THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Xạ đen; tạo lá cây Bắt ruồi; gieo hạt và tạo rễ Bông cải xanh. Kết quả thu được, đối với cây Dứa, môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mgL; đối với cây Xạ đen, môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,6 mgL và không sử dụng inositol; đối với cây Bắt ruồi, môi trường thích hợp cho việc tạo chồi là môi trường 13MS bổ sung 1mgL Kinetin; đối với Bông cải xanh môi trường gieo hạt là môi trường MS không bổ sung chất

THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

Nguyễn Thị Huế Thi*, Hồ Kim Ngân, Phùng Thị Trâm, Nguyễn Thị Minh Thương, Võ Thanh Phúc

Trường Đại Học Bách Khoa- ĐHQG TPHCM

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro trên các đối tượng Xạ đen (Ehrretia asperula), Dứa (Ananas comosus), Cây Bắt ruồi (Dionaea muscipula), Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica) Tạo chồi

Dứa, cây Xạ đen; tạo lá cây Bắt ruồi; gieo hạt và tạo rễ Bông cải xanh Kết quả thu được, đối với cây Dứa, môi trường thích hợp để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/L; đối với cây Xạ đen, môi trường thích hợp

để nhân chồi là môi trường MS có bổ sung BA 0,6 mg/L và không sử dụng inositol; đối với cây Bắt ruồi, môi trường thích hợp cho việc tạo chồi là môi trường 1/3MS bổ sung 1mg/L Kinetin; đối với Bông cải xanh môi trường gieo hạt là môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, môi trường tạo rễ là môi trường MS bổ sung

1,6 mg/L IBA

Từ khóa: Ehrretia asperula, Ananas comosus, Dionaea muscipula, Brassica oleracea var.italica,

Chữ viết tắt: BA – 6-benzyladenine; IBA – indole-3-butyric acid; MS – Murashige và Skoog (1962)

MỞ ĐẦU

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là những thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi

cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng Đây được coi là phương pháp ưu việc nhất hiện nay,được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tác giống cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy

mô, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một lượng sinh khối lớn, có hệ số nhân giống cao Đặc biệt nếu nguồn nguyên liệu nuôi cấy sạch bệnh thì sản phẩm nhân giống sẽ hoàn toàn sạch bệnh

https://tailieu.vn/doc/ch-ong-ii-cong-nghe-nuoi-cay-mo-va-te-bao-thuc-vat-nhan-giong-in-vitro-573760.html https://tailieu.vn/doc/bai-6-ung-dung-cong-nghe-nuoi-cay-mo-te-bao-1563206.html

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã làm thí nghiệm trên các đối tượng: Xạ đen (Ehrretia asperula), Dứa (Ananas comosus), cây Bắt ruồi (Dionaea muscipula), Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica).

Cây dứa (Ananas comosus): việc nghiên cứu nhân giống in vitro nhằm tạo ra nguồn cây con với số lượng lớn đồng

nhất về mặt di truyền, không nhiễm bệnh Đồng thời, tạo được nguồn giống dứa kiểng đáp ứng cho nhu cầu chơi cây kiểng hiện nay

http://www.vjol.info/index.php/sphcm/article/viewFile/17508/15536

Cây Xạ đen (Ehrretia asperula): đây là loại dược liệu có tác dụng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị một số loại bệnh

Xạ đen giúp cơ thể thanh nhiệt và giải độc, hỗ trợ điều trị các bệnh viêm nhiễm, tiểu đường, máu nhiễm mỡ, dùng trong giảm đau, tăng sức đề kháng của cơ thể Trong các nghiên cứu gần đây, người ta đã phát hiện được trong cây

xạ đen có hoạt chất Fanavolnoid, Quinon có tác dụng phòng chống ung thư và làm tế bào ung thư hóa lỏng dễ tiêu

