Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân giống cây củ mài (dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ---*****--- PHẠM THỊ QUY NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI Dioscorea persimilis BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -***** -

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI

( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

HÀ NỘI, 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -***** -

PHẠM THỊ QUY

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CÂY CỦ MÀI

( Dioscorea persimilis) BẰNG PHƯƠNG

PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Sinh lí học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

TS LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện

để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh

lí học thực vật trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

PHẠM THỊ QUY

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội, 18 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

PHẠM THỊ QUY

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm và phân loại cây Củ mài 3

1.1.1 Phân loại thực vật cây Củ mài 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài 4

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến 5

1.1.4 Đặc điểm của dược liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến 5

1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.1.6 Công dụng 6

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 7

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 7

1.2.1.3 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào 9

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và cấy khởi động 9

1.2.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 9

1.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 9

1.2.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh 10

1.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất 10

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.2.3.1 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng 11

1.2.3.2 Nguồn cacbon 12

1.2.3.3 Các vitamin và acid amin 12

1.2.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 13

1.2.3.5 Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường 14

1.2.3.6 pH môi trường 15

1.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

1.2.4.1 Điều kiện vô trùng 15

1.2.4.2.Môi trường vật lý 15

1.3 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mài ở Việt Nam và thế giới 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây Củ mái ở Việt Nam 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 18

2.3.1 Thiết bị 18

2.3.2 Dụng cụ 18

2.4 Môi trường nuôi cấy 18

2.5 Điều kiện nuôi cấy 18

2.6 Phương pháp nghiên cứu 19

2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19

2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.6.2.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19

2.6.2.2 Tái sinh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh của chồi cây Củ mài 20

2.6.2.3 Ra rễ tạo cây Củ mài in vitro hoàn chỉnh 21

2.6.2.4 Huấn luyện cây Củ màiin vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 22

2.7 Phương pháp thống kê 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 24

3.2 Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro cây củ mài 25

3.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi 27

3.2.2 Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi 28 3.3 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành rễ của chồi Củ mài in vitro 29 3.4 Huấn luyện cây Củ mài in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Củ mài 28

Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của BAP đến nhân nhanh chồi Củ mài

in tro 29 Bảng 2.3: Công thức ảnh hưởng của BAP kết hượp NAA đến khả năng nhân chồi Củ mài in tro 29 Bảng 2.4: Công thức ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ Củ mài in vitro 30 Bảng 2.5: Công thức ảnh hưởng của giá thể tới sự thích nghi của cây Củ mài 30 Bảng 3.1: Kết quả tạo vật liệu khởi đầu đốt thân cây Củ mài 33 Bảng3.2: Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi của Củ mài sau 6 tuần nuôi cấy 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP kết hợp NAA lên khả năng nhân chồi của

Củ mài nuôi cấy 38

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của NAA lên khả năng nhân chồi của củ mài sau 6 tuần nuôi cấy 39 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của giá thể đến sự thuần hoá cây Củ mài in vitro 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cây Củ mài 11

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 27

Hình 3.1: Vật liệu khởi đầu 34

Hình 3.2: Tái sinh và nhân nhanh chồi Củ mài in vitro 35

Hình 3.3: Rễ cây Củ mài in vitro 39

Hình 3.4: Rèn luyện cây con ngoài tự nhiên 41

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA: α- Napthlacetic acid

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây củ mài (Dioscorea persimilis Prain et Burkill), thuộc họ Củ nâu (Dioscoreaceae) là một trong những loài thực vật thân leo nằm trong danh

biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: hoài sơn, sơn dược, khoai mài, mằn chèn, mán dịn, co mằn kép (tiếng dân tộc Thái), mằn ôn (tiếng dân tộc Nùng), hìa dòi (tiếng dân tộc Dao), gờ lờn (tiếng dân tộc K'dong) Cây Củ mài là loài cây có rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ngoài ra các lá non và thân non cây củ mài cũng được sử dụng như một loại rau rừng [18] Do có vị ngọt và tính mát, mùi vị đặc trưng nên từ nhiều năm nay củ mài được chế biến thành những mặt hàng thực phẩm đặc sản (bánh củ mài, chè củ mài, ) tại một

số vùng miền núi như Chùa Hương, Đền Hùng

Cây củ mài ngoài vai trò chính là nguồn cung cấp lương thực, trong dân gian còn được con người nghiên cứu và biết đến với vai trò là một vị thuốc

