nhu cầu ngày càng lớn của thị trường, góp phầngiảm nguy cơ

PHÕNG GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO…

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

… , tháng … năm ….

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 3

1 Lí do chọn đề tài 3

2 Mục tiêu của đề tài 3

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4

3.1 Ý nghĩa khoa học 4

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5

1.1 Đặc điểm phong lan Phi điệp tím ( Dendrobium anosmum ) 5

1.2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 6

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật 6

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào 6

1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 7

1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro 7

1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào 9

1.3.1 Trên thế giới 9

1.3.2 Trong nước 10

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nội dung nghiên cứu 11

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 11

2.2.2 Nghiên cứu khử trùng mẫu 11

2.2.3 Nghiên cứu môi trường tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro 12

2.2.4 Nghiên cứu môi trường để nhân nhanh chồi 12

2.2.5 Nghiên cứu môi trường thích hợp cho ra rễ 13

2.2.6 Nghiên cứu huấn luyện cây con giai đoạn ra ngôi: 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 15

3.1 Tạo mẫu sạch 15

3.2 Môi trường tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro 15

3.2.1 Môi trường tạo protocorm 15

3.2.2 Môi trường tạo chồi 17

3.3 Môi trường nhân nhanh chồi 18

3.4 Môi trường ra rễ 20

3.4 Ra ngôi 21

3.4.1 Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây đến tỷ lệ sống của cây lan con 21

3.4.2 Ảnh hưởng của loại giá thể trồng lên tỷ lệ sống của cây lan con 21

3.4.3 Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sinh trưởng của cây lan con 22

3.5 Quy trình nhân giống phong lan Phi điệp tím bằng công nghệ in vitro 23

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25

1 Kết luận 25

2 Kiến nghị 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

1

LỜI CẢM ƠN Nhóm nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM BẰNG CÔNG NGHỆ IN VITRO”

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) là loài lan có thân thòng, lá mọc hai hàng

theo thân Hoa biến thiên từ màu trắng đến tím đậm, lưỡi mở hình tim, phủ lông mịnnhư nhung, có ánh kim Lan Phi điệp tím có hoa đẹp, độ bền bông cao, là một loài câyrất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa Loài lan rất được ưa chuộng trên thịtrường, tuy nhiên số lượng loài này trong tự nhiên đang có nguy cơ sụt giảm nghiêmtrọng do nạn khai thác quá mức

Phương pháp nhân giống lan Phi điệp tím hiện nay là nhân giống bằng hạt vànhân giống bằng cách tách chồi non mọc từ mắt ngủ [5,8] Cả hai phương pháp nhângiống này đều có nhiều hạn chế Nhân giống bằng hạt có tỉ lệ nhân giống rất thấp do tỉ

lệ nảy mầm của hạt lan rất thấp, cần có sự cộng sinh của một số loại nấm Nhân giốngbằng chồi non có hệ số thấp vì số lượng chồi mọc ra từ thân không nhiều, các chồi cókhả năng sinh trưởng không đồng đều Chính vì vậy cả hai phương pháp nhân giốngnày đều không thể cung cấp được số lượng cây giống lớn, đáp ứng được nhu cầu ngàycàng nhiều của con người đối với loài hoa lan đẹp này

Ngày nay, công nghệ sinh học được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong nhângiống cây trồng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào (in vitro) đã được chứng minh có rấtnhiều ưu điểm như tạo được tạo ra với số lượng lớn cây con, chất lượng đảm bảo, sạchbệnh, giá thành phù hợp và không phụ thuộc vào yếu tố thời tiết Chính vì vậy phươngpháp này ngày càng được sử dụng nhiều trong nhân giống cây trồng, trong đó có nhângiống nhiều loài lan ở Việt Nam cũng như trên thế giới [9]

Từ đó, câu hỏi được đặt ra là có thể sử dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào đểnhân giống loài lan Phi điệp tím không? Môi trường thích hợp cho nhân giống lan Phiđiệp tím gồm những thành phần nào? Quy trình nhân giống lan Phi điệp tím bằng côngnghệ nuôi cấy mô tế bào như thế nào?

