Nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cây lan hài hồng (paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí hiếm của việt nam

Đã từ lâu, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây k

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Lê Quang Luân, người không chỉ hướng dẫn em bước đầu trên con đường nghiên cứu khoa học mà còn dìu dắt em trên ngưỡng cửa bước vào đời

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu và quí thầy cô trường Đại học Nha Trang, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Chế biến đã dạy dỗ em trong suốt thời gian vừa qua

Xin cảm ơn cô Hà, cô Nụ và chị Vang trong Phòng Sinh học đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giúp đỡ trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn tập thể lớp 45SH, cảm ơn những người bạn đã cùng tôi sánh bước trên giảng đường đại học

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình và những người thân yêu đã nuôi dưỡng, yêu thương, quan tâm và chăm sóc người con này

Tp Hồ Chí Minh, ngày 30/10/2007 Sinh viên thực hiện

Hồ Ngọc Văn

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình ảnh

Lời mở đầu

Chương 1 Tổng quan tài liệu 1

1.1 Khái quát về phương pháp vi nhân giống 1

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nhân giống in vitro 1

1.1.2 Môi trường nuôi cấy 1

1.1.2.1 Các muối khoáng đa lượng 2

1.1.2.2 Các muối khoáng vi lượng 3

1.1.2.3 Các vitamin 4

1.1.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 5

1.1.2.5 Các chất bổ sung 9

1.1.3 Những vấn đề thường găp trong nhân giống in vitro 9

1.1.3.1 Tính bất định về mặt di truyền 9

1.1.3.2 Sự nhiễm mẫu 10

1.1.3.3 Sự hóa thủy tinh thể 10

1.1.3.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu 10

1.1.4 Các ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô 11

1.1.4.1 Ưu điểm 11

1.1.4.2 Nhược điểm 12

1.1.5 Các ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp 12

1.1.5.1 Vi nhân giống 12

1.1.5.2 Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh 13

1.1.5.3 Bảo quản giống in vitro 13

1.1.5.4 Biến dị tế bào soma 13

1.1.5.5 Lai đơn bội 13

1.2 Khái quát về cây Lan hài 13

1.2.1 Giới thiệu về họ Lan 13

1.2.2 Giới thiệu về Lan hài 14

1.2.2.1 Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của Lan hài 15

1.2.2.2 Hình thái của Lan hài 15

1.2.2.3 Vòng đời 18

1.2.2.4 Sinh thái 19

1.2.2.5 Phân bố địa lý 20

1.2.2.6 Hiện trạng cây Lan hài Việt Nam 21

1.2.3 Giới thiệu một vài loài Lan hài đặc hữu của Việt Nam 24

1.2.3.1 Paphiopedilum vietnamense 24

1.2.3.2 Paphiopedilum helenae 25

1.2.3.3 Paphiopedilum villosum 26

1.2.3.4 Paphiopedilum hangianum 27

1.2.3.5 Vài nét về cây Lan hài hồng 28

Chương 2 Vật liệu và phương pháp 34

2.1 Vật liệu 34

2.1.1 Mẫu cấy 34

2.1.2 Địa điểm thực hiện đề tài 34

2.1.3 Phòng thí nghiệm và các dụng cụ 34

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 35

2.1.5 Điều kiện nuôi cấy 35

2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 35

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 35

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường MS, VW và KC kết hợp với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 37

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp các chất ĐHST 2,4D và TDZ đến khả năng tạo callus của Lan hài hồng 38

2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ĐHST 2,4D, BA, NAA và TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40 2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các chất ĐHST BA, TDZ và

NAA đến quá trình nhân nhanh chồi cây Lan hài hồng 41

2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Lan hài hồng 42

2.2.7 Xử lí thống kê số liệu 43

Chương 3 Kết quả và thảo luận 44

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 44

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của các loại môi trường MS, VW và KC kết hợp với IBA đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 47

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của sự kết hợp các chất ĐHST 2,4D và TDZ đến khả năng tạo callus của Lan hài hồng 49

3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các loại ĐHST thực vật 2,4D, BA, NAA và TDZ đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 51

3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của các chất ĐHST BA, TDZ và NAA đến quá trình nhân nhanh chồi cây Lan hài hồng 53

3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của cây Lan hài 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận 57

2 Kiến nghị 58 Tài liệu tham khảo

Phụ lục

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm Lan hài Việt Nam xếp theo thứ hạng bảo tồn của IUCN 22

Bảng 2.1 Nghiệm thức khử trùng đỉnh sinh trưởng Lan hài hồng 36

Bảng 2.2 Nghiệm thức khử trùng mẫu cành phát hoa Lan hài hồng 36

Bảng 2.3 Nghiệm thức khử trùng trái Lan hài hồng dùng Ca(Ocl)2 37

Bảng 2.4 Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 38

Bảng 2.5 Nghiệm thức ảnh hưởng của sự phối hợp các chất ĐHST đến khả năng tạo callus Lan hài hồng 39

Bảng 2.6 Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 40

Bảng 2.7 Nghiệm thức ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi Lan hài hồng 41

Bảng 2.8 Nghiệm thức các loại môi trường ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây Lan hài hồng 42

Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng cây Lan hài hồng sau khi khử trùng 44

Bảng 3.2 Tình trạng mẫu cành phát hoa cây Lan hài hồng sau khi khử trùng và nuôi cấy 6 tuần 45

Bảng 3.3 Tình trạng mẫu trái Lan hài hồng qua khử trùng và gieo hạt sau 10 tuần 46 Bảng 3.4 Kết quả ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả năng nẩy mầm của hạt hài hồng 48

Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của các chất ĐHST ảnh hưởng đến khả năng tạo callus Lan hài hồng 50

Bảng 3.6 Kết quả ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng nhân nhanh PLB Lan hài hồng 52

Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của các loại ĐHST đến khả năng nhân chồi cây Lan hài hồng 54

Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng tái sinh cây Lan hài .56

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của auxin 7

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của cytokinin 8

Hình 1.3 Nữ hài hiệp – Loài Lan hài đã bị tuyệt chủng 23

Hình 1.4 Hoa Paphiopedilum vietnamense 24

Hình 1.5 Hoa Paphiopedilum helenae 25

Hình 1.6 Hoa Paphiopedilum villosum 26

Hình 1.7 Hoa Paphiopedilum hangianum 27

Hình 1.8 Cây và hoa Lan hài hồng 28

Hình 1.9 Hình thái Lan hài 29

Hình 1.10 Hoa Paphiopedilum ngoài tự nhiên 30

Hình 2.1 Hoa Lan hài hồng 34

Hình 3.1 Mẫu Lan hài sống và phát triển tốt sau khi vào mẫu 47

Hình 3.2 Sự hình thành callus của cây Lan hài 51

Hình 3.3 Sự hình thành PLB của mẫu Lan hài 52

Hình 3.4 Sự hình thành cụm chồi ở cây Lan hài 54

Hình 3.5 Cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) được tái sinh hoàn chỉnh trong ống nghiệm 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4D: acid 2,4 Dichlorophenoxy acetic

BA: 6-Benzylaminopurine

ĐHST: Điều hòa sinh trưởng

IAA: 3-Indolacetic acid

IBA: 3-Indolbutyric acid

IUCN: Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế

Lời mở đầu

Đã từ lâu, người phương Đông đã tôn hoa Lan là “vương giả chi hoa” và người phương Tây cũng đã tôn hoa Lan là “nữ hoàng của các loài hoa” Hoa Lan đã thực sự chinh phục người phương Đông và người phương Tây bởi chính cấu trúc kì diệu và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ của nó Hiện nay, nhu cầu trồng và thưởng thức hoa Lan của con người ngày càng cao bởi không chỉ vì những điều nêu trên mà còn bởi độ bền hoa, nếu được giữ đúng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thì hoa Lan có thể còn nguyên hương nguyên sắc từ hai tuần cho đến hai tháng thậm chí đến bốn tháng