Xạ đen có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư vòm họng, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư thực tràng và nhiều căn bệnh ung thư khác Vì vậy, nhu cầu Xạ đen ở nước ta trong những năm qua là rất lớn , dẫn đến nguy cơ cạn kiệt ngoài tự nhiên Việc tạo nguồn giống lớn, chất lượng cao phục vụ cho việc trồng Xạ

%C5%A9%20Quang%20Nam.pdf?fbclid=IwAR3Dx93o05W4tX6WFmmwgnQASuPJwF-f6Z8PQBGBTs8QkqKDEptvsmE7kRc

http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/nghien-cuu-ky-thuat-nhan-giong-in-vitro-cay-xa-den-ehretia-asperula-zoll-mor-13525.html

http://soha.vn/xa-den-co-chua-khoi-ung-thu-khong-dung-nghe-don-thoi-hay-nghe-chuyen-gia-dong-y-ly-giai-2018081523511221.htm

Cây Bắt ruồi (Dionaea muscipula ): cây ăn thịt lâu năm là chi đơn loài thuộc họ Droseracea Hầu hết các cây ăn thịt

phát triển trên toàn thế giới nhưng cây bắt ruồi Venus trong tự nhiên chỉ phát triển trong vùng giới hạn ở bờ biển phía Đông USA (Slack, 1981) Cây bắt ruồi Venus được dùng trong nhiều năm như nguồn điều chế thuốc chống ung thư và nhiều hợp chất thứ cấp được dùng như thuốc miễn dịch, chống co giật, chống nắng, phá thai và chất ức chế synthetase chitin (Finnie và Staden, 1993; Pakulski và Budzianowski, 1996) Do các đặc tính bẫy côn trùng, có ứng dụng trang trí và tiềm năng cho mục đích dược phẩm, nhu cầu trồng loài cây này luôn gia tăng Kỹ thuật nuôi cấy

mô thực vật đóng vai trò quan trọng trong bảo tồn và vi nhân giống giống cây có nguy cơ tuyệt chủng hay trên bờ tuyệt chủng

https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/vi-nhan-giong-cay-bay-ruoi-venus-bang-nuoi-cay-cho.aspx?

fbclid=IwAR3WSL1u3pqIBl8BdbQa07tLehEKXhtzjzQSiBRD2Ha7dxpVsRiy8BkEaig

https://www.sbc-vietnam.com/san-pham/hoa-chat-dung-cu-nuoi-cay-mo-thuc-vat/vi-nhan-giong-cay-bay-ruoi-venus-bang-nuoi-cay-cho.aspx

Bông cải xanh ( Brassica oleracea var.italica): bông cải xanh là một loại rau Các bộ phận mọc trên mặt đất được sử

dụng để làm thuốc Bông cải xanh được sử dụng để ngăn ngừa ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư bàng quang và ung thư dạ dày Một số người cũng sử dụng nó để thúc đẩy hiệu quả của hệ miễn dịch Vì vậy việc nhân giống bông cải xanh để tạo ra nguồn rau sạch, cung cấp các chất dinh dưỡng và chữa bệnh cho con người ngày càng được chú ý

https://vi.thehealthylifestyleexpo.com/broccoli-23898

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Các mẫu thực vật Xạ đen, Dứa, cây Bắt ruồi, Bông cải xanh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ sinh

học- Đại học Bách Khoa- Đại học quốc gia Tp.HCM Hạt giống rau mầm bông cải xanh ở thí nghiệm 9 được cung cấp bởi công ty TNHH-TM Trang Nông

Chồi của cây bông cải xanh 7 ngày tuổi được sử dụng để tạo rễ bất định

Phương pháp

Môi trường nuôi cấy: là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung thêm sucrose 30g, agar 6g, chất điều hòa sinh trưởng theo các nghiệm thức thí nghiệm, pH của môi trường được điều chỉnh về 5,8±0,1 trừ môi trường cây bắt ruồi pH là 5,5±0,1 trước khi đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC và áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm được thực hiện ở phòng thí nghiệm Sinh Học, cơ sở Lý Thường Kiệt; quang kỳ