Để trả lời các câu hỏi trên, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống

phong lan Phi điệp tím bằng công nghệ in vitro” đã được đề xuất thực hiện Kết quả

nghiên cứu có thể góp phần tạo ra nguồn cây giống phong lan Phi điệp tím chất lượngtốt với số lượng nhiều, đáp ứng được nhu cầu ngày càng lớn của thị trường, góp phầngiảm nguy cơ biến mất của loài lan này trong tự nhiên

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho loài lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum).

3

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Đặc điểm phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum)

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố lan Phi điệp tím

Lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) thuộc:

Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum)

Loài lan Phi điệp tím thường mọc ở các quốc gia thuộc vùng Đông Nam Á

nhưng nay được con người trồng ở nhiều nơi trên thế giới [3]

1.1.2 Đặc điểm lan Phi điệp tím

Đây là loài lan đa thân, thân cứng, thân dài tới 1,20 m buông rũ xuống Lá mọc

so le, đối cách dài 8-12 cm, rộng từ 4-7 cm, lá dày Hoa to tới 10 cm mọc từ 1-3 chiếc

ở các đốt đã rụng lá, nở vào mùa xuân, xuân hè Dendrobium anosmum có hai mầu sắc

chính: Tím, tím hồng và trắng Tuy nhiên có khá nhiều biến dạng từ màu trắng đến tímđậm hay hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím tuỳ theo sự phân bố (miềnNam hay Bắc Việt Nam)… Lưỡi hoa mở hình tim, phủ lông mịn như nhung, có ánhkim, hoa có kích thước lớn 5-8 cm [3]

Hoa D anosmum hầu hết đều lâu tàn trong 3-4 tuần lễ và rất thơm Một cây nếu

mạnh khỏe có thể ra tới 50-70 hoa

Hình 1.1 Lan Phi điệp tím

Lan Phi điệp tím cần nhiều ánh sáng khoảng từ 4000-4500 ánh nến, nghĩa là trồng ởngoài nắng với lưới che Nhiệt độ từ 60°F (15.6°C) vào ban đêm và 95°F (35°C) vào banngày Khi cây non mọc mạnh tưới thật nhiều nước và bón phân Ẩm độ lý tưởng là 60-

5

70% Vào mùa thu, khi cây ngừng tăng trưởng, ban đêm cần lạnh xuống dưới 60°F(15°C) thời gian này rất cần trong vòng 4-5 tuần lễ để cây ra nụ, cây bắt đầu rụng lá.

1.2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô - tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng đểphát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn

bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điềukiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Đặc điểmnày chính là tính toàn năng của tế bào [9] Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lýluận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quanchức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng

cụ thể khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh

“Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của môchuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể”[9] Tuy nhiên, khi tế bào

đã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia củamình Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tếbào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là sự phản phân hoá tế bào,ngược lại với sự phân hoá tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật thực chất là kếtquả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào xétcho đến cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôicấy tách rời trong điều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách định hướng dựa và sự phânhóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật

Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sungvào trong môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật đó là auxin

và cytokinin Tỷ lệ hai nhóm chất này trong môi trường sẽ kéo theo sự phát sinh hìnhthái khác nhau của thực vật [9]

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào

Tùy thuộc vào đối tượng khác nhau, quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể

có các giai đoạn khác nhau Tuy nhiên, nhìn chung quá trình này gồm các giai đoạnvào mẫu, nhân nhanh (ở một số loài hay với một số mẫu có thể có giai đoạn tạo chồi

và nhân nhanh chồi) [9]

2.2.2.1 Giai đoạn vào mẫu (giai đoạn nuôi cấy khởi động)

Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Khi đã có nguồn nguyên

liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng Khi lấymẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp: đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển: người ta

thường lấy chồi đỉnh, chồi nách, phôi non để nuôi cấy in vitro Ngoài ra cũng có thể sử

dụng đoạn thân, mảnh lá, để tiến hành nuôi cấy Người ta thường sử dụng một số loạihoá chất như: HgCl2 0,1 %, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2 để khử trùng mẫu cấy Mẫu saukhi được khử trùng được cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động [9]

2.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so với các

phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Vì vậy giai đoạn nhânnhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Giai đoạn này

sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua cáccon đường: Hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính [9]