Trong số các loại hoa Lan thì Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một

loại Lan rất đặc biệt bởi cấu trúc hoa có một không hai của chúng Cánh hoa giữa hình chiếc hài nằm ở vị trí thấp nhất của hoa tạo nên một vẻ ngoài rất đặc sắc, màu sắc hoa toát lên vẻ mềm mại và hết sức quyến rũ Không chỉ hoa mà lá của Lan hài hồng cũng rất dặc sắc bởi những khảm xanh tím tựa như vải nhung hoặc gấm Những điều đó tạo cho Lan hài hồng một nét đẹp rất cao sang và quý phái Và đặc biệt hơn nữa khi đây là loài đặc hữu và quí hiếm của Việt Nam Vẻ đẹp của Lan hài hồng làm cho chúng rất được ưa chuộng trên thị trường của cả thế giới Cũng bởi chính vẻ đẹp và giá trị của nó dẫn đến việc thu thập khai thác Lan hài hồng diễn ra một cách ồ ạt làm cho loài hoa quý hiếm này đang ngày càng cạn kiệt ngoài tự nhiên

Đã từ lâu, người ta đã tiến hành nhân giống các loài Lan bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây không đồng đều, chất lượng cây thấp và số lượng cây ít,…Để khắc phục được điều này, người ta đã tiến hành nhân giống bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro để tạo ra số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều

và sạch bệnh Đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được

Hiện nay, nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là ở Đà Lạt, nơi mà điều kiện khí hậu rất phù hợp cho việc nhân giống in vitro

Đối với cây Lan hài, mặc dù đã có một số công trình công bố về kết quả vi nhân giống loại cây này nhưng đa số các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng

việc nhân giống in vitro cây Lan hài là hết sức khó khăn Ở Việt Nam, vấn đề này

cũng đang rất được quan tâm và đã có những kết quả nghiên cứu bước đầu nhưng chủ yếu là tập trung vào kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm Việc nhân giống loài cây này còn nhiều vấn đề phải giải quyết Đối với cây Lan hài hồng, nhiều tài liệu

đã cho thấy, việc nhân giống loài hoa này hiện nay chủ yếu được thực hiện bằng

phương pháp tách mầm hoặc gieo hạt in vitro Cho đến nay chưa có tài liệu nào công bố qui trình hoàn chỉnh phục vụ nhân giống in vitro loại cây quý hiếm này

Chính vì vậy, đề tài “nghiên cứu hoàn thiện qui trình nhân giống in vitro cây Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quí hiếm của Việt Nam” là vấn đề

hết sức cần thiết và cấp bách hiện nay nhằm bảo tồn nguồn tài nguyên quốc gia quí hiếm này cũng như tạo tiền đề cho việc nhân giống đại trà loại hoa hết sức có giá trị này cho thị trường trong nước và xuất khẩu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về phương pháp vi nhân giống

1.1.1 Khái niệm về phương pháp nhân giống in vitro

Thuật ngữ “nuôi cấy mô tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói

về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (mô, cơ quan, tế bào đơn) trong điều kiện vô trùng Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật thường được dùng để nghiên cứu tất cả các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lí học, sinh hóa học, di truyền học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cũng được mở rộng để nhân giống vô tính một cách kinh tế các loại cây trồng quan trọng và có giá trị kinh tế

Nuôi cấy mô là nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp (như đường, muối khoáng, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng) trong điều kiện vô trùng

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi và cơ quan từ mô như lá, hoa hoặc rễ

Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô được sử dụng rộng rãi trong công tác giống

và cây trồng, cung cấp các loại giống cây trồng chất lượng cao

1.1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật là tổ hợp gồm nhiều thành phần: muối, vitamin, axit amin, chất điều hòa sinh trưởng, đường, agar hay gelrite và nước Tất cả các thành phần này thực hiện một hay nhiều chức năng trong

quá trình phát triển in vitro của thực vật

Các chất khoáng có mặt trong môi trường nuôi cấy được các tế bào thực vật

sử dụng như là các yếu tố cơ bản để tổng hợp nên các phân tử hữu cơ hay là chất xúc tác trong các phản ứng enzyme Các dạng ion của muối đóng vai trò rất quan trọng trong việc vận chuyển các phân tử ion hóa trong cơ thể thực vật, trong việc điều hòa áp suất thẩm thấu và duy trì điện thế ở trong cây [7], [16]

Tùy theo các loại cây khác nhau mà thành phần môi trường có thể thay đổi

để thích hợp với từng loại cây Môi trường còn thay đổi tùy theo sự phát triển phân hóa của mô nuôi cấy, tùy thuộc vào mục đích ta muốn duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi cấy phải thay đổi nhiều hay ít

Tuy nhiên, tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm 5 thành phần cơ bản:

 Đường làm nguồn cacbon

 Các muối khoáng đa lượng

 Các muối khoáng vi lựơng

 Các vitamin

 Các chất điều hòa sinh trưởng

Ngoài ra một số nhà nghiên cứu còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần xác định (acid amin, EDTA,…) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây,…)

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, do mô thực vật không có khả năng quang hợp nên trong môi trường nuôi cấy phải bổ sung thêm đường làm nguồn cacbon để thực vật làm nguyên liệu tổng hợp nên các chất hữu cơ cần thiết cho quá trình phân chia tế bào, tăng sinh khối Hai loại đường thường được sử dụng trong nuôi cấy mô

là saccharose và glucose nhưng saccharose được dùng phổ biến hơn

1.1.2.1 Các muối khoáng đa lượng

Nhu cầu về muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều

so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp

là nitơ, canxi, photpho, kali, magie, sắt,…

Nguồn nitơ (N): N là nguồn nguyên liệu để tế bào tổng hợp các axit amin, protein cho hoạt động sống của chúng Trong môi trường nuôi cấy, N được cung cấp dưới các dạng muối như: KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4,

Nguồn lưu huỳnh (S): S cần thiết cho tế bào để tổng hợp nên lipit, tham gia vào cầu nối disulfua trong cấu trúc phân tử protein và là thành phần của một số axit amin Trong môi trường nuôi cấy, S được bổ sung dưới dạng ion SO42-

Nguồn photpho (P): P là thành phần quan trọng trong sự sinh trưởng, P cần thiết cho sự phân chia tế bào, sự tạo hoa và trái, sự phát triển của rễ P có liên quan đến sự tổng hợp đường, tổng hợp tinh bột trong lục lạp vì P là thành phần của các hợp chất cao năng tham gia vào các quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu

cơ trong tế bào Hai dạng photpho thường dùng nhất là NaH2PO4.7H2O và KH2PO4

Nguồn kali (K): K làm tăng quá trình quang hợp và thúc đẩy vận chuyển gluxit từ phiến lá vào các cơ quan khác K còn giúp cây cứng cáp và tăng khả năng

đề kháng sâu bệnh K còn ảnh hưởng đến sự hô hấp tế bào Người ta cung cấp kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO3), kali clorua (KCl) và kali dihydrophotphat (KH2PO4)

Nguồn canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào Ca

có mặt trên vách tế bào và khả năng dao động có hạn của Ca từ màng tế bào vào tế bào chất (cytoplasm)

Hàm lượng Ca ở màng tế bào và vách tế bào lớn giúp cho vách tế bào vững vàng và điều chỉnh cấu trúc màng tế bào

Sự có mặt của Ca2+ cũng rất quan trọng trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm Sự ổn định của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bởi ion Ca2+ Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng các quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào Ca được cung cấp dưới dạng canxi nitrat (Ca(NO3)2.4H2O), canxi clorua (CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O)

Nguồn magiê (Mg): Mg là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng sâu sắc và nhiều mặt đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme liên quan trong biến dưỡng cacbonhydrat sự tổng hợp axit nucleic…

Ion Mg2+ có tính linh động rất cao, hầu hết ion Mg2+ đều được sử dụng trong việc điều hòa pH nội bào và ổn định cân bằng anion và cation Ngoài ra Mg còn là nguyên tử trung tâm của phân tử diệp lục

Việc thiếu hụt Mg2+ sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp ARN Kết quả là cấu trúc

và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra sự thiếu hụt Mg

Magiê là nguyên tố không thể thiếu được trong quá trình trao đổi năng lượng của thực vật bởi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP

Magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunfat (MgSO4.7H2O) [4], [7], [16]

1.1.2.2 Các muối khoáng vi lượng

Nhu cầu về muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào

Tuy nhiên, trong môi trường nuôi cấy vẫn bổ sung các nguyên tố vi lượng cho mô tế bào phát triển

