Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây củ mài (dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH - KTNN ---*****--- PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI Dioscorea persimilis BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -***** -

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI

( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

HÀ NỘI, 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -***** -

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI

( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa SinhKTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôitrong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, BanChủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện

để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tìnhcủa cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ,đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửilời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh

lí học thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị,phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong quatrình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

PHẠM THỊ QUY

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

PHẠM THỊ QUY

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm và phân loại cây Củ mài 3

1.1.1 Phân loại thực vật cây Củ mài 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài 4

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến 5

1.1.4 Đặc điểm của dược liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến 5

1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.1.6 Công dụng 6

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 7

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 7

1.2.1.3 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào 9

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và cấy khởi động 9

1.2.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 9

1.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 9

1.2.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh 10

1.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất 10

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.2.3.1 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng 11

1.2.3.2 Nguồn cacbon 12

1.2.3.3 Các vitamin và acid amin 12

1.2.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 13

1.2.3.5 Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường 14

1.2.3.6 pH môi trường 15

1.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

1.2.4.1 Điều kiện vô trùng 15

1.2.4.2.Môi trường vật lý 15

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mài ở Việt Nam và thế giới .16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt Nam 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 18

2.3.1 Thiết bị 18

2.3.2 Dụng cụ 18

2.4 Môi trường nuôi cấy 18

2.5 Điều kiện nuôi cấy 18

2.6 Phương pháp nghiên cứu 19

2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.6.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19

2.6.2.2 Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài 20

2.6.2.3 Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh 21

2.6.2.4 Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 22

2.7 Phương pháp thống kê 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 24

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài 25

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi 27

3.2.2 Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi 28 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in

vitro 29

3.4 Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài 28 Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài

in tro 29 Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng nhân chồi Củ mài in tro 29 Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in vitro 30 Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ mài 30 Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây Củ mài 33 Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy 36

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi

của

Củ mài nuôi cấy 38 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6 tuần nuôi cấy 39 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Củ mài in vitro 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Củ mài 11

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 27

Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu 34

Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro 35

Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro 39

Hình 3.4: Rèn luyện cây con ngoài tự nhiên 41

1 Lý do chọn đề tài

MỞ ĐẦU

số vùng miền núi như Chùa Hương, Đền Hùng.

Cây củ mài ngoài vai trò chính là nguồn cung cấp lương thực, trong dângian còn được con người nghiên cứu và biết đến với vai trò là một vị thuốcnằm trong danh mục Dược điển Việt Nam [1]

Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài thuộc chi Dioscorea đã được

các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lênkhá nhanh Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượngnghiên cứu của họ Kohmura và cs (1995) sử dụng là non làm mẫu nuôi cấy ở

loài Dioscorea oppositaThumb [29] Alizadeh và cs (1998) nghiên cứu về

Dioscorea composite Hemsl [22] Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu

cấy là rễ ở loài Dioscorea alata [35] Tor và cs (1998) dùng tế bào và protoplast trên loài Dioscorea Yams [34] Nhiều tác giả như Matell và Hugo

(1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đãthực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [25],[26], [27], [30]

Trong tự nhiên, Củ mài tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ.Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm

truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [34].Hơn nữa, nhân giống theophương pháp truyền thống không đảm bảo được cây sạch bệnh Phương phápnuôi cấy mô giúp sản xuất cây Củ mài với số lượng lớn có chất lượng cao(sạch bệnh) Điều quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra cây giống ở quy

mô công nghiệp trong thời gian ngắn, cây sạch bệnh và trồng được quanh

năm Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên

cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài(Dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”.

2 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài bằng kĩ thuậtnuôi cấy mô tế bào thực vật

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

-Ý nghĩa khoa học:

+ Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây củ mài

bằng kỹ thuật in vitro.

+ Góp phần bảo tồn nguồn gen loại cây dược liệu, cây lương thực này

-Ý nghĩa thực tiễn : Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây củ mài

bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với

số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống chosản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm

và dược liệu

4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro.

- Tái sinh và nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chấtđiều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Củ mài

- Ra rễ, tạo cây in vitrohoàn chỉnh.

- Huấn luyện cây Củ mài cấy mô thích nghi với điều kiện tự nhiên

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm và phân loại cây Củ mài

1.1.1 Phân loại thực vật cây Củ mài

Theo hệ thống thực vật [19] cây Củ mài được phân loại như sau:

Giới (regum) : Thực vật (Plantae)

Bộ (Ordo) : Củ nâu (Dioscoreales)

Họ (family) : Củ nâu (Dioscoreaceae)

Chi (genus) : Củ nâu (Dioscorea L.)

Loài (species) : Dioscorea persimilis

Chi Dioscorea được đặt theo tên bác sĩ

Hình 1.1: Cây Củ mài

Hy Lạp cổ đại và nhà thực vật học Dioscorides Theo Ayensu ES và cs(1972) chi này bao gồm hơn 600 loài, thuộc nhóm cây một lá mầm chủ yếuđược trồng ở Nam Mỹ, Châu Á và Tây Phi [23] Theo Jean M và cs (1992)

bộ Dioscoreales được xác định có niên đại khoảng 124 triệu năm trước [28] Hầu hết các loài thuộc chi Dioscorea đều có nguồn gốc ở Châu Á, Châu Phi,

Châu Mỹ và Châu Đai Dương, xuất hiện cách ngày nay khoảng 10.000 năm(Khoai mỡ) và du nhập sang các vùng khác nhau trên thế giới, nhất là cácquốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [36]

Ở nước ta hiện nay có 4 loài phổ biến thuộc chi Dioscorea phân bố tập

trung nhiều ở các vùng trung du, bán sơn địa và các vùng mới khai hoang: củ

nâu(Dioscorea cirrhosa), khoai mỡ(Dioscorea alata), củ mài(hay hoài sơn: Dioscorea persimilis) và củ từ(Dioscorea esculenta).

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài

Cây Củ mài thuộc loài cây thân thảo, leo quấn trên các giá thể khác nhautrong tự nhiên, cây sống nhiều năm, dài 5-10 m, cây có củ mọc sâu trong lòngđất từ 1,5 – 2 m Cây thường mọc rải rác ven rừng, rừng tre nứa, khe núi đá,trên đất đồi, những địa điểm ẩm quanh năm, đất xốp và giàu chất dinh dưỡng

Cây củ mài (Dioscorea persimilis) thường có một củ chính to được hình

thành từ rễ chính, củ dài hình chiếc dùi cui, mọc sâu vào trong đất độ sâu cóthể từ 1-2 m Trên rễ củ có rất nhiều rễ dinh dưỡng mọc dài có tác dụng hấpthụ nước và ion khoáng trong đất Cây trồng một năm đã cho củ với năng suấttrung bình đạt từ 1-1,2 kg/gốc [17]

Cây củ mài dạng thân leo (thân tự leo) dài trên 10 m, đường kính thântrung bình từ 0,2-0,5 cm thân quấn vào các giá thể khác theo chiều từ trái quaphải Thân cây nhẵn, không có lông, màu nâu đỏ và có góc cạnh, trên thânkhông có tua Chồi bên hình thành từ các nách lá hình thành lên các cành cấp

1 nhưng số lượng cành ít tập trung chủ yếu ở giữa thân Thân cây chia đốtmỗi đốt thân dài khoảng 15-20 cm toàn thân cây có từ 50-100 đốt tùy mức độsinh trưởng và phát triển của cây Trên mỗi đốt thân có 4 lá Do đặc điểm cấutạo thân cây nhỏ, mềm dẻo nên cây Củ mài không tự đứng trong không gian

mà phải leo lên các giá thể khác để lấy ánh sáng mặt khác khi leo lên cá giáthể khác sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát tán của hạt trong không gian[17]

Lá cây Củ mài là lá đơn, lá có dạng bản nhỏ, mọc so le hay mọc đối,hình tim đôi khi hình mũi tên, trên lá không lông, số lượng gân lá nhiều,gân lá có hình chân vit, dài khoảng 10-12 cm, rộng 6-8 cm, nhẵn, chóp lánhọn [17]