2.2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển từ môi trường

ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạnnày môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát triển Các chấtNAA, IBA, IAA thường được sử dụng ở nồng độ 1 - 5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loàicây trồng Từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh [9]

2.2.2.5 Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm

Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời đểtạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần với môi trường tự nhiên

1.2.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro

1.2.3.1 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện tiên quyết đối với thành công của quá trình nuôi cấy mô - tế bào.Nếu không mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn sẽ thối và chết Do đó, các dụng cụ nuôi cấy,môi trường và mẫu cấy phải được vô trùng Thao tác cấy đều phải được thực hiệntrong buồng cấy (box) vô trùng [9]

1.2.3.2 Ánh sáng và nhiệt độ

Các mẫu nuôi cấy thường được đặt trong những phòng nuôi ổn định về ánh sáng

và nhiệt độ Tất cả các trường hợp nuôi cấy đều cần có ánh sáng trừ một số trường hợpnuôi cấy tạo mô sẹo, nhưng quá trình nhân giống của chúng cũng cần có ánh sáng.Nhiệt độ của các phòng nuôi cây thường được duy trì từ 25-280C nhờ các máy điềuhoà nhiệt độ [9]

1.2.4 Môi trường nuôi cấy in vitro

1.2.4.1 Thành phần hóa học của môi trường

7

Thành phần môi trường nuôi cấy mô- tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại

tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đíchnuôi cấy khác nhau thì môi trường nuôi cấy khác nhau cũng khá cơ bản Môi trườngnuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy [9]

Mặc dù có sự đa dạng về thành phần các chất nhưng môi trường nuôi cấy đềugồm các thành phần sau:

- Thành phần vô cơ: Bao gồm các muối khoáng (đa lượng và vi lượng) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

+ Muối khoáng đa lượng các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, photpho, kali + Muối khoáng vi lượng được sử dụng ở nồng độ < 30 ppm Các nguyên tố vilượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot đóng vai trò quan trọng

- Thành phần hữu cơ:

+ Vitamin, aminoaxit, amit, myo-inositol: Các vitamin hay được sử dụng là cácvitamin nhóm B (B1, B3, B6), ngoài ra môi trường nuôi cấy còn sử dụng một sốvitamin khác như vitamin H, vitamin M, vitamin B2, vitamin C, vitamin E với cácnồng độ khác nhau (Vitamin B1: 0,1- 5,0 mg/l; Vitamin B6: 0,1- 1,0 mg/l ; Vitamin H:0,01- 1,0 mg/l ) Myo-inositol có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng và phát triển giốngnhư các vitamin và trong nhiều trường hợp có vai trò như nguồn cacbon của môitrường nuôi cấy Hàm lượng sử dụng là 100 mg/l môi trường

+ Thành phần hữu cơ phức hợp: được dùng trong môi trường nuôi cấy để cungcấp thêm nitơ hữu cơ, aminoaxit, vitamin và các khoáng chất Chúng được sử dụngkhi môi trường khoáng xác định không đạt kết quả mong muốn về sinh trưởng và pháttriển của mẫu nghiên cứu

- Các chất điều hoà sinh trưởng:

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu được trong môi

trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái thực vật in vitro Hiệu

quả tác động của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại và nồng độ chất điềuhoà sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy

+ Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinhtrưởng và giãn nở tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kíchthích sự hình thành rễ và tham gia cảm ứng phát sinh phôi vô tính Các loại auxinthường sử dụng cho nuôi cấy: IAA (Indole acetic acid), IBA (Indole butyric acid),NAA (Naphthaleneacetic acid), 2.4 D (2.4 diclorophenolxy acetic acid)

+ Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của

chồi in vitro Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nhưng

có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Các loạicytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô là: Zeatin (6-[4-hydroxy-3-metyl-but-

2-enylamino] purine), Kinetin (6-furfurylamino purine), BAP (Bezylamino purine), TDZ (Thidiazuzon).