Nguồn Bo (B): có thể khẳng định giống như canxi, nguyên tố Bo cũng có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp vách tế bào cũng như trong việc ổn định sự vững chắc của vách tế bào và màng tế bào

Sự thiếu hụt Bo sẽ kiềm hãm sự phát triển chiều dài rễ sơ cấp ngay lập tức Hơn nữa, Bo còn tham gia vào quá trình trao đổi chất của phenol và sự tổng hợp lignin bằng cách tạo ra các borat ester ổn định giữa axit boric và axit phenolic

Clo (Cl): vai trò của ion Cl- là điều hòa áp suất thẩm thấu và tái tạo điện tích Ion Cl- tham gia vào quá trình đóng mở khí khổng Thiếu Cl- làm khí khổng mở liên tục là nguyên nhân gây nên sự mất nước Cl có vai trò quan trọng trong việc điều hòa áp suất thẩm thấu của không bào có liên quan đến quá trình trương nước

Sắt (Fe): những môi trường cổ điển thường dùng Fe dưới dạng clorua sắt (FeCl2, FeCl3.6H2O), sunfat sắt (FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3), sitrat sắt (Fe(C4H4O6)) Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm điều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-etylen diamintetra acetat (EDTA)

Đồng (Cu): Đồng được cây trồng hấp thu dưới dạng ion Cu2+ hay là các phức hợp Cu Trong tế bào, Cu là thành phần của các phản ứng oxy hóa – khử Sự thiếu hụt Cu sẽ làm giảm hoạt động của các enzyme có chứa đồng

Mangan (Mn): Mn là nguyên tố vi lượng quan trọng nhất gần như luôn luôn

có mặt trong tất cả các môi trường nuôi cấy Mn tác động hóa học tương tự Mg nên

có thể thay thế Mg trong một số hệ thống enzym [5], [4], [7], [16]

1.1.2.3 Các vitamin

Vitamin được bổ sung vào cây dưới nhiều dạng và nồng độ khác nhau, có chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme Trên thực tế các phức hợp này là rất cần thiết cho một vài phản ứng sinh hóa Tất cả các loại môi trường dùng để nuôi cấy đều chứa thiamin (vitamin B1)

Inositol cũng được đề cập tới như môt loại vitamin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây một cách đáng kể [17]

Các vitamin thường dùng là: myo-inositol, acid nicotinic (vitamin PP), pyridoxine HCl (vitamin B6), thiamin HCl (vitamin B1)…

1.1.2.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, thực vật không những cần các chất protein, gluxit, lipit, axit nucleic,… để cấu trúc nên tế bào, mô và cung cấp năng lượng cho hoạt động sống mà còn cần rất nhiều các chất có hoạt tính sinh lí như vitamin, enzym và nhất là các chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) Trong số đó các ĐHST có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và hoạt động sinh lí của cây

Chất ĐHST thực vật (đôi khi còn được gọi là phytohocmon) là các chất hữu

cơ có bản chất hóa học khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ phận nhất định của cây để điều hòa các hoạt động sinh lí cũng như quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, các bộ phận trong cơ thể thực vật

Các chất ĐHST thực vật tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh hưởng mạnh đến những quá trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh tổng hợp các enzym, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp,…[8] Chính vì vậy chúng

có tác dụng điều hòa sinh trưởng phát triển của cây Các chất ĐHST thực vật bao gồm những nhóm chất sau:

Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với cytokinin Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, khi nồng độ của auxin cao hơn hoặc khi chỉ xử lí với auxin thì rễ sẽ được tạo thành [4], [5]

Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là

do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzym, làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào làm cho sự thâm nhập của nước vào trong tế bào được dễ dàng, giảm sức đề kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra Auxin hoạt hóa các quá trình sinh tổng hợp các chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin,…) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodizinxki, 1981) Vì vậy, chúng có tác dụng làm chậm trễ quá trình già hóa, kích thích ra rễ và xúc tiến sự sắp xếp của những rễ bất định

Nồng độ sử dụng của auxin có liên quan chặt chẽ đến sự chiếu sáng, nhiệt độ

và sự có mặt của các chất điều hòa sinh trưởng khác

Vai trò của auxin trong nuôi cấy mô được công bố bởi Skoog và Miller vào năm 1957 Ông thấy rằng mô tủy của cây thuốc lá có khả năng tạo chồi ở môi trường có nồng độ cytokinin cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường có nồng độ cytokinin thấp và auxin cao Một vài năm sau đó, sự hình thành phôi sinh dưỡng bằng các nuôi cấy mô trong môi trường có chứa 2,4-D được phát hiện Có thể lưu ý rằng auxin chỉ được sử dụng trong giai đọan khởi đầu của sự hình thành rễ bất định

và phát sinh phôi sinh dưỡng, sau đó trở thành chất ức chế ngăn cản sự phát triển của các cơ quan và phôi mới được hình thành

Auxin còn kích thích hình thành rễ trên các đoạn cắt của thân, phát triển các nhánh rễ và sự phản biệt hóa các mô để tạo rễ trong nuôi cấy mô

Các chất ĐHST trong nhóm auxin được biết đến như IBA (3-Indolbutyric acid); IAA (3-Indolacetic acid); NAA (Naphtalenacetic acid); 2,4D (acid 2,4 Dichlorophenoxy acetic)

NAA (Naphtalenacetic acid) có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA [4]

Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng: NAA tác động ở mức độ phân tử tế bào theo cơ chế:

 Thứ nhất, NAA gắn với phân tử enzym và kích thích enzym hoạt động, Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin lên citrat synthetase còn Yamaki thông báo rằng auxin kích thích hoạt tính của ATPase

 Thứ hai, NAA tác động vào gen và các enzym phân giải acid nucleic [5].

IBA là auxin tổng hợp, chúng ổn định hơn nhiều so với IAA và thường dùng trong môi trường nuôi cấy tạo rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh IBA là chất được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống thương mại IBA là chất nhạy cảm với ánh sáng, chính vì vậy mà nó cần phải được bảo quản trong các lọ tối trong tủ lạnh

Các chất thuộc nhóm auxin:

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của auxin

b Cytokinin

Cytokinin được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật vào năm 1945-1955 Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất có hoạt tính sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu trúc hóa học của nó Cytokinin là chất ĐHST thực vật có tác dụng đẩy mạnh sự sinh trưởng của cây trồng

Cytokinin có khả năng kích thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó là kích thích quá trình phân bào giảm nhiễm Bên cạnh đó, cytokinin có vai trò quan trọng trong quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan Để thực hiện được quá trình phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinin phải được kết hợp với auxin hoặc giberelin Nếu vắng mặt auxin hoặc giberelin thì quá trình phân hóa các tế bào và tạo mới các cơ quan sẽ không có hiệu quả bởi vì auxin thúc đẩy quá trình nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời các nhiễm sắc thể [5]

Trong nuôi cấy in vitro, cytokinin đẩy mạnh quá trình hình thành chồi mầm

trong nhiều mô, bao gồm mô sẹo (callus)

Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián

tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro

Tác dụng này của cytokinin đôi khi hiệu quả hơn khi kết hợp với auxin Một

tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái mẫu cấy

Tuy nhiên, nồng độ cytokinin cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng thời cũng ngăn cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin Vì lí do này mà người ta thường không sử dụng cytokinin trong môi trường kích thích sự ra rễ của chồi để tạo cây con

Những kết quả nghiên cứu về cytokinin cho thấy cytokinin là sản phẩm bình thường trong hoạt động sống của thực vật, nó tham gia trực tiếp vào các giai đoạn quan trọng của quá trình trao đổi chất, quá trình nẩy mầm của hạt và sinh trưởng của cây con [4], [5], 16]

Đại diện chính của cytokinin là kinetin được phát hiện trong dịch thủy phân nấm men Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong tối, tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia tế bào khi nuôi cấy tế bào rời

Ngoài ra, trong nuôi cấy môi thường sử dụng hai chất thuộc nhóm cytokinin

là BA (6-benzylaminopurin) và TDZ (1-phenyl 3-(1-2,3 thiadiazol-5 yl) urea)

Acid giberelic (GA3) và hỗn hợp giữa GA3 và GA7 là những giberelin duy nhất

có giá trị thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

Mô cấy thực vật nói chung tăng trưởng và phát triển không cần thiết đến sự hiện diện của giberelin trong môi trường nuôi cấy Nhưng GA3 thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào có mật độ thấp