Hoa nhỏ, đều, mọc thành bông, trục bông khúc khuỷu, hoa đơn tính Hoađực và hoa cái khác gốc, thích nghi với lối thụ phấn nhờ gió Hoa đực có 6nhị Hoa cái mọc thành cụm dạng bông cong dài tới 20 cm Cây ra hoa vàokhoảng tháng 10 đến tháng 11 dương lịch hàng năm trước khi bước vào thời

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Cây mọc hoang khắp nơi tại các vùng rừng núi nước ta, nhiều nhất ở cáctỉnh Hà Bắc, Hoàng Liên Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình,đặc biệt là các vùng dọc dãy Trường Sơn và vùng núi đá vôi của tỉnh QuảngBình, hiện nay đã được trồng phổ biến để chế biến thuốc

Mùa thu hoạch tốt nhất vào thu đông cho đến đầu xuân (từ tháng 10 đếntháng 4 năm sau)

Chế biến: củ mài đào về cần chế biến ngay

1.1.4 Đặc điểm của dược liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế

biến

Hạt tinh bột Củ mài có hình trứng hay hình chuông, dài 10-60 m, rộngkhoảng 15-50 m, có vân đồng tâm, rốn lệch tâm, hình chấm hay hình vạch.Tinh thể calci oxalat hình kim dài 35-50 m Mảnh mô mềm gồm các tế bàomàng mỏng, chứa tinh bột, mảnh mạch mạng

đã có một số nghiên cứu tác dụng dược lý của củ mài trên cơ thể sống

(chuột) thông qua các chỉ tiêu như tăng thân trọng, tăng sự đồng hóa và tácdụng nội tiết hướng sinh dục… Theo danh y Đỗ Tất Lợi (2004) [4] chấtmucin trong củ mài hòa tan trong nước ở điều kiện axit và nhiệt độ thích hợp

sẽ phân giải thành chất protid và hydrat carbon Ở nhiệt độ 45 – 55 độ C, khảnăng thủy phân chất đường của men trong củ mài rất cao, trong axit loãngtrong 3 giờ có thể tiêu hóa 5 lần lượng đường có vai trò rất quan trọng trongviệc chữa bệnh tiểu đường ở con người

1.1.6 Công dụng

Ngoài việc dùng để ăn chống đói, củ mài (hoài sơn) còn là vị thuốc Củmài với công năng kiện tỳ, chỉ tả, bổ phế khí, ích thận, cố tinh, giải độc, đượcdùng trong các trường hợp tỳ vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, tiêu chảy hoặctrẻ em bị vàng da, bụng ỏng, mắt mũi nhoèn gỉ mà y học cổ truyền gọi là bệnhcam, có thể phối hợp với các vị thuốc kiện tỳ: bạch truật, hoàng kỳ, bạch biểnđậu… hoặc trong trường hợp khí phế hư nhược, đoản hơi, mệt mỏi, ho khan,phối hợp với đảng sâm, cát cánh, bách bộ Còn dùng khi thận hư, mộng tinh,

di tinh, tiểu tiện không cầm, phụ nữ bạch đới, phối hợp với ba kích, kim anh,khiếm thực…, đái tháo đường, phối hợp với mạch môn, thiên hoa phấn, sinhđịa… Dùng ngoài, trị viêm tuyến vú gây đau đớn: củ mài tươi, rửa sạch, giãnát, đắp vào chỗ sưng đau, cách dùng vị hoài sơn là rất phong phú và đa dạng

Đề tài : Chế biến tinh bột củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường týp2[38] do Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế cùng cộng sự đượcthực hiện từ tháng 3- 2011 đến tháng 9- 2012 nhằm nghiên cứu về các đặctính lý hóa, cấu trúc và thành phần của tinh bột củ mài Theo Trần Hữu Dũngthông qua nghiên cứu lâm sàng trên 60 người tình nguyện bị đái tháo đườngtype 2 (được cho ăn các khẩu phần bánh chế biến từ nguyên liệu tinh bột củmài theo một cách xác định), bước đầu đã chứng minh được rằng, khẩu phầnbánh tạo ra có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường một cáchhiệu quả

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên họcthuyết về tính toàn năng của tế bào

Cuối thế 19 đầu thế kỉ 20 nhà sinh vật học ngưới Đức Haberlandt (1902)

đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơthể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thểhoàn chỉnh [3]

Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thựcvật đều mang toàn bộ lượng thông tin ditruyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó Do đó, khigặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một

cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [20]

Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua

sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chứcnăng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiêntất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôisinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Từ các tế bào phôi sinhnày chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,

cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể

Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năngchuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trongtrường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tếbào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái

sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngượclại với sự phân hóa tế bào.

Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăngkích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung Sau haigiai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóathành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khácnhau trong cùng một cơ thể sống [6]

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực

vật

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạthóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cáthể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tínhtrạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ratheo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN củamỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luônđược hài hòa Mặt khác, khi tế bàonằm trong một khối mô của cơ thể thường

bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảmkích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào[11]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thựcchất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

1.2.1.3 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào

Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóađều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó.Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thểhoàn chỉnh Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinhmột cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6]

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và cấy khởi động

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống

invitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng

để đưa vào nuôi cấy

Mẫu sau khi được vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp,

tỷ lệsống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thờigian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnhsinh trưởng, chồi nách, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ [7] Chọn đúng phươngpháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc

độ nhân nhanh cao [7]

1.2.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mônuôi cấy Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng(auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấmmen .vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợpnhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú

ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô

đã chuyển hóa [7]

1.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi làthen chốt của quá trình Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi

trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như:nước dừa, dịch chiết nấm men, kết hợp với yếu tố nhiệt độ và ánh sáng [7].Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cáchkích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự pháttriển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính.

1.2.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môitrường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thànhcây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung các vào môi trường nuôicấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thựcvật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này cácchất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thường sử dụng để tạo rễ cho chồi

1.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình

nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Trong giai đoạn này cây con

được chuyển từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, do đó cần đảmbảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt

tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho

sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sựthành công của nuôi cấy mô thế bào thực vật Thành phần của môi trườngnuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quanđược nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấykhông giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản.Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển củamẫu nuôi cấy [21]

1.2.3.1 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng)được đưa vào nuôi cấy Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vậttách rời là không khác nhiều so với nhu cầu của cây trong điều kiện tựnhiên Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cungcấp là nitơ, phospho, kali và sắt [21]

Nitơ vô cơ được đưa vào môi trường ở hai dạng: Nitrat (NO3) và amon(NH4) Đa số các môi trường có chứa dạng nitrat nhiều hơn dạng amon Hàmlượng nitrat trong môi trường khoảng 25 mM, còn của amon khoảng từ 2-20

môi trường B5 của Gamborg có amon dạng muối (NH4)2SO4 Các gốc nitratđược đưa vào môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali, nitrat natrihoặc nitrat amon Trong số các nguyên tố của môi trường, nitơ có hàm lượnglớn nhất [21]

Hai dạng phospho thường được dùng là: NaHPO4.7H2O và KH2PO4 [21].Kali được cung cấp cho môi trường dưới dạng kali nitrat (KNO3); KaliClorua (KCl); Kali phosphate (KH2PO4) Nồng độ kali trong môi trường nuôicấy thay đổi từ 2-25 mM [19]

Nguồn Canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối canxi nitratCa(NO3)2.4H2O; canxi clorua CaCl2.6H2O Nồng độ Ca2+ trong môi trườngnuôi cấy thay đổi từ 1-3,5 ụM [21]

7H2O Với nồng độ trong môi trường từ 0,5-3 ụM [21] Nguồn Mg và S đượccung cấp dưới dạng MgSO4.H2O hoặc (NH4)2SO4 [22]

Sắt: thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu sắt làm giảm hàmlượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng tổng hợp ADN và axit

tự do dẫn đến giảm phân bào Các môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạngclorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, sunfat sắt FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3[21]

Các ion Na+và Cl- cần ở hàm lượng thấp được đưa vào môi trường cùngvới các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường.