Trong thực tế, nhân giống in vitro các loài thuộc chi Dioscorea đã được

các tác giả tiến hành nghiên cứu cách đây khoảng 30 năm và sau đó tăng lên khá nhanh Các tác giả sử dụng các bộ phận nuôi cấy khác nhau cho đối tượng nghiên cứu của họ Kohmura và cs (1995) sử dụng là non làm mẫu nuôi cấy ở

loài Dioscorea oppositaThumb [29] Alizadeh và cs (1998) nghiên cứu về

Dioscorea composite Hemsl [22] Twyford và Mantell, (1996) sử dụng mẫu

cấy là rễ ở loài Dioscorea alata [35] Tor và cs (1998) dùng tế bào và protoplast trên loài Dioscorea Yams [34] Nhiều tác giả như Matell và Hugo

(1989), Jasik và Mantell (2000), Fotso và cs (2013), Borges và cs (2004) đã thực hiện nghiên cứu trên đối tượng cây Khoai Mỡ với mẫu là củ bi [25], [26], [27], [30]

Trong tự nhiên, Củ mài tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm

truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ [34].Hơn nữa, nhân giống theo phương pháp truyền thống không đảm bảo được cây sạch bệnh Phương pháp nuôi cấy mô giúp sản xuất cây Củ mài với số lượng lớn có chất lượng cao (sạch bệnh) Điều quan trọng, phương pháp này là sản xuất ra cây giống ở quy

mô công nghiệp trong thời gian ngắn, cây sạch bệnh và trồng được quanh

năm Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên

cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài(Dioscorea persimilis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”

2 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây Củ mài bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

-Ý nghĩa khoa học:

+ Kết quả nghiên cứu sẽ xây dựng được quy trình nhân giống cây củ mài

bằng kỹ thuật in vitro

+ Góp phần bảo tồn nguồn gen loại cây dược liệu, cây lương thực này

-Ý nghĩa thực tiễn : Đề xuất quy trình hoàn chỉnh nhân giống cây củ mài

bằng kỹ thuật in vitro, từ đó đảm bảo chủ động trong sản xuất cây giống với

số lượng lớn, sạch bệnh, chất lượng đồng đều, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất, nâng cao hiệu quả sản xuất, phục vụ nhu cầu lương thực, thực phẩm

và dược liệu

4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro

- Tái sinh và nhân nhanh chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây Củ mài

- Ra rễ, tạo cây in vitrohoàn chỉnh

- Huấn luyện cây Củ mài cấy mô thích nghi với điều kiện tự nhiên

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm và phân loại cây Củ mài

1.1.1 Phân loại thực vật cây Củ mài

Theo hệ thống thực vật [19] cây Củ mài được phân loại như sau:

Giới (regum) : Thực vật (Plantae)

Bộ (Ordo) : Củ nâu (Dioscoreales)

Họ (family) : Củ nâu (Dioscoreaceae)

Chi (genus) : Củ nâu (Dioscorea L.)

Loài (species) : Dioscorea persimilis

Chi Dioscorea được đặt theo tên bác sĩ

Hy Lạp cổ đại và nhà thực vật học Dioscorides Theo Ayensu ES và cs (1972) chi này bao gồm hơn 600 loài, thuộc nhóm cây một lá mầm chủ yếu được trồng ở Nam Mỹ, Châu Á và Tây Phi [23] Theo Jean M và cs (1992)

bộ Dioscoreales được xác định có niên đại khoảng 124 triệu năm trước [28] Hầu hết các loài thuộc chi Dioscorea đều có nguồn gốc ở Châu Á, Châu Phi,

Châu Mỹ và Châu Đai Dương, xuất hiện cách ngày nay khoảng 10.000 năm (Khoai mỡ) và du nhập sang các vùng khác nhau trên thế giới, nhất là các quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [36]

Ở nước ta hiện nay có 4 loài phổ biến thuộc chi Dioscorea phân bố tập

trung nhiều ở các vùng trung du, bán sơn địa và các vùng mới khai hoang: củ

nâu(Dioscorea cirrhosa), khoai mỡ(Dioscorea alata), củ mài(hay hoài sơn: Dioscorea persimilis) và củ từ(Dioscorea esculenta)

Hình 1.1: Cây Củ mài

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây Củ mài

Cây Củ mài thuộc loài cây thân thảo, leo quấn trên các giá thể khác nhau trong tự nhiên, cây sống nhiều năm, dài 5-10 m, cây có củ mọc sâu trong lòng đất từ 1,5 – 2 m Cây thường mọc rải rác ven rừng, rừng tre nứa, khe núi đá, trên đất đồi, những địa điểm ẩm quanh năm, đất xốp và giàu chất dinh dưỡng