Khi bổ sung giberelin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, rễ bất định và phát sinh phôi soma

Acid giberelic có ảnh yếu lên sự phân hóa tế bào in vitro ngoài sự tác động

của auxin Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và mẫu cấy chồi cũng có thể được tăng thêm khi bổ sung acid giberelic [4], [16]

1.1.2.5 Các chất bổ sung

Trong môi trường nuôi cấy mô, ngoài những thành phần môi trường dinh dưỡng cơ bản còn bổ sung thêm một số yếu tố khác như:

Các hợp chất hữu cơ: trong một số môi trường nuôi cấy thường bổ sung một

số chất hữư cơ có thành phần không xác định nhằm cung cấp thêm một số chất cần thiết cho mô phát triển Các chất hữu cơ bổ sung có thể là nước dừa, dịch chiết nấm men, pepton,….Nước dừa thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy chủ yếu cung cấp myo-inositol và một số acid amin, lượng nước dừa bổ sung thường từ 10% đến 20% thể tích môi trường

Than hoạt tính: bổ sung than hoạt tính vào môi trường có tác dụng khử độc, giữ ẩm Trong môi trường nuôi cấy, than hoạt tính có vai trò hấp thụ các polyphenol, do vậy nó có tác dụng hạn chế hiện tượng hóa nâu mẫu Than hoạt tính thường dùng trong môi trường nuôi cấy các loại cây Phong lan, Địa lan, Lan hài,… với lượng dùng thường là 1g/lít môi trường

Agar: môi trường nuôi cấy cần bổ sung agar để làm đặc môi trường Tùy vào môi trường nuôi cấy loại cây yêu cầu độ cứng môi trường khác nhau mà lượng agar

bổ sung dao động từ 8-15g cho một lít môi trường

1.1.3 Những vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro

1.1.3.1 Tính bất định về mặt di truyền

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh trưởng Tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại Tần số biến dị trong nuôi

cấy mô sẹo thường cao hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tần số biến dị xảy ra còn phụ thuộc vào các yếu tố:

 Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy

 Loại mô cấy

 Số lần cấy chuyển nhiều hay ít [5]

1.1.3.2 Sự nhiễm mẫu

Do môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng cho mô tế bào thực vật phát triển thì đồng thời nó cũng là môi trường thích hợp cho các loài nấm và vi khuẩn phát triển

Sự nhiễm mẫu xảy ra có thể là do nồi hấp không đạt yêu cầu, yêu cầu về điều kiện vô trùng trong phòng cấy không đảm bảo hoặc cũng có thể là do thao tác của người nuôi cấy

1.1.3.3 Sự hóa thủy tinh thể

Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lí của cây bị mất nước khi chuyển

cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài

Để hiện tượng thủy tinh thể được hạn chế ta cần phải:

 Giảm bớt sự hút nước của cây trong in vitro bằng cách tăng nồng độ đường

trong môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao

 Tránh gây thương tổn trên mẫu cấy khi khử trùng

 Giảm hàm lượng ethylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy [5]

1.1.3.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu

Thường chúng ta thấy đó là hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu Sinh trưởng của mẫu bị chậm lại, thậm chí hư mẫu

Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay polyphenol, chúng có nhiều trong mô già hơn mô non

Các phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:

 Tách các phân tử phenol ra khỏi môi trường

 Ngăn chặn hoạt động của enzym phenolaza

 Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn

 Chuẩn bị mẫu có vết cắt nhỏ

 Gây vết thương nhỏ nhất trên mẫu khi khử trùng

 Sử dụng mô mẫu cấy nhỏ từ mô non [5]

1.1.4 Các ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô

1.1.4.1 Ưu điểm

Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô được sử dụng rất rộng rãi bởi có những ưu điểm sau:

 Tạo ra số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền

 Có thể nhân giống từ bất cứ bộ phận nào của cây

 Khắc phục được đặc tính khó nhân giống, hệ số nhân giống thấp và tính bất thụ ở cây trồng, rút ngắn thời gian nhân giống

 Kiểm soát được các yếu tố gây bệnh cho cây, tạo ra các dòng cây sạch bệnh

 Ứng dụng vào lĩnh vực di truyền nhằm tạo ra những giống mới mà phương pháp truyền thống không làm được như: giống đơn bội, giống đa bội,…

 Là công cụ giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật

 Là công cụ để nghiên cứu đặc tính sinh lí thực vật

Bên cạnh đó, việc áp dụng phương pháp nhân giống in vitro còn có những

thuận lợi như:

 Cảm ứng được sự trẻ hóa của mô, do vậy sự sinh trưởng của những cây nuôi

cấy in vitro thường mạnh hơn vì chúng đã được trẻ hóa và sạch bệnh

 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống ex vitro

 Một số cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống nhờ

phương pháp nhân giống in vitro

 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen

Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma

 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp ( nguồn

dinh dưỡng và điều kiện môi trường) nên có thể sản xuất cây con quanh năm

 Có thể sử dụng cây mẹ in vitro để sử dụng cho các bước nhân giống tiếp theo

 Nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ nên có điều kiện để

chọn mẫu được kỹ càng

 Các cây sạch bệnh có thể dễ dàng trao đổi với các nơi khác nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất

1.1.4.2 Nhược điểm

Bên cạnh các ưu điểm ở trên thì nhân giống in vitro còn có những nhược

điểm như:

 Việc nhân giống in vitro đòi hỏi có kỹ thuật cao, phòng nuôi cấy yêu cầu về

trang thiết bị đắt tiền, yêu cầu cao về mức độ vô trùng

 Kiểu gen thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

 Đặc biệt đối với một số loại cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện

 Việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm rất khó thực hiện Cây dễ bị héo do khí khổng hoạt động không ổn định Cây rất dễ bị sâu bệnh tấn công,

vì vậy giá thể dùng làm môi trường sống của cây cần được xử lí cẩn thận Tỉ

lệ sống của cây con khi chuyển ra vườn ươm rất thấp

 Đối với một số mô, việc vô trùng mẫu trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất do việc cấy chuyền mô sẹo nhiều lần

 Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm giá thành của

sản phẩm tăng cao

1.1.5 Các ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu và ứng dụng trong

nông nghiệp

1.1.5.1 Vi nhân giống

Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được áp dụng phổ biến

trong nông nghiệp nhờ có hệ số nhân nhanh hơn phương pháp thông thường

Vi nhân giống được ứng dụng để:

1.1.5.2 Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh

Nuôi cấy in vitro có khả năng sản xuất hàng loạt cây sạch bệnh từ những cây

bị nhiễm virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây sạch bệnh có khả năng

nhân nhanh, trao đổi giống và bảo quản in vitro

1.1.5.3 Bảo quản giống in vitro

Phương thức duy nhất an toàn cho lai giống và tạo giống mới là phải có ngân hàng giống Giữ tập đoàn giống cho đến nay là một vấn đề nan giải cho những cây

trồng nhân vô tính hay cây đa bội Bảo quản in vitro trong thời gian dài bằng

phương pháp sinh trưởng chậm bước đầu đã giải quyết được một phần Hạn chế của phương pháp này là có những biến đổi về mặt di truyền do thời gian nuôi cấy kéo dài [5]

1.1.5.4 Biến dị tế bào soma

Cây để tái sinh in vitro từ nuôi cấy cơ quan, mô sẹo và protoplast thường có

những thay đổi về hình thái hay nói một cách khác là biến dị tế bào soma

Những thay đổi qua nuôi cấy in vitro có thể do tình trạng sinh lí mẫu cấy, thể

bội của cây trồng, trao đổi chéo DNA, thời gian, điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy… Những biến dị tế bào soma thu được này có thể dẫn đến hình thành giống mới qua chọn dòng Phương thức chọn dòng này có thể thu ngắn một nữa thời gian chọn giống mới

1.1.5.5 Lai đơn bội

Cây đơn bội được tạo ra qua nuôi cấy hạt phấn và túi phấn Cây đơn bội thể hiện được đặc tính thuần khiết của giống, và là nguyên liệu hoàn hảo được sử dụng trong lai giống [5]