12 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2500±500 lux, nhiệt độ 27±3ºC, độ ẩm 75±10%

Bố trí thí nghiệm :

TN1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA lên sự sinh trưởng và khả năng nhân chồi của giống Dứa

Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức là môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

BA nồng độ 0,5mg/L và inositol Theo dõi các chỉ tiêu sau 3 tuần nuôi cấy: Chiều cao chồi (cm), số chồi (chồi/mẫu),

tỉ lệ mẫu tạo chồi (%), đặc điểm chồi (đánh giá cảm quan)

TN2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của BA lên sự sinh trưởng và khả năng nhân chồi của cây Xạ đen

Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức là môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng

BA nồng độ 0,2-1 mg/L và không sử dụng inositol Theo dõi các chỉ tiêu sau 3 tuần nuôi cấy: Chiều cao chồi (cm),

số chồi (chồi/mẫu), tỉ lệ tạo chồi (%), số lượng lá/mẫu cấy, đặc điểm chồi (đánh giá cảm quan)

TN3: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Kinetin đến sự sinh trưởng và khả năng tạo chồi của cây Bắt ruồi

Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức là môi trường 1/3MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Kinetin nồng độ 0-2 mg/L và inositol Theo dõi các chỉ tiêu sau 2 tuần nuôi cấy: tỷ lệ tạo lá (%), số lá mới/ mẫu cấy, đặc điểm lá (đánh giá cảm quan)

TN4: Gieo hạt bông cải xanh

Ở ngoài phòng cấy, hạt Bông cải xanh sẽ được lắc trong xà phòng khoảng 30 giây Sau đó, rửa sạch dưới vòi nước Khi vào tủ cấy, hạt Bông cải xanh được chuyển sang chai vô trùng Tiếp đó hạt sẽ được lắc với nước javel 7% + 2 giọt tween 20 trong 7 phút để làm giảm sức căng bề mặt Rửa sạch hạt với nước cất vô trùng và lặp lại quá trình này

4 lần Sau đó tiến hành cấy hạt trong môi trường MS cơ bản Sau 1 tuần sẽ lấy mầm cây thu được đem đi tạo rễ bất định

TN5: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA đến sự sinh trưởng và khả năng tại rễ của Bông cải xanh

Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức là môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IBA nồng độ 1,6 mg/L và inositol Theo dõi các chỉ tiêu sau 2 tuần nuôi cấy: số rễ (rễ/mẫu), chiều dài rễ (cm), tỉ lệ mẫu ra rễ (%), đặc điểm rễ (đánh giá cảm quan)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi Dứa

chồi(cm)

Màu sắc

lá màu xanh đậm

(5,0cm): lá màu xanh đậm

(5,5cm): lá màu xanh đậm

Bảng 1: Ảnh hưởng của BA đến sự tạo chồi Dứa sau 3 tuần nuôi cấy

Thí nghiệm sử dụng BA nồng độ 0,5 mg/L để kích thích quá trình hình thành chồi của giống Dứa ( bảng 1)

Sau 3 tuần nuôi cấy, các mẫu cấy đều tạo chồi Tuy nhiên chỉ có sự hình thành chồi ngọn mà không tạo chồi bất định

ở mẫu cấy Kết quả thu được có sự sai lệch do quá trình hủy đỉnh không thành công trong bước thao tác Môi trường

MS bổ sung 0,5 mg/L BA tốt nhất cho việc nhân nhanh chồi (tỷ lệ hình thành chồi 100%)(bảng 1)

Như đã biết Cytokinin đóng vai trò chính trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô, đồng thời nó còn kích thích chồi nách, phân chia tế bào, ức chế sự lão hóa lá, thành lập mô sẹo và tăng trưởng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Ngoài ra, với sự hiện diện của cytokinin còn gỡ bỏ hiện tượng ưu thế ngọn và có thể phối hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin

Theo Bùi Trang Việt (2002) [1], tỉ lệ auxin/cytokinin cao giúp sự tạo rễ, còn auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi

Do đó, hầu hết ở thí nghiệm của chúng tôi đều sử dụng tỉ lệ auxin/cytokinin thấp nên sự tái sinh chồi dễ dàng Theo kết quả nghiên cứu của Amin (2005) [7], sự tái sinh chồi từ mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1,0mg/l và NAA 0,1mg/l cho tỉ lệ tái sinh chồi là 100%, với số lượng chồi và chiều cao chồi tương ứng là 18,5 chồi/mẫu và 5,28cm (Alvard, 1993) [6] Trong khi ở thí nghiệm này, tỉ lệ mẫu tạo chồi cao nhất là 100%, nhưng số chồi và chiều cao chồi chỉ đạt 3,8 chồi/mẫu và 1,02 cm Có sự khác biệt này có thể do nguồn vật liệu cấy ban đầu của thí nghiệm khác nhau nên thu được kết quả khác nhau

1a 1b 1c

Hình 1: 1a-1b-1c mẫu cấy cây Dứa sau 3 tuần nuôi cấy http://www1.vnua.edu.vn/tapchi/Upload/30102014-tc%20so%207(8).pdf

Ảnh hưởng của BA đến sự hình thành chồi của mẫu cấy Xạ đen

Ở các nghiệm thức của môi trường nuôi cấy đều có khả năng tạo cụm chồi và khả năng tạo chồi ở cả 3 mẫu đều là 100% Tuy nhiên, khi bổ sung BA với các nồng độ khác nhau sẽ cho khả năng tạo chồi là khác nhau ( bảng 2)

Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu cấy

tạo chồi (%)

Số chồi/mẫu cấy

Chiều cao chồi (cm)

lá/mẫu cấy

Bảng 2: Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy cây xạ đen trên môi trường MS bổ sung 0,6 mg/L BA

Thí nghiệm sử dụng BA để kích thích quá trình phát sinh chồi của Xạ đen và sau 3 tuần nuôi cấy kết quả thu được ở (bảng 3)

BA (mg/L) Tỉ lệ tạo chồi(%) Số chồi/mẫu cấy Hình thái ( màu sắc )

Bảng 3: Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy cây xạ đen trên môi trường MS có bổ sung 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/L BA

Nghiệm thức bổ sung BA 0,6mg/L cho tỉ lệ tái sinh chồi là 89%, số lượng chồi cao nhất là 2,4 chồi/mẫu Trong đó, các nghiệm thức còn lại đều có tỉ lệ tạo chồi là 100%, nhưng số chồi cao nhất là 2,25 chồi/ mẫu ở BA 0,4mg/L và thấp nhất 1,93 chồi/ mẫu ở BA 1mg/L Khi nồng độ BA tăng thì khả năng tạo chồi và nhân nhanh sẽ gia tăng nhưng nếu nồng độ BA cao cũng hạn chế sự hình thành và nhân nhanh chồi, nồng độ tối ưu cho việc nhân nhanh chồi với cây Xạ đen là 0,6 mg/L BA Tuy nhiên tỷ lệ tạo chồi ở mẫu cấy Xạ đen bổ sung 0,6mg/L là thấp nhất có thể do nguồn vật liệu đầu và thao tác cấy dẫn đến kết quả trên

2a 2b 2c 2d

Hình 2: 2a-2b-2c-2d mẫu cấy cây Xạ đen sau 3 tuần nuôi cấy Tạo mầm bông cải xanh

hạt nảy mầm (%)

hạt nhiễm (%)

hạt không nhiễm, không nảy mầm (%)

Chiều cao (cm)

Màu sắc

Tạo rễ bất định bông cải xanh

Sau 1 tuần nuôi cấy tạo rễ bất định, ta thu được kết quả:

Tỉ lệ thân ra rễ

(%)

Theo kết quả thu được của Amin và cộng sự (2005) [7], chồi dứa in vitro được cảm ứng tạo rễ trên môi trường ½

MS với các nồng độ khác nhau giữa các chất NAA, IBA hoặc IAA Rễ hình thành tốt trên môi trường MS có bổ sung 0,2mg/l IBA và 0,2mg/l NAA (Alvard, 1993) [6] Cũng tương tự như kết quả của (Atique, 2003) [8], khi chuyển chồi dứa in vitro vào nuôi cấy trong môi trường rắn có bổ sung NAA hoặc IBA riêng lẻ, hoặc phối trộn NAA

và IBA thì chồi cho ra rễ Tuy nhiên, khi chồi dứa nuôi cấy trong môi trường có bổ sung phối trộn NAA và IBA cho kết quả tốt hơn nếu như chồi dứa nuôi cấy trên môi trường bổ sung riêng lẻ NAA hoặc IBA (Duval, 2001)

Ảnh hưởng nồng độ Kinetin lên sự tạo chồi của cây Bắt ruồi

Nghiệm thức Tỉ lệ tạo lá của

mẫu cấy (%)

Số lá mới /mẫu cấy

Hình thái Chiều dài lá (cm)

Màu sắc

màu hồng nhạt

Bảng 5: Sự hình thành lá của mẫu cấy bắt ruồi trên môi trường MS 1/3 bổ sung nồng độ 1mg/L Kinetin sau 2 tuần

nuôi cấy Mẫu cấy được bổ sung Kinetin 1mg/L nhận thấy có thêm khá nhiều lá mới, trung bình 11 lá/mẫu cấy nhưng chiều dài lá ngắn do nồng độ Kinetin cao

Các thí nghiệm sơ bộ chỉ ra rằng nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) Các ảnh hưởng của hàm lượng môi trường MS lên nhân chồi từ đoạn cắt chồi được kiểm tra với môi trường 1/3, 1/6, 1/9 MS

và không bổ sung cytokinin hay auxin Nhân chồi bị ảnh hưởng lớn bởi hàm lượng môi trường MS Nhân chồi tốt nhất trên môi trường 1/3 MS (19.55 chồi/mẫu) và thấp nhất trên môi trường 1/9 MS Chiều dài lá dài nhất trên môi trường 1/3 MS (dài 2.85 cm) và ngắn nhất trên môi trường 1/9 MS sau 8 tuần nuôi cấy Các dữ liệu này không tương đồng với kết quả của Beebe (1980) khi dùng môi trường MS cho nhân chồi từ nuôi cấy lá Dionaea muscipula Ellis Khác biệt có lẽ đến từ sự khác nhau của các loài và mô nuôi cấy (chồi với lá, và lá trưởng thành với cây con non) được sử dụng

pH được biết đến trong các ảnh hưởng đến sự hấp thụ môi trường và nhân chồi (Parliman và cộng sự, 1982a), ảnh hưởng của pH môi trường (3.5, 4.5, 5.5 và 6.5) được kiểm tra trên môi trường 1/3 MS bổ sung 2.3 µM kinetin pH tối ưu cho việc nhân chồi và kéo dài chồi là pH 5.5 và nó cũng ức chế nghiêm trọng trong môi trường có tính acid

Rễ phát triển tốt ở pH 5.5 và 6.5 nhưng không phát triển ở các pH thấp hơn Các dữ liệu này tương đương với các dữ liệu trước của Hutchinson (1984) rằng số chồi cao nhất trên môi trường ở pH 5.5 Parliman và cộng sự (1982a) nuôi cấy thân rễ mẫu Dionaea muscipula Ellis trên môi trường pH 4.9

4a 4b 4c 4d

Hình 4: 4a-4b-4c-4d mẫu cấy cây Bắt ruồi KẾT LUẬN