Cây củ mài (Dioscorea persimilis) thường có một củ chính to được hình

thành từ rễ chính, củ dài hình chiếc dùi cui, mọc sâu vào trong đất độ sâu có thể từ 1-2 m Trên rễ củ có rất nhiều rễ dinh dưỡng mọc dài có tác dụng hấp thụ nước và ion khoáng trong đất Cây trồng một năm đã cho củ với năng suất trung bình đạt từ 1-1,2 kg/gốc [17]

Cây củ mài dạng thân leo (thân tự leo) dài trên 10 m, đường kính thân trung bình từ 0,2-0,5 cm thân quấn vào các giá thể khác theo chiều từ trái qua phải Thân cây nhẵn, không có lông, màu nâu đỏ và có góc cạnh, trên thân không có tua Chồi bên hình thành từ các nách lá hình thành lên các cành cấp

1 nhưng số lượng cành ít tập trung chủ yếu ở giữa thân Thân cây chia đốt mỗi đốt thân dài khoảng 15-20 cm toàn thân cây có từ 50-100 đốt tùy mức độ sinh trưởng và phát triển của cây Trên mỗi đốt thân có 4 lá Do đặc điểm cấu tạo thân cây nhỏ, mềm dẻo nên cây Củ mài không tự đứng trong không gian

mà phải leo lên các giá thể khác để lấy ánh sáng mặt khác khi leo lên cá giá thể khác sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát tán của hạt trong không gian [17]

Lá cây Củ mài là lá đơn, lá có dạng bản nhỏ, mọc so le hay mọc đối, hình tim đôi khi hình mũi tên, trên lá không lông, số lượng gân lá nhiều, gân lá có hình chân vit, dài khoảng 10-12 cm, rộng 6-8 cm, nhẵn, chóp lá nhọn [17]

Hoa nhỏ, đều, mọc thành bông, trục bông khúc khuỷu, hoa đơn tính Hoa đực và hoa cái khác gốc, thích nghi với lối thụ phấn nhờ gió Hoa đực có 6 nhị Hoa cái mọc thành cụm dạng bông cong dài tới 20 cm Cây ra hoa vào khoảng tháng 10 đến tháng 11 dương lịch hàng năm trước khi bước vào thời

kỳ tích lũy tinh bột Cụm hoa đực dài không 40 cm, mang từ 20-40 hoa nhỏ, màu vàng [17]

Quả nang, quả có 3 cạnh rộng 2-3 cm, mang 6 hạt Khi còn non quả có màu xanh, đến cuối tháng 12 quả chuyển sang màu vàng xanh Đối với cây trồng 1 năm sẽ ra hoa và quả, quả được hình thành vào tháng 11 dương lịch hằng năm trước khi cây chuẩn bị bước vào thời kì ngủ nghỉ [17]

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

Cây mọc hoang khắp nơi tại các vùng rừng núi nước ta, nhiều nhất ở các tỉnh Hà Bắc, Hoàng Liên Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình, đặc biệt là các vùng dọc dãy Trường Sơn và vùng núi đá vôi của tỉnh Quảng Bình, hiện nay đã được trồng phổ biến để chế biến thuốc

Mùa thu hoạch tốt nhất vào thu đông cho đến đầu xuân (từ tháng 10 đến tháng 4 năm sau)

Chế biến: củ mài đào về cần chế biến ngay

1.1.4 Đặc điểm của dƣợc liệu và hạt tinh bột Củ mài sau khi chế biến

khoảng 15-50 m, có vân đồng tâm, rốn lệch tâm, hình chấm hay hình vạch Tinh thể calci oxalat hình kim dài 35-50 m Mảnh mô mềm gồm các tế bào màng mỏng, chứa tinh bột, mảnh mạch mạng

đã có một số nghiên cứu tác dụng dược lý của củ mài trên cơ thể sống

(chuột) thông qua các chỉ tiêu như tăng thân trọng, tăng sự đồng hóa và tác dụng nội tiết hướng sinh dục… Theo danh y Đỗ Tất Lợi (2004) [4] chất mucin trong củ mài hòa tan trong nước ở điều kiện axit và nhiệt độ thích hợp

sẽ phân giải thành chất protid và hydrat carbon Ở nhiệt độ 45 – 55 độ C, khả năng thủy phân chất đường của men trong củ mài rất cao, trong axit loãng trong 3 giờ có thể tiêu hóa 5 lần lượng đường có vai trò rất quan trọng trong việc chữa bệnh tiểu đường ở con người