1.2 Khái quát về cây Lan hài

1.2.1 Giới thiệu về họ Lan

Họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ măng tây, lớp một lá mầm, là một trong

những họ đỉnh cao của sự tiến hóa của các họ cây có hoa Trên thế giới hiện có khoảng 25000 đến 30000 loài hoa Lan, gồm khoảng 800 chi Họ Lan có khu vực phân bố vô cùng rộng lớn, từ xích đạo đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng băng tuyết, song nhiều hơn cả là vùng nhiệt đới và á nhiệt đới nhất là ở Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh [1], [7]

Hoa Lan mọc ở nhiều nơi và được chia làm 4 loại sau đây:

 Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây

 Terestrials: Địa lan mọc dưới đất

 Lithophytes: Thạch lan mọc ở các kẽ đá

 Saprophytes: Hoại lan mọc trên lớp rêu hay gỗ mục

1.2.2 Giới thiệu về Lan hài

Lan hài là một nhóm rất khác biệt Chúng có thể dễ dàng nhận ra bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa ở giữa hình túi sâu trông giống một chiếc hài (trong chuyên môn gọi là môi hay cánh môi) nằm ở vị trí thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc Và do vậy, nó trở thành tên chung của nhóm

này Cũng như vậy, tên Latin của chi Lan hài lớn nhất, Paphiopedilum, có thể dịch

nghĩa là “chiếc hài của Paphos” Paphos là nơi sinh của Aphrodite, vị thần của tình yêu và cái đẹp trong thần thoại Hy Lạp (còn được gọi là thần Vệ nữ), và pedilon là một từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là cái hài hay chiếc giày Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa làm cho Lan hài dễ dàng phân biệt với tất cả các loài Lan khác

Một số lớn các loài Lan hài và các dòng lai nhân tạo từ chúng đã được trồng

và trở thành một trong các nhóm cây cảnh phổ biến nhất tại nhiều quốc gia Mặc dù vậy, phần lớn các loài này đều rất hiếm gặp trong tự nhiên Phần lớn chúng phân bố

ở các nơi sống hiểm trở không đến được như các vách đá dựng đứng tại các vùng núi hay mỏm đá gần thác nước, hay trong tán của các cây gỗ cao Ngoại trừ rất ít trường hợp, các loài Lan hài là một cấu phần không thể thiếu của rừng nguyên sinh

và chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng và không thể phục hồi được khi các quần xã thực vật tự nhiên bị con người phá hủy Vì lí do đó, có rất ít người

đã từng nhìn thấy các loài thực vật quyến rũ này tại nơi sống tự nhiên của chúng vốn chỉ còn tồn tại ở một vài vùng rừng nguyên thủy còn sót lại

Trong các vùng núi ở Việt Nam, nơi còn sót lại của những mảnh rừng nguyên sinh đa dạng nhất, các loài Lan hài rất phong phú Mặc dù là nhóm rất hiếm, tính đa dạng của Lan hài Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào khác trên thế giới Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là các loài đặc hữu hẹp, là báu vật quốc gia có tầm quan trọng quốc tế

1.2.2.1 Nguồn gốc và quan hệ họ hàng của Lan hài

Lan hài là một nhánh nhỏ nhưng nỗi bật trong quá trình tiến hóa của Lan Họ

Lan (Orchidaceae) thể hiện một trong những dòng chuyên hóa nhất của thực vật có

hoa Có vẻ như tất cả các loài Lan đều bắt nguồn từ tổ tiên kiểu Hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao hoa vòng ngoài gọi là lá đài và ba mảnh bao hoa vòng trong gọi là cánh hoa) và sáu nhị đực (ba nhị đực ở vòng ngoài và ba nhị đực ở vòng trong) Một số xu hướng chuyên hóa về hình thái có thể quan sát được trong sự tiến hóa và hình thành của các nhóm Lan khác nhau

Lan hài đại diện cho một dòng tiến hóa riêng với hai nhị đực còn tồn tại trong hoa với kiểu thích nghi tiến hóa thụ phấn nhờ côn trùng Môi hình túi của Lan hài giữ vai trò như một cái bẫy đối với tác nhân thụ phấn [3]

1.2.2.2 Hình thái của Lan hài

Các loài Lan hài có thể có hình dạng bên ngoài rất đa dạng Ở đây chủ yếu vào các loài Lan hài nhiệt đới Châu Á có phân bố tại Việt Nam, tất cả đều thuộc về

chi Paphiopedilum

a Dạng cây

Các loài Paphiopedilum là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân

bị thu rất ngắn mang nhiều lá mọc thành hai hàng xếp hình quạt Tất cả các loài đều

có thân rễ nhưng thường rất ngắn Tuy nhiên, một số loài như P malipoense và P

micranthum lại hình thành thân rễ kéo dài liên kết rất nhiều gốc với nhau hình thành

một mạng lưới ngầm dưới đất Đối với những loài này một dòng sinh sản vô tính cũng có thể bao phủ tới một vài mét vuông nếu như có điều kiện sống thuận lợi [3]

b Lá

Lá của các loài Paphiopedilum thường có dạng lá dài gấp đôi, hình trứng

ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ

V xếp lợp xít lên nhau trên thân Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây cùng màu, hay khảm bởi các mảng xanh lá cây đậm nhạt không đều nhau với các gân lá màu xanh lá cây thẫm nỗi rõ Mặt dưới lá của hầu hết các loài có các đốm tím dày đặc Ở một số loài khác, các vệt tím xỉn chỉ thấy rõ ở phần gốc lá Rất ít loài có mặt dưới lá màu xanh lá cây Đặc điểm và mật độ của vết khảm màu trên lá rất khác nhau ở mỗi loài

Mép lá non của một số loài, ví dụ ở P malipoense có thể có lông Lá của các loài điển hình cho điều kiện sống khô như P helenae và P dianthum đều dày, mọng

nước và cứng [3]

c Cụm hoa

Cụm hoa của các loài Paphiopedilum thường thẳng đứng hay cong Phần lớn các loài thường chỉ có một hoa riêng lẽ Một số loài như P dianthum có cụm hoa

gồm nhiều hoa, thường từ hai đến năm hoa Một số ít loài khác thường có một hoa

trong cụm hoa, ví dụ P delenatii và P concolor, nhưng lại phát triển thành cụm hoa

với hai hoa trong điều kiện thuận lợi Phần lớn các loài còn lại thường chỉ có một

hoa riêng lẻ Trục cụm hoa của hầu hết các loài đều có lông tơ dày và ngắn

Lá hoa của cụm hoa gập đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loại, từ hình mũi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có

lông ở mép và lông cứng dọc gân ở giữa mặt ngoài lá Lá hoa nhẵn có ở loài P

dianthum [3]

d Hoa

Hoa của các loài Paphiopedilum có hai lá đài ở vòng ngoài: một lá đài lưng

(dorsalsepal) và một lá đài hợp (synsepal) và ba cánh hoa ở vòng trong Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳng lên trên và thường nỗi bật với các vạch hay chấm ở mặt trong Đôi khi nó ôm lấy phía trên môi hình túi tạo thành nắp trên che cho môi khỏi

bị nước mưa chảy vào Đối với các loài khác, nó dựng thẳng và có vai trò như một

lá cờ

Lá đài lưng nằm đối diện với lá đài hợp ở vị trí thấp hơn và hướng xuống phía dưới được hình thành bởi sự dính lại hoàn toàn của hai lá đài bên Nguồn gốc của lá đài hợp được thể hiện rõ bởi nó có hai gân chính và hai sống khum lên theo chiều dọc ở mặt ngoài

Lá đài hợp nằm phía sau của môi thường có một màu tối xỉn và kém nỗi bật hơn hẳn so với lá đài lưng Cả lá đài lưng và lá đài hợp đều thường có lông tơ dày ở mặt ngoài

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xòe xuống dưới theo chiều ngang Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn Cánh hoa ở tất cả các loài đều có lông mềm dài dễ dàng nhận thấy ở mép gần gốc

Cánh hoa giữa thứ ba của hoa ở các loài Paphiopedilum biến dạng rõ rệt để

hình thành một môi giống như cái bao hay hình chiếc hài có vai trò như một cái bẫy đối với các loài côn trùng có khả năng thụ phấn Môi có ba thùy với thùy giữa lõm sâu và các thùy bên vòng xung quanh