Các loại muối khoáng vi lượng: là những nguyên tố thường được sửdụng với hàm lượng thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vilượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe,

Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng tronghoạt động của các enzyme [3]

1.2.3.2 Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro,các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinhdưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đườngsaccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế chosaccharose nhưng chúng thường nghèo cacbon hydrate so với nhu cầu củathực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thờigian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyểnsang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [3]

1.2.3.3 Các vitamin và acid amin

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầuhết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó để mô có thể sinh trưởng,tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin vàamino acid, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6, Cácvitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol đóng vai trò sinh tổng hợpthành tế bào và được sử dụng với lượng lớn từ 50-100 mg/l [3]

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm,khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trongđiều kiện lạnh dưới 0oC hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng [3]

1.2.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến 3nhóm chất sinh trưởng sau: auxin, cytokinin và gibberelin Các chất sinhtrưởng tương tác với nhau và tương tác với các chất ức chế sinh trưởng (axitabscisis, ethylen) quyết định sự hình thành, phát triển, phát sinh hình thái củathực vật nuôi cấy [16]

*Auxin: Auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

và thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ đầu Auxin cùng vớicytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phát sinh và phát triển chồi, huyền phù tếbào và cơ quan Đồng thời điều hòa quá trình phát sinh hình thái Ở mức độ tếbào, auxin điều khiển các quá trình cơ bản của tế bào như phân chia và kéodài tế bào [3]

Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid(IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sựhình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid(NAA) và 2,4- dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) Các chất này cũng đóngvai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ[3]

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang pháttriển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống cácphần phía dưới của cây [7]

*Cytokinin: Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kíchthích sử dụng protein, điều khiển chu trình tế bào và tăng sự phân chia tế bào.Các cytokinin thường được sử dụng rộng rãi là kinetine, benzyadenin(BA), 6- benzyl aminopurin (BAP) và thidiazuzon (TDZ) Đây là cáccytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều các cytokinin

tự nhiên như zeatin hay iP Các cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tếbào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự giàhóa của tế bào [3]

*Gibberellin: Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứungười nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm GibberellaFujikuroi gây ra Năm 1939, ông đã tách chiết được gibberellin từ nấm G.Fujikuroi và được gọi là gibberellin A Vào thời điểm năm 2003, đã có 126chất được biết đến thuộc nhóm Gibberellic acid, thông dụng nhất trong nuôicấy mô là GA3 Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiềudọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũngnhư tạo chồi phụ Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thựcvật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây Tuy nhiên GA3 rất mẫn cảmvới nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng Vì vậy

sử dụng GA3 thường phải đem lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vàomôi trường nuôi cấy [3]

1.2.3.5 Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường

*Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ,chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [14] Nước dừa đã được sử dụng

để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thườngđược lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Nước dừa thường sửdụng với hàm lượng 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhânnhanh chồi [21]

*Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và pháttriển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trongnuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với hàm lượng thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%)hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (xanh) nhằm tăngcường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy [21]

*Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar đểlàm rắn hoá môi trường Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6-1% đây làloại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môitrường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh [14]

1.2.4.1 Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm

bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ

bị nhiễm Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến cả quy trình nuôi cấy

mô in vitro [2]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng cácchất hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn Đây là một thaotác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa tiên quyết Song nếu tìm được nồng

độ và thời gian xử lí thích hợp sẽ cho mẫu tỉ lệ sống cao và tỉ lệ nhiễmthấp Các hóa chất thường dùng để khử trùng như: HgCl2 0,1%, nướcClolox, cồn 700, Ca(ClO)2

1.2.4.2.Môi trường vật lý

*Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào

và các quá trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thườnggiữ ổn định ở 25-270C; nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của auxin [21].Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loàicây là

25±20C [3]

*Ánh sáng: Các nghiên cứu cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phátsinh hình thái mẫu nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởngcủa mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Và cácloại mẫu cấy khác nhau có nhu cầu về thời gian chiếu sáng, cường độánh sáng khác nhau Thời gian chiếu sáng với đa số các loài cây thích hợp là12-

18h/ngày Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-10000lux[21].

*Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn luôn là100%

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mài ở Việt Nam và thế