1.1.6 Công dụng

Ngoài việc dùng để ăn chống đói, củ mài (hoài sơn) còn là vị thuốc Củ mài với công năng kiện tỳ, chỉ tả, bổ phế khí, ích thận, cố tinh, giải độc, được dùng trong các trường hợp tỳ vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, tiêu chảy hoặc trẻ em bị vàng da, bụng ỏng, mắt mũi nhoèn gỉ mà y học cổ truyền gọi là bệnh cam, có thể phối hợp với các vị thuốc kiện tỳ: bạch truật, hoàng kỳ, bạch biển đậu… hoặc trong trường hợp khí phế hư nhược, đoản hơi, mệt mỏi, ho khan, phối hợp với đảng sâm, cát cánh, bách bộ Còn dùng khi thận hư, mộng tinh,

di tinh, tiểu tiện không cầm, phụ nữ bạch đới, phối hợp với ba kích, kim anh, khiếm thực…, đái tháo đường, phối hợp với mạch môn, thiên hoa phấn, sinh địa… Dùng ngoài, trị viêm tuyến vú gây đau đớn: củ mài tươi, rửa sạch, giã nát, đắp vào chỗ sưng đau, cách dùng vị hoài sơn là rất phong phú và đa dạng

Đề tài : Chế biến tinh bột củ mài hỗ trợ điều trị bệnh nhân đái tháo đường týp 2[38] do Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế cùng cộng sự được thực hiện từ tháng 3- 2011 đến tháng 9- 2012 nhằm nghiên cứu về các đặc tính lý hóa, cấu trúc và thành phần của tinh bột củ mài Theo Trần Hữu Dũng thông qua nghiên cứu lâm sàng trên 60 người tình nguyện bị đái tháo đường type 2 (được cho ăn các khẩu phần bánh chế biến từ nguyên liệu tinh bột củ mài theo một cách xác định), bước đầu đã chứng minh được rằng, khẩu phần bánh tạo ra có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường một cách hiệu quả

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào

Cuối thế 19 đầu thế kỉ 20 nhà sinh vật học ngưới Đức Haberlandt (1902)

đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau: mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [3]

Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thựcvật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi, cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một

cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [20]

Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua

sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

1.2.1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô,

cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể

Tuy nhiên, khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái

sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

Sự giãn tế bào: tế bào giãn ra cả về chiều ngang và chiều dọc làm tăng kích thước của từng cơ quan nói riêng và toàn bộ cơ thể nói chung Sau hai giai đoạn này cùng với quá trình cùng với quá trình biệt hóa tế bào phân hóa thành các mô chức năng chuyên hóa chuyên biệt, đảm nhận các vai trò khác

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực

vật

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt

hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bàonằm trong một khối mô của cơ thể thường

bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [11]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

1.2.1.3 Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào

Theo quan niệm sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Cho đến nay các tác giả đã chứng minh được khả năng tái sinh

1.2.2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.2.1 Khử trùng mẫu và cấy khởi động

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống

invitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng

để đưa vào nuôi cấy

Mẫu sau khi được vô trùng đảm bảo các yêu cầu sau: tỉ lệ nhiễm thấp,

tỷ lệsống cao và tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là: đỉnh

pháp khử trùng sẽ đưa lại tỉ lệ mẫu sống cao, môi trường thích hợp sẽ đạt tốc

1.2.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Đây là giai đoạn tái sinh một cách có định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy Quá trình được điều khiển bằng các chất kích thích sinh trưởng (auxin/cytokinin), các chất bổ sung khác như là nước dừa, dịch chiết nấm men .vào môi trường kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp nhằm tạo ra tỷ lệ tái sinh cao nhất Tuổi mẫu đem vào nuôi cấy cần được chú

ý, thường các mô non chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn những mô

đã chuyển hóa [7]

1.2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi

Giai đoạn này là giai đoạn tạo ra hệ số nhân nhanh cao nhất, được coi là then chốt của quá trình Điều khiển quá trình này bằng cách bổ sung vào môi

trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung khác như:

Tùy thuộc vào vào đối tượng nuôi cấy, có thể tiến hành nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển cuả các chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