Môi của các loài Paphiopedilum có vai trò bẫy các tác nhân thụ phấn và cùng

với mép ngăn chặn côn trùng đã lọt vào trong môi không thể thoát ra ngoài dễ dàng Côn trùng thụ phấn muốn thoát ra ngoài phải đi theo một cái thang bằng lông dẫn từ trong túi đến gốc của môi để có thể leo lên và đi ra ngoài theo một cửa hẹp ở phía bên kia cột nhị - nhụy lần lượt qua bên dưới núm nhụy và một bao phấn

Các nhị đực còn lại và nhị cái của Lan hài hợp lại với nhau thành một cột hình trụ (cột nhị nhụy) ở trung tâm của hoa

Cấu tạo chính của cột nhị-nhụy là một nhị lép hình ô nhô cao ở đỉnh được hình thành từ nhị đực bất thụ giữa của vòng ngoài Mặt dù có sự khác biệt lớn giữa các loài, song hình dáng, màu sắc, lông của nhị lép có ý nghĩa quan trọng trong phân loại của chi

Ở phía sau và bên dưới nhị lép dính với núm nhụy hình trứng hoặc hình tròn

có cuống Đĩa lồi, có núm nhụy nhẵn được chia thành ba phần bởi các rãnh nông phản ảnh nguồn gốc của nhị cái đã được hợp lại từ ba lá noãn

Hai nhị đực có chỉ nhị ngắn có bao phấn hình bầu dục rộng dính liền ở phía sau núm nhụy và ở hai bên của cuống cột Chúng chính là các nhị đực bên của vòng trong Chỉ nhị của hầu hết các loài đều mở rộng thành một điểm nhô cao ở đỉnh Các ô của bao phấn thường nằm sát nhau nhưng đôi khi lại tách rời nhau

Bầu ở tất cả các loài của Việt Nam đều có lông tơ trừ Paphiopedilum

dianthum nhẵn Hầu hết các loài bầu đều ít nhiều hình trụ trừ Paphiopedilum villosum có mặt cắt ngang hình tam giác Bầu phổ biến nhất có màu xanh lá cây hay

màu đỏ tía xỉn [3]

e Quả

Quả của Lan hài là dạng quả nang khô, dài, có một ô với ba van rộng và ba van hẹp Quả mở ở gần đỉnh bằng sáu rãnh nứt Quả thường chín trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ sáu đến mười tháng

1.2.2.3 Vòng đời

Hạt của các loài Paphiopedilum có hình dạng rất khác nhau, từ bầu dục đến

dạng thuôn dài hay hẹp và thường có chiều dài 0,4-1,1mm Phôi nhỏ, dài 0,3-0,4mm được bao bởi vỏ hạt chất giấy phát triển từ vỏ trong và ngoài của noãn Hạt chín rất nhẹ và dễ dàng phát tán nhờ gió Hạt của Lan không có nội nhũ, và như vậy nó dinh dưỡng phụ thuộc vào quan hệ cộng sinh chặt chẽ với một loài nấm rễ

Hạt chín trong vòng từ sáu đến mười tháng sau khi được thụ phấn và phát tán qua khe mở của nang chín đã chuyển thành màu nâu và khô đi Sự nẩy mầm xảy ra trên đất, trên đá hay trên cây, ở chỗ tối ngay sau khi phát tán và khi cuống của phôi được nhiễm một loại nấm rễ phù hợp Mầm rễ phát triển ra các rễ giả dài cũng bị nhiễm các sợi nấm của rễ Một rễ thật nhanh chóng mọc ra từ phía sau của đỉnh chồi Tiếp theo là mầm rễ mọc dài ra và sinh ra rễ con Lá đầu tiên có thể xuất hiện vài tháng sau khi hạt nẩy mầm Rễ đầu tiên có ít xylem nhưng có rất nhiều floem được bao phủ bởi các rễ giả và đã nhiễm nấm ngay khi mới hình thành Trong giai đoạn này, vỏ rễ bị nhiễm các búi nấm dày đặc Tuy nhiên, các rễ càng xuất hiện muộn hơn càng ít nhiễm nấm, và đến tháng thứ năm thì rễ trở thành rễ đặc trưng dạng sợi mảnh với hệ floem phát triển mạnh và không có các búi nấm Ở cây trưởng thành, chồi mang lá và cụm hoa sẽ nở hoa trong năm tới đã phát triển trong mùa sinh trưởng trước đó Sự sinh trưởng mới bắt đầu phát triển thường xảy ra trước khi kết thúc nở hoa Phần lớn các Lan hài Việt Nam ra hoa trong điều kiện tự nhiên vào mùa xuân hay đầu mùa hè Tất cả các loài Lan hài của Việt Nam, ngoại trừ

Paphiopedilum delenatii nở hoa vào mùa khô Hoa tồn tại trong thời gian từ bốn

đến tám tuần Sự thay đổi thời gian nở hoa xảy ra với hầu hết các loài đã được đưa vào trồng trong điều kiện nhân tạo [3]

Các loài Lan hài có thể sống trong rất nhiều năm, sự sinh trưởng trục hợp mới xảy ra hàng năm Phần thân rễ cũ với các gốc của chồi thẳng đứng cũ lần lượt thối đi Tuy nhiên, đối với các loài sống trong điều kiện khô, phần thân rễ chết có

thể tồn tại trong thời gian dài Trong những trường hợp như vậy, số lượng các gốc chồi chết (nhưng không thối rửa) sẽ tương đương với số tuổi tối thiểu của mỗi cây

Tuổi tối thiểu của các cây trưởng thành của Paphiopedilum helenae trong quần thể

hoang dại ít nhất là 30-40 năm Trong tự nhiên, tuổi thật của các cây được nghiên cứu chắc chắn cao hơn Các Lan hài do các nhà nuôi trồng ở Châu Âu lai tạo trong

ba thập kỷ cuối của thế kỷ XIX hiện vẫn còn phát triển mạnh sau hơn một thế kỷ nuôi trồng [3]

1.2.2.4 Sinh thái

Các Lan hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm riêng Các loài của nhóm

thứ nhất chỉ phân bố ở các vùng núi đá vôi Bắc Việt Nam Paphiopedilum

aspersum, P concolor, P dianthum, P helenae, P malipoense, P micranthum, P purpuratum, P tranlienianum và P vietnamense là các loài mọc trên đá vôi bắt

buộc Chúng gặp các vùng núi đá vôi bị bào mòn mạnh phân bố rộng Các sườn đá khuất nắng và các vết nứt sâu trên vách đá và các bờ đá vôi rắn dạng cẩm thạch hay các mỏm đá là nơi sống điển hình nhất cho các loài này

Các loài thuộc nhóm Lan hài thứ hai phân bố ở các vùng núi được tạo thành chủ yếu từ đá axit Kiểu núi này có ở khắp nơi tại Việt Nam, tuy nhiên phổ biến hơn

ở miền Trung và miền Nam

Cũng như bất cứ nơi nào khác trên thế giới,các loài Lan ở Việt Nam mọc trên đất, trên đá và phụ sinh Có một số loài đôi khi cũng thay đổi nơi sống ưa thích, nhưng cách mọc chính vẫn là đặc trưng riêng của loài Khoảng 22% các loài Lan của Việt Nam mọc trên đất, 8% mọc trên đá, 70% còn lại là Lan phụ sinh Trong số các loài Lan phụ sinh có khoảng 15% là các loài phụ sinh trên mùn, sống ở chạc cành già trên các cây gỗ lớn tích nhiều mùn và lá cây chết Khoảng 50% các loài phụ sinh sống bám trên thân và các cành cây, khoảng 5% sống trên các cành nhỏ, cành mang lá hay thậm chí trên lá cây trong tán của các cây gỗ lớn Các loài Lan hài của Việt Nam có thể sống trên đất, bám đá và phụ sinh mùn [2], [3]

Các loài Lan hài sống trên đất thường có khảm những ô hay mảng màu rõ rệt Chúng thường mọc ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, chủ yếu ở sườn núi dốc, trong điều kiện thoát nước tốt Chúng thường ưa thích các nền đất có nhiều lá rơi đã

bị phân hủy mạnh và rất giàu mùn, đôi khi chúng cũng mọc trên đá Hầu hết các

Lan hài của Việt Nam là các loài mọc trên đá Chúng thường mọc dưới bóng cây của kiểu rừng ít nhiều không khép tán, chủ yếu trên các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh

Tại các vùng ở Việt Nam nơi có Lan hài phân bố, lượng mưa lớn kéo theo độ

ẩm cao Tuy nhiên, mưa thường thay đổi theo mùa và như vậy, thực vật ở các vùng này thường phải trải qua giai đoạn khô hạn

Sự xuất hiện lá dày, dai và mọng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót qua các đợt khô hạn định kỳ và chúng sẽ phục hồi nhanh chóng khi mùa mưa trở lại

Các sườn bắc, Đông bắc và Tây bắc của núi chắc chắn là nơi sống ưa thích của các Lan hài trong các vùng rừng đã xuống cấp Tuy nhiên, trong rừng nguyên sinh chúng phân bố đều nhau ở các hướng sườn Nhưng dù sao thì Lan hài thường

có điều kiện tốt nhất và nở hoa tốt hơn ở các sườn Nam ấm và nhiều ánh sáng hơn Thường thì Lan hài ngày nay mọc thành những đám nhỏ Tuy nhiên, trước đây những đám lớn với hàng ngàn chồi nở hoa chắc chắn không phải là hiếm

Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn phù hợp và cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong việc hình

thành và diễn thế của các quần thể Paphiopedilum Các nơi sống tự nhiên bị phá

hủy bởi con người, sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái Lan để bán

là nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của các loài Lan hài trên khắp cả nước ta [3]

1.2.2.5 Phân bố địa lý

Khu phân bố của Paphiopedilum kéo dài từ vùng nhiệt đới ở chân núi

Himalaya chạy ngang sang phía Đông qua Trung Quốc đến Philippin, xuống Đông nam đến hầu khắp vùng Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai, New Guinea và quần đảo Solomon

Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ lục địa Đông Nam Á Sự mở rộng

khu phân bố của nó về phía Nam và phía Đông đến vùng Malaixia và Tây nam Thái Bình Dương là do kết quả di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân bố tổ tròn thành nhiều loài đặc hữu địa phương, và thường có khu phân bố xa nhau

Hầu hết các loài Paphiopedilum đều thuộc vào một trong số các tổ của dưới chi Paphiopedilum có khu phân bố gần như trùng với khu phân bố của chi nói

chung Mỗi tổ đều có một khu phân bố riêng nhưng hẹp hơn

Vùng tập trung nhiều nhất của chi Paphiopedilum là ở Nam Trung Quốc (Vân

Nam, Quảng Tây) và Bắc Việt Nam với 18-20 loài đã được phát hiện Các trung tâm đa dạng khác ở Bắc Sumatra và Bắc Borneo, mỗi nơi có chín loài Tuy không phong phú bằng các vùng kể trên nhưng các vùng đa dạng của chi Lan hài cũng được phát hiện tại vùng chân núi Hymalaya, Bắc Myanma và Thái Lan, trung tâm của bán đảo Mã Lai và Philippin Trong mỗi vùng này đều gặp từ bốn đến sáu loài Lan hài

Tính đặc hữu hẹp là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi Paphiopedilum

Có đến 72% số loài đã biết là đặc hữu hẹp với khu phân bố rất hạn chế như P

delenatii, P hehenae, P vietnamense, P hangianum, P henryanum Rất nhiều

trong số này mới được phát hiện tại một hoặc vài địa điểm [3]

1.2.2.6 Hiện trạng cây Lan hài Việt Nam

Lan hài là một loài cây không những có giá trị thẩm mĩ, giá trị khoa học mà còn có giá trị kinh tế rất cao Hoa Lan hài có một nét đẹp kiêu sa, quyến rũ và mềm mại, mang dáng vẻ sang trọng và huyền bí Chính vì vậy, những người chơi hoa sẵn sàng mua các loài Lan hài với giá cao Không những thế, Lan hài Việt Nam rất được ưa chuộng trên thị trường thế giới Điều này đã làm cho việc thu thập khai thác mẫu Lan hài diễn ra ồ ạt, dẫn đến việc các loài này ngày càng hiếm ngoài tự nhiên

Không có nơi nào trên thế giới mà sự đa dạng của các loài Lan hài cao hơn ở Việt Nam Tuy nhiên, Lan hài Việt Nam đang bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng

hơn bất cứ loài cây nào khác trong hệ thực vật hoang dại Tất cả các Paphiopedilum

ở Việt Nam đang bị biến mất một cách nhanh chóng Dựa trên những nghiên cứu thực địa gần đây, tình trạng bảo tồn các Lan hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ hạng về mức độ đe dọa tuyệt chủng của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) đã được tổng kết ở Bảng 1.1 [3]

Bảng 1.1 Các nhóm Lan hài Việt Nam xếp theo thứ hạng bảo tồn của IUCN

Tình trạng bảo tồn Loài

Đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên P vietnamense

Đang bị tuyệt chủng trầm trọng P delenatii

P callosum; P dianthum; P emersonii; P

gratrixianum; P hangianum; P helenae; P

henryanum; P herrmannii; P malipoense var Jackii; P malipoense var malipoense; P

micranthum; P purpuratum; P tranlienianum

hirsutissimum var Chiwuanum; P

hirsutissimum var Esquirolei; P villosum var Annamense

Qua đó ta thấy rằng Paphiopedilum đang bị tuyệt chủng trầm trọng và rất có

thể sẽ bị tuyệt chủng trong tương lai rất gần nếu không có biện pháp kịp thời về công tác bảo tồn Đa số các Lan hài của Việt Nam nằm ở mức độ đang bị tuyệt chủng

Một số ít Lan hài hiện vẫn còn khá phổ biến ở Việt Nam nhưng đều đang trở nên hiếm một cách nhanh chóng Đôi khi không thể đánh giá được tình trạng bảo tồn ngoài thiên nhiên của một vài Lan hài do không có đủ các dẫn liệu đáng tin cậy Mức độ đe dọa tuyệt chủng đối với tất cả các Lan hài của Việt Nam đã bị thay đổi nhiều trong thời gian gần đây do sự suy giảm nhanh chóng các quần thể đã biết Rất

có thể đa số các Lan hài hoang dại của Việt Nam sẽ bị tuyệt chủng hoàn toàn trong tương lai rất gần

Hình 1.3 Nữ hài hiệp – Loài Lan hài đã bị tuyệt chủng

Việc thay đổi môi trường sống do con người gây nên và việc thu mua với số lượng lớn để buôn bán hiện nay là nguyên nhân chính làm suy giảm nhanh chóng các Lan hài của Việt Nam

Kinh tế phát triển, dân số tăng nhanh cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm do hoạt động khai phá rừng làm giảm đi nơi sống tự nhiên của Lan hài Các loài Lan hài cũng như đa số các loài Lan khác rất nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường Chúng là nhóm thực vật bị đe dọa tuyệt chủng đặc biệt và sẽ bị biến mất trước tiên sau khi nơi sống tự nhiên của chúng bị suy thoái

Nếu không có biện pháp bảo vệ có hiệu quả và khẩn cấp thì những khu rừng nguyên sinh của Việt Nam sẽ đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng trong tương lai Điều này kéo theo sự tuyệt chủng số lượng lớn các loài hiếm và đặc hữu của Việt Nam, trong đó có Lan hài

Nguyên nhân thứ hai dẫn đến sự tuyệt chủng của các loài Paphiopedilum ở

Việt Nam trong những năm gần đây là việc thu hái trên qui mô lớn của dân địa phương để bán cho những người buôn Lan Việc thu mẫu các loài

Paphiopedilum nhằm mục đích thương mại diễn ra với qui mô lớn trên khắp cả

nước để xuất khẩu bất hợp pháp ra nước ngoài, chủ yếu là Hồng Kông, Đài Loan, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu Một lượng lớn các Lan hài quí hiếm của Việt Nam đã được nhiều nước nhập khẩu trong thời gian gần đây Điều này đã trực tiếp thúc đẩy tốc độ thu thập Lan hài dẫn đến sự tuyệt chủng của nhiều quần thể Lan hài của Việt Nam đang diễn ra một cách nhanh chóng

Hiện nay, vấn đề về công tác bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên quí giá này của Việt Nam đang được đặt ra rất cấp bách với nhiều chương trình quốc gia về bảo

vệ rừng nguyên sinh, thành lập các khu bảo tồn, Hy vọng rằng với sự cố gắng của chính quyền cùng với ý thức của mỗi người dân Việt Nam, các loài Lan hài quí hiếm đặc hữu của Việt Nam sẽ được bảo tồn, để nó trở thành một nét đặc sắc của quốc gia

1.2.3 Giới thiệu một vài loài Lan hài đặc hữu của Việt Nam

1.2.3.1 Paphiopedilum vietnamense

Hình 1.4 Hoa Paphiopedilum vietnamense

Paphiopedilum vietnamense là một trong những loài Lan hài đẹp kỳ lạ nhất

với lá có đốm khảm và hoa to, màu tím hay đỏ hồng Loài này có mối quan hệ rất

gần gũi với Paphiopedilum delenatii sống trong một khu vực núi rất hẹp của Nam

Việt Nam

Paphiopedilum vietnamense có lẽ là loài có phạm vi phân bố hẹp nhất trong

số các loài Lan đặc hữu của Việt Nam

P vietnamense phân bố ở Bắc Việt Nam (tỉnh Thái Nguyên) trong rừng

nguyên sinh rậm, ẩm, cây lá rộng trên núi đá vôi kết tinh bị bào mòn, cao từ 350 đến 500m

P vietnamense mọc trên đá, đôi khi mọc trên đất, lá từ hình trứng tới hình bầu

dục thuôn có đốm khảm xanh lá cây thẫm và xanh xám bóng, có đốm tím và gờ lồi sắc ở mặt dưới Lá nhẵn hoặc có lông rìa trắng thưa ở gốc Cụm hoa dựng đứng, cuống hoa dài 15-25cm, màu tím tía hoặc nâu tía Lá hoa hình trứng rộng, nhọn, gập đôi, màu xanh lá cây nhạt có đốm tím rất đẹp Hoa rất to, rộng từ 10-12cm, cao từ 8-9cm, lá đài trắng hoặc hồng có đốm hồng tía ở chóp Cánh hoa trắng, hồng hoặc tía thẫm Môi trắng, hồng hoặc tía với một vết tím thẫm ở phía trước, đặc biệt là ở

quanh mép Môi gần giống mỏ vẹt, hình lọ sâu, gần tròn, loe ra ở gốc với mép đỉnh cong vào trong và có rãnh dọc theo gân [3]

Theo cuộc điều tra của Averyanov và Phan Kế Lộc vào năm 2001 ở các tỉnh

phía Bắc Việt Nam thì P vietnamense được tìm thấy với số lượng vô cùng ít ở một

khu vực rất nhỏ hẹp trên các dãy núi đá vôi thấp thuộc trung tâm tỉnh Thái Nguyên Khu phân bố nguyên sinh của chúng không vượt quá 60-80km2 Đây là một ví dụ rất hay về tính đặc hữu hẹp của một vài loài của hệ thực vật Việt Nam

Một lượng lớn P vietnamense được xuất khẩu là một bằng chứng rõ ràng cho

thấy loài đặc hữu vô cùng hiếm này của Việt Nam đang đứng trên bờ vực của sự tuyệt chủng ngoài thiên nhiên do việc thu mẫu ồ ạt nhằm mục đích thương mại

Theo đánh giá của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) thì

Paphiopedilum vietnamense đã bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên Đây quả là một

điều đáng tiếc đối với một loài Lan hài đặc biệt của Việt Nam

1.2.3.2 Paphiopedilum helenae

Hình 1.5 Hoa Paphiopedilum helenae

P helenae là một trong những loài Lan hài đẹp nhất được phát hiện trong thời

gian gần đây Loài Lan nhỏ xíu này chắc chắn là nhỏ nhất thuộc chi Lan hài Những cây đang ra hoa ngoài tự nhiên thường có lá chỉ dài 4-5cm với hoa rộng 4-6cm Sự kết hợp giữa thân cây nhỏ xíu với hoa to đã tạo ra một vẻ đẹp của loài và rất được

ưa chuộng trong nghề trồng cây cảnh để tạo ra các dạng hoa nhỏ xíu

P helenae là một loài đặc hữu địa phương với khu phân bố rất hẹp, và là một

trong những loài Lan hài hiếm nhất ở Việt Nam, chỉ gặp ở khu vực núi đá vôi Đông

bắc Việt nam (các tỉnh Bắc Cạn và Cao Bằng), trong các rừng nguyên sinh khô hỗn giao và rừng cây lá kim, thưa, nhiều rêu

P helenae được mô tả là cây rất nhỏ mọc thành cụm trên đá, lá hơi mọng

nước hình mũi giáo có màu xanh với mép trắng vàng nhạt, có vài đốm tím tía bên dưới và có 3 răng ở đỉnh tù Cụm hoa hình vòng cung, một hoa, cuống cụm hoa mảnh, phủ lông tía đen ngắn và dày đặc Hoa to so với kích thước của cây, phủ lông

ở mặt ngoài lá đài, lá đài lưng vàng tươi sáng, lá đài hợp trắng, cánh hoa màu cam hoặc vàng son cho tới vàng nhạt với gân vàng nâu thẫm hơn Môi màu cam-nâu sáng cho tới hồng-vàng nhạt hoặc hồng nhạt Môi dạng túi sâu, không nhọn lắm ở phần đỉnh, nhẵn ở mặt ngoài, thùy bên cong lại, không có hạt lồi Cánh hoa thẳng hoặc hơi cong vào, hình lưỡi tới gần hình thìa, tù hoặc cụt ở đỉnh, có lông ở rìa mép

và lông tơ ở gần gốc [3]

Theo đánh giá của Tổ chức bảo tồn thiên nhiên Quốc tế (IUCN) thì P

helenae đang bị tuyệt chủng

Chính vì vậy mà Việt Nam cần có các biện pháp kịp thời để bảo vệ loài Lan hài vô cùng hiếm và đặc hữu của Việt Nam này

1.2.3.3 Paphiopedilum villosum

Hình 1.6 Hoa Paphiopedilum villosum

P villosum là một loài phân bố rộng và biến đổi với hoa to quyến rũ Chúng

phân bố ở cả Bắc và Nam Việt Nam (Lai Châu, Lào Cai, Lâm Đồng, Kon Tum,

Khánh Hòa,…) trong rừng nguyên sinh hỗn giao, rậm, ấm, thường xanh và rừng mây mù, cây lá rộng trên núi ở độ cao 1300-2000m

Đây là loài sống phụ sinh, cuống hoa thường ngắn, lá hoa và hoa to, hoa có màu sắc dễ nhận thấy và các cánh hoa hình thìa rộng, lá đài lưng hình trứng ngược, bầu phủ lông, có mặt cắt hình tam giác và môi dài [3]

Loại Lan nổi tiếng này hiện được trồng rộng rãi ở nhiều nơi P villosum là

một trong những loài Lan hài được các nhà thực vật học người Pháp phát hiện sớm nhất ở Việt nam vào đầu thế kỷ trước Trước đây loài Lan này rất phổ biến ở Đà Lạt, nhất là trên núi Lang Biang Tuy nhiên, hiện nay loài Lan hài này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng do việc khai thác quá mức cho mục đích thương mại

1.2.3.4 Paphiopedilum hangianum (Lan hài hằng)

Hình 1.7 Hoa Paphiopedilum hangianum

P hangianum là một loài đặc hữu Việt Nam có khu phân bố rất hẹp, chủ

yếu là ở Bắc Việt Nam trong khu vực tỉnh Tuyên Quang, liền kề với ranh giới Nam của các tỉnh Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Cạn Khu phân bố của loài Lan này không vượt quá 20-25km2

P hangianum mọc trên đá, lá hình lưỡi, mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh

nhạt Cụm hoa thẳng đứng có một hoa Hoa thơm ngọt thoang thoảng, rất to so với kích cỡ của cây, hoa gần hình chuông hoặc xòe rộng, cánh hoa vàng nhạt hoặc xanh-vàng nhạt với đốm tím ở gốc Môi trắng vàng, có đốm tím thẫm ở mặt trong Môi gần giống mỏ vẹt, dạng lọ sâu, loe ra ở gốc, có mép đỉnh cong lại và có rãnh dọc theo gân, bề mặt nâu thẫm [3]