- Nguồn cacbon:

Các mẫu nuôi cấy thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợpnhưng ở cường độ rất thấp Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcacbon vàothành phần môi trường nuôi cấy Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đườngsucrose với hàm lượng từ 2 - 6% Những loại đường khác như fructose, glucose,maltose, sorbitol, rất ít dùng

1.2.4.2 pH của môi trường

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0 pHdưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng

1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

1.3.1 Trên thế giới

Năm 1931, White và Gautheret đã tìm ra môi trường nuôi cấy Phong lan Trênmôi trường của White và Gautheret hạt lan có thể nảy mầm không cần sự có mặt của

nấm Rhiroctonia Từ đó, khá nhiều công trình nhân giống phong lan bằng công nghệ

nuôi cấy mô tế bào đã được thực hiện, trong đó có các loài phong lan thuộc chi Hoàngthảo (Dendrobium)

Năm 1997, Nayka và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng trong nhân nhanh chồi khi

kết hợp cytokinin và auxin trên hai đối tượng Dendrobium aphyllum và Dendrobium

moschatum, đã cho kết quả tần số tái sinh chồi đạt tối ưu ở nồng độ 44µM BA (9,91

mg/l BA) [11] Năm 2011, Kaewduangta và Reamkatog đã báo cáo trong công trình

nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium parishii khi đánh giá ảnh hưởng của

môi trường cải biến lên sự sinh trưởng và phát triển loài lan này Kết quả chỉ ra môi

trường nhân chồi phù hợp nhất đối với loài lan Dendrobium parishii là: VW + than

hoạt tính( 2g/l) + nước dừa( 150ml/l) + chuối nghiền( 50g/l) + bột nhộng (5g/l) + gạonâu( 5g/l) cho kết quả sau 6 tuần nuôi cấy chồi có chiều cao là 0,98cm/chồi và có 7,83lá/chồi [10] Tuhuteru và cộng sự (2012) đã tiến hành đánh giá về sự sinh trưởng và

9

phát triển của loài lan Dendrobium anosmum trong nuôi cấy in vitro với môi trường có

bổ sung thêm nước dừa đã cho kết quả số lượng chồi và chiều cao chồi đạt hiệu quảcao nhất trong môi trường có bổ sung 100 ml/l nước dừa [12]

1.3.2 Trong nước

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô hoa lan cũng đã được phát triển từ khá lâu và đến nay

đã thu được một số kết quả Nguyễn Quang Thạch và cs (2005) đã tiến hành nghiên

cứu xây dựng quy trình kỹ thuật sau in vitro cho cây Địa Lan (Cymbidium) [7] Trần Quang Hoàng (2005) đã tiến hành nghiên nuôi cấy in vitro của hai giống lan

endrobium và Cymbidium”[2] Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009) đã tiến hành triển khai

đề tài nhân giống lan Dendrobium mini bằng phương pháp nhân giống in vitro trên môi

trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA hoặc MS có bổ sung 1mg/l BA và 0,2 mg/l NAAcho tỉ lệ nảy chồi từ hạt đạt được là ≥ 85% [1] Vũ Thanh Sắc và cs (2012) đã nghiên

cứu nhân giống in vitro Dendrobium anosmum đã tìm ra môi trường nhân nhanh chồi

thích hợp nhất là: 1/2MS + đường sucrose (20g/l) + agar (10g/l) + chuối xanh nghiền(120g/l) + nước dừa (10%) + kinetin (1,5mg/l) + than hoạt tính (1g/l) trong môi trường

có pH=5,8 [6] Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh (2013) đã

nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl [4].

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu khử trùng mẫu

- Nghiên cứu môi trường tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro

- Nghiên cứu môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi

- Nghiên cứu môi trường thích hợp cho ra rễ

- Nghiên cứu phương pháp huấn luyện cây phù hợp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Các nhân tố chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức khác nhau

- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: Phải bảo đảm tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm

- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)

- Phải tuân thủ nguyên tắc lặp lại (số lần lặp lại ≥ 3)

2.2.2 Nghiên cứu tạo mẫu sạch

- Vật liệu vào mẫu: Đối tượng Lan Phi điệp tím: quả chín sinh lí (Quả lan bắt đầuchuyển từ màu xanh sang xanh hơi vàng, bóp quả thấy cứng)

Mẫu trước tiên được rửa qua vòi nước chảy, sau đó được khử trùng thô (ở ngoàibox) bằng dung dịch xà phòng loãng Rửa sạch lại bằng nước và cuối cùng mẫu đượctráng lại bằng nước cất 3 - 4 lần Tiếp đó, mẫu được đưa vào trong box cấy và khửtrùng theo các công thức nghiên cứu sau:

Công thức Hóa chất, nồng độ Thời gian xử lý

Σ Số mẫu sạch tái sinh

Σ số mẫu ban đầu

2.2.3 Nghiên cứu môi trường tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro

Vật liệu được tạo ra ở thí nghiệm trên được sử dụng để nghiên cứu khả năng phátsinh thể chồi và chồi theo các công thức thí nghiệm sau:

Thí nghiệm tạo protocorm và phát sinh chồi in vitro được bố trí trên các môi

trường cơ bản: Knudson cải tiến (K*) có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo cáccông thức sau:

TC1 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,1 mg/l BAPTC2 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAPTC3 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAPTC4 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,1 mg/l KiTC5 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,3 mg/l KiTC6 K* + 0,1 mg/l NAA + 0,5 mg/l KiCác công thức môi trường đều được bổ sung thêm 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar

- Chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ tạo protocorm, đặc điểm protocorm, tỷ lệ tái sinh chồi, đặc điểm chồi tái sinh

Số mẫu tạo protocorm

Tổng số mẫu ban đầu

Số mẫu tái sinh chồi

Tổng số mẫu ban đầu

2.2.4 Nghiên cứu môi trường để nhân nhanh chồi

- Vật liệu sử dụng: chồi in vitro

- Công thức thí nghiệm: Chồi được tạo ra ở thí nghiệm trên được cấy sang môitrường mới nhằm nhân tạo số lượng lớn chồi để cung cấp cho giai đoạn ra rễ tạo câyhoàn chỉnh Thí nghiệm được bố trí trên môi trường cơ bản: K* có bổ sung chất điềuhòa sinh trưởng theo các công thức sau:

NN1 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l BAPNN2 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l BAPNN3 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAPNN4 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,1 mg/l KiNN5 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,3 mg/l KiNN6 K* + 0,2 mg/l NAA + 0,5 mg/l Ki

12

Các công thức môi trường đều được bổ sung thêm 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar.

- Chỉ tiêu đánh giá: hệ số nhân nhanh chồi, đặc điểm của chồi

Tổng số chồi

Số chồi cấy ban đầu

2.2.5 Nghiên cứu môi trường thích hợp cho ra rễ

- Vật liệu nghiên cứu: chồi in vitro cao 2 - 3 cm, có từ 2 - 3 lá được tạo thành từ

giai đoạn trên

- Công thức thí nghiệm: Thí nghiệm Nghiên cứu môi trường thích hợp cho ra rễ được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo các công thức thí nghiệm sau:

R1 K* + 0,1 mg/l NAAR2 K* + 0,2 mg/l NAAR3 K* + 0,3 mg/l NAAR4 K* + 0,1 mg/l IAAR5 K* + 0,2 mg/l IAAR6 K* + 0,3 mg/l IAACác công thức môi trường đều được bổ sung thêm 100ml/l ND + 100g/l KT + 30g/l sucrose + 7g/l agar

- Chỉ tiêu đánh giá: tỷ lệ mẫu ra rễ, số rễ/cây

Tỷ lệ mẫu ra rễ (%) Số mẫu ra rễ x 100

= Tổng số mẫu ban đầu

2.2.6 Nghiên cứu huấn luyện cây con giai đoạn ra ngôi:

* Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây trong ống nghiệm

- Vật liệu nghiên cứu: bình cây đã hoàn thành giai đoạn ra rễ

- Công thức thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí trên các công thức:

H1: bình cây để nguyên không mở nắp đặt ở nhà lưới 2 tuần

H2: bình cây để nguyên không mở nắp đặt nhà lưới 1 tuần, tuần 2 mở nắp bìnhH3: bình cây mở nắp đặt ở trong nhà lưới 1 tuần,

H4: chuyển cây ra nhà lưới, phun ẩm 5 lần/ngày trong nhà lưới 7 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ cây sống (%)

* Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến tỷ lệ sống của cây lan con

Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng cây (dớn, xơ dừa, than củi) đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của lan Phi điệp tím con mô sau khi trồng ngoài nhà lưới

Hệ số nhân nhanh chồi (lần) =