1.2.2.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung các vào môi trường nuôi cấy các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin là nhóm hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA, 2,4-D thường sử dụng để tạo rễ cho chồi

1.2.2.5 Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng quyết định khả năng ứng dụng của quá trình

nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất Trong giai đoạn này cây con

được chuyển từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên, do đó cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp (nhiệt độ và độ ẩm) để cây có thể đạt

tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong sản xuất

1.2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho

sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công của nuôi cấy mô thế bào thực vật Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường nuôi cấy sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu nuôi cấy [21]

1.2.3.1 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lượng và vi lượng) được đưa vào nuôi cấy Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực vật

nhiên Trong thành phần muối khoáng đa lượng, các nguyên tố cần phải cung cấp là nitơ, phospho, kali và sắt [21]

lượng nitrat trong môi trường khoảng 25 mM, còn của amon khoảng từ 2-20

được đưa vào môi trường dưới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali, nitrat natri hoặc nitrat amon Trong số các nguyên tố của môi trường, nitơ có hàm lượng lớn nhất [21]

cấy thay đổi từ 2-25 mM [19]

Nguồn Canxi trong môi trường cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2.4H2O; canxi clorua CaCl2.6H2O Nồng độ Ca2+

trong môi trường

nuôi cấy thay đổi từ 1-3,5 ụM [21]

Sắt: thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu sắt làm giảm hàm lượng ARN và sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng tổng hợp ADN và axit

tự do dẫn đến giảm phân bào Các môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2, FeCl3.6H2O, sunfat sắt FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3[21]

Các ion Na+và Cl

cần ở hàm lượng thấp được đưa vào môi trường cùng

với các muối khoáng khi điều chỉnh pH môi trường

Các loại muối khoáng vi lượng: là những nguyên tố thường được sử dụng với hàm lượng thấp hơn 30 mg/l dung dịch nhưng rất nhiều nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe,

Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong

1.2.3.2 Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro,các tế bào thực vật thường không có khả năng

quang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúng thường nghèo cacbon hydrate so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển

1.2.3.3 Các vitamin và acid amin

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid, đặc biệt là vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6, Các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo-inositol đóng vai trò sinh tổng hợp

Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có nồng độ cao từ 500 đến 1000 lần dung dịch làm việc Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong

1.2.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng

Thông thường trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phổ biến 3 nhóm chất sinh trưởng sau: auxin, cytokinin và gibberelin Các chất sinh trưởng tương tác với nhau và tương tác với các chất ức chế sinh trưởng (axit abscisis, ethylen) quyết định sự hình thành, phát triển, phát sinh hình thái của thực vật nuôi cấy [16]

*Auxin: Auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

và thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ đầu Auxin cùng với cytokinin có tác dụng thúc đẩy sự phát sinh và phát triển chồi, huyền phù tế bào và cơ quan Đồng thời điều hòa quá trình phát sinh hình thái Ở mức độ tế bào, auxin điều khiển các quá trình cơ bản của tế bào như phân chia và kéo dài tế bào [3]

Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA, còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid (NAA) và 2,4- dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ [3]

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [7]

*Cytokinin: Cytokinin là chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích sử dụng protein, điều khiển chu trình tế bào và tăng sự phân chia tế bào Các cytokinin thường được sử dụng rộng rãi là kinetine, benzyadenin (BA), 6- benzyl aminopurin (BAP) và thidiazuzon (TDZ) Đây là các cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều các cytokinin

tự nhiên như zeatin hay iP Các cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế bào [3]

*Gibberellin: Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra Năm 1939, ông đã tách chiết được gibberellin từ nấm G Fujikuroi và được gọi là gibberellin A Vào thời điểm năm 2003, đã có 126 chất được biết đến thuộc nhóm Gibberellic acid, thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều dọc, giúp kéo dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và rút ngắn thời gian sinh trưởng của cây Tuy nhiên GA3 rất mẫn cảm với nhiệt độ, nó bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng Vì vậy

sử dụng GA3 thường phải đem lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào

1.2.3.5 Các chất bổ sung, làm thay đổi trạng thái môi trường

*Nước dừa: Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng [14] Nước dừa đã được sử dụng

để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Nước dừa thường sử dụng với hàm lượng 5-20% thể tích môi trường, kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi [21]

*Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với hàm lượng thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thuỷ phân casein hydrolyase (0,1-1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy [21]

*Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hoá môi trường Hàm lượng agar sử dụng thường là 0,6-1% đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi